ChromAtoMol. časopis nejen pro analytické laboratoře

Transkript

1 1 ChromAtoMol #2 časopis nejen pro analytické laboratoře» ICP-QQQ pro přímé stanovení Pt, Rh a Pd» LIMS a SDMS v moderní laboratoři» Agilent 1290 Infinity II» Detekce somatických mutací s nízkou frekvencí» Spolehlivé a korektní srovnání citlivosti přístrojů» Servisní smlouvy nejen pro akreditované laboratoře» Analýza environmentálních kontaminantů» Triky pro lepší spojení v plynové chromatografii Laboratoře dopravní infrastruktury a životního prostředí Centra dopravního výzkumu, v.v.i. Laboratoř akreditovaná pro Stanovení Pb, Cd, As a Ni ve frakci PM 10 aerosolových částic metodou ICP-MS Autor fotografie: Stanislav Pecháček

2 ChromAtoMol časopis nejen pro analytické laboratoře číslo 2 vychází zdarma a nepravidelně Vydavatel: HPST, s.r.o. Písnická 372/ Praha 4 Tel.: Fax: E mail: info@hpst.cz Web: Redakce: Ing. Daniela Tršová, Ph.D. manažer marketingu daniela.trsova@hpst.cz Mob.: Ing. Michaela Vránová marketingový specialista michaela.vranova@hpst.cz Tel.: Mob.:

3 Vážení přátelé, po dlouhé době příprav a ujasňování našich představ jsme před pár týdny v HPST realizovali jeden z našich dlouhodobých cílů. Bylo jím první číslo našeho vlastního časopisu ChromAtoMol, které nám udělalo velkou radost, ale zároveň s sebou přineslo napjaté očekávání, zda se nápad ujme a zda bude mít smysl publikovat i další čísla. Podle prvních ohlasů se zdá, že čtenáře tento nápad oslovil, a proto celý náš tým velice těší, že již po pár týdnech můžeme publikovat číslo druhé, které je rozsáhlejší a přináší více praktických aplikačních článků. Ti z Vás, jejichž hlavním oborem je stopová analýza kovů a zajímají je možnosti nejnovějších technologií ICP-MS, naleznou hned v úvodu článek z Centra dopravního výzkumu v Brně zaměřující se na přesnou analýzu skupiny platinových kovů v životním prostředí. Jedním z nejdůležitějších parametrů výkonu dnešních přístrojů je citlivost. Která forma výpočtu je ta optimální, necháme na Vašem zvážení po přečtení článku o detekčních limitech přístrojů. Jaký je skutečný výkon nejcitlivějších trojitých kvadrupólů v plynové chromatografii? Detailní odpověď naleznete v další publikaci. V aktuálním čísle nechybí ani tipy a triky z oblasti spotřebního materiálu, novinky v instrumentaci a nově také část popisující oblast pokročilých laboratorních softwarů. Další novinkou našeho časopisu jsou příspěvky zaměřené na oblast molekulární biologie, která tvoří důležitou část produkce Agilent Technologies, a v HPST se jí věnuje kompletní tým specialistů. Druhé číslo pak tradičně uzavírají informace o servisních službách a jedinečných školeních z dílen servisního a aplikačního týmu HPST. Karel Vranovský, generální ředitel Strana 2 Obsah Kde nás najdete 2 Pořádáme Agilent slaví 50 let působení v chemické analytice (Daniela Tršová) Využití ICP-QQQ pro přímé stanovení Pt, Rh a Pd v různých typech vzorků (Jitka Hegrová, Centrum dopravního výzkumu, v.v.i.) Spolehlivé a korektní srovnání citlivosti přístrojů: Instrument Detection Limit (IDL) (Jitka Zrostlíková) Agilent 1290 Infinity II: čas pro maximální propojení hardwaru a softwaru ve 21. století (Jan Kovář) Agilent 7010 GC/MS/MS trojitý kvadrupól v analýze environmentálních kontaminantů (Ivo Novotný) Tipy a triky pro lepší spojení v plynové chromatografii (Jana Havelková, Labicom s.r.o.) LIMS a SDMS v moderní laboratoři (Michal Novotný) Odstraňte tuky, najdete analyty (Jitka Berková, Labicom s.r.o.) Agilent 4200 TapeStation: plně automatizovaná kontrola kvality Vašich vzorků (Iva Šenitková) Systém pro detekci somatických mutací s nízkou frekvencí za použití molekulárního barkódování HaloPlex HS (Zbyněk Halbhuber) Uživatelská školení pořádaná společností HPST (Růžena Penížková) Servisní smlouvy...nejen pro akreditované laboratoře (Růžena Penížková) Kontakty

4 Kde nás najdete 2 Co: Kdy: Kde: Info: 16. Škola hmotnostní spektrometrie Frymburk LABOREXPO Praha Celostátní sjezd lékařské genetiky a 48. výroční cytogenetická konference Brno XXIII. Ostravské dny forenzních věd Ostravice Analýza organických látek Valtice RAFA Praha Kurz AAS Praha Pořádáme Co: Kdy: Kde: Info: GC školení, uživatelské dovednosti a diagnostika Praha MS (single-quad/qqq pro GC) školení, uživatelské dovednosti a diagnostika Praha acgh Microarray Workshop Praha info@hpst.cz Mass Hunter pro GC/MS Dříteč Mass Hunter pro LC/MS (QQQ) Dříteč OpenLab - Chemstation Dříteč LC školení, uživatelské dovednosti a diagnostika Praha

5 3 Agilent slaví 50 let působení v chemické analytice Obrázek 1 Jeden z prvních GC na světě, typ F&M 17A Obrázek 2 Plynový chromatograf F&M 202 (195X) Obrázek 3 Zleva: Aaron Martin, C. Eugene Bennett a Frank Martinez Jr. Obrázek 4 Manfred Donike měří na plynovém chromatografu HP 7600A HP na olympijských hrách v Mnichově v roce 1972 Dne 9. srpna 1965 dokončila firma Hewlett- -Packard svoji pátou akvizici, kterou byla firma F&M Scientific z Avondale v Pensylvánii (USA), v té době už jeden z předních výrobců nové technologie zvané plynová chromatografie. Firma F&M Scientific začínala jako bokovka jednoho ze zaměstnanců amerického chemického gigantu DuPont. Frank Martinez Jr. byl sklář, který pracoval na analytických a procesních instrumentech. V roce 1956 dostal svolení vyrábět plynové chromatografy ve svém volném čase. Po úspěšné reklamě v časopise Analytic Chemistry začala jeho firma prosperovat a Frank Martinez v roce 1958 opouští společnost DuPont, aby se mohl na plný úvazek věnovat své firmě F&M (pojmenované podle jeho iniciál). Když mu další dva bývalí zaměstnanci firmy DuPont (Aaron Martin a C. Eugene Bennett) nabídli odkoupení F&M, Martinez jim místo toho nabídl partnerství ve firmě. Všichni tři zakladatelé byli později nadací Chemical Heritage Foundation uvedeni do Přístrojové síně slávy - Instrumentation Hall of Fame. V roce 1959 chtěla firma F&M vystavovat své přístroje na Pittsburghské konferenci analytické chemie a aplikované spektroskopie (známé jako Pittcon ), ale nebyla schopná si zajistit stánek, proto se tým usadil v hotelovém pokoji. Tým předvedl první programovatelný vysokoteplotní chromatograf s teplotně-vodivostním detektorem, který mohl pracovat při teplotách do 300 C. Přístroj se stal hitem konference a přitáhl velké zákazníky jako Pfizer, Dow a Esso. Materiály jako nafta, polymery nebo léčiva bylo možné analyzovat v řádu několika minut. Během jednoho roku rozšířila firma F&M teplotní rozsah přístroje na 500 C. Společnost zvýšila počet zaměstnanců z původních tří na 25. Ve výrobním procesu zaměstnala většinu absolventů Wilmingtonské technické školy. Prodej se zdvojnásobil z 250 na 500 tisíc dolarů a každý následující rok to byl vždy dvojnásobek. Za tři roky se stala firma F&M Scientific největším světovým výrobcem plynových chromatografů. V roce 1965 (to měla firma již 400 zaměstnanců a roční obrat 7 milionů dolarů) byla společnost prodána firmě Hewlett-Packard (HP). Společnost HP provozovala F&M jako oddělenou divizi pod názvem F&M Scientific Division a expandovala na nové trhy jako životní prostředí, potraviny a forenzní analytika. Aplikace zahrnovaly analýzu automobilových zplodin, měření znečištění ovzduší, kvality vody, obsahu pesticidů aj. Společnost HP také podepsala kontrakt s federální vládou na vývoj speciální řady přenosných přístrojů pro testování potravinářských produktů jako obilí, pícnin, mléka a ovoce. V roce 1967 německý biochemik Manfred Donike demonstroval, že plynový chromatograf HP lze použít pro detekci anabolických steroidů a dalších zakázaných látek v moči sportovců. Výsledkem bylo první plošné testování všech sportovců na letních olympijských hrách v Mnichově v roce 1972, kde bylo použito osmi plynových chromatografů HP. Analytická instrumentace společnosti HP se nadále rozšiřovala. V roce 1970 byla vytvořena samostatná divize Scientific Instruments Division pro vývoj nových technologií z oblasti hmotnostní spektrometrie. V roce 1973 vstoupila společnost HP na trh s kapalinovou chromatografií akvizicí firmy Hupe & Busch. Jedním z největších technologických průlomů byl v roce 1979 vynález křemenných kapilárních kolon, což zjednodušilo analýzu a umožnilo změřit více látek ve směsi. Plynový chromatograf HP 5890 (uvedený na trh v roce 1984) zůstává dodnes nejprodávanějším plynovým chromatografem všech dob. V roce 1999 měl Agilent dvě divize: Life Sciences a Chemical Analysis. Zatímco divize Life Sciences byla považována za hnací motor a hlavní cíl investic společnosti, divize Chemical Analysis byla brána jako zastaralé odvětví s ustrnulým rozvojem, jehož nejlepší dny už jsou ty tam. Mike McMullen (tehdejší ředitel divize Chemical Analysis, dnes třetí prezident Agilentu) přesunul největší investice z USA do Evropy, Číny, Indie a dalších rozvíjejících se trhů. Díky tomu se chemická analytika stala nejrychleji rostoucí divizí celé společnosti. Padesát let po akvizici F&M Scientific společnost Agilent stále roste, v roce 2014 byl roční obrat 4 miliardy dolarů. Vedoucí postavení na trhu s chemickou analytikou umožnilo společnosti investovat do nových oblastí jako genomika nebo diagnostika. Daniela Tršová daniela.trsova@hpst.cz

6 Využití ICP-QQQ pro přímé stanovení Pt, Rh a Pd v různých typech vzorků 4 Hmotnostní spektrometr ICP-QQQ 8800 series firmy Agilent Technologies je elegantním řešením pro stanovení komplikovaných prvků, které za využití klasických jednokvadrupólových ICP-MS není možné stanovit v nízkých koncentracích, nebo jejich stanovení vyžaduje určitou předúpravu vzorku. ICP-QQQ je vhodným přístrojem pro vzorky s komplikovanou matricí a/nebo vzorky obsahující komplikované prvky. ICP-QQQ obsahuje dva kvadrupóly umístěné za sebou, mezi nimiž je kolizně-reakční cela (Octopole Reaction System - ORS3 ). Tato cela může být zaplněna kolizním nebo reakčním plynem, který interaguje s ionty prošlými prvním kvadrupólem. Výsledné produkty z ORS jsou selektovány druhým kvadrupólem. První kvadrupól propustí jen ionty (i interferenty - on mass) s vybraným poměrem m/z. Tyto ionty o vybraném m/z dále interagují v kolizně-reakční cele s vybraným plynem. Dochází tedy k více účinnému odstranění interferencí, než u ICP-MS s jedním kvadrupólem, kde kolizní nebo reakční plyn reaguje se všemi ionty. ICP-QQQ je ideálním řešením pro dříve problematické vzorky a analyty. Co jsou problematické vzorky? Vzorky s komplikovanou matricí způsobující zanesení interface, zvýšení interferencí, pokles signálu. Vzorky, které je nutno ředit. Vhodné je ředění pomocí HMI (high matrix interface) - ředění aerosolu přídavným argonem zvýší toleranci matrice až 10krát, možno měřit neředěné vzorky moči i mořské vody. Vzorky, kde hledaný analyt je v ultrastopových koncentracích, a naproti tomu interferent je obsažen ve vysokých koncentracích (např. Cd/Mo). Co jsou problematické analyty? Všechny prvky, které jsou slabě ionizovány v plazmatu (jako např. P, S). Všechny prvky, které mají hodnoty m/z zatížené polyatomickými interferencemi. Prvky zatížené izobarickými interferencemi. Interference v ICP-MS 1) Fyzikální a chemické interference: těkavost, viskozita, hustota, povrchové napětí - lze odstranit (eliminovat) vhodnou úpravou kalibračních roztoků a úpravou transportu vzorků do plazmatu. 2) Spektroskopické interference: např. izobarické interference 48 Ca + / 48 Ti + lze odstranit vhodným reakčním plynem v rekční cele, dvojitě nabité ionty lze odstranit v reakční cele nebo využít vyššího rozlišení; polyatomické interference lze odstranit v kolizně reakční cele pomocí korelačních rovnic, které je možné využít při nastavení v metodě, laděním přístroje tak, aby byl nízký poměr oxidů, využít podmínky studeného plazmatu, alternativní způsoby předúpravy vzorků (generování hydridů, ETV atd.), využít vysoce rozlišovací spektrometry atd. Ideální řešení nabízí ICP-QQQ díky možnosti využití prvního kvadrupólu pro selekci iontů, dále pak kolizně- -reakční cely s možností využití až čtyř plynů v jedné metodě (H 2 /O 2 /NH 3 /He). Stanovení PTK Důležitými prvky z hlediska analýzy vzorků životního prostředí ve vztahu k dopravě je skupina platinových kovů (Rh, Pd a Pt). Tyto prvky jsou běžně používány v katalyzátorech jako aktivní složky pro redukci emisí oxidů dusíku a oxidu uhelnatého. Jeden katalyzátor obsahuje asi 7 g těchto kovů. Ačkoliv nejsou tyto kovy při vlastních procesech v katalyzátoru spotřebovávány, dochází k jejich uvolňování zejména v podobě pevných částic do prostředí v množstvích 6-8 ng/km Pt, ng/km Pd a 4-12 ng/km Rh (Moldovan, 2007). V České republice došlo k významnému rozšíření katalyzátorů v polovině devadesátých let, tedy téměř po dvaceti letech od legislativního ustanovení v USA (1975). Anglie, Belgie a Španělsko přijaly legislativně katalyzátory teprve v roce 1993 v souvislosti s akceptováním emisních norem EURO. V průběhu spalování jsou katalytické konvertory výfukových plynů chemicky i fyzikálně zatěžovány rychlým střídáním oxidačně redukčních podmínek, vysokými teplotami a mechanickou abrazí, což způsobuje emise částic obsahujících PTK do životního prostředí (König et al.1992, Fargo et al. 1996, Fargo et al. 1997, Zereini et al., 1997, Gómez et al., 2001). Použití v automobilech tak způsobuje plošné rozšiřování PTK, zvláště pak podél silničních komunikací a v městských aglomeracích s vysokou hustotou dopravy, a to nejenom do ovzduší, ale Obrázek 1 Systémy pro automatické odběry vzorků Obrázek 2 ICP/QQQ systém laboratoř CDV (Autor fotografie: Stanislav Pecháček)

7 5 Vzorek Město, stát (rok odběru) Lokalita Obsahy / koncentrace platinových kovů Ovzduší PM10 Brno, Česká republika (2007) Frekventovaná ulice v intravilánu města Pt: 5,3 pg m-3 Pd: 32,4 pg m-3 Rh: 3,62 pg m-3 Madrid, Španělsko ( ) Hlavní silniční okruh Pt: 17,7 pg m-3 Rh: 4,6 pg m-3 Göteborg, Švédsko ( ) Hlavní silniční okruh Pt: 4,1 pg m-3 Pd: 1,6 pg m-3 Rh: 0,8 pg m-3 Řím, Itálie ( ) Hlavní silniční okruh Pt: 8,1 pg m-3 Pd: 54,9 pg m-3 Rh: 3,0 pg m-3 Mnichov, Německo ( ) Hlavní silniční okruh Pt: 4,1 pg m-3 Rh: 0,3 pg m-3 Silniční prach Madrid, Španělsko ( ) Hlavní silniční okruh a centrum města Götenburg, Švédsko ( ) Řím, Itálie ( ) Mnichov, Německo ( ) Londýn, Anglie ( ) Hlavní silniční okruh a centrum města Hlavní silniční okruh a centrum města Hlavní silniční okruh a centrum města Hlavní silniční okruh a centrum města Pt: 220 ng g-1 Rh: 74 ng g-1 Pt: 123 ng g-1 Rh: 48 ng g-1 Pt: 34 ng g-1 Rh: 5 ng g-1 Pt: 179 ng g-1 Rh: 31 ng g-1 Pt: 53 ng g-1 Půda Peking, Čína (2007) Hlavní silnice ve městě Pt: 39,8 ng g-1 Pd: 20,8 ng g-1 Rh: 10,1 ng g-1 Brno, Česká republika (2006) Intravilán města Brna Pt: 4,52 ng g-1 Pd: 2,55 ng g-1 Rh: 0,52 ng g-1 Braunschweig, Německo (2005) Dálnice B248 Pt: 50,4 ng g-1 Pd: 43,3 ng g-1 Rh: 10,7 ng g-1 Athény, Řecko (2003) Dálnice Athény-Thessaloniky Pt: 141,1 ng g-1 Pd: 125,9 ng g-1 Neapol, Itálie (2000) Metropolitní oblast - centrum města a předměstí Pt: 4,2 ng g-1 Pd: 12,7 ng g-1 Tabulka I Příklady nalezených koncentrací PTK v různých typech vzorků a v různých lokalitách (Sikorová, Ličbinský, Adamec, 2011) Vegetace Guangzou, Čína (2007) Silniční okruh kolem města Listy rostlin: Pt: 1,52 ng g-1 Pd: 0,77 ng g-1 Rh: 0,41 ng g-1 Białystok, Polsko (2000) Silnice E67 s vysokou intenzitou dopravy Tráva: Pt: 8,98±0,39 ng g-1 Pd: 3,20±0,23 ng g-1 Rh: 0,68±0,18 ng g-1 Saarbruecken, Německo (1999) Město Pampeliška: 5,4±0,4 ng g-1 0,83±0,15 ng g-1 2,2±0,3 ng g-1 Živočichové Sever Švédska ( ) Hnízda na severu Švédska Vejce sokola stěhovavého: Pt: 0,45 ng g-1 Pd: 0,45 ng g-1 Rh: 0,48 ng g-1 Sever Švédska (1997 a 2000) Hnízda na severu Švédska Výkaly sokola stěhovavého: Pt: 0,28 ng g-1 Sever Švédska (2000, 2001) Hnízda na severu Švédska Krev ptáčat sokola stěhovavého: Pt: 3,44 ng g-1 Pd: 1,23 ng g-1 Rh: 0,67 ng g-1

8 i dalších složek životního prostředí, jako jsou např. podzemní a povrchové vody, půda, biota. Zvýšená množství platiny byla nalezena v prachu kolem frekventovaných silnic, především v tunelovém prachu a také v říčních sedimentech. PTK z automobilových emisí, které tvoří depozit v prachu a půdách kolem silnic, mohou být za určitých podmínek vymývány deštěm do okolních vodních toků (kyselé deště, vysoký obsah chloridů). Lze předpokládat, že zmíněné platinové kovy reagují s dalšími chemickými sloučeninami za vzniku látek schopných vazby do biologicky významných sloučenin, jako jsou nukleové kyseliny a proteiny. Řada sloučenin platiny je vysoce toxických a působí jako silné alergeny (Lustig, 1997). Stále se zvyšující obsahy těchto kovů v životním prostředí tak mohou představovat významné rizikové faktory pro zdraví člověka (Barefoot, 1997). Stanovení koncentrací těchto kovů ve vzorcích životního prostředí běžnými přístroji je velmi komplikované a často není možné bez předchozí separace, neboť je zatíženo množstvím interferencí (zejména Pd). Stanovení PTK v různých typech vzorků 1) PTK ve vzorcích ovzduší pevné částice (PM) Odběry vzorků ovzduší (PM) jsou prováděny přístroji Leckel MVS6 (Sven Leckel, Německo) po dobu 24 hodin v různých lokalitách, např. v tunelu Mrázovka v Praze, na frekventovaných křižovatkách v Brně atd. Před vlastním odběrem a následně odebrané vzorky jsou uchovány po dobu 48 hodin v klimatizované místnosti při teplotě C a poté zváženy (před i po odběru). Po zvážení jsou vzorky s PM podrobeny rozkladu v mikrovlnném zařízení SW-4 (Berghof, Německo) v uzavřených teflonových nádobkách. Rozklad je prováděn dle normy CSN EN Filtr je opatrně vložen do nádobky celý, poté je přidáno 5 ml ultračisté kyseliny dusičné a 0,5 ml ultračisté kyseliny chlorovodíkové (používá se pouze při stanovení PTK, jinak je používán peroxid vodíku). Po uzavření jsou nádobky vloženy do rotoru a teplota mineralizace je postupně zvyšována až na 220 C a tlak na 30 bar. Po skončení mineralizace jsou vzorky převedeny do odměrných baněk o objemu 25 ml a doplněny ulračistou vodou. Kalibrační roztoky jsou připraveny z jednoprvkových standardních roztoků Astasol (Analytika, Praha) se stejnou koncentrací kyselin jako při mineralizaci. Společně se vzorky filtrů je rozložen i certifikovaný referenční materiál BCR 723 (Road dust) s certifikovaným obsahem Pt, Rh a Pd. Vzorky jsou měřeny s využitím ICP-QQQ 8800 series (Agilent Technologies, Japonsko). První kvadrupól je nastaven tak, aby propustil pouze vybrané hmoty ( 103 Rh, 105 Pd, 195 Pt, 198 Pt). Do kolizně-reakční cely je vpouštěn amoniak o velkém průtoku. Dochází k reakci interferujících prvků a druhý kvadrupóĺ vyselektuje opět pouze vybrané hmoty. Detekční limity pro jednotlivé prvky: 4,26 ng.l Pt; 13,8 ng.l Pd; 1,21 ng.l Rh jsou spočítány jako průměr z deseti opakování měření signálu blanku + trojnásobek směrodatné odchylky blanku. Koncentrace PTK ve vzorcích filtrů s PM se pohybuje v rozmezí µg/g. Předseparační kroky nejsou možné z důvodu velmi malého množství vzorku (cca 1 mg). 6 Obrázek 4 Vzorkování půd Tabulka II Obsah vybraných prvků ve filtrech exponovaných 24 hod na křižovatce Kotlářská/Kounicova v Brně týdenní kampaň µg/g Rh Pd Pt F1 0,035 0,451 0,132 F2 0,013 0,121 0,090 F3 0,026 0,240 0,106 F4 0,025 0,222 0,081 F5 0,016 0,368 0,152 F6 0,008 0,118 0,023 F7 0,020 0,305 0,073 Obrázek 3 Kalibrační křivka je lineární v širokém rozsahu koncentrací

9 7 2) PTK ve vzorcích půd Vzorky půd jsou odebírány ve vzdálenostech 0, 1, 5, 20, 100 m od komunikace do hloubky 15 cm. Lokality jsou vybírány na základě intenzity dopravy a tak, aby pokryly oblast celé České republiky. Vzorky jsou po odběru sušeny čtrnáct dní při laboratorních podmínkách, poté jsou přesítovány sítem o velikosti ok 2 mm a homogenizovány na oscilačním mlýnu (Retsch, Německo). Z homogenizovaných vzorků jsou připraveny lučavkové výluhy v mikrovlnném zařízení. Postup je prováděn dle normy ČSN EN K navážce 1 g vzorku se přidá 2,5 ml kyseliny dusičné ultračisté a 7,5 ml kyseliny chlorovodíkové ultračisté. Po vložení do mikrovlnného rozkladného zařízení se teplota zvyšuje až na 180 C a tlak na 30 bar. Po ukončení rozkladu se vzorek převede do 100ml odměrné baňky. Současně se vzorky půd se provádí i rozklad certifikovaného referenčního materiálu BCR 723 (Road dust) s certifikovaným obsahem PTK. Obsah prvků se pohybuje v rozmezí 0-5 µg/kg, pouze u vzorků odebraných v těsné blízkosti silnice je obsah cca pětkrát vyšší. 3) Stanovení PTK v certifikovaném referenčním materiálu BCR Problematické stanovení koncentrací PTK v environmentálních vzorcích je možné velmi dobře demonstrovat přímo na certifikovaném referenčním materiálu BCR 723 (Road dust). Vzorek BCR byl rozložen stejným způsobem jako vzorky půd (viz výše). Problém se stanovením PTK v BCR 723 s využitím kvadrupólového ICP-MS bez využití předseparačních kroků spočívá zejména v interferencích Pd se Sr, proto jsou většinou stanovené koncentrace několikanásobně vyšší, než jsou skutečné obsahy ve vzorku (viz Obr. 5). Obrázek 5 Výsledky srovnání s certifikovaným materiálem v případě využití klasického ICP-MS systému a s použitím NH 3 jako reakčního plynu Obrázek 6 Výsledky srovnání s certifikovaným materiálem v případě využití ICP-QQQ a s použitím NH 3 jako reakčního plynu

10 103 Rh NH3 mode Uncertainty µg/kg 105 Pd NH3 mode Uncertainty µg/kg 195 Pt No gass Uncertainty µg/kg 198 Pt NH3 mode Uncertainty µg/kg 8 LOD 1.21 ppt 13.8 ppt 4.26 ppt 53.1 ppt Certif. value µg/kg BCR µg/kg BCR µg/kg NO GASS single quad Tabulka III Stanovené hodnoty koncentrací PTK v CRM BCR 723 s využitím ICP-QQQ a singlequad ICP-MS Závěr Přístroj ICP-QQQ přináší nové výhody pro analýzu ultrastopových koncentrací prvků, jak bylo demonstrováno výše. Ty spočívají zejména v přítomnosti dvou nezávislých kvadrupólů obklopujících dynamickou reakční celu, což umožňuje efektivní odstranění interferencí přímo v přístroji při využití různých měřících módů bez nutnosti použití separačních či prekoncentračních metod při přípravě vzorků. To je velmi důležité při omezeném množství analyzovaného vzorku (např. PM v ovzduší) nebo při stanovení prvků ve velmi rozdílných koncentracích ve vzorku. Navíc může být využito až čtyř reakčních plynů pro reakce jak sledovaných analytů, tak pro reakce interferujících prvků v rámci jedné analýzy. Velmi výhodné se zdá být použití amoniaku jako reakčního plynu pro stanovení např. koncentrací paladia pro odstranění vznikajících spektrálních interferencí v kombinaci s MS/MS módem. Jitka Hegrová jitka.hegrova@cdv.cz Ivo Novotný ivo.novotny@hpst.cz Jitka HEGROVÁ 1, Roman LIČBINSKÝ 1 a Walter GO- ESSLER 2. Využití ICP-QQQ pro přímé stanovení Pt, Rh a Pd v různých typech vzorků. 8. kurz ICP - MS/OES 2015, Brno, Brno : Spektroskopická společnost Jana Marka Marci, 2015, nestr. ISBN Laboratoře dopravní infrastruktury a životního prostředí Centra dopravního výzkumu, v.v.i., Brno; Laboratoř akreditovaná pro Stanovení Pb, Cd, As a Ni ve frakci PM 10 aerosolových částic metodou ICP-MS. 2 Institute for Chemistry - Analytical Chemistry, Graz, Austria Příspěvek byl publikován se souhlasem Spektroskopické společnosti Jana Marka Marci. Literatura BAREFOOT, R. R.. Determination of platinum at trace levels in environmental and biological materials. Environmental Science & Technology, 1997, Vol. 31, No. 2, p ISSN X. 3. FARGO, M.E., KANAVAGH, R. BLANKS, R. Platinum metal concentrations in urban road dust and soil in the United Kingdom. Fresenius J. Anal. Chem., 1996, Vol. 354, p ISSN FARGO, M. E., KAVANAGH, P., BLANKS, R., KELLY, J., KAZANTZIS, G., THORNTON, I., SIMPSON, P. R., COOK, J. M., PARRY, S., HALL, G. M., 1998: Platinum concentratios in urban road dust and soil in the United Kingdom. The Analyst, 123, GÓMEZ, B, GÓMEZ, M., SANCHEZ, J.L. et al. Platinum and rhodium distribution in airborne particulate matter and road dust. Sci. Tot. Environ., 2001, Vol. 269, p ISSN HELMERS, E., SCWARZER, M., SCHUSTER, M. Comparison of Pd and Pt in environmental matrices. Eniron.Sci.Pollut.Res., 1998, Vol. 5, HELMERS, E., KÜMMERER, K., Anthropogenic Platinum Fluxes: Quantifikation of sources and Sinks,and outlook. Eniron.Sci.Pollut.Res., 1999, Vol. 6, KÖNIG, H. P., HERTEL, R. F., KOCH, W., ROSNER, G. Determination of platinum emissions from a three-way catalyst-equipped gaoline engine. Atmos Environ., 1992, 26A, , ISSN LUSTIG, S., 1997: Platinum in the environment: car catallyst emitted platinum. Transformation behavior in soil and platinum accumulation in plants. UTZ-Wissenschaftsverlag München, Germany ISBN MOLDOVAN, M Origin and fate of platinum group elements in the environment. ABC, 388, (2007) 11. ZEREINI, F., SKERSTUPP, B., ALT, F. et al. Geochemical behaviour of platinum-group elements (PGE) in particulate emissions by automobile exhaust catalysts: experimental results and environmental investigations. Sci. Tot. Environ., 1997, Vol. 206, No. 2, p , ISSN Obrázek 7 Náhled technického uspořádání ICP-QQQ 8800 Agilent Technologies Obrázek 8 Náhled technického uspořádání ICP-QQQ 8800 Agilent Technologies

11 9 Spolehlivé a korektní srovnání citlivosti přístrojů: Instrument Detection Limit (IDL) Při výběru hmotnostního spektrometru ve spojení s chromatografií je citlivost jeden z důležitých parametrů. Nejčastěji je vyjadřována jako poměr signálu k šumu (signal-to-noise, S/N) při nástřiku definovaného množství vybraného analytu a přístroj, který dosáhne vyšší hodnoty, je považován za citlivější. Nicméně hodnota S/N závisí na mnoha proměnných a lze ji tedy jednoduše ovlivnit buď umělým zvýšením signálu, nebo snížením šumu. Signál lze například zvýšit napětím detektoru, pro získání nižšího šumu lze záznam vyhladit, odečíst šum tam, kde je nejnižší (nezávisle na elučním čase analytu), a v neposlední řadě záleží na způsobu výpočtu výšky šumu (peak-to-peak, RMS apod.). Uvedené postupy v praxi vedou k navýšení hodnoty S/N, které však není postaveno na reálném základě, a extrapolovaná mez detekce neodpovídá skutečně stanovitelnému množství analytu. Obrázky 1 a 2 ilustrují, jak lze pro identický chromatogram ovlivnit hodnotu S/N až o dva řády. V tomto světle je porovnání přístrojů na základě S/N minimálně diskutabilní. Obrázek 1 Závislost vypočteného poměru signál/šum na oblasti výběru šumu a šířce okna šumu. Všechny tři obrázky znázorňují identický chromatogram. Obrázek 2 Závislost vypočteného poměru signál/šum na metodě výpočtu šumu (Peak-to-peak, RMS nebo auto RMS). Všechny tři obrázky znázorňují identický chromatogram.

12 Dalším z kritických bodů při stanovování meze detekce přístroje je již zmíněná extrapolace signálu k šumu. Jako příklad může posloužit nejnovější generace LC/MS trojitých kvadrupólů, kde se pro pozitivní polaritu elektrospreje ve specifikaci uvádí S/N pro 1 pg reserpinu v hodnotách přes :1. Pokud budeme za mez detekce (LOD) považovat koncentraci analytu, pro kterou se dosáhne S/N > 3:1, po extrapolaci by LOD těchto přístrojů mělo být nižší než 0,05 fg vnesených na kolonu. Přitom ve skutečnosti se dosahují meze detekce o 1 až 2 řády vyšší. Citlivost analytických přístrojů udávaná takovýmto způsobem ve specifikačních listech je tedy irelevantní a jedná se o nic neříkající číslo na papíře. Pro korektní porovnání citlivosti je vhodnější používat metody, které jsou v praxi často využívané pro stanovení meze detekce či kvantifikace. Tyto postupy jsou zakotveny i v oficiálních metodických pokynech pro laboratoře. Např. dle EPA - Analytical Detection Limit Guidance, [1] je limit detekce metody (Method Detection Limit - MDL) definován jako minimální koncentrace sloučeniny, která může být změřena a reportována s 99% mírou pravděpodobnosti, že koncentrace analytu je větší než nula. Pro stanovení MDL je nutné opakované měření koncentrace analytu (alespoň 7 ) v příslušné matrici o koncentraci 1-5 násobku očekávané mezi detekce. Z naměřených dat je MDL vypočteno jako: MDL=t (n-1,1-α=0.99) s kde: t (n-1, 1-α=0,99) je kritická hodnota Studentova rozdělení pro hodnotu spolehlivosti 0,99 s n-1 stupňů volnosti (pro 7 opakování je hodnota Studentova rozdělení 3,143) n je počet opakování s je směrodatná odchylka odezvy z opakovaných měření. Podle této metodiky MDL závisí na opakovatelnosti měření koncentrací na limitu kvantifikace nebo nižších. Pro seriozní porovnání citlivosti přístrojů začala společnost Agilent Technologies uvádět i hodnotu Instrumentální Mez Detekce (IDL), která je stanovena analogicky jako MDL, tedy na základě několika opakovaných měření standardního roztoku, jehož koncentrace nesmí být vyšší, než je pětinásobek odhadované meze detekce. V praxi je většinou nutné provést opakované měření pro několik různých koncentračních hladin a následně se vybere ta, která je ke stanovení IDL vhodná. Výpočet IDL probíhá dle výše uvedené rovnice. IDL se u firmy Agilent Technologies stala standardem pro specifikaci citlivosti GC/MS i LC/MS přístrojů typu trojitého kvarupólu QQQ IDL Nastřikované množství Počet opakování Plocha % RSD t (99 %) IDL Reserpine (+) 1 fg n = fg Tabulka I Výpočet Instrumentální Meze Detekce (IDL) pro reserpin a chloramfenikol na trojitém kvadrupólu Agilent 6495 Chloramphenicol (-) 1 fg n = fg Obrázek 3 Chromatogramy reserpinu (vlevo) a chloramfenikolu (vpravo) znázorňující opakované nástřiky množství 1 fg a množství odpovídající vypočtené mezi detekce Příkladem výpočtu IDL v praxi je Tabulka I a Obrázek 3. IDL bylo stanoveno pro LC/MS trojitý kvadrupól Agilent 6495 (Obrázek 4), který je novinkou z roku 2014 a představuje současnou technologickou špičku. V Tabulce 1 jsou uvedeny výsledky opakovaného měření (n=10) při nástřiku 1 fg absolutního množství reserpinu (ESI pozitivní), respektive chloramfenikolu (ESI negativní), kdy vypočtená opakovatelnost plochy píku při tomto analyzovaném množství byla 7,2% pro reseprpin a 9,7% pro chloramfenikol.

13 11 Dle výše uvedené rovnice, v níž je směrodatná odchylka vypočtena jako RSD měřené množství, bylo vypočteno IDL 0,2 fg pro reserpin a 0,27 fg pro chloramfenikol. Na Obrázku 3 jsou vidět chromatogramy obou analytů z opakovaných nástřiků množství 1 fg, přeložené s chromatogramem při nástřiku množství odpovídajícímu vypočtenému IDL. Tento obrázek dokladuje nejen vynikající opakovatelnost na tak nízké hladině, jako je 1 fg, ale i fakt, že stanovené IDL je stále ještě pohodlně detekovatelným množstvím analytu a signál přibližně odpovídá trojnásobku šumu. Závěr: Specifikace citlivosti přístroje založená na poměru signálu k šumu může poskytovat zkreslující informace, neboť hodnota signálu k šumu je snadno ovlivnitelná řadou parametrů. Naopak parametr IDL přináší několik výhod: (i) s hodnotou IDL v podstatě nelze manipulovat: se šumem se nepracuje vůbec, a zvýšení napětí detektoru zvýší pouze výšku signálu, nikoli množství iontů dopadajících na detektor, a tím i opakovatelnost; (ii) pro výpočet se používají koncentrační hladiny blízko detekčního limitu a není proto nutné výsledky extrapolovat. Praktické příklady ukazují, že tento přístup poskytuje realistické hodnoty meze detekce přístroje, a lze jej tudíž využít jako objektivního parametru porovnání. Jitka Zrostlíková jitka.zrostlikova@hpst.cz Literatura: 1. EPA - Analytical Detection Limit Guidance, 1996: Laboratory Guide for Determining Method Detection Limits Obrázek 4 Trojitý kvadrupól LC-MS Agient 6495

14 Agilent 1290 Infinity II: čas pro maximální propojení hardwaru a softwaru ve 21. století 12 Nová generace kapalinových chromatografů firmy Agilent Technologies představuje budoucnost UHPLC systémů. Systém Agilent 1290 Infinity II Vám nabídne vše, co od UHPLC systému ve 21. století očekáváte: výjimečnou spolehlivost, robustnost, flexibilitu a především také řadu průlomových technologií pro zajištění maximální efektivity ve Vaší laboratoři. Stejně jako u předchozí generace se jedná o systém modulární. Velikou devízou tohoto systému je jeho zpětná kompatibilita s předchozími generacemi, a to až do roku 1995, kdy byl uveden na trh dnes již legendární kapalinový chromatograf HP/Agilent Uživatel tak může volit postupnou obměnu systému, který má v laboratoři již 20 let, a tak například jednoduchou výměnou DAD detektoru zvýšit citlivost svých analýz až 10x. Agilent Technologies Vám v systému 1290 Infinity II nenabízí pouze vyšší tlakový limit, větší kapacitu autosampleru, účinnější ohřev kolon a vyšší rychlost sběru dat jako drtivá většina výrobců kapalinových chromatografů, ale mnohem více. Dokážeme zkombinovat možnosti hardwaru a softwaru pro získání maximálního užitku jak pro uživatele systémů Agilent Technologies, tak pro uživatele pracující na jiných systémech. Řeč je o technologii ISET (Intelligent System Emulating Technology), která dokáže velice jednoduchým způsobem převést metodu z jednoho instrumentu na druhý, a to přizpůsobením vnitřního objemu systému a úpravou gradientového profilu tak, že se získaný chromatografický záznam mezi dvěma emulovanými systémy nijak neliší. Emulovat lze nejen chromatografické systémy firmy Agilent Technologies, ale také například HPLC systémy jiných výrobců. Převod metod je v tuto chvíli opravdu jen otázkou několika kliknutí a analýzy budou vypadat naprosto stejně se stejnými retenčními časy a rozlišením jako na Vašem starém systému. Zároveň máte možnost využít chromatografický systém s tlakovým rozsahem až do 1300 bar a zkrátit tak chromatografické analýzy při zachování nebo zlepšení rozlišení a snížit tím celkové náklady na jednotlivé analýzy. Další užitečnou vlastností systémů Agilent 1290 Infinity II je integrovaný software BlendAssist, který Vám automaticky dokáže připravit mobilní fázi požadovaného složení a koncentrace. Jedná se o velice praktickou funkci, která maximálně usnadňuje uživatelům práci s mobilními fázemi. Obrázek 1 UHPLC Agilent 1290 Infinity II Obrázek 2 ISET emulování chromatografických systémů

15 13 Stále více laboratoří, především ve farmaceutickém průmyslu, vyžaduje s ohledem na výrazné zkrácení chromatografických metod stále vyšší kapacitu autosamplerů se zajištěním minimálního nežádoucího přenosu analytů mezi nástřiky, tj. dobře známého carryover. Nový Multisampler díky revolučnímu řešení tyto všechny požadavky s přehledem splňuje. Jedná se o jediný autosampler svého druhu, který dokáže bez nutnosti dalšího přídavného modulu zpracovat více jak 6000 vzorků. Veškerá potenciální kapacita je zahrnuta v základním uspořádání modulu. Minimální carryover je zajištěn díky možnosti oplachu jehly až třemi různými Obrázek 3 Multikolonový termostat kolon Obrázek 4 Uchycení kolony pomocí A-line kontektorů rozpouštědly, včetně tzv. zpětného oplachu sedla jehly. O teplotní stabilitu kolony, která je zásadní pro přesnou identifikaci látky na základě retenčního času, se stará Multikolonový termostat s novou generací termobloků, sloužící k zajištění nejúčinnějšího přechodu tepla (předkolonová temperace mobilní fáze). Princip ohřevu mobilní fáze bez nuceného proudění vzduchu (still air) zamezuje nežádoucímu radiálnímu přehřívání kolony, které při separacích za vyšších tlaků prokazatelně způsobuje snížení separační účinnosti na koloně až o 40 %. V termostatovaném prostoru, stejně tak jako mimo něj, lze umístit celou řadu ventilů, které výrazně rozšiřují aplikační využití celého přístroje, ať už jde o pouhé přepínání kolon, online SPE, vývoj metod nebo přechod na 2D-LC. O zajištění maximální citlivosti a rychlosti se u těchto systémů v drtivé většině případů stará DAD detektor. Nová generace toho detektoru předčí Vaše očekávání. Samozřejmostí je optofluidní technologie s jednoduchou výměnou cel (Max-Light Cartridge Cell), programovatelná optická štěrbina pro zajištění vhodného spektrálního rozlišení, a také nově nejvyšší rychlost sběru dat na trhu až 240 Hz. Unikátní umění zkombinovat možnosti hardwaru a softwaru je patrné také zde. Kombinací signálů ze dvou detektorů DAD s rozdílnými průtočnými celami získáte až 30x větší lineární dynamický rozsah detektoru. Ušetříte tak spoustu času nutného pro opakovanou analýzu vzorků, rekalibraci nebo případné ředění vzorků. Ne všechny látky lze samozřejmě detekovat prostřednictvím DAD detektoru. Takové látky, které ve své molekule neobsahují žádný chromofor nebo fluorofor, jsou ideální k měření na ELSD detektoru. Velkou výhodou proti klasickému detektoru je především možnost využití gradientových profilů mobilní fáze. Nová generace ELSD detektoru nabízí až 90x větší dynamický rozsah, 9x větší citlivost a především výrazně vyšší odezvu pro těkavé látky. Obrázek 5 Rozsah a citlivost při zapojení dvou DAD detektorů

16 14 Obrázek 6 Rozsah nového 1290 Infinity II ELSD detektoru UHPLC systém 1290 Infinity II je také mimo jiné ideální tam, kde 1D s ohledem na kapacitu píků nestačí. Přechod nebo rozšíření systému na 2D je díky unikátním ventilům velice jednoduchý. Získáte možnosti jako je heart-cutting, multiple heart-cutting nebo například Comprehensive 2D-LC analýzy. K dispozici je také nová publikace Two-dimensional liquid chromatography, principles, practical implementation and aplications, která Vám na 162 stranách poskytne vše, co budete potřebovat pro pochopení této chromatografické techniky. Spolu s přístrojem byla na trh uvedena také celá řada nového příslušenství pod jednotným označením A-Line. Mezi nejzajímavější novinku patří bezesporu nové spojky Agilent A-Line Quick Connect Fittings určené pro UHPLC, které jsou jako jediné skutečně těsnící spojky dotahovatelné rukou ( finger-tight ). Fungují jako jednoduchá páčka a lze je používat znovu a znovu bez obav z netěsností až do tlaků 1300 bar. V případě Vašeho zájmu o bližší informace prosím kontaktujte naše produktové specialisty Ing. Naděždu Jeřábkovou nebo Ing. Jana Kováře. Jan Kovář jan.kovar@hpst.cz Obrázek 7 Agilent A-Line Quick Connect Fittings

17 15 Agilent 7010 GC/MS/MS trojitý kvadrupól v analýze environmentálních kontaminantů V rámci uskutečněného měření byla provedena analýza 41 environmentálních kontaminantů v rozpouštědlových standardech na deseti koncentračních hladinách a ve vzorku povrchové vody (přirozené/uměle kontaminované). Všechna měření byla provedena s využitím plynového chromatografu Agilent 7890 ve spojení s hmotnostním spektrometrem typu trojitý kvadrupól Agilent 7010 MS/MS. Cílem experimentů bylo stanovit limity detekce pro jednotlivé sloučeniny ve standardech rozpouštědel a připravených extraktech povrchové vody a určit opakovatelnost (RSD, %) a linearitu GC/MS/MS měření v módu elektronové ionizace (EI). Cílové analyty Obrázek 1 Agilent 7010 series s automatickým dávkovačem 1,2,4,5-tetrachlorbenzen heptachlor 2,4 DDD bifenyl Parathionmethyl endrin pentachlorbenzen PCB kongener č. 52 2,4 DDT trifluralin aldrin PCB kongener č. 118 a- HCH Parathionethyl 4,4 DDD hexachlorbenzen oktachlorstyren b - endosulfan g- HCH isodrin PCB kongener č. 153 galaxolide Heptachloroepoxid cis 4,4 DDT tonalide Heptachloroepoxid trans PCB kongener č. 138 b-hch 2,4 DDE methoxychlor PCB kongener č. 31 PCB kongener č. 101 PCB kongener č. 180 PCB kongener č. 28 a-endosulfan PCB kongener č. 194 Obrázek 2 Agilent 7010 series s CTC autosamplerem d -HCH ε - HCH 4,4 -DDE dieldrin Měřené vzorky Směsný standard všech výše uvedených látek o koncentraci 100 ng/ml isooktanu. Standard o koncentraci 100 ng/ml byl následně použit pro přípravu série kalibračních roztoků o koncentraci 50, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 a ng/ml. Kalibrační roztoky byly naředěny do čistého isooktanu. Vzorek povrchové vody (přirozeně kontaminovaný). Vzorek povrchové vody byl následně uměle kontaminován výše uvedeným standardem na tři koncentrační hladiny 0.05, 0.1 a 0.5 ng/ml.

18 Instrumentální vybavení základní informace Agilent 7010 GC/MS/MS představuje čtvrtou generaci trojitých kvadrupólů (QQQ) společnost Agilent Technologies, který je v kombinaci s plynovým chromatografem (GC) Agilent 7890B ideálním řešením pro účely vysoce selektivní ultra-stopové kvantitativní analýzy v komplexních matricích. Velmi nízké limity detekce dosažitelné pomocí nového QQQ potvrzuje i deklarovaný detekční limit přístroje (IDL, Instrument Detection Limit) 0,5 fg OFN, jehož dosažení je požadováno při instalaci přístroje a během jeho životnosti. Agilent 7010 GC/MS/MS využívá efektivní ionizaci neutrálních molekul v iontovém zdroji, které jsou následně filtrovány ve vyhřívaném zlatém hyperbolickém kvadrupólu, fragmentovány v lineární hexapolové kolizní cele a detekovány v triple-off-axis detektoru. Plynový chromatograf 7890B GC přináší vysoce účinnou chromatografickou separaci. Inertní cesta od nástřiku po detektor využívá chemicky deaktivované technologie a spotřební materiál a napomáhá tak dosažení ještě lepší citlivosti vlastní analýzy. Nástřik vzorků je možný prostřednictvím různých typů inletu, jako je split/splitless, PTV či Multi Mode Inlet (MMI), který v sobě kombinuje výhody obou dvou předcházejících typů nástřiku. Turn Top systém těsnění inletů umožňuje výměnu linerů během 30 s bez nutnosti jakýchkoliv nástrojů. Přesná kontrola tlaků/průtoků plynu je umožněna díky použité kapilární fluidní technologii (CFT), která kromě velmi dobré opakovatelnosti výsledků přináší také možnost využití tzv. zpětného toku (backflush), dean switching nebo dělení toku do několika paralelně zapojených detektorů. Zpětný tok (backflush) podporovaný CFT zkracuje dobu analýzy, prodlužuje životnost GC kolony, snižuje riziko carry-over efektu a výrazně snižuje potřebu údržby iontového zdroje, kterou lze doplnit také automatickým čištěním pomocí technologie SCIS (aktivní čištění vodíkem více detailů v prvním čísle časopisu). V souvislosti s přesnou kontrolou průtoku mobilní fáze lze také implementovat tzv. retention time locking (RTL), který umožňuje dosažení identických retenčních časů nezávisle na operátorovi či údržbě kolony, což výrazně urychluje vlastní analýzu, a to především v případě multireziduálních metod. Ionty vzniklé v iontovém zdroji jsou následně filtrovány ve vyhřívaném zlatém hyperbolickém kvadrupólu s rozsahem hmot až do 1050 amu. Stabilita monolitického kvadrupólu umožňuje zahřívání až na 200 C, čímž dochází k tepelnému čištění a odstraňování kontaminace běžné u kovových kvadrupólů. V režimu MS/MS jsou ionty vybrané v prvním kvadrupólu následně fragmentovány v lineární hexapolové kolizní cele pomocí dusíku jako kolizního plynu. Do cely je také přiváděno malé množství tzv. zhášecího plynu (quenching gas), který snižuje množství přítomných metastabilních částic hélia (v případě, že je helium použito jako mobilní fáze). Tyto metastabilní částice navyšují neutrální šum detektoru, který je použitím zhášecího plynu eliminován. K detekci vybraných hmotnostních přechodů či iontů (v případě použití trojitého kvadrupólu jako jednoduchého kvadrupólu) dochází v tzv. triple-axis detektoru. Umístění elektronásobiče dvojitě mimo osu vzhledem ke vstupu iontů do detektoru vede ke snížení šumu a následně i detekčních limitů přístroje. Software Ovládání přístroje i následné zpracování dat je kontrolováno pomocí unikátního softwaru MassHunter. MassHunter akviziční software umožňuje měření ve vybraných módech MRM (multiple reaction monitoring), SIM (selected ion monitoring), full scan, scan produktových iontů atd. V rámci MRM měření je možno snímat až 800 MRM přechodů za sekundu s minimálním dwell time 0,5 ms a nulovým cross talk efektem. Ladění a kalibrace přístroje probíhá plně automaticky. Pro rychlé a efektivní zavedení nových MS metod či nových analytů do stávajících metod je možné využít rozsáhlou databázi MRM přechodů pesticidů a environmentálních kontaminantů. Mass Hunter Quantitative Analysis pro kvantitativní zpracování dat umožňuje tzv. Batch-at-a-Glance náhled na data. Vyhodnocovací metoda je pak tvořena z velké části automaticky na základě informací zadaných v akviziční metodě (MRM přechody pro jednotlivé sloučeniny, názvy sloučenin, retenční čas, typ analytu vnitřní standard, cílový analyt) a vlastní sekvenci (typ vzorku kalibrační roztok, vzorek, blank atd.). Reportování výsledků je možno provádět do Excelu nebo je k dispozici velké množství předpřipravených reportů v různých formátech. V případě potřeby je možno formát reportu upravit na míru. Kvalitativní zpracování dat probíhá v MassHunter Qualitative Analysis. V této části softwaru je možno využívat při měření v MRM módu např. funkci Find Compounds by MRM pro kontrolu retenčních časů, manuální integraci, porovnávání vzorků mezi sebou atd. V případě měření ve full scan módu je možné na základě naměřených spekter provádět např. identifikaci látek ve spojení s vybranou knihovnou spekter (NIST apod.). Z naměřených dat je pak možná i tvorba vlastních knihoven. 16 Obrázek 3 Multi mode inlet (MMI) Obrázek 4 Vyhřívaný zlatý hyperbolický kvadrupól Obrázek 5 Triple-axis detektor

19 17 Experimentální část Všechny GC/MS/MS experimenty byly provedeny na plynovém chromatografu Agilent 7890 ve spojení s hmotnostním spektrometrem Agilent 7010 typu trojitý kvadrupól. Plynový chromatograf byl vybaven autosamplerem Agilent 7693A, multimode inletem (MMI), purge ultimate jednotkou (PUU), která umožňuje zpětný proplach kolony (backflush) a modulem pro pneumatickou kontrolu (pneumatics control modul, PCM). Pro separaci byly využity dvě HP-5 MS UI kapilární kolony (15 m 0.25 mm i.d μm tloušťka filmu) zapojené za sebou v tzv. mid-column backflush uspořádání. Schématické znázornění celého systému je uvedeno na Obrázku 6. Obrázek 6 Schématické znázornění systému Purge ultimate union (PUU), který umožňuje zpětný proplach kolony (backflush) a no-vent aplikaci. Optimalizace GC/MS/MS metody Pro stanovení všech výše uvedených kontaminantů byla zvolena metoda předdefinovaná v databázi MRM přechodů dodávaná firmou Agilent Technologies. V rámci této databáze jsou kromě MRM přechodů a kolizních energií pro jednotlivé sloučeniny také stanoveny přesné retenční časy. Pro zavedení GC metody byl nejprve proveden tzv. Retention Time Locking s využitím chlorpyrifos-methylu jako lockovací sloučeniny. V dalším kroku byly z MRM databáze vybrány pro cílové analyty příslušné MRM přechody (3 MRM přechody/1 sloučenina), které byly následně dle zadaných kritérií auto maticky rozděleny do jednotlivých časových segmentů, a to s využitím nástroje Compound List Assistent. Pro sloučeniny, které nejsou uvedeny v MRM databázi, byly přechody naladěny s využitím dodaného standardu. Na závěr byla provedena optimalizace podmínek nástřiků, byly otestovány módy nástřiku cold splitless (CLS, 1 a 2 μl), hot splitless (HSL, 1 μl) a solvent vent (SV, 2 μl). V Tabulce I je uveden přehled testovaných typů nástřiků včetně detailního popisu nastavení jednotlivých parametrů. Tabulka I Přehled testovaných typů nástřiků včetně detailního popisu nastavení jednotlivých parametrů Cold splitless Hot splitless Solvent vent Objem nástřiku (µl) Splitless time (min) 0,75 0,75 0,75 1 Split flow (ml/min) Teplota nástřiku ( C) 65 C (0,1 min), 600 C/min do 325 C (5 min) 65 C (0,1 min), 600 C/min do 325 C (5 min) 325 C 65 C (0,1 min), 600 C/min do 325 C (5 min) Solvent vent time (min) Solvent vent flow (ml/min) Solvent vent pressure (psi)

20 Parametry GC/MS/MS metody Plynový chromatograf: Typ nástřiku: Agilent 7890B Series Multi mode inlet (MMI) Typ lineru: Ultra inert liner, universal, low pressure drop, glass wool (Part No ) Mód nástřiku: Teplota nástřiku: Objem nástřiku: 1 µl GC kolona: Mobilní fáze: Teplotní program pece: Celková doba analýzy: Cold splitless (40 ml/min, 0,75 min) 65 C (0,1 min), 600 C/min to 325 C (5 min) 2x HP-5ms UI (15 m 0,25 mm 0,25 µm) Helium (konstantní průtok: 1. kolona 0,975 ml/min, 2. kolona 1,1975 ml/min) 60 C (1 min), 40 C/min do 170 C, 3 C/min do 310 C (1 min) 18,75 min Parametry backflush: teplota 310 C tlak 37 psi doba 3 min Hmotnostní spektrometr: Typ ionizace: Teplota iontového zdroje: 280 C Teplota 1. a 2. kvadrupólu: 150 C Akviziční mód: MRM přechody: Dwell time: Kolizní plyn: Zhášecí plyn: Agilent 7010 Series EI Multiple reaction monitoring (MRM) viz Tabulku (Kompletní tabulka přechodů na vyžádání na ivo.novotny@hpst.cz) Nastaven s ohledem k počtu MRM přechodů v daném časovém segmentu tak, aby byla zachována frekvence akvizice cca 5 Hz. Dusík (1.5 ml/min) Helium (4 ml/min) 18 Obrázek 7 Agilent 7000 series - konstrukce Sekvence V rámci experimentu byly změřeny níže uvedené sekvence standardu a vzorku. Pro výpočet opakovatelnosti byly dané standardy a vzorky změřeny 10 za sebou. Na začátku každé sekvence byl proveden nástřik čistého isooktanu pro kontrolu kontaminace pozadí. Obrázek 8 Kapilární fluidní technologie Agilent Technologies 18/05/2015 CLS (1 μl) 19/05/2015 CLS (2 μl) 20/05/2015 SV (2 μl) 21/05/2015 CLS (1 μl) 22/05/2015 HSL (1 μl) kalibrace 0, ng/ml 10 standard 0,1 ng/ml 10 standard 1 ng/ml 10 standard 10 ng/ml kalibrace 0,005 0,1 ng/ml 10 standard 0,1 ng/ml kalibrace 0,005 1 ng/ml 10 standard 0,1 ng/ml 10 vzorek 5 (přirozeně kontaminovaný) 10 vzorek SP1 (uměle kontaminovaný na hladinu 0,05 ng/ml) 10 vzorek SP2 (uměle kontaminovaný na hladinu 0,1 ng/ml) 10 vzorek SP3 (uměle kontaminovaný na hladinu 0,5 ng/ml) kalibrace 0,005 1 ng/ml 10 standard 0,1 ng/ml