ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE. Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů. Katedra chemie

Transkript

1 ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra chemie Vliv faktorů na obsah vybraných ukazatelů jakosti hlíz brambor Doktorská disertační práce Autor: Školitel: Konzultant: Ing. Kateřina Hejtmánková prof. Ing. Jaromír Lachman, CSc. prof. Ing. Karel Hamouz, CSc. Praha 2011

2 Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala svým školitelům prof. Ing. Jaromíru Lachmanovi, CSc. a prof. Ing. Karlu Hamouzovi, CSc. za odbornou pomoc a ochotu při řešení úkolů mé disertační práce. Děkuji také pracovníkům laboratoře katedry chemie v čele s Ing. Vladimírem Pivcem, CSc. za pomoc při řešení praktických problémů a příjemnou atmosféru v laboratoři. V neposlední řadě bych moc ráda poděkovala svým rodičům za podporu finanční, morální i odbornou během celého studia. Za podporu a pomoc s konečným zformátováním práce děkuji svému partnerovi.

3 OBSAH 1 ÚVOD Hypotézy Literární rešerše Charakteristika brambor Kvalita brambor Jednotlivé aspekty kvality brambor Sušina Sacharidy Proteiny Lipidy Minerální látky Organické kyseliny Antioxidanty Polyfenoly Anthokyany v barevných odrůdách brambor Karotenoidy

4 Vitamin C Tokoferoly a α-lipoová kyselina Rizikové látky Látky pocházející z chemizace zemědělství Dusičnany Těţké kovy a arsen Přírodní toxiny - alkaloidy Steroidní glykoalkaloidy Glykoalkaloidy brambor Biologické účinky (toxicita) glykoalkaloidů Hladiny glykoalkaloidů v běţně dostupných bramborách Vliv technologického a kulinárního zpracování na obsah glykoalkaloidů Vliv osvětlení na obsah glykoalkaloidů a chlorofylů Kalysteginy Materiál, podmínky pokusů a metody stanovení Materiál Charakteristika lokalit pěstování Podmínky pokusů

5 4.3.1 Osvětlování Dlouhodobé skladování Kvalita barevných odrůd brambor Rok Rok Kulinární úpravy Pouţité přístroje a chemikálie Přístroje a vybavení Chemikálie Standardy Metody stanovení Stanovení obsahu α-solaninu a α-chaconinu metodou HPLC-ESI-MS/MS Stanovení celkového obsahu anthokyanů Stanovení vitaminu C Stanovení chlorogenové kyseliny Stanovení antioxidační aktivity Stanovení luteinu Stanovení jednotlivých anthokyanidinů

6 4.5.8 Stanovení obsahu chlorofylů Stanovení sušiny Výsledky a diskuse Vliv kontinuálního osvětlení na obsah glykoalkaloidů, chlorofylů a karotenoidů Vliv dlouhodobého skladování na obsah glykoalkaloidů Kvalita barevných odrůd brambor Rok Rok Sušina vzorků Obsah glykoalkaloidů Celkový obsah anthokyanů Zastoupení jednotlivých anthokyanidinů Obsah vitaminu C Obsah chlorogenové kyseliny Antioxidační aktivita Vztah jednotlivých antioxidantů k celkové antioxidační aktivitě Statistické zhodnocení výsledků

7 5.4 Vliv kulinárních úprav na obsah vitaminu C a glykoalkaloidů v ţlutých a barevných odrůdách brambor Vliv kulinárních úprav na obsah sušiny, roky 2008 a Vliv kulinárních úprav na obsah vitaminu C Rok Rok Statistické zhodnocení výsledků z let 2008 a Vliv kulinárních úprav na obsah glykoalkaloidů Statistické zhodnocení výsledků Závěr Seznam pouţitých zkratek a symbolů Literatura Seznam vlastních publikací Vědecké články vztahující se k disertační práci Vědecké články nevztahující se k disertační práci Příspěvky na českých, zahraničních nebo mezinárodních konferencích Přílohy

8 1 ÚVOD Brambory (Solanum tuberosum) představují jednu z nejvýznamnějších plodin určených k výţivě světové populace. Jsou pěstovány ve většině zemí mírného pásma a jejich světová produkce činí více neţ 300 milionů tun ročně. V České republice zaujímá jejich pěstování nezanedbatelnou část rostlinné produkce konvenčního i ekologického zemědělství. Brambory jsou cenným zdrojem nutričně významných látek, a to vitaminů (zejména vitaminu C), plnohodnotných proteinů, antioxidantů, vlákniny a minerálních látek. Díky vysokému obsahu škrobu jsou brambory důleţitým zdrojem energie. Na druhé straně obsahují brambory i zdraví škodlivé látky, které pochází buď z chemizace zemědělství (dusičnany, těţké kovy a pesticidy) nebo jsou rostlinou syntetizovány, tzv. přírodní toxiny. Nejvýznamnější přírodní toxiny v bramborách jsou glykoalkaloidy a kalysteginy. Řada látek obsaţených v bramborách vykazuje antioxidační aktivitu. Antioxidanty mají pozitivní účinek na lidský organismus, zachycují a neutralizují volné radikály, zpomalují aterosklerotické procesy, inhibují akumulaci cholesterolu v krevním séru a zvyšují rezistenci cévních stěn. Hlavními antioxidanty běţných ţlutých odrůd brambor jsou polyfenoly (kyseliny chlorogenová, neochlorogenová, kávová a ferulová, aj.), vitamin C, karotenoidy, tokoferoly, kyselina α lipoová a selen. V poslední době je věnována značná pozornost barevným odrůdám brambor (Solanum tuberosum). Tyto odrůdy obsahují v duţnině a slupce navíc rostlinné přírodní pigmenty anthokyany, které vykazují silnou antioxidační aktivitu. Hlavními anthokyanidiny (aglykony anthokyanů) barevných odrůd brambor jsou v závislosti na odrůdě pelargonidin, peonidin, malvidin, cyanidin a petunidin. Vzhledem ke skutečnosti, ţe antioxidační kapacita červeně a fialově zbarvených odrůd brambor je mnohonásobně vyšší ve srovnání s bramborami se ţlutou duţninou, mohly by tyto brambory výrazně zvýšit příjem antioxidantů v lidské výţivě. V neposlední řadě poskytují barevné odrůdy netradiční surovinu vhodnou pro barevné zpestření jídel z brambor. V České republice je od roku 2005 registrovaná prozatím jediná fialová odrůda Valfi. Na hladiny nutričně cenných i toxických látek v bramborách má vliv celá řada faktorů. Mezi nejvýznamnější faktory patří vliv odrůdy, zralosti (velikost hlíz), mechanického poškození hlíz, podmínek pěstování (způsob hnojení, závlaha, lokalita, ekologické konvenční zemědělství, aj.), skladování (teplota, osvětlení, vlhkost, aj.) a technologické zpracování 6

9 (loupání, vaření, pečení, aj.). Uváţený výběr odrůd, dodrţení správné agrotechnické praxe a vhodného způsobu uskladnění hlíz má zásadní vliv na kvalitu produktů z brambor. Cílem předkládané práce je sledováni kvality brambor a různých vlivů, které mohou jejich kvalitu ovlivnit. Dílčí cíle předkládané práce jsou následující: Zhodnocení vlivu krátkodobého osvětlování na obsah chlorofylu, glykoalkaloidů a karotenoidů v ţlutomasých odrůdách brambor. Zhodnocení vlivu dlouhodobého skladování na obsah glykoalkaloidů v ţlutomasých odrůdách brambor. Podrobné studium barevných odrůd brambor, o jejichţ kvalitativním a hlavně kvantitativním sloţení je v literatuře dostupné zatím omezené mnoţství informací. Předmětem výzkumu je stanovení obsahu anthokyanů (celkových i jednotlivých), chlorogenové kyseliny, vitaminu C, antioxidační aktivity a glykoalkaloidů v barevných odrůdách a porovnat je s obsahy v běţných ţlutých odrůdách brambor. Studium vlivu vybraných kulinárních úprav na obsah vitaminu C a glykoalkaloidů ve ţlutých i barevných odrůdách brambor. 2 Hypotézy Na základě studia odborné literatury byly navrţeny tyto hypotézy: 1) Vlivem osvětlení brambor dochází k nárůstu toxických glykoalkaloidů a světlocitlivých pigmentů - chlorofylu a karotenoidů. 2) Míra akumulace glykoalkaloidů a chlorofylu je závislá na odrůdě. 3) Vlivem dlouhodobého skladování dochází k nárůstu glykoalkaloidů. 4) Červené a fialové odrůdy brambor se liší od tradičních ţlutomasých odrůd z hlediska obsahu cenných nutričních i toxických látek. 5) Obsah glykoalkaloidů v některých červených nebo fialových odrůdách je vyšší neţ povolených 200 mg/kg č.hm.. 6) Vlivem kulinárních úprav klesá obsah vitaminu C. 7) Vlivem kulinárních úprav klesá obsah toxických glykoalkaloidů. 7

10 3 Literární rešerše 3.1 Charakteristika brambor Brambory byly do Evropy dovezeny z Jiţní Ameriky koncem 16. století a odtud poté rozšířeny do celého světa. V současné době patří spolu s obilovinami a cukrovou řepou mezi nejvýznamnější zemědělské plodiny (Es a Hartmans, 1987). Brambory jsou denně konzumovány miliony lidí z celého světa. Jsou pěstovány v 80 % všech zemí a jejich roční produkce je přibliţně 330 milionů tun (FAOSTAT, 2009). Vyšší produkce dosahuje pouze pšenice, kukuřice a rýţe (Smith et al., 1996). Nejvyšší spotřeba brambor je v evropských zemích, kde převyšuje 80 kg brambor na osobu a rok (Lachman et al., 2009). Podle aktuální situační a výhledové zprávy Mze z května roku 2011 v předešlém roce zaujímala osázená plocha v ČR přibliţně 35 tisíc hektarů a bylo sklizeno 816 tisíc tun brambor. Průměrná spotřeba brambor v ČR v roce 2010 byla 61,38 kg/obyvatele/rok. Přes nízký obsah tuků jsou brambory důleţitým zdrojem energie, a to především díky vysokému obsahu škrobu. Energetická hodnota je přibliţně 290 kj na 100 g brambor, coţ odpovídá poloviční hodnotě oproti rýţi a těstovinám a čtvrtině v porovnání s chlebem (Storey a Davies, 1992). Je známo více neţ 5000 odrůd brambor, většina patří do druhu Solanum tuberosum. Kromě toho je kultivováno dalších 10 druhů rodu Solanum a dalších 200 druhů bylo identifikováno (Burlingame et al., 2009). Evropské odrůdy brambor patří do druhu lilek brambor (Solanum tuberosum) z čeledi lilkovitých (Solanaceae). Jedná se o jednoletou rostlinu rozmnoţující se vegetativně hlízami nebo generativně semeny. V zemědělské výrobě se vyuţívá výhradně vegetativního mnoţení, generativní mnoţení se uplatňuje zejména pro šlechtitelské účely (Schulzová a Hubert, 2004). Taxonomické zařazení je uvedeno v následující tabulce. 8

11 Tabulka I: Taxonomické zařazení brambor (Kubát, 2002) Český název Latinský název Říše Rostliny Plantae Podříše Vyšší rostliny Cormobionta Oddělení Krytosemenné Magnoliophyta Třída Vyšší dvouděloţné Dicotyledones Řád Lilkokvěté Solanales Čeleď Lilkovité Solanaceae Rod Lilek Solanum Druh Lilek brambor Solanum tuberosum 3.2 Kvalita brambor Hlízy jsou jediným vyuţitelným orgánem bramborového trsu. Kvalita hlíz se posuzuje na základě velikosti, tvaru, barvy a textury. Dále se posuzují vady jako například zelenání, tvorba oček a klíčků nebo mechanické poškození. Velikost hlíz je z části závislá na odrůdě a počtu hlíz pod trsem, velký vliv má také způsob pěstování a rostlinná populace. Z komerčního hlediska je ţádaná jednotná velikost hlíz. Tvar hlíz je převáţně odrůdovou charakteristikou, ale můţe být ovlivněn vnějšími podmínkami a chorobami. Bylo popsáno 8 základních tvarů brambor: stlačený, kulatý, vejčitý, obvejčitý, elipsovitý, oválný a protáhlý. Různé tvary jsou preferovány v závislosti na dalším zpracování. Struktura povrchu hlíz by měla být čistá, světlá a beze skvrn. Duţnina můţe být bíle krémová aţ ţlutá. Míra ţlutosti hlíz je způsobena obsahem karotenoidů (Storey a Davies, 1992). Pro konzumaci, zpracování nebo skladování má velký význam chemické sloţení hlíz. Průměrné chemické sloţení brambor je uvedeno v následující tabulce (Souci et al., 2008). 9

12 Tabulka II: Chemické složení bramborových hlíz (Souci et al., 2008) Složky brambor Množství v mg na 100 g jedlého podílu Voda Celkový dusík 330 Bílkoviny 2400 Tuky 110 Sacharidy Organické kyseliny 610 Hlavní sloţky brambor Minerální látky (celkem) 1020 Na 2,7 K 418 Mg 21 Ca 6,4 P 50 Fe 0,434 Zn 0,344 Askorbová kyselina 17 Vitamíny Thiamin 0,110 Riboflavin 0,047 Niacin 1,2 Asparagová kyselina 430 Aminokyseliny Glutamová kyselina 460 Asparagin 890 Glutamin

13 Chemické sloţení brambor je ovlivněno mnoha faktory, jako je místo pěstování, odrůda, sloţení půdy, klima nebo zemědělská praxe (Rivero et al., 2003). Důleţitým odrůdovým znakem je stolní hodnota vařených hlíz, která je charakterizována konzistencí hlíz, jejich strukturou, moučnatostí, vlhkostí a změnou barvy (tmavnutím). Významný je varný typ, který vyjadřuje převaţující uplatnění jednotlivých odrůd. Z tohoto pohledu jsou odrůdy konzumních brambor rozděleny do třech aţ čtyřech základních skupin: varný typ A - nízký obsah škrobu, pro přípravu salátů a příloh, varný typ B střední obsah škrobu, přílohové, pro přípravu pokrmů všeho druhu, varný typ C vysoký obsah škrobu, pro přípravu těst a kaší, varný typ D silně moučnaté, většinou nebývají povaţovány za stolní brambory. Mezi skupinami ještě existují přechodné typy AB, BA, BC a CB (Vokál et al., 2007). 3.3 Jednotlivé aspekty kvality brambor Sušina Významným znakem kvality hlíz je obsah sušiny. Obsah sušiny se pohybuje v rozmezí % a ovlivňuje kvalitu produktu, efektivnost a výtěţek zpracování a absorpci olejů (Lister a Munro, 2000). Brambory s vyšším obsahem sušiny vyţadují méně energie během smaţení, absorbují méně olejů a poskytují vyšší výtěţek. Obsah sušiny má vliv také na kvalitu vařených i smaţených brambor. Hlavní komponentou sušiny je škrob. Poměr mezi obsahem sušiny a škrobu je prakticky konstantní a můţe být mírně ovlivněn environmentálními podmínkami (Storey a Davies, 1992). Obsah sušiny v bramborových hlízách je geneticky podmíněn. Kultivary dozrávající dříve mají většinou obsah sušiny niţší neţ později dozrávající kultivary. Obsah sušiny dále ovlivňují zralost, podmínky pěstování, klima, sloţení půdy, hnojení, závlaha atd. (Es a Hartmans, 1987) Sacharidy Sacharidy vznikají v bramborové hlíze procesem fotosyntézy. Zásobním polysacharidem je škrob, který je umístěn v buňkách ve formě škrobových zrn nebo 11

14 amyloplastů a skládá se ze dvou polymerních látek amylózy a amylopektinu. Základní stavební jednotkou obou polymerních látek je α-d glukóza. Škrob tvoří % sušiny. Díky vysokému obsahu škrobu jsou brambory cenným zdrojem energie (Es a Hartmans, 1987). Na druhou stranu mají brambory díky vysokému obsahu sacharidů jeden z nejvyšších glykemických indexů (GI) ze všech potravin. GI je závislý na odrůdě, rané brambory mají díky odlišnému sloţení škrobu niţší hodnotu GI neţ brambory pozdní (Buono et al., 2009). Dalšími polysacharidy vyskytující se v bramborách jsou celulóza, hemicelulózy, pentosany a pektiny, které tvoří především buněčné stěny (Schulzová a Hubert, 2004). Vedle polysacharidů jsou v bramborové hlíze v malém mnoţství přítomny redukující monosacharidy glukóza a fruktóza a neredukující disacharid sacharóza. Značné změny v obsahu cukrů mohou probíhat v průběhu skladování (Es a Hartmans, 1987). Skladováním hlíz při nízkých teplotách (2-8 C) dochází k degradaci škrobu na redukující cukry, coţ se projevuje sládnutím hlíz (Ieri et al., 2011) Proteiny Bílkoviny brambor patří mezi nejhodnotnější bílkoviny rostlinného původu (Vokál et al., 2007). Proteinová kvalita činí okolo 70 % kvality vaječné bílkoviny (Lister a Munro, 2000). Jejich obsah je ale nízký, tvoří něco přes 2 % čerstvé hmoty bramborových hlíz. Tabulka III uvádí obsah esenciálních aminokyselin v bramborách (Burton, 1989). Brambory jsou velmi dobrým zdrojem lysinu, naproti tomu mají niţší obsah sirných aminokyselin cysteinu a methioninu. Nutriční hodnota proteinů brambor je odrůdově závislá a je ovlivněna skladováním a přípravou. V rámci jedné odrůdy je obsah proteinů závislý na lokalitě pěstování a pouţití hnojiv (Es a Hartmans, 1987). Majoritní protein brambor se nazývá patatin. Patatin je skupina imunologicky identických glykoproteinů o molekulové hmotnosti kda. Slouţí jako zásobní protein a pravděpodobně se zúčastňuje také obranných mechanismů rostliny. Představuje přibliţně % z celkových extrahovatelných proteinů z bramborových hlíz (Bárta a Bártová, 2008). Poslední dobou je věnována pozornost aminokyselině, která je v bramborách zastoupena v největším mnoţství, asparaginu (Tabulka II). Asparagin je jedním z prekurzorů akrylamidu ve výrobcích z brambor. Akrylamid vzniká reakcí asparaginu s redukujícím cukrem mechanismem Maillardovy reakce při teplotách vyšších neţ 100 C. Vysoké hladiny akrylamidu jsou v bramborových lupínkách, křupkách, hranolkách nebo fritovaných 12

15 bramborách. Hladiny akrylamidu v bramborových lupínkách mohou být aţ 2 mg/kg. Na tvorbu akrylamidu mají vliv také odrůda, doba vystavení vyšší teplotě, loupání nebo máčení. Podle IARC (International Agency for Research on Cancer) je akrylamid zařazen mezi potencionální lidské karcinogeny (Pedreschi et al., 2007; Viklund et al., 2007). Tabulka III: Obsah esenciálních aminokyselin v bramborách (Burton, 1989) Aminokyselina Obsah mg/100 g čerstvé hmoty Valin 143 Leucin 151 Isoleucin 102 Threonin 91 Methionin 40 Lysin 154 Fenylalanin 112 Tryptofan Lipidy Zastoupení lipidů v hlízách je velice nízké, okolo 0,1 %. Jedná se o volné mastné kyseliny, neutrální lipidy a fosfolipidy. Mezi nejdůleţitější mastné kyseliny, jeţ jsou součástí lipidů bramborových hlíz, patří kyselina linolová (obsah 32 mg na 100 g jedlého podílu), linolenová (obsah 23 mg na 100 g jedlého podílu), palmitová (obsah 0,513 mg na 100 g jedlého podílu) a stearová (obsah 4,3 mg na 100 g jedlého podílu) (Antoňů, 2005) Minerální látky Minerální látky obsaţené v hlíze představují komplex mnoha prvků. Jejich obsah je silně závislý na jejich obsahu v půdě a prostředí, kde je rostlina pěstována (Rivero et al., 2003). Brambory jsou dobrým zdrojem zejména draslíku, dále sodíku, ţeleza, hořčíku, vápníku, fosforu a zinku. Obsah draslíku se pohybuje v rozmezí 1,7 2 % v sušině a představuje zhruba polovinu všech minerálních látek v hlíze. Draslík vytváří z brambor zásaditou potravinu a vyvaţuje tak kyselé sloţky potravy (tuky, maso apod.) (Zrůst, 2004). Významný je i obsah mikrobiogenních prvků, a to především selenu. Selen působí v buněčném obranném antioxidačním systému společně s vitaminem E tak, ţe zastavuje reakce 13

16 volných radikálů (Zrůst, 2004). Obsah selenu se v bramborách pěstovaných v České republice pohybuje v rozmezí 0,003 0,018 mg/kg. S přihlédnutím ke skutečnosti, ţe téměř polovina obyvatelstva ČR trpí v současné době deficitem selenu, mohla by se nabídka brambor s jeho zvýšeným obsahem stát v budoucnosti prevencí s nedostatkem selenu souvisejících chorob (Jeţek et al., 2008). Miholová et al. (2010) zjistili, ţe pokud se brambory pěstují na půdách obohacených o soli selenu, mohou brambory s barevnou duţninou akumulovat více selenu neţ brambory ţlutomasé. Doporučené denní dietární dávky selenu jsou 55 μg pro ţeny a 70 μg pro muţe (Velíšek a Hajšlová, 2009a) Organické kyseliny V bramborových hlízách jsou obsaţeny organické kyseliny (citrónová, isocitrónová, jablečná, vinná, šťavelová, pyrohroznová kyselina a další). Jejich celkový obsah ovlivňuje aciditu brambor, a tudíţ i probíhající biochemické reakce, do nichţ mohou vstupovat jako substráty, katalyzátory nebo inhibitory (Schulzová a Hubert, 2004) Antioxidanty Přírodní antioxidanty přítomné v potravinách a dalším biologickém materiálu vyvolaly značný zájem díky svým potenciálním nutričním a terapeutickým účinkům. Antioxidanty zastoupené v lidské výţivě sniţují ve značné míře aterosklerotické procesy, inhibují akumulaci cholesterolu v krevním séru a zvyšují resistenci cévních stěn. Mnohé antioxidanty sniţují riziko koronárních srdečních onemocnění. Tyto látky mohou zachycovat volné radikály předtím, neţ mohou škodit a mohou bránit rozšíření oxidačního poškození (Zrůst, 2004). Antioxidanty brambor lze rozdělit na: polyfenoly (flavonoidy, anthokyany, fenylkarboxylové kyseliny a kumariny), karotenoidy, vitamin C, selen, α-lipoovou kyselinu, tokoferoly (vitamin E). Antioxidanty působí synergicky a vzájemně zvyšují pozitivní účinek. Hlízy brambor představují významný zdroj antioxidantů ve výţivě lidí (Lachman et al., 2000). 14

17 Polyfenoly Polyfenoly se řadí mezi sekundární metabolity. Pomáhají chránit rostlinu před napadením bakteriemi, houbami a viry. Polyfenoly jsou velmi silné antioxidanty a řadí se mezi ně fenolické kyseliny, aminokyselina tyrosin a flavonoidy (Lachman et al., 2000). Flavonoidy jsou dále velice rozsáhlou skupinou rostlinných fenolů obsahujících v molekule dva benzenové kruhy spojené tříhlíkovým (C 3 ) řetězcem. Podle stupně oxidace C 3 řetězce a jeho substituce se rozeznávají následující základní struktury flavonoidů: katechiny (flavan-3oly) leukoanthokyanidiny (flavan-3,4-dioly) flavanony flavanonoly flavony flavonoly (dihydroflavony) anthokyanidiny Z flavonoidních barviv jsou nejvýznamnější ţlutě zbarvené flavony a flavonoly a převáţně červené anthokyany (Velíšek a Hajšlová, 2009b). V bramborových hlízách jsou kromě L-tyrosinu nejvíce zastoupeny skořicové polyfenolické kyseliny: chlorogenová (asi 90 % z celkového obsahu polyfenolů), dále neochlorogenová, kávová a ferulová (Lachman et al., 2000). Navarre et al. (2010) uvádí vyšší obsah chlorogenové kyseliny (obrázek 1) a některých dalších fytonutrientů v raných odrůdách brambor v porovnání s odrůdami pozdními. Fenolické kyseliny jsou většinou akumulovány ve slupce a jsou zapojeny do obranných mechanismů rostliny (Rodriguez-Saona et al., 1998). V hlízách byl také zjištěn nízký obsah rutinu, quercetinu, myricetinu, naringeninu, kaempferolu a několika dalších flavonoidů (Reyes et al., 2005). Navarre at al. (2011) uvádí jako nejvíce zastoupené flavonoly v bramborách rutin a kaempferol-3-rutinosid. 15

18 Obrázek 1: Struktura kyseliny chlorogenové Fenoly jsou prekurzory sloučenin, které způsobují typické barevné změny produktů z brambor (hnědé aţ modrošedé zbarvení). Na tvorbě barevných produktů během zpracování brambor se podílejí mechanismy enzymového i neenzymového hnědnutí a tzv. tmavnutí po vaření (vznik komplexů chlorogenové kyseliny a ţeleza). Tyto změny jsou konzumenty vnímány negativně, a proto je snahou jim v řadě technologií předcházet. Polyfenolické sloučeniny vykazují téţ antimutagenní, antiglykemické, antikarcinogenní a antimikrobiologiální účinky a dále sniţují hladinu cholesterolu (Antoňů, 2005) Anthokyany v barevných odrůdách brambor V poslední době je pozornost věnována červeně a fialově zbarveným odrůdám brambor, které v duţnině a slupce obsahují anthokyany. Anthokyany vykazují silnou antioxidační aktivitu, neutralizují volné radikály a chrání tak organismus před poškozením (Lachman et al., 2009). Hlavním zdrojem anthokynaů ve výţivě je v současné době ovoce a červené víno a příjem těchto látek se odhaduje na 180 mg/osoba/den (Galvano et al., 2004). Anthokyany jsou přírodní pigmenty, které vytváří oranţovou, červenou nebo modrou barvu plodů, květů, kořenů a dalších zásobních orgánů. Počet anthokyanů přítomných v jednotlivých rostlinách je různý a pohybuje se od několika málo (jahody, ostruţiny) aţ po více neţ 10 různých pigmentů (hrozny červených odrůd révy vinné, borůvky). Anthokyany jsou glykosidy různých aglykonů, které se nazývají anthokyanidiny. Všechny anthokyanidiny jsou odvozeny od jedné základní struktury, kterou je flavyliový (2- fenylbenzylpyryliový) kation. Jednotlivé anthokyanidiny se mezi sebou liší počtem hydroxylových skupin a stupněm metylace těchto skupin (Galvano et al., 2004). Uvádí se, ţe v přírodě existuje celkem 17 různých anthokyanidinů, v potravinách má význam pouze 6 16

19 z nich (malvidin, pelargonidin, cyanidin, petunidin, peonidin a pelargonidin) s hydroxyskopinou v poloze C3 (Velíšek a Hajšlová, 2009b) (obrázek 2). Nejrozšířenějším anthokyanidinem je cyanidin (Galvano et al., 2004). Brown et al. (2003) uvádí, ţe antioxidační aktivita cyanidinu je 3krát vyšší neţ pelargonidinu a dále, ţe nejefektivnějším antioxidantem je malvidin. Anthokyanidiny se liší svým zbarvením i zastoupením v různých rostlinách, podle jejich výskytu byly i pojmenovány (viz tabulka IV). Tabulka IV: Majoritní anthokyanidiny v potravinách (Velíšek a Hajšlová, 2009b) Anthokyanidin Barva Původ pojmenování Latinský název cyanidin fialový chrpa Cyanus spp. pelargonidin šarlatový pelargonie Pelargonium spp. peonidin fialový pivoňka Paeonia spp. delfinidin purpurově modrý stračka Delphinium spp. petunidin purpurově modrý petunie Petunia spp. malvidin purpurový sléz Malva spp. Volné aglykony se vyskytují v rostlinných pletivech zřídka, a to pouze jako stopové produkty hydrolýzy anthokyanů nebo produkty vzniklé z leukoanthokyanidinů. Ve všech rostlinných materiálech jsou hlavními pigmenty glykosidy a acylované glykosidy anthokyanidinů (anthokyany). Jako součást molekuly anthokyanů bylo identifikováno 5 sacharidů. Jsou to: D glukosa, L rhamnosa, D galaktosa, D xylosa a L arabinosa. Cukry jsou vázány vţdy v poloze C3, je-li glykosylována ještě další hydroxyyskupina, bývá to hydroxyl na C5. Cukry bývají často acylovány fenolovými kyselinami (p-kumarovou, kávovou, ferulovou aj.). Kyselina je obvykle vázána na hydroxylovou skupinu glukosy v poloze C6 a hydroxylovou skupinu rhamnosy v poloze C4 (Velíšek a Hajšlová, 2009b). 98 % z celkových anthokyanů brambor jsou anthokyany acylované (Lachman et al., 2009). Samotné anthokyanidiny jsou nestabilní. Glykosylací a zejména acylací anthokyanů se zvyšuje jejich stabilita během zpracování a skladování (Rodriguez-Saona et al., 1998). Jejich stabilitu dále ovlivňuje chemické sloţení matrice. K rozkladu anthokyanů dochází 17

20 působením různých enzymů, a to především fenoloxidáz, peroxidáz a glykosidáz. Přítomnost vitaminu C urychluje degradaci anthokyanů (Wrolstadt et al., 2005). Převládajícími anthokyany ve fialových odrůdách jsou petunidin- a malvidin-3- rutinosid-5-glukosid acylovaný p-kumarovou nebo ferulovou kyselinou, zatímco v červených odrůdách to jsou pelargonidin- a peonidin-3-rutinosid-5-glukosid acylovaný p-kumarovou nebo ferulovou kyselinou (Reyes et al., 2005). Mohou se vyskytovat i neacylované nebo můţe být p-kumaroyl nahrazen zbytkem ferulové kyseliny (Lachman et al., 2009). Struktury 6 anthokyanidinů vyskytujících se v barevných bramborách jsou uvedeny v následujícím obrázku. Obrázek 2: Struktury anthokyanidinů V České republice je registrována fialová odrůda Valfi, která byla vyšlechtěna ve Výzkumném ústavu bramborářském v Havlíčkově Brodě. Valfi je speciální poloraná aţ polopozdní konzumní odrůda s modrofialovou slupkou a modrofialovou mramorovanou duţninou registrovaná v roce 2005 a oceněná hlavní cenou Zlatý klas [ Z dalších odrůd je například registrována tmavě fialová odrůda Vitelotte ve Francii (Ieri et al., 2011). Rodriguez-Saona et al. (1998) uvádí obsah celkových anthokyanů v barevných odrůdách brambor mg/kg č.hm.. Obsah antokyanů v barevných odrůdách brambor je podle tohoto údaje srovnatelný s jejich obsahem v červeném zelí (250 mg/kg č.hm.), 18

21 švestkách ( mg/kg č.hm.), jahodách ( mg/kg č.hm.) nebo ředkvičkách ( mg/kg č.hm.) (Bridgers et al., 2010). Na obsah anthokyanů v bramborových hlízách má vliv řada faktorů. Obsah je závislý zejména na odrůdě a také na lokalitě pěstování (Brown et al., 2008). Je známo, ţe niţší teploty a vyšší světelná intenzita indukují biosyntézu těchto látek (Reyes et al., 2004). Obsah anthokyanů je vyšší ve slupce v porovnání s duţninou (Brown, 2005; Jansen et al., 2006). Dalším faktorem je zralost hlíz, anthokyany se v hlízách akumulují běhěm stárnutí (Rodriguez-Saona et al., 1998). Stejný autor studoval stabilitu anthokyanů v zamraţených hlízách. Skladoval hlízy nakrájené na plátky po dobu 3 měsíců při -20 C. Ve všech testovaných odrůdách zjistil pokles obsahu anthokyanů Karotenoidy Karotenoidy jsou značně rozšířené ţluté a oranţové, výjimečně také ţlutozelené a červené pigmenty hub, rostlin, mikroorganismů a ţivočichů (Velíšek a Hajšlová, 2009b). Karotenoidy patří do skupiny lipofilních terpenoidních látek. Molekulu většiny karotenoidů tvoří 8 isoprenových jednotek. Dělí se na dvě hlavní skupiny: karoteny (uhlovodíky), xantofyly (kyslíkaté sloučeniny odvozené od karotenů). Kromě antioxidační aktivity je v lidské výţivě významná provitaminová funkce karotenoidů. Přibliţně 50 karotenoidních sloučenin jsou provitaminy vitaminu A. Pro provitaminovou funkci je nezbytný nejméně jeden nesubstituovaný β-iononový kruh na konci molekuly prekusoru. Nejvýznamnějším a nejrozšířenějším provitaminem A je β-karoten (Kotíková et al., 2007). Obsah karotenoidů v bramborách se pohybuje v rozmezí 0,5 1 mg/kg v bílých aţ světleţlutých odrůdách, 1-3,5 mg/kg ve středně ţlutých odrůdách a do 20 mg/kg v tmavoţlutých aţ oranţových odrůdách (Brown et al., 2008). Majoritními karotenoidy brambor jsou lutein (obrázek 3), violaxanthin a zeaxanthin (Brown, 2005). Další autoři stanovili v hlízách navíc také antheraxanthin, neoxanthin a β-cryptoxanthin (Breithaupt a Bamedi, 2006). Všechny uvedené karotenoidy patří do skupiny oxidačních produktů karotenů xantofylů, které nemají funkci provitaminu A (Velíšek a Hajšlová, 2009b). Brown (2005) uvádí ve stopových mnoţstvích také β karoten a α karoten. Brambory jsou tedy dobrým zdrojem xantofylů, které jsou součástí lidské sítnice a musí být přijímány ve stravě, ale chudým 19

22 zdrojem provitaminu A (Brown et al., 2007). Hlízy hybridů diploidně kultivovaných brambor (S. phureja a S. stenotonum) jsou charakteristické vysokým obsahem karotenoidů (okolo 14 mg/kg) a obsahují velké mnoţství zejména karotenoidu zeaxanthinu (Burgos et al., 2009b). Karotenoidy jsou také obsaţeny v barevných odrůdách brambor, jejich obsah je ale negativně korelován s obsahem anthokyanů (Brown et al., 2007). Obrázek 3: Struktura luteinu Vitamin C Askorbovou kyselinu syntetizují všechny zelené rostliny, které zajišťují svoji potřebu energie pomocí fotosyntézy (Velíšek a Hajšlová, 2009a). V porovnání s některými druhy ovoce a zeleniny obsahují brambory nepříliš vysokou hladinu vitaminu C (asi mg/kg č.hm.), vzhledem ke konzumovanému mnoţství ale patří k majoritnímu zdroji tohoto vitaminu v lidské výţivě, a to i přes fakt, ţe obsah vitaminu C značně klesá během uskladnění po dobu zimních měsíců. Doporučovaný denní příjem vitaminu C se pohybuje v rozmezí mg. Veškerá potřeba vitaminu C je kryta vitaminem z potravy, hlavně bramborami (asi %), zeleninou (asi %), a ovocem (30-35 %) (Velíšek a Hajšlová, 2009a). Aktivitu vitaminu C vykazují 2 formy kyseliny askorbové (obrázek 4), a to L-askorbová a L- dehydroaskorová kyselina (Burgos et al., 2009a). 20

23 Obrázek 4: L-askorbová a L-dehydroaskorová kyselina Mnoţství askorbové kyseliny v bramborových hlízách ovlivňuje celá řada faktorů. Mezi nejvýznamnější patří odrůda, rok pěstování, způsob pěstování, klimatické podmínky, stupeň zralosti, způsob sklizně a skladování. Nejvyšší hladina vitaminu C je ve střední části duţniny, nejniţší pak v okolí slupky (Storey, 2007). Po kulinárních úpravách a v průběhu skladování obsah vitaminu C klesá v závislosti na pouţití kulinární úpravy a na délce skladování (Burgos et al., 2009a). Stejný autor uvádí, ţe ve vařených bramborách je obsah vitaminu vyšší neţ v bramborách pečených v horkovzdušné i mikrovlnné troubě. To je ve shodě s tvrzením, ţe ve vařených bramborách je obsah vitaminu C stále poměrně vysoký, a to průměrně 130 mg/kg (Lachman et al., 2000). Nejvyšší obsah vitaminu C zůstává ve vařených bramborách ve slupce (Brown, 2005). Bylo zjištěno, ţe % vitaminu C se ztratí během blanšírování, a to především difůzí vitaminu do vody. Tyto ztráty se nejefektivněji sníţí, je-li proces blanšírování proveden za vyšší teploty po kratší dobu (Brown, 2005). Navarre et al. (2010) ve své práci neuvádí ţádný pokles, ale dokonce mírný nárůst vitaminu C v kulinárně zpracovaných malých bramborách (tzv. baby potatoes ). Během skladování obsah vitaminu C významně klesá, o % během prvních 3 měsíců, přičemţ pokles u odrůd s vyšším přirozeným obsahem vitaminu C je vyšší (Tudela at al., 2002). Bylo zjištěno, ţe v hlízách kříţence Solanum phureja Solanum tuberosum bylo zachováno po skladování 2krát více vitaminu C v porovnání s odrůdami Solanum tuberosum (Storey, 2007). Askorbová kyselina je hlavním přírodním inhibitorem hnědnutí brambor, neboť redukuje primární produkty oxidace o-chinony zpět na o-difenoly (Lachman et al., 2000). Vedle vitaminu C, jsou brambory téţ zdrojem thiaminu (vitamin B1), riboflavinu (vitamin B2), nikotinové kyseliny a pyridoxinu (vitamin B6) (Schulzová, 2004). 21

24 Tokoferoly a α-lipoová kyselina Nejvýznamnějším tokoferolem v bramborových hlízách je α-tokoferol (0,5 2,8 mg/kg). Společně se selenem (0,01 mg/kg) zastavuje reakce volných radikálů. α-lipoová kyselina působí jako růstový faktor brambor. Uvnitř buněk se redukuje na dihydrolipoovou kyselinu, která likviduje a neutralizuje volné radikály (Lachman et al., 2000). 3.4 Rizikové látky Vedle látek prospěšných pro lidskou výţivu jsou brambory téţ zdrojem látek, které v určitých mnoţstvích mohou představovat zdravotní riziko Látky pocházející z chemizace zemědělství Dusičnany V zemích evropské unie byl zaveden poţadavek na přípustné mnoţství dusičnanů v bramborách 300 mg/kg a v raných bramborách (sklizeň do 15. července) 500 mg/kg čerstvých hlíz. Vedle hnojení dusíkem je obsah dusičnanů významně ovlivněn podnebím, lokalitou a odrůdou (Lachman et al., 2005). Základním předpokladem nízkého obsahu dusičnanů je dostatečné mnoţství sráţek. 500 mm sráţek během vegetační doby by mělo zajistit podlimitní obsahy dusičnanů v hlízách (Hamouz et al., 1999). Potenciální toxicita dusičnanů vyplývá z moţnosti jejich redukce na dusitany. Toxický účinek dusitanů po jejich vstřebání do krve spočívá v moţnosti vyvolání methemoglobinemie (Velíšek a Hajšlová, 2009b) Těžké kovy a arsen Výskyt toxických prvků (olovo, kadmium, rtuť a arsen) v potravinách souvisí mimo jiné se znečišťováním ţivotního prostředí. Jedním ze zdrojů kontaminace toxickými prvky je i nadměrné pouţívání minerálních hnojiv a jiných agrochemikálií, případně aplikace čistírenských kalů do půdy (Velíšek a Hajšlová, 2009b). Podle vyhlášky MZd 305/2004 Sb. ze dne jsou stanovena následující nejvyšší přípustná mnoţství toxických prvků v bramborách: 0,3 mg/kg arsenu, 0,1 mg/kg kadmia, 0,15 mg/kg olova a 0,02 mg/kg rtuti. 22

25 3.4.2 Přírodní toxiny - alkaloidy Přírodní toxiny patří do skupiny sekundárních metabolitů, které jsou v rostlinách syntetizovány za účelem ochrany proti fytopatogenům. Brambory obsahují 2 skupiny přírodních toxinů, které obě patří do skupiny alkaloidů. Za alkaloidy se povaţují dusíkaté bazické sloučeniny, které vznikají jako sekundární metabolity a vykazují v závislosti na konzumovaném mnoţství různé biologické účinky. Alkaloidy jsou heterogenní skupinou zahrnující více neţ 5000 sloučenin. Byly izolovány z rostlin patřících do různých čeledí, jako například Solanaceae, Erythroxylaceae, Convolvulaceae, Proteaceae, Rhizophoraceae, Brassicaceae a Euphorobiaceae (Dräger, 2002). Vyskytují se nejčastěji jako směsi látek příbuzné struktury v různých částech vyšších rostlin (semenech, listech, kořenech, kůře, aj.). Některé se povaţují za produkty detoxikace, regulátory růstu, rezervní formy dusíku nebo rostlinná antibiotika (přírodní pesticidy). Jedná se o látky s významným biologickým účinkem a ve vysokých koncentracích mohou být toxické pro člověka. Alkaloidy se běţně dělí do 3 hlavních základních skupin: pravé alkaloidy, pseudoalkaloidy, protoalkaloidy. Potravinářsky významné rostliny z čeledi lilkovitých (Solanaceae), a to rody lilek (Solanum) a rajče (Lycopersicon), k nimţ se řadí brambory (Solanum tuberosum), lilky vejcoplodé (Solanum melongena) a rajčata (Lycopersicon esculentum) syntetizují jak zástupce pseudoalkaloidů (steroidní glykoalkaloidy), tak zástupce protoalkaloidů (kalysteginy) (Velíšek a Hajšlová, 2009b) Steroidní glykoalkaloidy Dusíkaté steroidní glykoalkaloidy jsou syntetizovány dvouděloţnými rostlinami čeledi lilkovitých (Solanaceae), liliovitých (Liliaceae) a klejichovitých (Asclepiadaceae). Jejich základní skelet je odvozen od cholestanu (obrázek 5), který se skládá ze tří kondenzovaných šestičlenných a jednoho pětičlenného kruhu. 23

26 Obrázek 5: Cholestan Molekula glykoalkaloidů se skládá ze tří základních strukturních částí. Polární hydrofilní cukerné části, nepolární lipofilní steroidní části a dusíkatého heterocyklu. Poslední dvě části tvoří dohromady aglykon. Ve více neţ 300 druzích rostlin rodu Solanum se nachází minimálně 90 různých steroidních glykoalkaloidů, které se podle struktury aglykonu dělí do pěti skupin na: solanidany, spirosolany, spiroaminoketaly, 22,26 epeminocholestany, α-epeminocyklohemiketaly, 3 aminospirostany. V potravinářsky významných rostlinách se nacházejí glykoalkaloidy, jejichţ aglykony jsou 3β-hydroxyderiváty odvozené od solanidanu nebo spirosolanu. Derivátem solanidanu je solanidin a demissidin, od spirosolanu jsou odvozeny solasodin a tomatidenol (Velíšek a Hajšlová, 2009b) Glykoalkaloidy brambor Glykoalkaloidy brambor byly prvně identifikovány v první polovině 19. století a od té doby bylo shromáţděno velké mnoţství poznatků o těchto látkách (Smith, 1996). Aţ do roku 1954 se předpokládalo, ţe po chemické stránce se jedná o jeden alkaloid solanin. Výsledkem snahy o frakcionaci solaninu bylo objevení α-chaconinu. Majoritními glykoalkaloidy brambor jsou tedy α-solanin a α-chaconin. Tyto glykoalkaloidy představují 95 % glykoalkaloidů brambor a jejich poměr bývá uváděn 3:2 (Zrůst a Fialková, 1996). Zbytek tvoří tzv. minoritní glykoalkaloidy (viz následující obrázek 6) (Friedman, 2004). V kulturních odrůdách jsou z minoritních glykoalkaloidů přítomny β1-solanin, β2-solanin, γ-solanin, β1-chaconin, β2-chaconin, γ-chaconin, α-solamarin a β-solamarin. 24

27 Společným aglykonem pro výše zmíněné glykoalkaloidy (kromě posledních dvou jmenovaných) je aglykon solanidin, který se vyskytuje také volný (Velíšek a Hajšlová, 2009b). Jejich struktura je uvedena v následující tabulce. Tabulka V: Složení forem solaninu a chaconinu kulturního druhu bramboru Solanum tuberosum (Zrůst, 2004) Sloučenina α-solanin β1-solanin Struktura Solanidin + galaktóza + glukóza + rhamnóza Solanidin + galaktóza + glukóza β2-solanin Solanidin + galaktóza + rhamnóza γ-solanin Solanidin + galaktóza α-chaconin Solanidin + glukóza + rhamnóza (1) + rhamnóza (2) β1-chaconin Solanidin + glukóza + rhamnóza (1) β2-chaconin Solanidin + glukóza + rhamnóza (2) γ-chaconin Solanidin + glukóza 25

28 Obrázek 6: Glykoalkaloidy brambor (Friedman, 2004) Dále se v kulturních bramborách vyskytuje aglykon α-solamarinu a β-solamarinu tomatidenol a demissidin (Lachman et al., 2001). Glykoalkaloidy jsou termostabilní látky. Působením hydroláz nebo v kyselém prostředí dochází k hydrolýze glykoalkaloidů za vzniku aglykonů a cukrů. Aglykony jsou prakticky stabilní. Distribuce glykoalkaloidů se obecně liší v různých částech rostlin. V bramborách je nejvyšší mnoţství glykoalkaloidů přítomno v pletivech s vysokou metabolickou aktivitou jako jsou v květy, nezralé plody, mladé listy a klíčky. V hlízách jsou hladiny glykoalkaloidů zpravidla nízké, ale vystavením hlíz nevhodným podmínkám se můţe obsah glykoalkaloidů výrazně zvýšit (viz dále). Nejvyšší 26

29 hladiny v hlízách jsou v povrchových vrstvách, směrem do středu hlízy obsah glykoalkaloidů klesá. Distribuce a obsah glykoalkaloidů je uvedena v následující tabulce. Tabulka VI: Distribuce a obsah glykoalkaloidů v bramborách (Velíšek a Hajšlová, 2009b) Část rostliny nebo hlízy Obsah (mg/kg původní hmoty) Květy 5000 Klíčky Neloupané brambory 75 Pokoţka (2 3 % hmotnosti hlízy) Slupka po oloupání (10 15 % hmotnosti hlízy) Slupka a očka (průměr 3 mm) Loupané brambory Biologické účinky (toxicita) glykoalkaloidů V evropských státech, včetně ČR, bylo v celých neloupaných bramborách přípustné mnoţství α-solaninu a α-chaconinu stanoveno na hodnotu 200 mg/kg. Toxický účinek glykoalkaloidů spočívá v inhibici acetylcholinesterázy, butyrylcholinesterázy, porušování membrán zaţívacího traktu a některých orgánů. Inhibicí acetylcholinesterázy dochází k akumulaci acetylcholinu v nervové tkáni, coţ má za následek bolest hlavy, malátnost, dýchavičnost a nervové poruchy. Vysoké dávky glykoalkaloidů způsobují nízký krevní tlak, horečku, slabý puls, rychlé dýchání, halucinaci, delirium a následně koma. Extrémní případy mohou skončit úmrtím. Smrtelná dávka pro dospělého člověka je 3 aţ 6 mg/kg tělesné hmotnosti, coţ je dávka srovnatelná se smrtelnou dávkou strychninu či arseniku. V literatuře je popsáno asi 30 smrtelných otrav po poţití brambor (Zrůst, 2004). Vysoké dávky α-chaconinu působí teratogenně. Moderní studie naznačují, ţe glykoalkaloidy jsou odpovědné za zvyšování rizika rakoviny mozku, prsu, plic a štítné ţlázy (Korpan et al., 2004). Friedman a Levin (2009) uvádí, ţe α-chaconin je více toxický neţ α- 27

30 solanin. Chronická toxicita glykoalkaloidů je nízká, vzhledem k jejich nízké absorpci v gastrointestinálním traktu. Intestinální bakterie téţ napomáhají detoxikaci, protoţe hydrolyzují přítomné glykoalkaloidy za tvorby aglykonu solanidinu, který se vstřebává velmi málo. Z těla jsou glykoalkaloidy odstraňovány poměrně rychle, a to během 12 hodin jak močí, tak výkaly (Lachman et al., 2001). Vedle negativních účinků vykazují glykoalkaloidy téţ prospěšné účinky. Inhibují růst rakovinných buněk v játrech a tračníku u lidí. Téţ inaktivují herpes simplex virus, zesilují účinek anestetik inhibujících cholinesterázu a účinek vakcíny proti malárii (Friedman, 2004) Hladiny glykoalkaloidů v běžně dostupných bramborách Většina konzumních odrůd obsahuje méně neţ 120 mg/kg glykoalkaloidů a nepředstavuje zdravotní riziko. Jejich obsah se běţně pohybuje v rozmezí mg/kg. Mnoţství glykoalkaloidů ovlivňuje chuť brambor. Glykoalkaloidy vyvolávají dva smyslové vjemy, hořkou chuť podobnou kofeinu a svíravý palčivý pocit (Zrůst, 2004). Obsah glykoalkaloidů vyšší neţ 140 mg/kg způsobuje hořkou chuť brambor. Odrůdy obsahující vyšší obsah neţ 200 mg/kg způsobují palčivou bolest v ústech a krku. Jedna z pěstovaných odrůd v ČR Karin má vysoký obsah glykoalkaloidů, který můţe za určitých podmínek překročit přípustný limit 200 mg/kg. Z hygienicko toxikologického pohledu lze tuto odrůdu povaţovat za rizikovou (Guziur et al., 2000). Faktory ovlivňující obsah glykoalkaloidů v bramborách lze zařadit do 3 hlavních skupin (Smith et al., 1996) na: genetické, předklizňové, posklizňové. Rozhodující vliv na obsah glykoalkaloidů v bramborách má odrůda, zralost (velikost hlíz), mechanické poškození hlíz, podmínky pěstování (způsob hnojení, závlaha, lokalita, aj.) a skladování (teplota, osvětlení, vlhkost, aj.). Například brambory pěstované v oblasti s vyšší nadmořskou výškou obsahovaly vyšší obsah glykoalkaloidů v porovnáním s bramborami pěstovanými v níţe poloţených oblastech (Lachman et al., 2001). Nejednoznačný vliv má způsob pěstování (ekologické konvenční). Odrůda významně ovlivňuje i změny obsahu glykoalkaloidů následkem ostatních faktorů. Vzhledem k významu glykoalkaloidů v ochraně 28

31 rostlin proti patogenům (viry, bakterie, houby a hmyz) poskytuje kříţení mezi divokými bramborami (Solanum aculae) a standardními odrůdami (Solanum tuberosum) nové hybridy obsahující niţší mnoţství glykoalkaloidů, avšak s širším spektrem jejich strukturálního zastoupení, které umoţňují synergický efekt vůči patogenům (Lachman et al., 2001) Vliv technologického a kulinárního zpracování na obsah glykoalkaloidů Na obsah glykoalkaloidů v konečných produktech mají vliv také kulinární úpravy. Koncentrace glykoalkaloidů v produktech závisí na jejich obsahu v původní surovině. Glykoalkaloidy jsou značně termostabilní, odolávají mraţení i sušení, nerozkládají se vařením, pařením, pečením, ani mikrovlnným ohřevem. K tepelné degradaci dochází při teplotách C, aglykony nepodléhají rozkladu ani při teplotách C (Zrůst, 2004). Příčinou zvýšeného obsahu glykoalkaloidů ve zpracovávaných bramborách můţe být indukovaná syntéza po mechanickém zpracování (loupání, krájení) hlíz, po kterém tepelné opracování přichází s časovou prodlevou. Vyšší je také obsah glykoalkaloidů ve výrobcích s nízkým obsahem vody (např. výrobky vzniklé extrudováním). Sušením dochází aţ k pětinásobnému zakoncentrování alkaloidů oproti syrovým hlízám. Naopak ke sníţení obsahu glykoalkaloidů ve výrobcích z brambor přispívá jejich vyluhování z dělených hlíz do oplachových vod (Zrůst, 2004). Při vaření ve vodě dochází k úbytku solaninu výluhem. Vyluhované mnoţství solaninu lze zvýšit přídavkem octové kyseliny. Přídavkem 0,3% kyseliny octové se sníţí obsah solaninu ve vařených bramborách aţ o 84 % (Velíšek a Hajšlová, 2009b). V průběhu technologických procesů dochází ke značnému poklesu obsahu obou hlavních glykoalkaloidů. Významného sníţení je docíleno při trţní úpravě především oloupáním hlíz (Zrůst, 2004). Byl proveden pokus, ve kterém byl sledován pokles obsahu glykoalkaloidů zbavením slupky (tloušťka asi 1,5 mm) v českých a zahraničních odrůdách. V českých odrůdách se obsah glykoalkaloidů sníţil v průměru o 51,5 % a v zahraničních o 55,1 %. Úbytek na hmotě činil pouze % (Zrůst, 2004). Byl sledován vliv tepelné úpravy na obsah a stabilitu α-solaninu a α-chaconinu v hlízách bramboru. Při vaření nedocházelo k výraznému poklesu glykoalkaloidů (asi o 4 29

32 6 %), při mikrovlnném ohřevu činil pokles aţ 15 %. Při smaţení při teplotě 150 C nebylo sníţení obsahu prokázáno, při teplotě 170 C byl obsah glykoalkaloidů značně variabilní a při teplotě 210 C docházelo jiţ k částečnému rozkladu glykoalkaloidů (obsah α-chaconinu klesl o 30 %, α-solaninu o 40 %) (Takagi et al., 1990). Tajner-Czopek et. al. (2008) uvádí pokles obsahu glykoalkaloidů v raných odrůdách brambor vlivem oloupání o 58 % a následným vařením o dalších 22 %. Dále uvádí vyšší ztráty solaninu v porovnání s chaconinem při loupání i vaření. Bylo zjištěno, ţe kulinárními úpravami se obsah glykoalkaloidů sniţuje rozdílně v závislosti na odrůdě i roku pěstování (Zrůst, 2004). Při rozdílné úpravě bramborových hranolků byly nejniţší obsahy glykoalkaloidů shledány v předsmaţených, zmraţených a dodatečně dosmaţených hranolcích, coţ odpovídá velkovýrobní technologii společně s přípravou konečného výrobku ve velkém v restauracích, či v malém v domácnostech. K většímu sníţení dochází při vlastním procesu smaţení (Dräger, 2002). Byl studován obsah glykoalkaloidů v neloupaných vařených bramborách, pečených bramborách, bramborách připravovaných mikrovlnným ohřevem nebo v hranolkách. Bylo zjištěno, ţe sníţení obsahu glykoalkaloidů ve výše popsaných úpravách je způsobeno především loupáním (Peksa et al., 2006). Byly pozorovány změny obsahu glykoalkaloidů během přípravy hranolků. Významného sníţení obsahu glykoalkaloidů bylo docíleno loupáním, krájením na plátky, omytím a blanšírováním plátků i konečným smaţením. Proces smaţení plátků při vysoké teplotě ( C) usnadňuje penetraci oleje a dochází k vyluhování i rozkladu přibliţně 40 % přítomných glykoalkaloidů (Peksa et al., 2006). Významným způsobem zpracování brambor je extruze. Při ní dochází k různým chemickým reakcím vlivem vysoké teploty a tlaku. Během extruze se obsah glykoalkaloidů nesniţuje. Pokud je před extruzí přidána do směsi sirná sloučenina (methionin, thiamin nebo benzyldisulfid) dochází k významnému sníţení obsahu glykoalkaloidů. Předpokládá se, ţe vlivem reaktivity thiolových skupin dochází ke změně konformace α-solaninu a α-chaconinu rozštěpením jedné nebo více navázaných molekul cukrů. I kdyţ byl prokázán účinek thiolů na sniţování obsahu přírodních toxinů během extruze, silný sirný zápach a výskyt nových sloučenin limituje jejich pouţití. Maskování chuti a vůně se ukazuje jako nezbytné (Surjawan et al., 2001). 30

33 Vliv osvětlení na obsah glykoalkaloidů a chlorofylů V důsledku poměrně malého rozdílu mezi běţnou a přípustnou hladinou těchto látek je vhodný výběr nebo šlechtění odrůd s niţším obsahem glykoalkaloidů velmi důleţitý. Je také ţádoucí vyloučit vliv faktorů, které mohou zapříčinit nárůst jejich obsahu. Mezi tyto faktory patří mechanické poškození, stádium zralosti, podmínky pěstování a skladování. Významný vliv na obsah glykoalkaloidů má i osvětlování (Haddadin et al., 2001). Světelná expozice má také vliv na konverzi amyloplastů na chloroplasty, čímţ se zvyšuje obsah chlorofylu a dochází k zelenání hlíz. Zelenání je pro většinu spotřebitelů signálem k tomu, aby takto vypadající brambory nekonzumovali, ale vztah mezi tvorbou chlorofylu a glykoalkaloidů nebyl průkazně zjištěn (Phillips et al., 1996). Vystavení brambor osvětlení má vedle zvýšené biosyntézy glykoalkaloidů, coţ je neţádoucí ze zdravotního hlediska, za následek zvýšení syntézy chlorofylu, která je neţádoucí z marketingového hlediska (Pavlista, 2007). Řada výzkumů se zabývá vlivem osvětlení na tvorbu chlorofylu a glykoalkaloidů. Výsledky naznačují jisté trendy, ale některé výsledky jsou protichůdné. Většina autorů se shoduje v názoru, ţe tvorba glykoalkaloidů vlivem osvětlení je významně odrůdově závislá (Edwards a Cobb, 1997). Odstraněním slupky se odstraní většina glykoalkaloidů. Následné vystavení oloupaných hlíz osvětlení můţe vést k syntéze glykoalkaloidů a obnovení vysokého obsahu těchto látek (Haddadin et al., 2001). Vystavení hlíz světlu a jejich poranění zvyšuje biosyntézu alkaloidů aţ o 400 %. Stimulačně působí především světlo niţších vlnových délek (Pavlista, 2007). Syntéza glykoalkaloidů vlivem osvětlení můţe probíhat na poli, během sklizně i v průběhu skladování. Během skladování v obchodech bývají brambory osvětlovány. Několik studií naznačuje, ţe vystavení brambor osvětlení můţe zvýšit hladinu glykoalkaloidů 2 3krát. Bylo zjištěno, ţe spektrální sloţení světla můţe významně ovlivnit akumulaci glykoalkaloidů. Vhodný výběr typu pouţitého světla v obchodech je důleţitý pro zajištění zdravotní nezávadnosti a kvality hlíz (Machado et al., 2007). Dvě odrůdy brambor (Draga a Sponta) byly vystaveny přímému a difúznímu slunečnímu svitu. Brambory byly skladovány na otevřeném dvoře (přímý sluneční osvit), překryté materiálem, který rozptyluje sluneční světlo (difúzní sluneční osvit) a překryté 31

34 materiálem, který nepropouští ţádné světlo (uchování v temnu). Brambory byly takto uchovány po dobu tří týdnů. V obou odrůdách byl po třech týdnech nejvyšší obsah solaninu v bramborách uchovávaných při přímém slunečním osvětlení a nejniţší v bramborách uchovávaných v temnu. S rostoucí dobou skladování na přímém slunečním světle vzrůstal obsah solaninu. Rychlá sklizeň brambor z pole je tedy důleţitá stejně, tak jako jejich další skladování v temnu (Haddadin et al., 2001). Tvorbu chlorofylu stimuluje na rozdíl od tvorby glykoalkaloidů především světlo delších vlnových délek (Pavlista, 2007). Na stimulaci tvorby chlorofylu má významný vliv i teplota. Niţší skladovací teploty prodluţují lag fázi od expozice světla ke stimulaci tvorby chlorofylu. Proces zelenání je téţ ovlivněn sloţením atmosféry. Atmosféra obsahující více neţ 15 % oxidu uhličitého je zvláště účinná v prevenci zelenání hlíz (Storey a Davies, 1992). Obsah chlorofylu nemá význam z toxikologického ani chuťového hlediska. V jiné studii byl zkoumán obsah glykoalkaloidů a chlorofylu v hlízách tří různých odrůd brambor (Desiree, King Edward a Kerrs Pink). Brambory byly skladovány po dobu 15 dní při kontinuální intenzitě osvětlení 250 μmol/ m 2 /s při teplotě 24 C. Bylo provedeno porovnání 4 různých zdrojů světla (fluorescenční světlo, vysokotlaká sodíková výbojka, vysokotlaká rtuťová výbojka a nízkotlaká rtuťová výbojka). Byl zaznamenán významný rozdíl mezi odrůdami v akumulaci glykoalkaloidů i chlorofylu. Akumulace glykoalkaloidů byla dále významně ovlivněna zdrojem světla. Pro všechny pouţité typy světla došlo k nárůstu obsahu glykoalkaloidů. Vyšší akumulace glykoalkaloidů i chlorofylu byla zjištěna v bramborách osvětlených pomocí fluorescenčního světla a sodíkové výbojky v porovnání s vysokotlakou a nízkotlakou rtuťovou výbojkou (Percival, 1999). Jiţ dřívější studie naznačily, ţe míra akumulace glykoalkaloidů můţe být významně ovlivněna spektrálním sloţením světla. Například v hlízách odrůdy Pentland Hawk byl obsah glykoalkaloidů 4 6krát vyšší při vystavení fluorescenčnímu světlu nebo sodíkové výbojce oproti nízkotlaké i vysokotlaké rtuťové výbojce. Obdobných výsledků bylo dosaţeno dříve i s odrůdou Desiree. Osvětlení brambor pozměnilo poměr α-solaninu a α-chaconinu, ale neovlivnilo významně poměr chlorofylu a a chlorofylu b. Výsledky naznačily silnou tendenci k tvorbě chlorofylu a glykoalkaloidů při vystavení brambor osvětlení. Ačkoli osvětlení indukuje syntézu glykoalkaloidů i chlorofylu, není zřejmé, zda jsou tyto biochemické procesy na sobě závislé. Brambory skladované v temnu nevykazovaly nárůst glykoalkaloidů ani 32

35 chlorofylu a poměry α-solaninu a α-chaconinu stejně jako chlorofylu a a chlorofylu b zůstaly stejné (Percival, 1999). Byl porovnán vliv dvou typů osvětlení a dvou teplot na tvorbu glykoalkaloidů v hlízách odrůdy Monaliza. Pokus probíhal 14 dní za následujících podmínek: nepřímé sluneční osvětlení, fluorescenční osvětlení, skladování ve tmě při teplotě 7 8 C a skladování ve tmě při C. Kromě nepřímého slunečního osvitu (přibliţně 10 hodin denně) byly všechny hlízy trvale vystaveny specifickým podmínkám. Ve všech případech byly na konci experimentu hladiny glykoalkaloidů v hlízách vyšší neţ na začátku. Nejvyšší akumulace glykoalkaloidů bylo dosaţeno vystavením brambor fluorescenčnímu osvětlení (Machado et al., 2007). Dvacet odrůd brambor bylo vystaveno osvětlení o intenzitě 140 μmol/m 2 /s při 20 C po dobu 48 hodin. Tato intenzita osvětlení odpovídá oblačnému dni. Hlízy všech odrůd byly zkoumány v odlišných stádiích zralosti, a to nezralé, zralé a jiţ skladované. Hlízy byly rozkrojeny na polovinu a skladovány v temnu a za osvětlení při jinak stejných podmínkách. V hlízách skladovaných v temnu nedošlo ke změně obsahu glykoalkaloidů. Podle očekávání vedlo vystavení hlíz osvětlení k nárůstu obsahu glykoalkaloidů. Byl zjištěn významný rozdíl v nárůstu obsahu glykoalkaloidů i chlorofylu v jednotlivých odrůdách při skladování za světla. Nárůst byl také ovlivněn stádiem zralosti brambor. Výrazně vyšší byl v bramborách, které jiţ byly skladovány oproti nárůstu v bramborách nezralých nebo právě zralých (Griffiths et al., 1994). Šest různých odrůd brambor bylo skladováno při 10 a 4 C po dobu 14 týdnů od sklizně. Po kaţdém odběru byly brambory dále vystaveny osvětlení po dobu 96 hodin a analyzovány na obsah chlorofylu a glykoalkaloidů. Skladovací teplota ovlivnila následnou tvorbu glykoalkaloidů v důsledku osvětlení. Nejvyšší nárůst glykoalkaloidů následkem osvětlení byl zaznamenán u brambor skladovaných při 4 C po dobu 14 týdnů (Griffiths et al., 1998). V další ze studií byl uskutečněn osmidenní pokus, při kterém byly brambory (odrůda King Edward) skladovány při 5, 10, 20 a 25 C při intenzitě osvětlení 12 μmol/m 2 /s a ve tmě. Teplota významně ovlivnila tvorbu chlorofylu, nejvyšší hladiny chlorofylu byly nalezeny v bramborách skladovaných při 20 C. Nebyl zjištěn vliv teploty ani světla na tvorbu glykoalkaloidů (Edwards a Cobb, 1997). Odrůda White Rose byla vystavena fluorescenčnímu světlu po dobu 20 dní. Byl zaznamenán nárůst obsahu chlorofylu, chlorogenové kyseliny a glykoalkaloidů. V 33

36 bramborách skladovaných ve tmě byl zaznamenán také nárůst glykoalkaloidů a chlorogenové kyseliny, ale výrazně niţší v porovnání s bramborami vystavenými osvitu (Dao a Friedman, 1994). Čtyři různé odrůdy brambor byly skladovány při intenzitě osvětlení 250 μmol/m 2 /s po dobu 20 dní. Došlo k významnému nárůstu glykoalkaloidů i chlorofylu, tento nárůst byl odrůdově ovlivněný (Grunenfelder et al., 2006). Byl studován vliv osvětlení na 11 různých genotypů druhu Solanum phujera. Ve všech genotypech vedlo osvětlení k významné syntéze α-chaconinu a α-solaninu. V devíti ze studovaných genotypů došlo k i významnému nárůstu hladiny α-solamarinu. Stupeň akumulace glykoalkaloidů byl silně genotypově závislý (Griffiths a Dale, 2001). V další ze studií byly skladovány brambory odrůdy Marfona a Granola při čtyřech různých skladovacích podmínkách po dobu 6 měsíců. Brambory byly skladovány při běţném skladovacím světle a skladovací tmě při teplotě 10,2 19,2 C a 5 8 C. V bramborách skladovaných na světle byl nárůst obsahu glykoalkaloidů vyšší neţ v bramborách skladovaných ve tmě při stejné teplotě. Při niţší skladovací teplotě probíhala syntéza glykoalkaloidů méně (Sengül et al., 2004) Kalysteginy Kalysteginy patří mezi nedávno objevenou skupinu nortropanových alkaloidů. Jejich název vychází z latinského názvu rostliny Opletník plotní (Calystegia sepium) z čeledi svlačcovitých (Convulvoceae), kde byly identifikovány poprvé. Dosud bylo identifikováno 17 různých kalysteginů. Ve 3 čeledích, a to svlačcovitých (Covulvoceae), lilkovitých (Solanaceae) a morušovníkovitých (Moraceae). Z běţně konzumovaných plodin se vyskytují v bramborách, rajčatech, paprice a lilku vejcoplodém. 34

37 Obrázek 7: Struktura kalysteginů Majoritním zdrojem kalysteginů v evropské stravě jsou brambory. Celkový obsah kalysteginů v bramborách se pohybuje v rozmezí 1-10 mg/kg č.hm. Struktura kalysteginů je velmi podobná pyranózové struktuře hexóz (viz obrázek 7), a proto jsou velmi efektivními inhibitory glykosidáz, a to jak savčích tak lidských. Je pravděpodobné, ţe kalysteginy způsobují onemocnění, které je obdobné genetickým poruchám těchto enzymů (Andersson, 2002). 35

38 4 Materiál, podmínky pokusů a metody stanovení 4.1 Materiál Hlízy brambor byly dodány katedrou rostlinné výroby ČZU v Praze. Zdrojem sadby byl dovoz ze zahraničí a genobanka při VÚBHB. Na jednotlivé analýzy bylo odebráno vţdy 5 hlíz pro zajištění reprezentativnosti odběru. Pouţité hlízy byly vyrovnané velikosti, nepoškozené a na počátku pokusů nezelené. Charakteristika jednotlivých odrůd pouţitých v této práci je uvedena v tabulce VII a v následujícím textu. Tabulka VII: Charakteristika použitých odrůd brambor Odrůda Barva dužniny Varný typ 1) Vegetační doba Užitkový směr Karin ţlutá BA raná odrůda konzumní Rosara tmavě ţlutá BA velmi raná odrůda konzumní Ditta ţlutá AB poloraná odrůda konzumní Dali ţlutá BA raná odrůda konzumní Impala ţlutá B velmi raná odrůda konzumní Adéla ţlutá B raná odrůda konzumní Agria ţlutá B Saturna ţlutá B Valfi fialová, mramorovaná BC poloraná aţ polopozdní odrůda polopozdní aţ poloraná odrůda poloraná aţ polopozdní odrůda hranolky, suché výrobky lupínky, škrob barevné kaše, výrobky z brambor Russet Burbank bílá - pozdní odrůda výroba hranolek Mayan Gold tmavě ţlutá - pozdní odrůda - Lady Balfour bílá - pozdní odrůda - 36

39 Odrůda Barva dužniny Varný typ 1) Vegetační doba Užitkový směr Vitelotte tmavě fialová BA, B, BC pozdní odrůda - Violette tmavě fialová BC polopozdní odrůda - Blaue Elise fialová Blue Congo fialová, mramorovaná C, CD poloraná aţ polopozdní odrůda - Blaue St.Galler fialová B, BC poloraná odrůda - Shetland Black Highland Burgundy Red fialová, mramorovaná BC, C polopozdní aţ pozdní odrůda červená BC poloraná odrůda výroba lupínků - Rosalinde červená Herbie 26 červená Rote Emma červená Salad Blue fialová, mramorovaná BC, C poloraná odrůda - 1) Varný typ uvedený u barevných brambor (kromě odrůdy Valfi) byl stanoven na základě polního pokusu a senzorického hodnocení v roce 2008 katedrou rostlinné výroby ČZU ve spolupráci s VÚBHB. Uvedené ţlutomasé odrůdy (kromě odrůdy Mayan Gold) jsou registrované v ČR. Odrůda Russet Burbank je registrovaná a rozšířená v USA. Její hlavní pouţití je jako surovina pro výrobu hranolek v řetězcích rychlého občerstvení. Odrůda Lady Balfour je registrovaná ve Velké Británii. Mayan Gold je odrůda se speciální chutí a intenzivně ţlutou duţninou vyšlechtěná ve Skotsku z materiálů introdukovaných v nedávné době z Peru Solanum phureja). Odrůda Mayan Gold je registrovaná ve Velké Británii. Z barevných odrůd je v ČR registrovaná pouze odrůda Valfi. Ostatní odrůdy jsou registrované v jiných státech nebo nejsou registrované vůbec a jedná se pouze o krajové speciality. U většiny zatím nejsou k dispozici údaje o jejich charakteristice. 37

40 V Německu probíhají v současnosti zkoušky na registraci odrůd Rote Emma, Rosalinde a Blaue Elise. Po registraci budou tyto odrůdy vedeny pod názvy Rote Emmalie, Rosemarie a Violetta. Odrůda Blue Congo je registrovaná ve Finsku. Odrůda Blaue St. Galler je registrovaná ve Švýcarsku. Ve Francii je registrována odrůda Vitelotte, která nahradila odrůdu Violette, která byla ve Francii registrovaná dříve a nyní je z registru vyřazená. Z testovaných odrůd, které zatím registrované nejsou, byly pro pokus pouţity: Highland Burgundy Red, Salad Blue, Herbie 26 a Shetland Black. 4.2 Charakteristika lokalit pěstování V roce 2008 byly brambory současně pěstovány dle zásad běţné agrotechniky ve 4 různých lokalitách ČR s rozdílnou nadmořskou výškou Přerov nad Labem (178 m.n.m.), Suchdol (286 m.n.m.), Valečov (460 m.n.m.) a Stachy (860 m.n.m.). V letech byly brambory současně pěstovány dle zásad běţné agrotechniky ve 2 různých bramborářských lokalitách ČR s rozdílnými půdně klimatickými podmínkami - Valečov a Přerov nad Labem. Valečov typická produkční bramborářská oblast (460 m.n.m.) Přerov nad Labem ranobramborářská oblast v Polabské níţině (178 m.n.m.) 4.3 Podmínky pokusů Byl sledován vliv kontinuálního osvětlování na obsah glykoalkaloidů, chlorofylů a karotenoidů, dále vliv dlouhodobého skladování na obsah glykoalkaloidů a vliv kulinárních úprav na obsah vitaminu C a glykoalkloidů. Dále byla studována kvalita barevných odrůd brambor vypěstovaných v různých lokalitách v ČR Osvětlování Pokus byl třikrát opakován vţdy s dvěma odrůdami brambor (z kapacitních důvodů pouţitého zařízení klimabox MLR-351H (Sanyo, Japonsko)). Byly pouţity dvojice odrůd: Karin a Rosara; Ditta a Dali; Karin a Impala. Pokusy byly provedeny v září 2007; červenci 2008 a září

41 Hlízy brambor byly vystaveny kontinuálnímu osvětlení o intenzitě µmol/m 2 /s (viz obrázek 8, byly pouţity 3 zářivky, v grafu označení LS3), pro kontrolu byly uchovávány další hlízy v temnu za stejných podmínek. Hlízy brambory byly umístěny na rošt v jedné vrstvě a nebyly během pokusu obraceny, na jedno stanovení bylo odebráno vţdy 5 hlíz. Pokusy probíhaly po dobu 1 měsíce, kromě intenzity osvětlení byla zaznamenána teplota (20 ºC) a vlhkost (23 %) (Klimalogger TFA, Německo). Hlízy brambor byly odebírány 0., 2., 8., 14., 22. a 29. den. Byla stanovena také sušina vzorků, ta se ale v průběhu pokusu významně neměnila, a proto byly výsledky vztaţeny na čerstvou hmotu. Obrázek 8: Charakteristika fluorescenčních zářivek typu FL40SS-W/37 (intenzivní spektrální linie 438, 548, 580 nm) V odrůdách Karin a Rosara byl v září 2007 sledován obsah glykoalkaloidů a chlorofylů, v odrůdách Ditta, Dali (červenec 2008), Karin a Impala (září 2008) byl kromě předchozích parametrů stanoven také obsah luteinu (majoritní zástupce karotenoidů) Dlouhodobé skladování Byl sledován vliv dlouhodobého skladování na obsah glykoalkaloidů brambor. Stanoveny byly obsahy α-solaninu, α-chaconinu a sušina. Odrůdy Adéla a Dali (vhodné k dlouhodobému uskladnění) byly skladovány od října 2008 do května 2009 v chladicím boxu při přibliţně 7,5 C, relativní vlhkost vzduchu se pohybovala mezi % (Klimalogger TFA, Německo). Brambory byly odebírány vţdy na 39

42 konci měsíce (s výjimkou měsíce prosince, kdy byl odběr vynechán) a ihned analyzovány. Na jednu analýzu bylo odebíráno vţdy 5 hlíz. Odrůda Adéla měla jiţ na konci března vyvinuté klíčky, odrůda Dali aţ o měsíc později Kvalita barevných odrůd brambor Rok 2008 V roce 2008 bylo analyzováno 12 odrůd brambor, 4 běţné ţluté odrůdy (Ditta, Karin, Impala a Saturna) a 8 barevných odrůd (Salad Blue, Shetland Black, Blue Congo, Blue St. Galler, Highland Burgundy Red, Violette, Valfi, Vitelotte). Brambory byly současně pěstovány dle zásad beţné agrotechniky ve 4 různých bramborářských lokalitách České republiky s rozdílnou nadmořskou výškou (Suchdol, Stachy, Přerov nad Labem a Valečov). Ve vzorcích byla stanovena antioxidační aktivita, obsah vitaminu C, chlorogenové kyseliny a v barevných odrůdách celkový obsah anthokyanů Rok V dalších letech bylo analyzováno 14 odrůd brambor. K 10 barevným odrůdám (Highland B. Red, Rosalinde, Rote Emma, Herbie 26, Blaue Elise, Blaue St. Galler, Valfi, Vittelote, Violette, Blue congo) byly vybrány k porovnání 2 ţluté odrůdy (Mayan gold a Agria) a 2 bělomasé odrůdy (Russet Burbank a Lady Balfour). Tato kontrolní skupina brambor bude v následujícím textu pro jednoduchost označena jako ţlutomasé odrůdy brambor (s vědomím, ţe odrůdy Lady Balfour a Russet Burbank mají díky nízkému obsahu karotenoidů duţninu bílou). Obrázky jednotlivých odrůd pouţitých v tomto pokusu jsou uvedeny v příloze 3. Brambory byly současně pěstovány dle zásad běţné agrotechniky ve 2 různých bramborářských lokalitách České republiky s rozdílnými půdně klimatickými podmínkami - Valečov a Přerov nad Labem. Rok 2009 byl teplejší a s niţším úhrnem sráţek v porovnání s rokem Údaje o průměrné roční teplotě a průměrném úhrnu sráţek v jednotlivých letech jsou uvedeny v následující tabulce. 40

43 Tabulka VIII: Průměrná roční teplota a úhrn srážek (zdroj ČHMÚ) Oblast Teplota ( C) Úhrn srážek (mm) ČR 8,4 7, Středočeský kraj (Přerov/Labem) 9,1 7, Vysočina (Valečov) 8,0 6, Ve vzorcích byla stanovena antioxidační aktivita, obsah vitaminu C, glykoalkaloidů, chlorogenové kyseliny a v barevných odrůdách celkový obsah anthokyanů a zastoupení jednotlivých anthokyanidinů Kulinární úpravy V roce 2008 byly testovány 2 ţluté odrůdy (Ditta a Saturna) a 3 barevné odrůdy (Violette, Valfi a Highland Burgundy Red) vypěstované v lokalitě Stachy za účelem zhodnocení vlivu 3 různých kulinárních úprav na obsah vitaminu C. Pokus byl opakován v roce 2010 s dalšími odrůdami brambor (barevné - Valfi, Highland Burgundy Red, Vitelotte a ţlutomasá Agria z lokality Valečov a barevnými odrůdami Valfi, Rotte Emma, Blaue St. Galler a ţlutomasou odrůdou Agria a bělomasou odrůdou Russet Burbank z lokality Přerov nad Labem). Současně s vitaminem C byl sledován i obsah glykoalkaloidů. Pouţité kulinární úpravy v obou letech jsou uvedeny v následující tabulce IX. 41

44 Tabulka IX: Podmínky kulinárních úprav Kulinární úprava Podmínky úpravy Vaření celé loupané, 15 min Pečení Mikrovlnný ohřev krájené (2 cm 2 cm) neloupané brambory, 45 min, 180 ºC krájené (2 cm 2 cm) neloupané brambory, 10 min, 750 W Pro srovnání byly analyzovány syrové neloupané brambory. 4.4 Použité přístroje a chemikálie Přístroje a vybavení chromatografický systém pro HPLC/DAD, Ultimate 3000 (Dionex, USA) - vysokotlaká kvartérní pumpa Ultimate autosampler Ultimate DAD detektor Ultimate termostat kolon Ultimate 3000 chromatografický systém pro HPLC/MS/MS, Ultimate 3000 RS (Dionex, USA) - vysokotlaká binární pumpa Ultimate 3000RS - autosampler Ultimate 3000 RS - termostat kolon Ultimate 3000 RS - hmotnostní detektor Qtrap 3200 (AB Sciex, USA) - generátor dusíku NM20Z-80Z (Peak Scientific, USA) - kompresor OFI BD3(Jun-Air, USA) spektrofotometr Heλios γ, (Spectronic Unicam, Anglie) váhy s přesností na 3 a 4 desetinná místa (Kern&Sohn GmbH, Německo) 42

45 míchačka magnetická IKA RET control-visc C, (ILABO, Česká republika) lyofilizátor LYOVAC GT2 (Gmbh, Německo) ultrazvuková lázeň Ultrasonic Compact Cleaner (Notus-Powersonic, Slovensko) rotační vakuová odparka BÜCHI Rotavapor, (BÜCHI Laboraltechnik AG, Švýcarsko) systém na filtraci mobilní fáze s filtry pro filtraci vodných roztoků (0,22 m) (Sigma- Aldrich, USA) přístroj na přípravu redestilované vody GFL 2104 (GFL, Německo) přístroj na přípravu deionizované vody (Millipore, Francie) klimabox MLR-351H (Sanyo, Japonsko) klima Logger (TFA, Německo) centrifuga MPW-56 (MPW Med. instruments, Polsko) laboratorní sušárna Binder FD 53 (GmbH, Německo) ph-metr SHOTT (Camlab, Anglie) ruční mixér Braun MR 6550 MCA (Braun, Německo) mikrovlnná trouba Easytronic (Whirpool, Švédsko) elektronické stopky TimerClock (Gmbh, Německo) kuchyňská lednice s mrazicím boxem (Gorenje, Slovinsko) membránový filtr PVDF (0,45 µm) (SISw, ČR) membránový skleněný filtr (0,45 µm) (Whatman, USA) stříkačky Hamilton plynotěsné 100 µl, 500 µl a 1000 µl (Chromservis, ČR) filtrační papír Filtrak (č. 388), Spezielpapier Filtrak (GmbH, Německo) jednorázové plastové kyvety 1,5 ml, Plastibrand (Gmbh, Německo) běţné laboratorní sklo Chemikálie methanol, supergradient min. 99,9 % (Lachner, Česká republika) 43

46 acetonitril HPLC gradient grade, (Lachner, Česká republika) tetrahydrofuran min. 99 %(J.T. Baker, Holandsko) deionizovaná voda (Milipore, Francie) redestilovaná voda (GFL, Německo) methanol, p.a. min. 99,5 % (Lachner, Česká republika) aceton, p.a. min. 99,5 %(Lachner, Česká republika) etylenglykol, p.a. max. 99,5 % (Lachner, Česká republika) octan amonný 99,999 % (Sigma-Aldrich, USA) kyselina mravenčí 99+% (Acros Organics, USA) kyselina chlorovodíková, p.a. 37 % (Chemapol, Česká republika) kyselina citronová monohydrát, p.a. min. 99,5 % (Sigma-Aldrich, USA) hydrogenfosforečnan disodný, dodekahydrát, p.a. min. 98 % (Lachner, Česká republika) kyselina metafosforečná, p.a. (Penta, Česká republika) kyselina sírová, p.a. min. 96 % (Chemapol, Česká republika) oxid manganičitý 90 % (Lachner, Česká republika) dihydrogenfosforečnan draselný, p.a. min 99 % (Lachema, Brno) Standardy α-solanin (Sigma-Aldrich, USA čistota > 95 %) α-chaconin (Sigma-Aldrich, USA čistota > 95 %) kyselina chlorogenová (Sigma-Aldrich, USA, čistota > 95 %) kyselina L-askorbová (Sigma-Aldrich, USA čistota > 99 %) lutein (Sigma-Aldrich, USA čistota > 90 %) pelargonidin chlorid (ChromaDex, USA, čistota 98,5 %) petunidin chlorid (ChromaDex, USA, čistota 98,3 %) 44

47 malvidin chlorid (ChromaDex, USA, čistota 93,2 %) cyanidin chlorid (ChromaDex, USA, čistota 98,0 %) peonidin chlorid (ChromaDex, USA, čistota 98,5 %) delfinidin chlorid (ChromaDex, USA čistota 97,6 %) ABTS (Sigma-Aldrich, USA, čistota > 99 %) 4.5 Metody stanovení Stanovení obsahu α-solaninu a α-chaconinu metodou HPLC-ESI- MS/MS Cca. 15 g homogenizovaného vzorku bylo extrahováno 60 ml methanolu pomocí ručního mixéru po dobu jedné minuty. Poté byl vzorek zfiltrován a doplněn methanolem do 100ml odměrné baňky. Alikvot byl převeden pomocí 0,45µm PVDF mikrofiltru do vialky a podroben HPLC-ESI-MS/MS analýze. Podmínky stanovení Analytická kolona: Pinnacle DB C18 ( mm; 1.9 μm) (RESTEK, USA) Mobilní fáze: ACN : MeOH : voda : 0,1M octan amonný (200:100:550:50) (v/v/v/v/v), ph=3,5 (mravenčí kyselina), izokratická eluce Průtok: 0,4 ml/min Nástřik: 1 µl Teplota kolony: 40 ºC Doba analýzy: 10 min Detekce: ESI-MS/MS 45

48 Q1 hmota [Da] Q3 hmota [Da] čas [ms] DP [V] EP [V] CEP [V] CE [V] CXP [V] Tabulka X: Podmínky ve zdroji Ochranný plyn Kolizní plyn Napětí zdroje 30 psi střední 5500 V Teplota 650 C Zmlţovací plyn Turboplyn 60 psi 60 psi Tabulka XI: Parametry metody pro stanovení glykoalkaloidů MRM pozitivní iontový mód analyt přechod kvantifikační 852,64 98, , α-chaconin konfirmační 852,64 380, , kvantifikační 868,62 98, , α-solanin konfirmační 868,62 398, , DP deklasterační potenciál; EP vstupní potenciál; CEP vstupní potenciál do cely; CE energie; CXP výstupní potenciál z cely - kolizní 46

49 Identifikace a kvantifikace Identifikace analytů ve vzorcích byla provedena porovnáním kvantifikačního a konfirmačního přechodu a retenčního času vzorků a retenčních časů standardů. Výsledky byly vyhodnoceny metodou kalibrační přímky. Rozsah kalibrační přímky byl 0,05 5 µg/ml pro α- chaconin i α-solanin Stanovení celkového obsahu anthokyanů Byla pouţita mírně modifikovaná metoda podle Lapornika et al., (2005), zaloţená na závislosti absorbance anthokyanů na ph roztoku. 50 g brambor bylo homogenizováno se 100 ml 70% methanolu po dobu jedné minuty. Poté byla směs ponechána přes noc (14-16 hodin) v lednici při 4 C. Následně byla směs zfiltrována a 1 ml extraktu byl přidán k 10 ml 2% HCl (ph 0,8), resp. k 10 ml citrátového pufru (ph 3,5), který byl připraven z 0,2M Na 2 HPO 4 a 0,1M citronové kyseliny. Oba roztoky byly pečlivě promíchány a byla změřena jejich absorbance při 520 nm oproti slepému pokusu (70% methanol). Celkový obsah anthokyanů (v mg/l) byl vypočítán podle rovnice: OA ( 2 A1 A ) f f 396,598 kde OA je celkový obsah anthokyaknů, A 1 je absorbance vzorku v 2% HCl a A 2 v citrátovém pufru Stanovení vitaminu C Cca. 15 g nakrájených brambor bylo ihned po rozkrájení přelito 60 ml 3% HPO 3 a extrahováno pomocí ručního mixéru po dobu jedné minuty. Poté byl vzorek zfiltrován a doplněn kyselinou do 100 ml odměrné baňky. Alikvot byl převeden pomocí 0,45µm PVDF mikrofiltru do vialky a podroben HPLC/DAD analýze. Podmínky stanovení Analytická kolona: ACE 5 C18 (250 4,6 mm) (HICHROM, UK) Mobilní fáze: 2,5 mm kyselina sírová, izokratická eluce Průtok: 1 ml/min Nástřik: 10 µl Teplota kolony: 30 ºC 47

50 Doba analýzy: 10 min Detekce: DAD (λ = 251 nm) Identifikace a kvantifikace Identifikace analytu ve vzorcích byla provedena porovnáním retenčního času vzorků s retenčním časem standardu. Výsledky byly vyhodnoceny metodou kalibrační přímky. Rozsah kalibrační přímky byl 5-75 µg/ml Stanovení chlorogenové kyseliny Cca. 15 g homogenizovaného vzorku bylo extrahováno 60 ml methanolu pomocí ručního mixéru po dobu jedné minuty. Poté byl vzorek zfiltrován a doplněn methanolem do 100ml odměrné baňky. Alikvot byl 10krát naředěn deionizovanou vodou, poté převeden přes 0,45µm PVDF mikrofiltr do vialky a podroben HPLC/DAD analýze. Podmínky stanovení Analytická kolona: ZORBAX Extend-C18 (3,0 250 mm, 5 µm) (Agilent,USA) Mobilní fáze: 0,1% HCOOH ve vodě (A) : MeOH (B) (90:10, v/v), lineární gradientová eluce 0 12 min A: 90 0 % min A: 0% min A: 0 90 % Průtok: 0,5 ml/min Nástřik: 10 µl Teplota kolony: 40 ºC Doba analýzy: 22 min Detekce: DAD (λ = 324 nm) Identifikace a kvantifikace Identifikace analytu ve vzorcích byla provedena porovnáním retenčního času vzorků s retenčním časem standardu. Výsledky byly vyhodnoceny metodou kalibrační přímky. Rozsah kalibrační přímky byl 0,5-75 µg/ml. 48

51 4.5.5 Stanovení antioxidační aktivity Antioxidační aktivita byla stanovena spektrofotometrickou metodou zaloţenou na reakci antioxidačně aktivních látek s volným radikálem ABTS (2,2 - azino-bis(3- ethylbenzthiazolin-6-sulfonan)diamonný). Byla měřěna změna absorbance radikálu po přidání 100 µl vzorku (nebo standardu) k 1 ml roztoku radikálu při vlnové délce 734 nm po uplynutí jedné minuty. Výsledky byly vyhodnoceny metodou kalibrační křivky a vyjádřeny jako ekvivalent vitaminu C. Kalibrační křivka byla vytvořena z roztoků standardu vitaminu C o koncentracích 0; 5; 10; 15; 25 a 35 µg/ml. Přístroj byl na začátku kaţdé analýzy vynulován na destilovanou vodu a radikál byl naředěn tak, aby jeho výchozí absorbance byla přesně 0,800 ± 0,01. Příprava vzorku Přefiltrovaná šťáva z nastrouhaných brambor byla naředěna redestilovanou vodou (fialové odrůdy 40krát, ţlutomasé 10krát) a ihned podrobena reakci s radikálem. Příprava radikálu Bylo naváţeno přibliţně 54.8 mg radikálu ABTS a 1g MnO 2 do kádinky. Směs byla zalita 20 ml redestilované vody a 20 minut míchána magnetickým míchadlem. Poté byla pomocí 0,45µm membránového filtru zfiltrována do kádinky a ředěna fosfátovým pufrem o ph = 7,4 na A 734 = 0,8 (±0,01) Stanovení luteinu Cca. 15 g nakrájených brambor bylo lyofilizováno. Lyofilizované brambory byly rozetřeny v kádince na jemný prášek, zality cca. 10 ml acetonu, pečlivě přikryty alobalem a nechány 4 dny v lednici při 4 C. Poté byly karotenoidy extrahovány 20 minut v ultrazvukové lázni. Následně byl extrakt zfiltrován pomocí frity a doplněn acetonem do 25ml odměrné baňky. Alikvot byl převeden pomocí 0,45µm PVDF filtru do vialky a podroben HPLC/DAD analýze. Podmínky stanovení Analytická kolona: Varian OmniSpher C ,6 mm (5µm) (Varian, USA) Mobilní fáze: MeOH : ACN : THF 56:40:4 (v/v/v), izokratická eluce Průtok: 1,5 ml/min Nástřik: 10 µl 49

52 Teplota kolony: 25 ºC Detekce: DAD (λ = 444 nm) Identifikace a kvantifikace Identifikace analytu ve vzorcích byla provedena porovnáním retenčního času vzorků s retenčním časem standardu. Výsledky byly vyhodnoceny metodou kalibrační přímky. Rozsah kalibrační přímky byl 0,1-5 µg/ml Stanovení jednotlivých anthokyanidinů Do 10 ml zkumavky byl naváţen 1 g homogenizovaného lyofilizovaného vzorku, který byl opakovaně extrahován 10 minut v ultrazvukové lázni vţdy s 10 ml 80% MeOH. Extrakty byly 5 minut odstředěny a slity přes kousek vaty do 100ml odpařovací baňky a následně odpařeny na rotační vakuové odparce do sucha při 65 C. K odparku bylo následně přidáno 15 ml 3M HCl a směs byla 1 hodinu při 100 C hydrolyzována v etylenglykolové (popř. glycerinové) lázni. Následně byla kyselina odpařena (65 C) na rotační vakuové odparce. K odparku bylo přidáno 25 ml 0,1% mravenčí kyseliny v 50% MeOH. Alikvot byl převeden přes skleněný mikrofiltr (0,45 µm) do vialky a podroben HPLC/DAD analýze. Podmínky stanovení Analytická předkolona a kolona: Security Guard cartridges C8 (4 2mm); Luna3u C8(2) 100A, (150 3mm) (Phenomenex, USA) Mobilní fáze: 0,1% HCOOH ve vodě (A) : ACN (B) (99:1, v/v), lineární gradientová eluce 0 2 min A: 99 % 2 7 min A: % 7 20 min A: % min A: % min A: 99 % Průtok: 0,6 ml/min Nástřik: 10 µl Teplota kolony: 30 ºC 50

53 Doba analýzy: 27 min Detekce: DAD (pelargonidin λ = 510 nm; ostatní anthokyanidiny λ = 530 nm) Identifikace a kvantifikace Identifikace analytu ve vzorcích byla provedena porovnáním retenčního času vzorků s retenčním časem standardu. Výsledky byly vyhodnoceny metodou kalibrační přímky. Rozsah kalibračních přímek byl přibliţně 0,1-50 µg/ml Stanovení obsahu chlorofylů Příprava vzorku pro stanovení obsahu chlorofylů je shodná s extrakcí luteinu. Acetonový extrakt byl proměřen při vlnových délkách 645 a 662 nm a obsah chlorofylu a a b v µg/ml byl vypočítán podle následujících empirických rovnic (Harmut et al., 1983): C C a b 11.75A 18.61A A 3.96A Kde A 645 a A 662 jsou absorbance při daných vlnových délkách a C a a C b koncentrace chlorofylu a resp. b. Výsledek byl vyjádřen jako suma chlorofylů a a b Stanovení sušiny Přibliţně 30 g homogenizovaného vzorku bylo sušeno při teplotě 105 ºC do konstantní hmotnosti (cca. 24 hodin). 51

54 5 Výsledky a diskuse 5.1 Vliv kontinuálního osvětlení na obsah glykoalkaloidů, chlorofylů a karotenoidů Výsledky v této kapitole jsou vyjádřeny jako mnoţství mg sledované látky (nebo mg sumy látek pro -chaconin + -solanin, resp. chlorofyl a + chlorofyl b) v čerstvé hmotě celých neloupaných brambor. Byla sledována i sušina vzorků, ta se však během ţádného z pokusů významně neměnila (pohybovala se okolo 20 %), a proto jsou výsledky vztaţeny na čerstvou hmotu. V grafech příslušných vzorků, kde byl překročen hygienický limit obsahu glykoalkaloidlů 200 mg/kg č.hm., je tento limit zvýrazněn červenou čarou. Ve všech vzorcích byl okem porozovatelný nárůst obsahu chlorofylu během pokusu. Během prvního pokusu v září 2007 došlo k nárůstu glykoalkaloidů (α solaninu a α chaconinu) i chlorofylů a a b v obou odrůdách brambor (Karin a Rosara) (viz obrázky 9-11). Obrázek 9: Kontinuální osvětlení - změny v obsahu glykoalkaloidů, odrůda Rosara 52

55 Obrázek 10: Kontinuální osvětlení - změny v obsahu glykoalkaloidů, odrůda Karin Obrázek 11: Kontinuální osvětlení - změny v obsahu chlorofylů, odrůdy Karin a Rosara 53

56 Nárůst obsahu glykoalkaloidů byl mnohem výraznější v případě odrůdy Karin, a to z původní hodnoty 148 mg/kg aţ na hodnotu 268 mg/kg, coţ představuje nárůst o 82 %. Překročení hygienického limit 200 mg/kg glykoalkaloidů v celých neloupaných bramborách bylo zjištěno jiţ při odběru ve 14. dni skladování. Obsah činil 222 mg/kg. V hlízách skladovaných ve tmě za stejných podmínek se obsah glykoalkaloidů významně nelišil a pohyboval se okolo 140 mg/kg. Poměr α chaconin / α solanin se během pokusu významně nezměnil a pohyboval se okolo hodnoty 3,1 v bramborách skladovaných na světle i v temnu. Obsah chlorofylů v odrůdě Karin se zvýšil vlivem osvětlení z původní hodnoty 1 mg/kg na hodnotu 11 mg/kg. Nebyla zjištěna změna poměru chlorofylů a a b v průběhu pokusu. Nárůst obsahu glykoalkaloidů v odrůdě Rosara vlivem osvětlení nebyl tak výrazný. Z původní hodnoty 79 mg/kg vzrostl během měsíce skladování na světle na hodnotu 107 mg/kg, coţ odpovídá nárůstu o 35 %. Při skladování v temnu za stejných podmínek nedošlo k nárůstu obsahu glykoalkaloidů, obsah se pohyboval okolo 74 mg/kg. Podobně jako v předešlé odrůdě nebyla zjištěna změna poměru majoritních glykoalkaloidů. Pohybovala se okolo hodnoty 2,5 (α chaconin / α solanin). Na začátku pokusu nebyly chlorofyly detekovány, jejich obsah narostl v průběhu pokusu aţ na hodnotu 6 mg/kg při skladování na světle. Také v tomto případě se poměr chlorofylů a a b nezměnil. V opakovaném pokusu v červenci 2008 s odrůdami Ditta a Dali nedošlo k ţádnému nárůstu obsahu glykoalkaloidů během skladování v temnu i na světle, naproti tomu se výrazně zvýšil obsah chlorofylů, a to více v odrůdě Dali neţ Ditta (11 mg/kg č.hm. vs. 6 mg/kg č.hm. na konci pokusu). Výsledky jsou uvedeny v následujících obrázcích. 54

57 Obrázek 12: Kontinuální osvětlení - změny v obsahu glykoalkaloidů, odrůda Ditta Obrázek 13: Kontinuální osvětlení - změny v obsahu glykoalkaloidů, odrůda Dali 55

58 Ditta a Dali patří k odrůdám s niţším přirozeným obsahem glykoalkaloidů a během pokusu byl obsah stále hluboko pod hygienickým limitem. V odrůdě Ditta byl obsah sumy glykoalkaloidů skladovaných na světle průměrně 58 mg/kg č.hm. a v temnu 57 mg/kg č.hm.. V bramborách odrůdy Dali byl ve vzorcích skladovaných na světle průměrný obsah 53 mg/kg č.hm. a v temnu 52 mg/kg č.hm.. Poměr majoritních glykoalkaloidů - chaconin/ - solanin se v ţádné z odrůd během pokusu neměnil, a to ani na světle ani v temnu. V odrůdě Ditta byl poměr - chaconin / - solanin 1,8 a v odrůdě Dali 2,4. Obrázek 14: Kontinuální osvětlení - změny v obsahu chlorofylů, odrůdy Ditta a Dali V opakovaném pokusu v září 2008 byla sledována odrůda Impala a opět odrůda Karin. V obou odrůdách došlo k postupnému výraznému nárůstu jak obsahu glykoalkaloidů, tak obsahu chlorofylů (viz obrázky 15-17). 56

59 Obrázek 15: Kontinuální osvětlení - změny v obsahu glykoalkaloidů, odrůda Karin Obrázek 16: Kontinuální osvětlení - změny v obsahu glykoalkaloidů, odrůda Impala 57

60 V obou odrůdách došlo k překročení hranice hygienického limitu, v odrůdě Impala byl zjištěn obsah glykoalkaloidů ve 14. dni skladování 341 mg/kg č.hm. a v odrůdě Karin jiţ v 8. skladovacím dni 348 mg/kg č.hm.. Na konci pokusu byl zjištěn obsah glykoalkaloidů v odrůdě Karin ve vzorcích skladovaných na světle dokonce 715 mg/kg č.hm., coţ představuje nárůst o 286 % oproti výchozí hodnotě, a tedy více neţ trojnásobné překročení hygienického limitu. Odrůda Karin je typická vysokým přirozeným obsahem glykoalkaloidů. Na začátku pokusu byl zjištěn obsah 185 mg/kg č.hm., coţ je těsně pod hygienickým limitem. Během skladování v temnu obsah glykoalkaloidů kolem této hodnoty kolísal a jednou byl dokonce stanoven obsah vyšší neţ hygienický limit, a to 220 mg/kg č.hm. ve 14. skladovacím dni. Průměrný poměr α - chaconin / α - solanin se lišil ve vzorcích skladovaných na světle (1,9) a ve tmě (2,7). Lze tedy říci, ţe vlivem osvětlení došlo k většímu nárůstu obsahu solaninu oproti chaconinu. V odrůdě Impala byl počáteční obsah glykoalkaloidů 70 mg/kg č.hm. a ve vzorcích uchovaných v temnu nedošlo k překročení limitu. Přesto v nich obsah glykoalkaloidů během pokusu narůstal, ale ne tak výrazně jako při skladování na světle (konec pokusu na světle ~ 517 mg/kg č.hm. a v temnu ~ 175 mg/kg č.hm.). Obsah glykoalkaloidů ve vzorcích skladovaných na světle byl zjištěn o 639 % vyšší neţ byl stanoven počáteční obsah. Také průměrný poměr α - chaconin / α - solanin se lišil ve vzorcích skladovaných na světle (1,4) a ve tmě (2,2). I v této odrůdě byl ve větší míře syntetizován alkaloid α - solanin. Vyšší nárůst α-solaninu oproti α-chaconinu vlivem 15-denního osvětlování uvádí téţ Percival (1999). 58

61 Obrázek 17: Kontinuální osvětlení - změny v obsahu chlorofylů, odrůdy Karin a Impala Nárůst obsahu chlorofylů byl výraznější v odrůdě Impala (na konci pokusu 17 mg/kg č.hm.), v odrůdě Karin narostl obsah glykoalkaloidů během měsíčního kontinuálního osvětlení na hodnotu 7 mg/kg č.hm. 59

62 obsah glykoalkaloidů (mg/kg č.hm.) Karin Rosara Ditta Dali Karin 2 Impala Lineární (Impala) Lineární (Karin 2) Lineární (Ditta) Lineární (Dali) R 2 = 0.86 R 2 = 0.81 R 2 = R 2 = 0.51 R 2 = 0.13 R 2 = obsah chlorofylů (mg/kg č.hm.) Obrázek 18: Vztah mezi biosyntézou glykoalkaloidů a chlorofylů během kontinuálního osvětlování v různých odrůdách brambor Byla testována závislost mezi obsahem glykoalkaloidů a obsahem chlorofylů ve vzorcích skladovaných na světle (obrázek 18). Pro odrůdy Impala a Karin lze vzájemný vztah mezi analyty charakterizovat přímkou (koeficient determinace pro odrůdu Impala je 0,92 a pro odrůdu Karin 0,81 resp. 0,86). Pro odrůdu Rosara je závislost méně výrazná (R 2 = 0,51). Ţádný vzájemný vztah sledovaných analytů (neprobíhá biosyntéza glykoalkaloidů) nebyl zjištěn pro odrůdy Ditta (R 2 = 0,03) a Dali (R 2 = 0,13). Tato skutečnost souhlasí s výsledky uvedenými v literatuře, ţe míra syntézy glykoalkaloidů a chlorofylů je významně odrůdově závislá a ţe tyto 2 biochemické cesty jsou na sobě zřejmě nezávislé (viz kapitola ). Výsledky naznačují, ţe biosyntéza glykoalkaloidů vlivem osvětlení je vysoká v odrůdách, které mají vysoký přirozený obsah těchto látek. 60

63 V pokusech s odrůdami Dali, Ditta, Karin a Impala byly sledovány také karotenoidy. Bylo zjištěno, ţe vlivem osvětlení narůstá významně obsah těchto světlocitlivých pigmentů. Na chromatogramu (obrázek 19) jsou zaznamenány tři různí zástupci těchto látek. V laboratoři byl k dispozici pouze standard luteinu, a proto byl kvantifikován pouze tento analyt. Z literatury je známo, ţe lutein je jedním z majoritních karotenoidů brambor (Brown, 2005). Trend je však u všech tří karotenoidů stejný. Je známo, ţe extrahované karotenoidy vlivem osvětlení podléhají degradaci. Vystavením hlíz osvětlení však došlo k nárůstu jejich obsahu. Vysvětlením bude patrně stále účinný enzymatický aparát, který je po rozkrojení hlíz narušen. Obrázek 19: Chromatogram karotenoidů vzorku brambory (λ = 444 nm) Míra syntézy karotenoidů vlivem osvětlení byla také ovlivněna odrůdou. Ze studovaných odrůd byla pozorována nejvyšší syntetická aktivita v odrůdě Ditta, kde došlo k nárůstu obsahu luteinu o 354 % ( z původní hodnoty 0,72 mg/kg na hodnotu 3,28 mg/kg). K nejmenšímu nárůstu došlo v odrůdě Karin, během měsíčního pokusu o 156 % ( z původní hodnoty 0,44 mg/kg na hodnotu 1,12 mg/kg). V kontrolních vzorcích, které byly skladovány za stejných podmínek v temnu nebyl zjištěn nárůst obsahu luteinu v odrůdách Impala a Karin. Mírný nárůst (významně niţší neţ v osvětlovaných vzorcích) byl stanoven v odrůdě Dali ( v průběhu pokusu o 10 %) a v odrůdách Ditta (v průběhu pokusu o 75 %). Podrobnější výsledky jsou uvedeny v grafech 20 a

64 Obrázek 20: Kontinuální osvětlení - změny v obsahu luteinu (světlo) Obrázek 21: Kontinuální osvětlení - změny v obsahu luteinu (tma) 62

65 suma GA (mg/kg sušiny) 5.2 Vliv dlouhodobého skladování na obsah glykoalkaloidů Během 8 - měsíčního skladování se měnil obsah sušiny výrazněji pouze v odrůdě Dali, v které postupně během skladování narůstal. V odrůdě Adéla byl obsah sušiny během skladování téměř konstantní (viz tabulka XI). Tabulka XII: Obsah sušiny v % během dlouhodobého skladování říjen listopad prosinec leden únor březen duben květen Adéla 21,2 21,1-19,6 20,3 22,8 20,6 21,2 Dali 19,4 20,3-18,5 19,7 22,6 22,2 21,9 Výsledky porovnání obsahu glykoalkaloidů vyjádřené jako suma α-chaconinu a α- solaninu jsou v následujícím obrázku uvedeny v mg/kg sušiny. Z obrázku je patrné, ţe obsah sledovaných látek se během 8 - měsíčního pokusu výrazně neměnil a kolísal kolem počáteční hodnoty Adéla Dali říjen listopad prosinec leden únor březen duben květen Obrázek 22: Vliv dlouhodobého skladování na obsah celkových glykoalkaloidů V následujících tabulkách je uveden obsah α-solaninu, α-chaconinu a jejich poměr. Během pokusu kolísal nejen obsah celkových glykoalkaloidů, ale i jejich vzájemný poměr. 63

66 Výsledky jsou vyjádřeny v mg/kg č.hm.. Odrůdy Adéla i Dali obsahovaly na začátku pokusu (v říjnu 2008) nízké hodnoty obsahu glykoalkaloidů, Adéla 43 mg/kg č.hm a Dali 39 mg/kg č.hm. Během pokusu se obsah těchto látek pohyboval hluboko pod hygienickým limitem. Na konci pokusu (v květnu 2008) byl stanoven obsah glykoalkaloidů v odrůdě Adéla 52 mg/kg č.hm. a Dali 50 mg/kg č.hm.. Tabulka XIII: Vliv dlouhodobého skladování na obsah α-solaninu a α-chaconinu, odrůda Adéla měsíc solanin chaconin suma GA poměr ch/s mg/kg č.hm. - říjen listopad prosinec leden únor březen duben květen

67 Tabulka XIV: Vliv dlouhodobého skladování na obsah α-solaninu a α-chaconinu, odrůda Dali měsíc solanin chaconin suma GA poměr ch/s mg/kg č.hm. - říjen listopad prosinec leden únor březen duben květen Přestoţe v obou odrůdách byly na konci pokusu vyvinuty klíčky, byly hlízy v dobrém stavu, zdravé a vhodné ke kuchyňské úpravě. Na základě provedeného pokusu se zdá, ţe obsah sledovaných alkaloidů se během dlouhodobého uskladnění němění. V budoucnu je pokus třeba zopakovat. 5.3 Kvalita barevných odrůd brambor Rok 2008 Výsledky výzkumu věnovanému kvalitě barevných odrůd brambor z roku 2008 byly prezentovány ve formě posteru na mezinárodní konferenci. Chemical Reactions in Food VI a jsou publikovány ve speciálním čísle Czech Journal of Food Sciences věnovanému této konferenci. Text článku je uveden v příloze 1. Hlavní závěry publikované práce jsou následující (výsledky jsou vyjádřeny v mg/kg sušiny): : 65

68 Byl zjištěn mírně vyšší (přibliţně 1,4krát) obsah vitaminu C v ţlutomasých odrůdách v porovnání s barevnými odrůdami brambor. Obsah vitaminu C se ve všech vzorcích pohyboval v rozmezí mg/kg sušiny. Barevné brambory obsahovaly výrazně vyšší mnoţství chlorogenové kyseliny. Průměrný obsah chlorogenové kyseliny byl ve ţlutých odrůdách 533 mg/kg sušiny, zatímco v barevných 3487 mg/kg sušiny, coţ představuje 6,5krát vyšší obsah v barevných odrůdách. Obsah anthokyanů v barevných odrůdách koreloval s intenzitou barvy duţniny a pohyboval se v rozmezí mg/kg sušiny. Antioxidační aktivita barevných brambor (vyjádřená jako ekvivalent vitaminu C) byla průměrně 1862 mg/kg sušiny a ţlutomasých odrůd pouze 425 mg/kg sušiny, coţ představuje přibliţně 4,4krát vyšší antioxidační aktivitu barevných odrůd brambor. Obsah jednotlivých sledovaných analytů byl porovnán s celkovou antioxidační aktivitou. Nejlepší korelace byla zjištěna v případě celkových anthokyanů (R 2 = 0,64), vysoký koeficient determinace (R 2 = 0,55) vykazovala i závislost antioxidační aktivity na obsahu chlorogenové kyseliny. Závislost antioxidační aktivity na vitaminu C zjištěna nebyla (R 2 = 0,08). Byl zjištěn statisticky významný vliv lokality na obsah celkových anthokyanů, vitaminu C a antioxidační aktivitu. V souladu s literaturou (Burgos et al., 2009a) obsah vitaminu C negativně koreloval s nadmořskou výškou lokality. Nejvyšší průměrný obsah vitaminu C (925 mg/kg sušiny) byl zjištěn v lokalitě Přerov (178 m.n.m.) a nejniţší (583 mg/kg sušiny) v lokalitě Stachy (860 m.n.m.). Dále byl zjištěn nejvyšší průměrný obsah anthokyanů v bramborách vypěstovaných v nejvýše poloţené lokalitě Stachy (průměrně 1191 mg/kg sušiny) oproti nejníţe poloţené lokalitě Přerov (průměrně 693 mg/kg sušiny). Vyšší obsah anthokyanů v bramborách vypěstovaných ve vyšší nadmořské výšce stanovil ve shodě s prezentovanými výsledky Brown et al. (2008) a Ieri et al. (2011). Dále byl zjištěn vliv odrůdy na obsah celkových anthokyanů, obsah chlorogenové kyseliny a antioxidační aktivitu Rok V letech 2009 a 2010 byly pěstovány barevné i ţlutomasé odrůdy brambor ve dvou lokalitách v ČR. Zdrojem sadby byl dovoz ze zahraničí a genobanka při VÚBHB. 66

69 Pro přesné polní pokusy byla zvolena dvě stanoviště s rozdílnými půdně klimatickými podmínkami. 8) Přerov nad Labem v ranobramborářské oblasti v Polabské níţině, kde pokusy probíhaly na Státní odrůdové zkušebně ÚKZÚZ. 9) Valečov u Havlíčkova Brodu v typické produkční bramborářské oblasti, kde byly pokusy realizovány na pracovišti Výzkumného ústavu bramborářského. 10) Výsledky v kapitolách jsou uvedeny v mg/kg čerstvé hmoty Sušina vzorků Průměrná sušina jednotlivých odrůd se pohybovala v rozmezí 17,6-27,3 %. Výrazně nejvyšší sušinu měly odrůdy Violette (25,3 %) a Vitelotte (27,3 %), vysoký obsah sušiny měla i odrůda H. B. Red (23,3 %). Naopak nejniţší obsah byl zjištěn v odrůdách Lady Balfour (17,6 %) a Blaue Elise (19,2 %). Kromě odrůdové závislosti nebyla zjištěna průkazná závislost obsahu sušiny na lokalitě ani na ročníku pěstování Obsah glykoalkaloidů Obsah glykoalkaloidů (vyjádřeny jako suma majoritních glykoalkaloidů α-chaconinu a α-solaninu) se ve všech analyzovaných vzorcích pohyboval pod hygienickým limitem 200 mg/kg č.hm.. Výsledky jsou uvedeny v následujícím obrázku. Obsah glykoalkaloidů se v testovaných odrůdách pohyboval v rozmezí mg/kg č.hm.. V roce 2009 byl zjištěn vyšší obsah glykoalkaloidů ve všech odrůdách vypěstovaných v lokalitě Přerov v porovnání s lokalitou Valečov. V roce 2010 byl zjištěn vyšší obsah glykoalkaloidů ve většině odrůd vypěstovaných v lokalitě Přerov (kromě červených odrůd H.B. Red a Rosalinde a bělomasé odrůdy Lady Balfour). Z obrázku 23 je patrný vyšší obsah glykoalkaloidů v červených odrůdách Herbie (průměrně 87 mg/kg č.hm.), H.B. Red (průměrně 80 mg/kg č.hm.) a Rosalinde (88 mg/kg č.hm.). Naopak niţší obsah glykoalkaloidů byl zjištěn ve fialových odrůdách Blaue Elise (41 mg/kg č.hm.), Blaue St. Galler (32 mg/kg č.hm.), červené odrůdě Rotte Emma (34 mg/kg č.hm.) a bělomasé odrůdě Lady Balfour (40 mg/kg č.hm.). 67

70 Obrázek 23: Obsah glykoalkaloidů v odrůdách brambor Byl vyhodnocen poměr dvou majoritních glykoalkaloidů, α-chaconinu a α-solaninu. Výsledky jsou uvedeny v obrázku 24. Všechny odrůdy aţ na odrůdu Mayan Gold (Solanum phureja) obsahovaly více α-chaconinu neţ α-solaninu. Odrůda Mayan Gold naopak obsahovala vţdy více α-solaninu neţ α-chaconinu, coţ v kulturních odrůdách není obvyklé. V odrůdě Mayan Gold se poměr ch/s pohyboval závislosti na lokalitě a roku od 0,52 do 0,70. K podobnému výsledku došli i Distl a Wink (2009), kteří zjistili přibliţně 2krát vyšší obsah α- solaninu neţ α-chaconinu v hlízách blíţe nespecifikované odrůdy druhu Solanum phureja. Naopak výrazně více α-chaconinu neţ α-solaninu obsahovala odrůda Blaue Elise. Poměr těchto dvou alkaloidů se v ní pohyboval od 3,40 do 4,18. Mírně vyšší hodnota poměru ch/s byla dále zjištěna v odrůdách H.B.Red (průměrně 2,55) a Rosalinde (2,40). V ostatních jedenácti odrůdách se poměr ch/s pohyboval od 1,7 2,0. Poměr ch/s je obdobně jako v případě ţlutomasých odrůd závislý na odrůdě. Friedman a Levin (2009) uvádí, ţe α- 68

71 chaconin vykazuje vyšší míru toxicity v porovnání s α-solaninem. Z tohoto hlediska by byly ke konzumaci vhodnější odrůdy s co nejniţší hodnotou ch/s. Obrázek 24:majoritních glykoalkaloidů v jednotlivých odrůdách Celkový obsah anthokyanů Odrůdy se vzájemně mezi sebou výrazně lišily v obsahu celkových anthokyanů. Obsah se v jednotlivých vzorcích pohyboval v rozmezí mg/kg č.hm.. Zjištění odpovídá výsledkům Rodriguez-Saona et al. (1998), kteří zkoumali 33 odrůd červeně zbarvených odrůd a obsah celkových anthokyanů se v nich pohyboval v rozmezí mg/kg č.hm.. Také Brown et al. (2008) uvádí podobný rozsah obsahu celkových anthokyanů ve 13 sledovaných odrůdách ( mg/kg č.hm.). 69

72 Výrazně vyšší obsah anthokyanů v porovnání všech odrůd byl zjištěn ve dvou odrůdách brambor s tmavě fialovou duţninou Violette a Vitelotte. Odrůda Violette obsahovala v průměru let a stanovišť 515 mg/kg č.hm. a odrůda Vitelotte 405 mg/kg č.hm.. Následovaly odrůdy s fialovou duţninou Blaue Elise a Blaue St. Galler, 196 resp. 125 mg/kg č.hm.. Srovnatelný obsah anthokyanů byl zjištěn v červených odrůdách Herbie 26 (175 mg/kg č.hm.), H.B. Red (195 mg/kg č.hm.) a Rotte Emma (127 mg/kg č.hm.). Nejniţší obsahy pak byly stanoveny v mramorovaných fialových odrůdách Blue Congo (56,9 mg/kg č.hm.), Valfi (58,5 mg/kg č.hm.) a červené odrůdě Rosalinde (80,8 mg/kg č.hm.). Souhrnné výsledky jsou uvedeny na obrázku 25. Obrázek 25: Obsah celkových anthokyanů v odrůdách barevných brambor 70

73 Zastoupení jednotlivých anthokyanidinů V roce 2010 byly metodou kapalinové chromatografie se spektrofotometrickou detekcí stanoveny jednotlivé anthokyanidiny v barevných odrůdách brambor. Obdobně jako v případě celkového obsahu anthokyanů se odrůdy také lišily v kvalitativním zastoupení jednotlivých anthokyanidinů. Zastoupení jednotlivých anthokyanidinů bylo odrůdově závislé a nebylo ovlivněno lokalitou (viz tabulka XV). Tabulka XV: Procentuelní zastoupení jednotlivých anthokyanidinů ( všech = 100 %) Odrůda Barva dužniny delphinidin cyanidin petunidin pelargonidin peonidin malvidin V P V P V P V P V P V P H.B. Red červená Blaue Elise fialová Violette fialová Vitelotte fialová Blaue St. Galler fialová Herbie červená

74 Odrůda Barva dužniny delphinidin cyanidin petunidin pelargonidin peonidin malvidin V P V P V P V P V P V P Rosalinde červená Rote Emma červená Blue Congo fialová Valfi fialová V = Valečov; P = Přerov Nejvyšší počet různých anthokyanidinů byl zjištěn v odrůdě Blaue Elise, kde byly stanoveny všechny sledované anthokyanidiny kromě pelargonidinu. Následovaly odrůdy Blue Congo a Valfi, ve kterých byl stanoven delphinidin, petunidin, malvidin a v lokalitě Valečov i stopy peonidinu. Následovaly všechny další fialové odrůdy Violette, Vitelotte a Blaue St. Galler, ve kterých byl stanoven delphinidin, petunidin a malvidin. Všechny sledované červené odrůdy obsahovaly převáţně pelargonidin a dále menší mnoţství peonidinu. Z tabulky XV je dále patrná podobnost (shodnost) anthokyanového sloţení všech červených odrůd a dále dvou tmavých odrůd Violette a Vitelotte a tří odrůd s mramorovanou duţninou Valfi, Blue Congo a Blaue St. Galler. V následující tabulce XVI jsou uvedeny majoritní anthokyanidiny jednotlivých odrůd. Všechny testované červené odrůdy obsahovaly více neţ 95 % pelargonidinu a dalším zastoupeným anthokyanidinem byl pouze peonidin. To se shoduje s výsledky Rodriguez- 72

75 Saony et al. (1998), který v červených odrůdách brambor stanovil převáţně pelargonidin a stopy peonidinu. Ve dvou tmavých odrůdách Violette a Vitelotte byl majoritním anthokyanidinem malvidin (cca. 70 %). Tyto odrůdy obsahovali dále přibliţně 25 % petunidinu a < 1 % delfinidinu. Anthokyanidinové sloţení odrůdy Vitelotte studovali i Eichhorn a Winterhalter (2005) a Ieri et al. (2011) a stanovili také malvidin a petunidin jako majoritní anthokyanidiny. Ve všech dalších fialových odrůdách byl majoritním anthokyanidinem petunidin. Brown et al. (2003), také uvádí pelargonidin jako hlavní anthokyanidin v červených odrůdách a petunidin ve fialových odrůdách. Ve fialových dále stanovil peonidin, který byl ale v této práci stanoven v malém mnoţství ve všech červených odrůdách a z fialových pouze v odrůdě Blaue Elise. Tabulka XVI: Majoritní anthokyanidiny v barevných odrůdách brambor Odrůda Barva dužniny Majoritní anthokyanidin % zastoupení H. B. Red červená pelargonidin 96.7 Blaue Elise fialová petunidin 81.6 Violette fialová malvidin 73.8 Vitelotte fialová malvidin 70.4 Blaue St. Galler fialová petunidin 91.2 Herbie červená pelargonidin 97.8 Rosalinde červená pelargonidin 95.5 Rote Emma červená pelargonidin 97.1 Blue Congo fialová petunidin 89.0 Valfi fialová petunidin Obsah vitaminu C Obsah vitaminu C se v jednotlivých vzorcích pohyboval v rozmezí mg/kg č.hm.. Byl zjištěn mírně vyšší obsah vitaminu C v ţlutých odrůdách brambor v porovnání 73

76 s ostatními barevnými odrůdami. Obsah vitaminu C ve ţlutých odrůdách byl průměrně 214 mg/kg č.hm., zatímco v barevných 157 mg/kg č.hm., coţ je přibliţně 1,4krát více. To je ve shodě s jiţ publikovanými výsledky z předchozích let (Hejtmánková et.al., 2009). Červené odrůdy obsahovaly průměrně mírně vyšší hladinu vitaminu C neţ brambory fialové (162,2 vs. 150,7 mg/kg č.hm.). Dvě červené odrůdy H.B. Red ( průměrně 175,5 mg/kg č.hm.) a Rosalinde (průměrně 195,5 mg/kg č.hm.) obsahovaly dokonce srovnatelné mnoţství vitaminu C jako ţlutomasá odrůda Agria (průměrně 190,5 mg/kg č.hm.). Obsah vitaminu C v testovaných odrůdách brambor je uveden v obrázku 26. Z něj je patrné, ţe nejvíce vitaminu C obsahovaly brambory vypěstované v roce 2009 v Přerově nad Labem. Výjimkou byla pouze odrůda Blue Congo, ve které byl zjištěn mírně vyšší obsah vitaminu C v hlízách vypěstovaných ve Valečově v roce Obrázek 26: Obsah vitaminu C v odrůdách brambor 74

77 Obsah chlorogenové kyseliny Obsah chlorogenové kyseliny byl stanoven pouze ve vzorcích z roku Byl zjištěn významný rozdíl mezi obsahem chlorogenové kyseliny v barevných a ţlutých odrůdách brambor. Kyselina chlorogenová patří stejně jako anthokyany do skupiny fenolických látek a zdá se pravděpodobné, ţe jejich obsahy jsou na sobě závislé. Zatímco ţluté odrůdy brambor obsahovaly v průměru za obě lokality pouze 81 mg/kg č.hm. chlorogenové kyseliny, v červených bylo stanoveno 301 mg/kg č.hm. a ve fialových dokonce 518 mg/kg č.hm.. V případě fialových brambor to představuje přibliţně 6,4krát vyšší obsah chlorogenové kyseliny v porovnání s odrůdami ţlutými. V předchozím pokusu byl zjištěn 6,5krát vyšší obsah chlorogenové kyseliny v barevných odrůdách brambor (Hejtmánková et al., 2009). Brown (2005) uvádí 3-4krát vyšší obsah fenolických kyselin v barevných odrůdách brambor v porovnání s ţlutomasými odrůdami. Výsledky jsou uvedeny v obrázku 27. Podobně jako v případě celkových anthokyanů byl zjištěn výrazně nejvyšší obsah kyseliny chlorogenové ve dvou tmavě fialových odrůdách Violette a Vitelotte. 75

78 Obrázek 27: Obsah chlorogenové kyseliny v odrůdách brambor Antioxidační aktivita Z literatury je známo, ţe barevné odrůdy brambor mají vyšší antioxidační aktivitu v porovnání se ţlutými. Například Brown et al. (2003) uvádí 2-3krát vyšší antioxidační aktivitu barevných odrůd ve srovnání s odrůdami bělomasými. Stejně jako v případě celkového obsahu anthokyanů a obsahu kyseliny chlorogenové byla antioxidační aktivita závislá na intenzitě zbarvení duţniny. Nejvyšší antioxidační aktivitu vykazovaly dvě tmavofialové odrůdy Violette a Vitelotte, průměrně 607 a 557 mg/kg č.hm.. Následovaly ostatní fialové odrůdy (průměr všech 339 mg/kg č.hm.) a červené (průměr všech červených odrůd 324 mg/kg č.hm.). Nejniţší míru antioxidační aktivity vykazovaly odrůdy ţlutomasé (průměr všech 81 mg/kg č.hm.). Výsledky jsou uvedeny v obrázku

79 Obrázek 28: Antioxidační aktivita testovaných odrůd brambor Vztah jednotlivých antioxidantů k celkové antioxidační aktivitě Byla sledována závislost antioxidační aktivity na obsahu jednotlivých stanovovaných antioxidantů (celkové anthokyany, chlorogenová kyselina a vitamin C). Do vztahu byly dány všechny hodnoty z obou let i lokalit. Závislosti jsou uvedeny v následujících obrázcích Nejvyšší koeficient determinace byl zjištěn v případě závislosti antioxidační aktivity na obsahu celkových anthokyanů, a to 0,73. Silná závislost byla pozorována téţ v případě kyseliny chlorogenové s koeficientem determinace 0,62. Ţádná závislost nebyla zjištěna mezi antioxidační aktivitou a vitaminem C. Velmi silnou závislost antioxidační aktivity na celkovém obsahu polyfenolů zjistili Navarre et al. (2011), kteří testovali více neţ 50 genotypů brambor. Koeficent determinace 77

80 stanovené závislosti činil 0,98. Střední závislost (r = 0,51) antioxidační aktivity na celkovém obsahu anthokyanů uvádí Brown et al. (2007). Obrázek 29: Závislost antioxidační aktivity na obsahu celkových anthokyanů 78

81 Obrázek 30: antioxidační aktivity na obsahu kyseliny chlorogenové Obrázek 31: Závislost antioxidační aktivity na obsahu vitaminu C 79

82 Statistické zhodnocení výsledků Všechny výsledky byly vyhodnoceny v programu STATISTICA Cz metodou analýzy rozptylu (ANOVA) na hladině pravděpodobnosti α = 0,05 s faktory odrůda, barva duţniny, lokalita a rok. Výsledky statistické analýzy jsou uvedeny v následujících tabulkách. Byl zjištěn vliv odrůdy, lokality i ročníku pěstování na obsah vitaminu C. Vliv lokality a odrůdy na obsah vitaminu C uvádí i Burgos et al. (2009a), který studoval 25 ţlutomasých odrůd ve třech různých lokalitách. Nejvíce vitaminu C stanovil v bramborách vypěstovaných v nejníţe poloţené lokalitě. Vlivu odrůdy přikládá 3krát větší váhu v porovnání s vlivem lokality. Byl zjištěn statisticky vyšší obsah vitaminu C v bramborách vypěstovaných v lokalitě Přerov (průměrně 183 mg/kg č.hm.) oproti lokalitě Valečov (průměrně 155 mg/kg č.hm.). Ve shodě s Burgem et al. (2009a) byl statisticky vyšší obsah vitaminu C stanoven v níţe poloţené lokalitě. Současně byl zjištěn vyšší obsah tohoto vitaminu v bramborách vypěstovaných v roce 2009 (183 mg/kg č.hm.) vs (156 mg/kg č.hm.). Rok 2009 byl teplejší a s niţším úhrnem sráţek v porovnání s rokem 2010 (viz tabulka VIII), a to je pravděpodobně důvodem vyššího obsahu vitaminu C v bramborách vypěstovaných v tomto roce. Dále byl zjištěn statisticky významně vyšší obsah vitaminu C ve ţlutých odrůdách brambor. Absolutně nejvyšší obsah byl zjištěn v bělomasé odrůdě Lady Balfour (průměrně 243 mg/kg č.hm.). Antioxidační aktivita byla průkazně olivněna pouze odrůdou. Barevné odrůdy vykazovaly statisticky významně vyšší míru antioxidační aktivity neţ odrůdy ţluté. Mezi barevnými pak měly dále tmavě fialové odrůdy Vitelotte a Violette průkazně vyšší antioxidační aktivitu neţ fialové odrůdy Valfi a Blue Congo a také neţ všechny červené odrůdy kromě odrůdy H. B. Red. Byl zjištěn statisticky významný vliv lokality pěstování na obsah glykoalkaloidů. Brambory vypěstované v níţe poloţené lokalitě Přerov obsahovaly vyšší obsah těchto látek (69 mg/kg č.hm.) neţ tytéţ vypěstované ve Valečově (50 mg/kg č.hm.). Vyšší obsah glykoalkaloidů v bramborách vypěstovaných v níţe poloţené a suché lokalitě v porovnání s výše poloţenou chladnější lokalitou uvádí i Morrison et al. (1985). Dále byl zjištěn všeobecně známý odrůdový vliv na obsah glykoalkaloidů. Odrůdou s nejvyšším obsahem těchto látek byla z testovaných odrůd červená odrůda Rosalinde (88 mg/kg č.hm.) a s nejniţším odrůda Blaue St. Galler (32 mg/kg č.hm.). 80

83 Byl zjištěn statisticky významně vyšší obsah anthokyanů ve dvou tmavě fialových odrůdách Violette a Vitelotte oproti všem ostatním odrůdám brambor. Nebyl zjištěn vliv lokality ani ročníku, coţ se shoduje se závěry autorů Jansen a Flamme, 2006, kteří také nezjistili vliv lokality a ročníku na obsah anthokyanů. Naproti tomu Brown et al. (2008) zjistili silnou závislost obsahu anthokyanů na lokalitě, kdyţ stanovili vyšší obsah těchto látek v bramborách pěstovaných ve vyšší nadmořské výšce. Obsah chlorogenové kyseliny byl stanoven pouze v roce 2010, a proto byl vyhodnocen pouze vliv odrůdy a stanoviště. Na obsah této kyseliny byl z testovaných vlivů průkazný pouze vliv odrůdy. Významně nejvyšší obsah chlorogenové kyseliny byl zjištěn opět ve dvou odrůdách tmavě fialových Violette a Vitelotte. Vzhledem k barvě duţniny, byl obsah chlorogenové kyseliny významně odlišný ve fialových (518 mg/kg č.hm.), červených (301 mg/kg č.hm.) a ţlutých odrůdách (84 mg/kg č.hm.). Souhrnné výsledky statistického zhodnocení experimentálně získaných dat jsou uvedeny v tabulkách XVII a XVIII. 81

84 Tabulka XVII: Výsledky analýzy ANOVA (α = 0,05) Analyt Odrůda Lokalita Ročník Vitamin C Antioxidační aktivita Celkové anthokyany Glykoalkaloidy Kys. chlorogenová n.d. statisticky významný rozdíl; statisticky nevýznamný rozdíl; n.d. není k dispozici Tabulka XVIII: Rozdíly mezi odrůdami s různou barvou dužniny (ANOVA; α = 0,05) Analyt Rozdíly mezi odrůdami Vitamin C ţlutá > červená fialová Antioxidační aktivita fialová > červená > ţlutá Glykoalkaloidy červená > fialová ţlutá Kys. chlorogenová fialová > červená > ţlutá > statisticky významně vyšší obsah; srovnatelný obsah 5.4 Vliv kulinárních úprav na obsah vitaminu C a glykoalkaloidů v žlutých a barevných odrůdách brambor Vliv kulinárních úprav na obsah sušiny, roky 2008 a 2010 Při kulinárních úpravách brambor se výrazně měnil obsah sušiny, a proto jsou výsledky v celé této kapitole vyjádřeny v mg sledované látky na kg sušiny. K výraznému 82

85 zvýšení sušiny došlo během pečení a mikrovlnného ohřevu. Vařením brambor se sušina výrazně nezměnila (viz následující obrázky). Obrázek 32: Obsah sušiny po kulinárních úpravách (rok 2008, Stachy) 83

86 Obrázek 33: Obsah sušiny po kulinárních úpravách (rok 2010, Valečov) Obrázek 34: sušiny po kulinárních úpravách (rok 2010, Přerov/Labem) 84

87 5.4.2 Vliv kulinárních úprav na obsah vitaminu C Rok 2008 Vyšší obsah vitaminu C v syrových bramborách byl zjištěn v ţlutých odrůdách brambor (viz následující tabulka). Ţluté brambory obsahovaly průměrně 710 mg vitaminu C na kg sušiny, barevné 455 mg/kg sušiny. Po kulinárních úpravách byl stanoven nejvyšší obsah vitaminu C vţdy v barevné odrůdě, nikoliv však stejné. Po mikrovlnném ohřevu obsahovala nejvyšší hladinu vitaminu C odrůda Violette (403 mg/kg sušiny). Nejvyšší obsah vitaminu C po vaření (613 mg/kg č.hm.) i pečení (380 mg/kg č.hm.) byl zjištěn v odrůdě Highland Burgundy Red. Tato skutečnost by mohla být vysvětlena přítomností anthokyanů v barevných odrůdách brambor, které vykazují antioxidační účinky a pravděpodobně chrání vitamin C před oxidací, resp. degradací. Ţlutá odrůda Saturna obsahovala vţdy nejniţší hladinu vitaminu C bez rozdílu pouţité kulinární úpravy. Tabulka XIX: Obsah vitaminu C v mg/kg sušiny Kulinární úprava Odrůda Syrové Vařené Pečené Mikrovlnný neloupané celé krájené ohřev loupané neloupané krájené Ditta neloupané 367 ţlutá Saturna Valfi fialová Violette H. B. Red červená Nezávisle na barvě odrůdy byl zjištěn nejvyšší úbytek vitaminu C většinou během pečení. Následoval mikrovlnný ohřev. Nejšetrnější pouţitou kulinární úpravou se zdá být 85

88 Změny obsahu vitaminu C (%) vaření, pravděpodobně díky nejniţší pouţité teplotě z testovaných kulinárních úprav. Změny obsahu vitaminu C jsou uvedeny v % v následujícím obrázku mikrovlnný ohřev -55 pečení -65 vaření -75 Valfi Violette Highland B.Red Ditta Saturna Obrázek 35: Změny obsahu vitaminu C po kulinárních úpravách (Stachy, 2008) Rok 2010 Ve shodě s předešlým pokusem byl zjištěn absolutně nejvyšší obsah vitaminu C v syrových bramborách ţluté odrůdy (viz následující tabulka). Obsah vitaminu C v ţlutomasé odrůdě Agria vypěstované v lokalitě Valečov byl 567 mg/kg sušiny, resp. 593 mg/kg sušiny v lokalitě Přerov. Obsah vitaminu C v bělomasé odrůdě Russet Burbank byl naopak nízký (304 mg/kg sušiny) a srovnatelný s barevnými odrůdami ze stejné lokality (Přerov). Obsah vitaminu C v barevných odrůdách byl nízký, kromě červené odrůdy Highland Burgundy Red z lokality Valečov (522 mg/kg sušiny). Na rozdíl od předešlého pokusu byl zjištěn po kulinárních úpravách nejvyšší obsah vitaminu C ve ţlutomasé odrůdě Agria. Odrůda Agria obsahovala nejvyšší obsah vitaminu C po všech pouţitých kulinárních úpravách (ve srovnání s odrůdami podrobenými stejné kulinární úpravě). Předpoklad pozitivního vlivu anthokyanů na stabilitu vitaminu C tedy nebyl potvrzen. 86

89 Z pouţitých kulinárních úprav došlo k výrazně nejvyšším úbytkům vitaminu C opět při pečení. Nejvyšší pokles při pečení byl zaznamenán v odrůdě Valfi (Valečov), a to o 78 %, nejniţší pak v odrůdě Agria (Přerov) o 44 %. Nejšetrnější kulinární úprava se zdá být ve shodě s předešlým pokusem vaření a to i přes skutečnost, ţe pouze vařené brambory byly před kulinární úpravou oloupány. Při vaření došlo k nejniţšímu úbytku vitaminu C ve většině odrůd, kromě odrůd H. B. Red a Agria (obě Valečov) a odrůdy Russet Burbank (Přerov). V těchto třech odrůdách byl zaznamenán nejniţší pokles vitaminu C v bramborách upravených mikrovlnným ohřevem (viz následující obrázky). Průměrná ztráta při vaření byla 23 %, při mikrovlnném ohřevu 30 % a při pouţití pečení 62 %. K podobnému závěru došli Burgos et al. (2009a), kteří testovali stejné kulinární úpravy se šesti původními odrůdami brambor. Jako nejšetrnější kulinární úpravu označili vaření v porovnání s pečením a mikrovlnným ohřevem. Ztrátu vitaminu C při kulinárních úpravách uvedli mezi 3 47 %; % a % při vaření, resp. pečení a mikrovlnném ohřevu. 87

90 Přerov Valečov Tabulka XX: Obsah vitaminu C v mg/kg sušiny Kulinární úprava Odrůda Lokalita Syrové neloupané Vařené celé loupané Pečené krájené neloupané Mikrovlnný ohřev krájené neloupané Agria ţlutá Valfi fialová Vitelotte H.B. Red červená Agria Russet Burbank ţlutá Valfi Blaue St. Galler fialová Rotte Emma červená

91 Obrázek 36: Změny obsahu vitaminu C po kulinárních úpravách (Valečov, 2010) Obrázek 37: Změny obsahu vitaminu C po kulinárních úpravách (Přerov, 2010) 89

92 Statistické zhodnocení výsledků z let 2008 a 2010 V programu Statistica Cz byla provedena analýza rozptylu (ANOVA) na hladině pravděpodobnosti α = 0,05 s faktory kulinární úprava, barva duţniny, lokalita a rok. Byl zjištěn statisticky významný rozdíl v obsahu vitaminu C v syrových a kulinárně upravených bramborách. K nejvyššímu poklesu došlo během pečení, tento pokles se dále statisticky významně lišil od poklesu vitaminu C během vaření a mikrovlnného ohřevu. Tyto dvě kulinární úpravy se od sebe z hlediska poklesu obsahu vitaminu C významně nelišily. Dále byl zjištěn statisticky významný vliv barvy duţniny na pokles vitaminu C, kde v barevných odrůdách došlo k poklesu vlivem kulinárních úprav v průměru o 31 % a ve ţlutých odrůdách o 43 %. Nicméně tento výsledek je ovlivněný výsledky z roku 2008, kde byl tento jev velmi zřejmý. V pokusu z roku 2010 uţ nebylo stejných výsledků dosaţeno, spíše naopak, protoţe nejniţší pokles v obsahu vitaminu C byl zjištěn v ţlutomasé odrůdě Agria při pouţití téměř všech kulinárních úprav. Nebyl zjištěn vliv lokality ani roku pěstování na průměrný pokles vitaminu C Vliv kulinárních úprav na obsah glykoalkaloidů V literatuře se uvádí, ţe glykoalkaloidy jsou termostabilní látky a vlivem běţných kulinárních úprav (vaření, pečení a mikrovlnný ohřev) nedochází k významnému úbytku (Friedman, 2006). V rozporu s tímto tvrzením jsou v literatuře uvedeny praktické výsledky kulinárních úprav, ve kterých autoři uvádí poklesy vlivem běţných kulinárních úprav (Tajner- Czopek et al., 2008; Peksa et al., 2006; Takagi et al., 1990). Také prezentované výsledky naznačují pokles obsahu glykoalkaloidů vlivem kulinárních úprav. V syrových bramborách se obsah glykoalkaloidů pohyboval mezi 138 mg/kg sušiny (Blaue St. Galler; Přerov) aţ 475 mg/kg sušiny (H. B. Red, Valečov). Po všech pouţitých kulinárních úpravách obsah glykoalkaloidů klesl. K nejvyššímu poklesu obsahu těchto látek došlo během vaření, a to především díky odstranění slupky a potom následným výluhem. Průměrná ztráta glykoalkaloidů během vaření byla 74 %. K absolutně nejvyššímu poklesu došlo v odrůdě Agria pěstované v Přerově, a to o 94 %. V té samé odrůdě pěstované ve Valečově došlo k nejvyššímu poklesu obsahu GA během vaření v bramborách vypěstovaných v této lokalitě, a to o 85 %. K nejniţšímu poklesu obsahu GA během vaření pak došlo v odrůdě H. B. Red (Valečov), která současně měla vysoký počáteční obsah glykoalkaloidů. Pokles obsahu GA byl o 48 %. 90

93 Pokles obsahu glykoalkaloidů během pečení a mikrovlnného ohřevu byl srovnatelný, a to o 46 %, resp. 42 %. K nejniţšímu poklesu obsahu GA došlo při mikrovlnném ohřevu i pečení v odrůdě Agria (Valečov), a to pouze o 11 %, resp. 19 %. Naopak k nejvyššímu poklesu během mikrovlného ohřevu došlo v odrůdě Blaue St. Galler (Přerov) a při pečení v odrůdě Valfi (Přerov), a to o 60 %, resp. 73 %. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce XXI a obrázcích Statistické zhodnocení výsledků V programu Statistica Cz byla provedena analýza rozptylu (ANOVA) na hladině pravděpodobnosti α = 0,05 s faktory kulinární úprava, odrůda, barva duţniny a lokalita. Byl zjištěn statisticky významný pokles obsahu glykoalkaloidů při pouţití všech kulinárních úprav. Statisticky významný byl i rozdíl v poklesu ve vařených bramborách (o 74 %) v porovnání s bramborami pečenými (o 46 %) a podrobenými mikrovlnnému ohřevu (o 42 %). Nebyl zjištěn vliv odrůdy ani barvy duţniny na pokles obsahu glykoalkaloidů. Naopak byl zjištěn statisticky významně niţší pokles obsahu GA v bramborách z lokality Valečov (o 44 %) v porovnání s bramborami z lokality Přerov (pokles o 64 %). Tento fakt by mohl souviset s tím, ţe průměrná počáteční hodnota obsahu glykoalkaloidů byla vyšší v bramborách z Valečova (průměrně 319 mg/kg sušiny) v porovnání s bramborami z Přerova (229 mg/kg sušiny). V bramborách s vyšším počátečním obsahem glykoalkaloidů by mohlo docházet k niţším poklesům těchto látek. Obdobně jako v pokusu s osvětlováním docházelo k vyšší biosyntéze glykoalkaloidů vlivem světla v bramborách s vyšším počátečním obsahem těchto látek. 91

94 Přerov Valečov Tabulka XXI: Obsah glykoalkaloidů v mg/kg sušiny Kulinární úprava Odrůda Lokalita Syrové neloupané Vařené celé loupané Pečené krájené neloupané Mikrovlnný ohřev krájené neloupané Agria ţlutá Valfi fialová Violette H.B. Red červená Agria ţlutá Valfi Blaue St. Galler fialová Rotte Emma červená

95 Obrázek 38: Změny obsahu glykoalkaloidů po kulinárních úpravách (Valečov, 2010) Obrázek 39: Změny obsahu glykoalkaloidů po kulinárních úpravách (Přerov, 2010) 93