U n i v e r z i t a P a l a c k é h o v O l o m o u c i

Transkript

1 U n i v e r z i t a P a l a c k é h o v O l o m o u c i Přírodovědecká fakulta Analýza markerů pro charakterizaci siličných drog Bakalářská práce Autor: Školitel: Vegerová Klára doc. RNDr. Barták Petr, Ph.D. Studijní program: Studijní obor: Forma studia: B 1407 Chemie Management v chemii Prezenční Olomouc 2013

2 Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracovala samostatně. Veškeré literární prameny a informace, které jsem v práci využila, jsou v seznamu použité literatury. Souhlasím s tím, že práce je prezenčně zpřístupněna v knihovně Katedry fyzikální chemie Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého v Olomouci. V Olomouci dne Vlastnoruční podpis

3 Ráda bych tímto poděkovala doc. RNDr. Petru Bartákovi, Ph.D. za odborné vedení bakalářské práce, jeho cenné rady v průběhu celého vypracování a poskytnutí některých materiálů použitých pro sepsání této bakalářské práce.

4 Bibliografická identifikace Jméno a přijmení: Klára Vegerová Název práce: Analýza markerů pro charakterizaci siličných drog Typ práce: bakalářská Pracoviště: Katedra analytické chemie Vedoucí práce: doc. RNDr. Petr Barták, Ph.D. Rok obhajoby práce: 2013 Abstrakt: Pomocí SPME extrakce a plynové chromatografie s hmotnostní detekcí byly zkoumány markery pro charakterizaci čtyř bylin bazalky pravé, rozmarýnu lékařského, šalvěje lékařské a tymiánu obecného. Nejprve byly byliny vysušeny a následně nadrceny na homogenní směs. Pro izolaci markerů bylo využito mikroextrakce tuhou fází a destilace. Při mikroextrakci tuhou fází byl vzorek umístěn do vialky a následně proběhla extrakce při 40 C. Během destilace bylo získáno 50 ml destilátu. Silice byly z destilátu extrahovány pomocí rozpouštědla. Po extrakci byla provedena separace na plynovém chromatografu s hmotnostní detekcí (GC-MS) a byly analyzovány látky (markery) charakteristické pro výše zmíněné byliny. Klíčová slova: silice, léčivé byliny, mikroextrakce tuhou fází, destilace, extrakce Počet stran: 51 Jazyk: čeština

5 Bibliographical identification Author s first name and surname: Klára Vegerová Title: Analysis of markers for the characterization of aromatic drugs Type of thesis: Bachelor Department: Department of Analytical Chemistry Supervisor: doc. RNDr. Petr Barták, Ph.D. The year of presentation: 2013 Abstract: Markers for the characterization of four herbs basil, rosemary, sage and thyme were examined by SPME extraction and gas chromatography with mass spectrometric detection. At first, herbs were dried and grinded to a homogeneous mixture. Solid phase microextraction and distillation were used for isolation of markers. During solid phase microextraction the sample was placed in a vial and extraction was performed at 40 C. 50 ml of distillate was obtained during the distillation. Essential oils were extracted from the distillate by using of solvent. After extraction, separation was performed by gas chromatography with mass spectrometry (GC-MS) and substances (markers) characteristic for above-mentioned herbs were analyzed. Keywords: essential oils, medicinal herbs, solid phase microextraction, distillation, extraction Number of pages: 51 Language: Czech

6 OBSAH 1 ÚVOD TEORETICKÁ ČÁST Silice Uhlovodíky Alkoholy Ethery Karbonylové sloučeniny Estery Fenoly Využití silic Extrakce Moderní metody extrakce Mikroextrakce tuhou fází (SPME) Extrakce tuhou fází (SPE) Superkritická fluidní extrakce (SFE) Mikroextrakce jednou kapkou (SDME) Klasické metody extrakce Destilace Destilace vodní parou Prostá destilace Lisování Enfluráž Extrakce Chemické složení bylin Bazalka pravá (Ocimum basilicum, L.) Rozmarýn lékařský (Rosmarinus officinalis, L.) Šalvěj lékařská (Salvia officinalis, L.) Tymián obecný (Thymus vulgaris, L.) EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Rostlinný materiál a chemikálie Pomůcky a přístroje Pracovní postupy... 29

7 3.3.1 Extrakce pomocí destilace Extrakce pomocí SPME vlákna VÝSLEDKY A DISKUZE Analýza bazalky pravé (Ocimum basilicum, L.) Analýza rozmarýnu lékařského (Rosmarinus officinalis, L.) Analýza šalvěje lékařské (Salvia officinalis, L.) Analýza tymiánu obecného (Thymus vulgaris, L.) ZÁVĚR SUMMARY BIBLIOGRAFIE SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK... 51

8 1 ÚVOD Hlavním cílem této práce je určení charakteristických látek obsažených ve vybraných rostlinách pomocí dvou metod extrakce. Zvolenými metodami extrakce jsou mikroextrakce tuhou fází (SPME) a destilace, které jsou vhodné pro izolaci látek obsažených v rostlinném materiálu tzv. silic. Následně byla provedena analýza na plynovém chromatografu s hmotnostní detekcí. Jako rostlinný materiál byly zvoleny rostliny z čeledi Lamiaceae - bazalka pravá (Ocimum basilicum, L.), rozmarýn lékařský (Rosmarinus officinalis, L.), šalvěj lékařská (Salvia officinalis, L.) a tymián obecný (Thymus vulgaris, L.). Tyto rostliny jsou charakteristické svým obsahem silic. Silice jsou směsí velkého množství látek, přičemž některé z těchto obsažených látek by mohly sloužit jako identifikační znaky neboli markery pro tyto čtyři vybrané druhy bylin. Některé z byliny obsahující silice lze označit jako siličné drogy. Ve slovníku najdeme pod slovem droga definici, která říká, že drogou muže být buď látka sloužící jako léčivo ve farmacii, nebo návyková či psychotropní látka, jež v určitých případech způsobuje závislost. Vyhledáme-li slovo silice, pak zjistíme, že silice jsou tvořeny směsicí chemických sloučenin, které vytváří jejich charakteristickou vůni a léčivé účinky. V přírodě hrají také velmi důležitou roli při ochraně rostlin. Pojmem siličná droga lze tedy popsat produkt s určitým obsahem silic, který je možno využít k léčbě. Skupina siličných drog je velmi široká a kromě výše zmíněných rostlin je zastoupena také mátou peprnou, heřmánkem lékařským, kmínem a mnoha dalšími. Dnes se však převážná většina těchto bylin využívá především v kuchyni, kde slouží jako koření k dochucování pokrmů. V minulosti však bylo známo, že tyto byliny lze využít i pro jiné účely. Jen málokdo v dnešní době synteticky vyráběných léčiv ví, že například z tymiánu lze udělat odvar, a ten posléze využít jako prostředek napomáhající vykašlávání. Dnešní využití rostlinných výtažku je vztaženo spíš k farmaceutické výrobě tablet, doplňků stravy, sprejů nebo sirupů. 8

9 2 TEORETICKÁ ČÁST 2.1 Silice V literatuře jsou silice popisovány jako látky lipofilní, ve vodě obtížně rozpustné, mající většinou charakteristickou vůni. Jsou to látky těkavé a během skladování mohou rychle měnit svou barvu působením tepla, světla a vlhka (tmavnou) a také viskozitu (tuhnou). Z toho důvodu je třeba je pečlivě uschovávat a chránit před výše zmíněnými faktory. Již v dávných dobách byly silice využívány pro výrobu koření a parfémů, později byly používány k léčbě. Silicím se také přezdívá esenciální či éterické oleje, což vyplývá z jejich schopnosti vydávat vůni případně zápach. Lokace silic v přírodních rostlinných materiálech je různá. Mohou být získávány z květů, stonků, plodů či semen, listů, kořenů i cibulí. Mezi 3 základní způsoby získávání silic se řadí destilace vodní parou, extrakce nepolárními rozpouštědly a lisování. Při každé z těchto zmíněných metod může čas od času docházet k nežádoucím chemickým změnám. Při destilaci vodní parou může dojít k chemickým přeměnám monoterpenů, zatímco u extrakce nepolárními rozpouštědly se během odstraňování extrakčního činidla ztrácí těkavé složky. V dnešní době se pro analýzu těkavých složek silic využívá také mikroextrakce pevnou fází, kdy se nepoužívají rozpouštědla a navíc je tato analýza časově výhodnější. Nejvýraznější podíl v silicích mají terpeny. Terpeny se na základě počtu isoprenových jednotek dělí na monoterpeny, seskviterpeny, diterpeny, triterpeny, tetraterpeny a polyterpeny. V silicích se vyskytují převážně monoterpeny a seskviterpeny. Velmi vysoký podíl v silicích tvoří monoterpenické a seskviterpenické uhlovodíky, ale ve většině případů nemají zásadní význam ani pro chuť a ani pro vůni. Ovlivňují především rozpustnost silic a jejich nestálost na vzduchu. Po odstranění uhlovodíků se silice stávají stabilnějšími. Látky, které mají na starost chuť a vůni látek jsou především látky obsahující kyslík - alkoholy, aldehydy, ketony, fenoly, estery a jiné. [1,3] Uhlovodíky V silicích můžeme nejčastěji pozorovat terpenové uhlovodíky, které se podle struktury dělí na alifatické, alicyklické a aromatické. Ačkoliv nejsou považovány za příliš významné, u ovoce, zeleniny a koření tvoří nejčastěji typickou vůni. V případě pomerančů je to až 99 % vonných látek. Na tvorbě vůně se podílí především monoterpeny, a méně pak seskviterpeny. 9

10 Terpenové uhlovodíky mají sklony na vzduchu oxidovat a to převážně za vyšších teplot. Průběh a výsledek oxidace je silně ovlivněn strukturou uhlovodíků. Na základě počtu cyklů, jimiž jsou tvořeny, lze uhlovodíky rozdělit na monocyklické a bicyklické. První skupinou uhlovodíků jsou monoterpenové uhlovodíky, které se dělí na alifatické monoterpeny - myrcen (šalvěj, bazalka, pomeranč) a ocimen (šalvěj, bazalka) monocyklické monoterpeny - uhlovodíky nejčastěji odvozené od p-menthanu (menthadieny); limonen (citrusové plody, máta), γ-terpinen (šalvěj, tymián), β-fellandren (rozmarýn, tymián, šalvěj) bicyklické monoterpeny - α-pinen (máta, tymián), β-pinen (vyskytuje se většinou společně s α-pinenem v koriandru, muškátu aj.) myrcen ocimen γ-terpinen α-pinen β-pinen Druhou, ale již méně významnou skupinou jsou seskviterpenové uhlovodíky. Seskviterpeny se nepodílejí na tvorbě aroma bylin takovým způsobem jako monoterpeny, jelikož u seskviterpenů nedochází k výraznému vypařování. Dělí se na acyklické, monocyklické a bicyklické seskviterpeny. acyklické seskviterpeny - farneseny v různých isomerech (α-farnesen fíkovník) monocyklické seskviterpeny - humulen (bazalka, šalvěj) či β-bisabol (bazalka) bicyklické seskviterpeny - δ-kadinen (bazalka, tymián), β-karyofyllen (bazalka, rozmarýn 10

11 α-humulen β-karyofyllen Typickým zástupcem aromatických uhlovodíků silic je p-cymen, který se vyskytuje v tymiánu, bazalce, ale i mnoha dalších rostlinách.[1,3] p-cymen Alkoholy Alkoholy, stejně jako uhlovodíky, je možno dělit na alifatické, alicyklické a aromatické alkoholy, ale navíc také na alkoholy heterocyklické. Nejčastěji se podobně jako uhlovodíky vyskytují ve formě monoterpenů či seskviterpenů, méně významné jsou diterpeny. Acyklické alkoholy monoterpenů i seskviterpenů voní po květinách, avšak v případě monoterpenů je tato vůně spíš těžká. Monoterpenové alkoholy lze dělit na acyklické monoterpenové alkoholy - linalool (máta, bazalka, tymián), geraniol (palma růžová) či jeho izomer nerol monocyklické monoterpenové alkoholy - α-terpineol (majoránka, bazalka, šalvěj), menthol (máta). bicyklické monoterpenové alkoholy - borneol (šalvěj, muškátový oříšek) linalool α-terpineol borneol 11

12 Kromě monoterpenových alkoholů jsou složkou silic i seskviterpenové alkoholy, které se dělí na alicyklické seskviterpenové alkoholy - farnesol (pomeranč) monocyklické seskviterpenové alkoholy - α-bisabolol (citrusy) bicyklické seskviterpenové alkoholy - guajenol (citrusy) Silice také běžně obsahují aromatické alkoholy, které vznikají procesem fermentace. Mezi aromatické alkoholy lze zařadit benzylalkohol, který je složkou silic jasmínu či hyacintu. [1,3] Ethery Ethery se v silicích vyskytují převážně ve formě alkylaryletherů, nejčastěji odvozených od anisolu (methoxybenzen) nebo veratrolu (o-dimethoxybenzen). Mezi významné ethery patří estragol neboli methylchavikol (estragonová silice), anethol (anýzová, fenyklová silice) a methlyeugenol (hřebíčková silice). K etherům se řadí také oxirany (1,2-epoxidy) a tetrahydrofurany (1,4-epoxidy). Oxirany jsou organické látky tvořené trojčlenným kruhem, který obsahuje kyslík, zatímco tetrahydrofurany jsou pětičlenné kyslíkaté heterocyklické látky. Příkladem epoxidů je eukalyptol neboli 1,8-cineol (máta, bazalka, šalvěj) či menthofuran (máta).[1,3] methyleugenol methylchavikol eukalyptol Karbonylové sloučeniny Podle toho, jakou skupinu karbonylové sloučeniny obsahují, se dělí na aldehydy (aldehydová skupina -CH=O) a ketony (ketoskupina -C(=O)-). Těkavé aldehydy a ketony jsou velmi žádané, jelikož jsou to právě ony, které způsobují chuť a vůni. Aldehydy Jako vonné látky se uplatňují skoro všechny nasycené alifatické aldehydy a z nenasycených alifatických aldehydů jsou nejvýznamnější monoterpenové aldehydy. 12

13 Obecně lze říci, že alifatické aldehydy obsahující 1 až 7 atomů uhlíků vykazují vůni ostrou až nepříjemnou, zatímco aldehydy mající 8 až 14 atomů uhlíku spíše příjemně voní. Aldehydy odvozené od seskviterpenů se v silicích vyskytují také, ale opět nemají takový význam jako monoterpeny. Mezi nenasycené alifatické monoterpenové aldehydy patří citral (citrusové plody, zázvor), který tvoří 2 izomery geranial a neral. geranial neral V silicích je možno často sledovat i aromatické aldehydy, kde je jedním z nejvýznamnějších aldehydů benzaldehyd (heřmánek, skořice). Od benzaldehydu lze odvodit mnoho látek jako například hydroxyaldehydy. Hydroxyaldehydy jsou látky, které mohou zastupovat aldehydy, ale také fenoly. Nejznámějším zástupcem hydroxyaldehydů je vanillin (vanilkové lusky).[1,3] Ketony Schopnost tvořit aroma mají především ketony alifatické nasycené i nenasycené. Charakteristickou vlastností skupiny vyšších ketonů tzv. methylketonů je především zápach, díky kterému se používají jako indikátory. Zatímco ketony s kratšími řetězci se využívají jako vonné látky v kosmetice. Ketony se také dělí na monoterpeny a seskviterpeny a nositeli aroma jsou především monoterpenové ketony. Jako příklad monocyklického ketonu může sloužit karvon (silice kmínu, kopru), menthon a jiné. Bicyklické monoterpenové ketony zastupuje thujon (silice šalvěje a pelyňku), který se běžně vyskytuje ve dvou izomerech α a β, verbenon a kafr (skořice, šalvěj, rozmarýn).[1,3] α-thujon β-thujon kafr verbenon 13

14 2.1.5 Estery Estery jsou v potravinách celkově velmi rozšířenou složkou, což je důvodem, proč u ovoce, zeleniny a koření způsobují primární aroma. Toto aroma je zapříčiněno převážně estery nižších mastných a aromatických kyselin s nižšími alkoholy jak alifatickými, tak aromatickými. Nejběžnější kyselinou vázanou v esterech je kyselina octová, méně se pak vyskytuje kyselina mravenčí či propionová. Z alkoholů je nejčastěji vázán ethanol, méně pak methanol, allylalkohol či butanol. Ve výsledku jsou běžné acetáty geraniolu, nerolu či borneolu.[1,3] Fenoly Fenoly jsou látky podílející se na vonných a chuťových vlastnostech všech potravin. U některých fenolů lze sledovat i antioxidační účinky. V silicích se fenoly vyskytují převážně ve formě jednoduchých alkylfenolů. Významnými fenolickými sloučeninami jsou karvakrol a thymol, které mají velmi podobnou vůni a obě jsou obsaženy v tymiánové silici. Eugenol je složkou hřebíčkové silice, zatímco isoeugenol se vyskytuje v silici bazalkové. [1,3] thymol karvakrol eugenol Využití silic Kromě využití silic v průmyslu či kosmetice je lze využít i v oblasti lékařství. Podle jejich účinku je lze rozdělit do několika skupin. Látky dráždící kůži, slouží jako přísada při výrobě mastí na revmatismus. Tyto látky obsahují především pineny, karvakrol, eukalyptol a limonen. Jako antiflogistika jsou označovány látky, které působí protizánětlivě a příkladem může být silice heřmánku. Látky napomáhající vykašlávání a lepší průchodnosti dýchacích cest jsou označovány jako expektorancia. Mezi hlavní silice s touto vlastností patří silice eukalyptová (inhalace), tymiánová a fenyklová (orální použití). 14

15 Stomachika dráždí žaludeční sliznici, což napomáhá trávení a podporuje chuť k jídlu. Do této skupiny lze zařadit především látky, které mají charakter koření (ostrá a pálivá chuť). Karminativa látky používající se při nadměrné plynatosti střev. Působí dezinfekčně a proti křečím. Zástupci karminativ jsou heřmánek, kmín, anýz, nať máty a mnoho dalších. Diuretika jsou látky, které mají dobrý vliv na močové cesty. Příkladem může být tymián či šalvěj. Dezinfekčně pak působí látky obsahující například thymol, karvakrol a eukalyptol. Mezi rostliny s dezinfekčním účinkem patří například heřmánek, šalvěj, tymián a měsíček lékařský. [1,2,3] 15

16 2.2 Extrakce Extrakce je proces, který slouží k izolaci určitých látek a jejich následnému zakoncentrování. Metody extrakce by se daly rozdělit na metody moderní a klasické. V případě získávání esenciálních olejů z různých rostlinných materiálů lze využít metody mikroextrakce tuhou fází (SPME), která je odvozená extrakce tuhou fází (SPE), dále pak metod jako jsou mikroextrakce na jedné kapce (SDME) či superkritická fluidní extrakce (SFE). Tyto metody by se daly řadit k moderním metodám extrakce. Ke klasickým metodám získávání silic se řadí především destilace (destilace vodní parou, prostá destilace), lisování, extrakce a enfluráž. Výše zmíněné moderní metody extrakce lze označit jako analytické metody, zatímco klasické metody jsou spíše preparativní. Pro analytické metody je charakteristické, že k jejich provedení je třeba pouze malé množství vzorku pro analýzu. Analytické metody se dají například velmi dobře využít při zkoumání složení jednotlivých částí rostlin či složení rostlin rostoucích blízko u sebe. V tom případě lze analyzovat, zda je jejich složení ovlivněno místem růstu a dalšími podmínkami (světlo, vláha, hnojení) a popřípadě jakou měrou. Zatímco u preparativních metod je podstatou získání preparátu, na který se ve většině případů spotřebuje velké množství vzorku (př. destilace). Vyhodnocení v rámci preparativních metod může probíhat nejen analýzou esenciálního oleje pomocí HPLC či GC, ale také množstvím získaného extraktu během izolace. 2.3 Moderní metody extrakce Mikroextrakce tuhou fází (SPME) SPME (solid phase microextraction) neboli mikroextrakce tuhou fází je jednou z izolačních metod. Při této izolační metodě dochází k sorpci látky na polymerní stacionární fázi, která pokrývá povrch křemenného vlákna. Dochází k ustavení rovnováhy mezi vzorkem nebo prostorem nad vzorkem a vláknem. Křemenné vlákno je zasunuto v jehle, která vlákno chrání před poškozením, a zároveň slouží k propíchnutí septa vialky se vzorkem. Vlákno je dlouhé 1 až 2 cm a jeho šířka se pohybuje od 0,05 do 1 mm.[16,20] Principem této metody je zasunutí jehly s vláknem do vialky se vzorkem, kde se vlákno pomocí pístu z jehly vysune a dochází k sorpci látky na vlákno. Doba sorpce je různá a záleží na podmínkách. Poté se vlákno zasune zpět do jehly, vytáhne z vialky a vsune se do nástřikového prostoru kapalinového nebo plynového chromatografu, kde se vlákno opět vysune a dochází k desorpci a následné separaci. Při práci s kapalinovým chromatografem je třeba využít interface.[16,19] 16

17 Optimalizace SPME Úspěšnost a výtěžnost této metody závisí na mnoha podmínkách, jako je například použitá stacionární fáze, kdy je potřeba zohlednit její tloušťku a polaritu, dále pak teplota, čas, hodnota ph, vliv míchání či přídavek soli.[16,18] Stacionární fáze Jedním z faktorů, které ovlivňují extrakci je volba vlákna. Na dnešním trhu se komerčně prodává 7 typů vláken, které se liší svými vlastnostmi. Dají se rozdělit podle své polarity nebo na základě principu sorpce. Dle obecných pravidel se pro extrakci polárních látek využívají převážně polární vlákna, mezi která lze zařadit vlákna pokrytá polyakrylátem (PA) jako stacionární fází. Vlákna PA jsou používány pro extrakci více polárních analytů. Naopak pro látky nepolární jsou využívána nepolární vlákna, kde lze jako příklad použité stacionární fáze uvést polydimethylsiloxan (PDMS). Ačkoliv se vlákna PDMS používají převážně pro extrakci nepolárních analytů, po úpravě určitých podmínek lze tento typ vlákna použít i na extrakci polárnějších sloučenin. Obecně lze také říci, že čím je vrstva stacionární fáze silnější, tím je potřeba více času na ustavení rovnováhy. Avšak tato zdánlivá nevýhoda může vést k vyšší citlivosti a lepším výsledkům. Díky odlišným vlastnostem stacionární fáze může probíhat extrakce na základě dvou odlišných jevů, jimiž jsou absorpce nebo adsorpce. V případě absorpce se nejčastěji využívají jako stacionární fáze polydimetylsiloxan (PDMS). Absorbenty jsou charakterizovány jako kapalné stacionární fáze. Z obecného hlediska má tento typ vláken větší extrakční kapacitu, a čím je vrstva pokrytí silnější, tím je sorpční kapacita větší. Vlákna pracující na základě absorpce jsou vhodné především pro látky s nízkou až střední těkavostí. Extrakce na základě adsorpce využívá Carboxen /polydimethylsiloxan (CAR TM /PDMS), Carbowax /divinylbenzen (CW TM /DVB), polydimethylsiloxan/ /divinylbenzen (PDMS/DVB) jako nejběžnější stacionární fáze. Adsorbenty jsou popisovány jako porézní částice suspendované v polymeru, na kterých dochází k záchytu analytů do pórů. Nevýhodou vlákna je sice jeho nižší mechanická stabilita, než má vlákno s homogenní polymerní fází, ale oproti němu vykazuje vyšší selektivitu. Extrakce adsorbentem je vhodnější pro látky s vyšší těkavostí. [18,19,20] 17

18 Metody vzorkování V rámci metody SPME jsou uvedeny 2 základní způsoby extrakce, které se od sebe liší umístěním vlákna. Jako první lze uvést přímou SPME (DI-SPME), která je založena na extrakci přímo ze vzorku, kdy je vlákno ponořeno do vzorku. Pro vzorky v kapalném stavu vykazuje přímá SPME větší citlivost než metoda headspace. Výraznou nevýhodou této metody může být nižší životnost vlákna, z důvodů jeho přímého kontaktu se vzorkem. Pomocí přímé SPME jsou většinou stanovovány látky polární a méně těkavé. Druhá metoda je pak označována jako headspace SPME (HS-SPME), kdy je vlákno ponecháno v prostoru nad vzorkem, kde pak dochází k samotné extrakci. Tuto metodu vzorkování lze využít na vzorky plynné, kapalné i pevné a během extrakce je vzorek umístěn v uzavřené nádobě. Jelikož vlákno během extrakce není v přímém kontaktu se vzorkem, prodlužuje se jeho životnost. Tato metoda je vhodná pro látky těkavé, jejichž bod varu je nízký. Za výhodu lze považovat kratší čas, který je potřeba pro sorpci těkavých látek na vlákno, což znamená i rychlejší ustavení rovnováhy. [16,19,20] Obr. 1 - Vzorkování DI-SPME Obr. 2 - Vzorkování HS-SPME Míchání V obou těchto metodách, což znamená DI-SPME a HS-SPME, se využívá proces magnetického míchání, který napomáhá přechodu analytu ze vzorku na povrch vlákna, čímž dochází k rychlejšímu ustavení rovnováhy. Je nutno zvolit přiměřenou rychlost míchání, jelikož příliš rychlé míchání může způsobit změny v ustavení rovnováhy, a také může mít negativní vliv na přesnost.[16,18,20] 18

19 Čas Doba extrakce je závislá na rychlosti míchání a také na rozdělovacím koeficientu mezi matricí vzorku a stacionární fází. Avšak není nutno dosáhnout úplné rovnováhy, která je spojena s maximální citlivostí. Díky lineárnímu vztahu mezi analytem sorbovaným na vlákně a výchozí koncentrací vzorku je možné dosáhnout přesných výsledků. Optimální doba extrakce je volena z grafu, jenž popisuje závislost plochy píku na době extrakce. Pro určení optimálního času se ve většině případů volí čas, kdy je plocha píku největší.[16,17] Přídavek soli Ovlivnění extrakce přidáním rozpustných solí pracuje na základě vysolování. Použití solí se využívá často pouze u metody HS-SPME, jelikož u metody DI-SPME dochází k znehodnocení až zničení vlákna. Mezi nejčastěji používané soli se řadí chlorid sodný, hydrogenuhličitan sodný či síran sodný.[16,20] ph Změny v ph mohou taktéž napomáhat extrakci. V okyseleném vzorku se lépe extrahují kyselé analyty a naopak ve vzorku, který má bazický charakter se lépe extrahují látky bazické. U metody DI-SPME dochází při vysokých či velmi nízkých hodnotách ph k znehodnocení vlákna.[16,20] Teplota Dalším důležitým faktorem, který by měl být zmíněn je teplota. Změny teploty se využívají především u metody HS-SPME, kdy dochází k zahřívání vzorku. Díky zahřívání dochází k uvolnění většího množství analytu ze vzorku do plynného stavu. Zahříváním se zvyšuje extrakční rychlost, což znamená kratší dobu extrakce. Teplota musí být zvolena tak, aby docházelo k uvolňování dostatečného množství analyzované látky, ale aby nedocházelo k desorpci analytu z vlákna. K desorpci za příliš vysoké teploty může docházet například u vláken PDMS.[16,21] Optimalizace desorpce V plynové chromatografii se uplatňuje termální desorpce. Termální desorpce je závislá především na těkavosti analytu, tloušťce stacionární fáze, hloubce ponoření vlákna, teplotě v místě nástřiku a času, po který je vlákno zasunuto v injektoru. Jednou z důležitých 19

20 podmínek je okamžitá desorpce po ukončené extrakci, což znamená, že jakmile je extrakce ukončena, jehla musí být zasunuta do nástřikového prostoru a vlákno musí být hned po zasunutí jehly vytaženo, aby tak mohlo docházet k desorpci. Jako druhou podmínku lze uvést, že během desorpce je třeba zajistit plynulý průtok mobilní fáze. Za optimální teplotu se pak volí taková, při které dochází k desorpci i nejméně těkavých látek. U kapalinové chromatografie se využívají 2 desorpční techniky. První z nich je dynamická desorpce, kdy je vlákno vystaveno proudu mobilní fáze, čímž dochází k desorpci. Druhá metoda je pak označována jako statická desorpce, kdy je vlákno před vstřikem na kolonu ponořeno v mobilní fázi po určitou dobu. Během obou metod se využívá pouze malé množství rozpouštědla a dochází k rychlé a kvantitativní desorpci.[16,18,20] Extrakce tuhou fází (SPE) Metoda SPE využívá kolonky plněné pevnými sorbenty, které na sebe adsorbují analyt z kapalného vzorku. Po průchodu vzorku skrz kolonku zůstane analyt nasorbován a následně je z kolonky vymyt vhodným rozpouštědlem nebo zahřátím kolonky. Podstatnou výhodou oproti klasické extrakci kapalina-kapalina je menší spotřeba rozpouštědla. U metody SPE je velmi důležitá volba vhodného adsorbentu, kterých je nepřeberné množství např. silikagel, uhlíkové adsorbenty, hydrofilní polymery a jiné.[24] Superkritická fluidní extrakce (SFE) Superkritická extrakce využívá superkritické kapaliny, jejíž tlak a teplota jsou nad kritickými hodnotami, což způsobí vznik kondenzovaného stavu, který má vlastnosti jak plynů, tak kapalin. Při superkritické extrakci dochází k oddělení dané složky od ostatních pomocí extrakčního rozpouštědla (superkritické kapaliny), do kterého postupně přechází. K extrakci dochází nejen z pevného povrchu, ale také z kapalin. Při změnách teploty a tlaku dochází ke změně rozpustnosti dané látky v rozpouštědle. Metoda SFE může sloužit jak pro analytické účely (kvalitativní a kvantitativní analýza), tak pro účely preparativní (očištění od nežádoucích příměsí). Nejčastěji používanou superkritickou kapalinou je oxid uhličitý, který může v určitých případech obsahovat příměs methanolu či ethanolu. Rychlost superkritické fluidní extrakce a separace je oproti klasické extrakci zvýšená.[25,26] 20

21 2.3.4 Mikroextrakce jednou kapkou (SDME) Metoda mikroextrakce jednou kapkou pracuje na principu absorpce látek do vhodného rozpouštědla, kdy rozpouštědlo je nemísitelné se vzorkem. Kapka může být umístěna na konci teflonového vlákna nebo v jehle, z které je při absorpci vytlačena a po jejím dokončení je nasáta zpět. Zde platí stejné pravidlo jako u SPME, že při extrakci polárních látek je nutno použít polární rozpouštědla a naopak. Metoda SDME využívá také jak metodu headspace (HS-SDME), tak metodu přímého zavedení do vzorku (DI-SDME). Poté co dojde k absorpci, je kapka zavedena do plynového nebo kapalinového chromatografu.[22,23,28] Mezi další metody, které by mohly být označeny za moderní metody, patří například mikrovlnná destilace, termomikrodestilace, mikrodestilace, membránová extrakce a jiné. 2.4 Klasické metody extrakce Destilace Obecným principem destilace je oddělení dvou či více látek, s rozdílnou teplotou varu neboli těkavostí. V případě dvousložkové směsi se jako první vypaří látka, která má nižší bod varu. Při získávání silic z rostlinných materiálů zůstává na povrchu destilátu vrstvička oleje, které představuje danou silici Destilace vodní parou Tento typ destilace je vhodný především pro látky nemísitelné s vodou nebo pro látky ve vodě pouze nepatrně rozpustné. U této metody je výhodou skutečnost, že díky použití vody resp. páry, se snižuje teplota samotné destilace a látky těkavější se destilují při nižších teplotách, než je jejich teplota varu. U rostlinných materiálů horká pára pomáhá při uvolňování aromatických látek otevřením kapes obsahujících esenciální oleje. Těkavější oleje jsou pomocí páry unášeny do chladiče, kde dochází k jejich kondenzaci. Obecně je metoda destilace vodní parou hojně používaná v organické chemii, kde může sloužit k čistění látek nestabilních za vyšších teplot. Voda je využívána, protože díky své vysoké tenzi par (oproti tenzi par organických látek) snižuje bod varu, a díky její malé molární hmotnosti je k destilaci zapotřebí poměrně malé množství. 21

22 Aparatura Aparatura pro destilaci vodní parou se skládá z vyvíječe vodní páry, trubice vedoucí páru do destilační baňky, destilační baňky, chladiče (sestupný), alonže a sběrné baňky. Vyvíječ páry obsahuje celkem 2 trubice, kdy jedna je označována jako pojistná trubice a druhá odvádí páru do destilační baňky. V baňce sloužící jako vyvíječ páry jsou umístěny varné kamínky, aby se předcházelo utajenému varu. Trubice přivádějící páru do destilační baňky je ohnutá, ve vyvíječi začíná těsně pod zátkou, aby odváděla pouze nejteplejší páry, a zároveň musí být co nejkratší, aby nedocházelo k rychlému ochlazení proudících pár a jejich následné kondenzaci v destilační baňce. Destilační baňka se vzorkem je ze začátku zahřívána, aby nedocházelo opět ke kondenzaci par. Po určité době je pomocné zahřívání vypnuto a vzorek je zahříván párou. Destilační baňka musí být vhodně nakloněna tak, aby destilovaná směs nestříkala do chladiče. U destilace vodní parou je třeba použít velmi účinné chladiče, jelikož voda má vysoké kondenzační teplo. Konec destilace nastává v okamžiku, kdy do sběrné baňky vtéká pouze voda bez jakýchkoliv olejovitých podílů. Obr. 3 - Aparatura pro destilaci vodní parou Překlad pojmů obr. 3: steam generator vyvíječ páry, water voda, safety valve pojistný ventil, mixture to be separated separovaná směs, water out odvod vody, water in přívod vody, required product (in water) potřebný produkt (ve vodě) Prostá destilace Během tohoto typu destilace je rostlinný materiál umístěn přímo do destilační baňky a je ponořen do vody. Baňka je postupně zahřívána buď přímým plamenem, nebo je ohřev zajištěn parní cívkou. Dojde k uvolňování par, které se v chladiči sráží a odtékají do sběrné baňky. Materiál, který je destilován, musí být stále v kontaktu s vodou. 22

23 Tento typ destilace je vhodný pro materiály, které by během parní destilace při kontaktu s párou mohly tvořit hrudky, a pára by pak nepronikla do všech částí. Výhodou tohoto systému je poměrně nízká pořizovací cena, je dobře sestavitelná i v terénních podmínkách. Nevýhodou tohoto systému je, že nikdy nedochází ke kompletní extrakci. Látky s vysokým bodem varu se odpařují velmi špatně, u aldehydů může docházet k polymeraci, u esterů k hydrolýze a kyslíkaté sloučeniny mají tendenci se ve vodě rozpouštět. Také je metoda prosté destilace pomalejší než destilace vodní parou. Obr. 4 Aparatura pro destilaci prostou Překlad pojmů obr. 4: heat source zdroj tepla, distilling flask destilační baňka, three-way adapter trojcestný nástavec, clamp svorka, thermometer teploměr, water outlet odvod vody, water inlet přívod vody, condenser chladič, vacuum adapter vakuový nástavec, receiving flask sběrná baňka Lisování Metoda lisování je známá pouze při extrakci esenciálních olejů z citrusových plodů. Žlázky obsahující silice jsou umístěny hned pod kůrou, což znamená, že při jejich porušení dochází k uvolnění oleje. Metoda lisování však není moc praktická, jelikož výtěžek je velmi malý a trvá poměrně dlouho.[3] 23

24 2.4.5 Enfluráž Tato metoda se nejčastěji používá na čerstvě posbírané rostlinné materiály, jako jsou například květy jasmínu či pomerančovníku. Pracuje na principu umístění těchto čerstvě nasbíraných rostlin na vrstvičku tuku, který poté absorbuje jejich esenciální oleje. Po určité době (cca 24 hodin) se květy vymění za nové a proces pokračuje, dokud tuk není silicemi nasycen. Poté se tuk, který se v tuto chvíli pojmenovává pomáda, odebere, rozpustí v lihu a destiluje. [3] Extrakce Extrakce silic z rostlinného materiálu probíhá pomocí vhodného rozpouštědla, které materiál naruší. Extrahovaná látka může být v kapalném i pevném stavu a rozpouštědlo je vždy kapalné. Mezi extrakce, při kterých je analyt extrahován z pevné látky pomocí vhodného rozpouštědla patří macerace, digesce nebo extrakce v Soxhletově extraktoru. Macerace je metoda, při které probíhá extrakce za studena a pevný materiál je louhován v rozpouštědle. Digesce probíhá na stejném principu jako macerace, ale je využito horké rozpouštědlo. Soxhletův extraktor využívá par rozpouštědla, které se v chladiči kondenzují a poté dopadají na vzorek. Analyt je ze vzorku extrahován rozpouštědlem a po dokončené extrakci je rozpouštědlo oddestilováno. Při extrakci kapalina - kapalina musí být jednotlivé kapaliny mezi sebou nemísitelné. Jednou z nich je ve většině případů voda, tou druhou pak organické rozpouštědlo. Dochází k přechodu analytu mezi jednotlivými kapalinami. Tato metoda je při nalezení vhodného extrakčního činidla velmi účinná. Mezi tento typ extrakcí patři vytřepávání za pomoci dělících nálevek, nebo perforace. 24

25 2.5 Chemické složení bylin Chemické složení bylin se vždy odvíjí od podmínek, za kterých rostou. Mezi tyto podmínky patří lokace, roční období, hnojení, zálivka či délka slunečního svitu. Přičemž se rostliny stejné čeledi neliší tolik jednotlivými obsaženými látkami, ale jejich množstvím. Rostliny se dají podle obsahových látek rozdělit na určité chemotypy. Chemické složení a účinky rostlin jsou stále zkoumány pomocí různých analytických metod extrakce i analýzy, které jsou popsány v mnoha odborných článcích a literatuře Bazalka pravá (Ocimum basilicum, L.) Ocimum basilicum, L. patří do čeledi hluchavkovitých rostlin a dříve byla pěstována převážně v Asii, odkud se rozšířila dále. Na světě existuje přes 150 druhů bazalek, přičemž nejrozšířenější je Ociumum basilicum, L.. Bazalka se v dnešní době používá ve formě čerstvých listů i jako sušená a nadrcená, nejčastěji k vaření, nebo slouží jako léčivo při bolestech hlavy, kašli, střevních potížích či poruše ledvin. Kromě výše zmíněných vlastností má také antioxidační a antibakteriální účinky, a také ji lze využit při výrobě repelentů.[2,4,5,6] Výzkum, zaměřený na různorodost chemického složení krajových odrůd bazalek rostoucích v Turecku, provedli Isa Telci, Emine Bayram, Güngör Yılmaz a Betül Avci. Během výzkumu použili extrakci metodu hydrodestilace a k následné detekci metodu GC a GC-MS, přičemž zjistili, že 18 vybraných vzorků lze rozdělit do sedmi základních skupin neboli chemotypů, podle dominantní složky obsažené ve vzorku (linalool, methylcinnamát, methylcinnamát/linalool, methyleugenol, citral, methylchavikol a methylchavikol/ citral).[4] Během jiné analýzy, při níž byly sledovány profily vonných látek u pěti rostlin Ocimum basilicum, L. vypěstovaných v České republice, byla k extrakci těkavých látek využita metoda HS-SPME za použití vláken PDMS, PDMS/DVB, DVB/CAR/PDMS a CW/DVB. Analýza byla provedena pomocí plynové chromatografie a detekce spojením hmotnostního spektrometru s iontovou pastí (GC-ITMS) nebo průletovým analyzátorem (GC-TOFMS). Dominantními složkami při použití metody GC-ITMS byli linalool, methylchavikol, eugenol, bergamoten a methylcinnamát, zatímco metoda GC-TOFMS detekovala jako hlavní složky linalool, methylchavikol, eugenol a eukalyptol. 25

26 Z tohoto výzkumu vyplývá, že nezáleží pouze na faktorech ovlivňujících rostlinu během růstu, ale také na použité analytické metodě.[5] Dalším příkladem odlišného složení je výzkum zabývající se analýzou chemického složení a antioxidační aktivitou bazalek pocházejících z Thajska. Byl proveden na dvou odlišných druzích - Ocimum basilicum var. thyrsiflora (thajská bazalka) a Ocimum basilicum (bazalka pravá). Zde bylo také využito jako metody analýzy GC-MS a bylo identifikováno celkem 80 komponent obsažených v bazalce pravé. Následně bylo zjištěno, že pouze v bazalce pravé se oproti bazalce thajské vyskytoval linalooloxid, (E)-sabinen hydrát, (Z)-myroxid, δ-terpineol, γ-terpineol, exo-2-hydroxycineol acetát, β-copaen a (E)-sesquisabinen hydrát.[6] Rozmarýn lékařský (Rosmarinus officinalis, L.) Rosmarinus officinalis, L. je rostlina původem ze Středomoří, která je v dnešní době celosvětově rozšířená. Využívá se nejen jako koření, ale také jako rostlina pro lékařské účely díky svým antiseptickým a antioxidačním vlastnostem. Slouží k léčbě zažívání, revmatismu, zlepšuje paměť a také má uklidňující účinek.[2,7,8,9] Na základě informací uvedených v článku Rosmarinus officinalis, L.: An aromatic plant with interesting biologocal properties (Rosmarinus officinalis, L.: Aromatická rostlina se zajímavými biologickými vlastnostmi) lze za hlavní složky považovat eukalyptol, α-pinen, kafr, verbenon a borneol. Podle množství těchto látek obsažených v rostlině je možno rozdělit rozmarýn na tři základní chemotypy - s vysokým obsahem eukalyptolu a kafru, s nízkým obsahem eukalyptolu nebo s vysokým obsahem α-pinenu a verbenonu.[7] Při výzkumu, který porovnával látky obsažené ve dvou druzích rozmarýnu z oblasti Tuniska (Rosmarinus officinalis var. typicus a var. troglodytorum), byla využita k extrakci silic z rostlin metoda hydrodestilace a následně analýza a detekce metodou GC-MS. Jako hlavní složky u obou druhů rostlin byly zjištěny eukalyptol a kafr.[8] Při použití superkritické kapalinové extrakce (SFE) a soxhletovy extrakce s detekcí GC-MS u rostlin pěstovaných v Brazílii byl hlavní složkou isokarnosol. Vzorek obsahoval také α-pinen, bornylacetát, kafr a karvakrol, což jsou látky odpovědné za antimikrobiální aktivitu rozmarýnu.[9] 26

27 2.5.3 Šalvěj lékařská (Salvia officinalis, L.) Šalvěj pochází původem z oblasti Východního Středomoří, kde roste volně, podobně jako dnes ve Francii nebo Itálii. Šalvěj je používána jako stimulátor a regulátor zažívacího traktu, mající antiseptické, antipyretické, analgetické a expektorační vlastnosti. Často se používají při léčbě chřipky a nachlazení, při zánětu sliznic úst a hrdla. Rostliny rodu Salvia lze také rozdělit do několika chemotypů α-thujon, α-pinen/β-pinen, kafr, borneol, kamfen, α-humulen, β-karyofyllen/ jeho oxidy, eukalyptol/thymol.[2,10,11,12] Při výzkumu, využívajícím metodu HS-GC-MS pro studium dvaceti vybraných druhů rostlin rodu Salvia, byl zkoumán tzv. fingerprint (otisk palce) u jednotlivých druhů. Jako hlavní složky byly identifikovány α-pinen, kamfen, β-pinen, thujol, kafr, β-chamigren a kadina-3,9-dien. U jednotlivých druhů byly zjištěny látky, které lze považovat za chemotaxonomické markery, např. τ-terpinen pro druh Salvia stenosa nebo isokaryofyllen a karyofyllen pro Salvia officinalis.[10] Při testování rostlin Salvia officinalis nasbíraných v Iráku a blízkých oblastech byly pomocí experimentu zjištěny jako podstatné složky α- a β-thujon, eukalyptol, borneol. K tomuto experimentu bylo využito extrakce pomocí rozpouštědla a chromatografie na tenké vrstvě (TLC) a následné identifikaci komponent. Přítomnost thujonu byla u těchto rostlin zvolena jako chemotaxonomický marker pro jejich identifikaci.[11] U skupiny rostlin rodu Salvia rostoucích v Maďarsku byla použita metoda destilace vodní parou a následně detekce GC-MS. Výzkum byl zaměřen na rozdílné množství obsažených látek na jaře a na podzim. Během jarního období bylo pozorováno, že největší obsah tvoří α-thujon, menší pak postupně guajol, α-humulen, β-karyofyllen, eukalyptol, kafr a β-thujon, který byl obsažen v nejmenším množství, zatímco během zimního období byl α-thujon opět majoritní složkou, ale množství ostatních složek se obsahově lišilo ve srovnání s jarním obdobím. Druhou složkou s největším podílem byl během zimního období kafr, třetí byl β-thujon a dalšími eukalyptol, guajol, α-humulen a β-karyofyllen, který byl obsažen pouze v malém množství.[12] Tymián obecný (Thymus vulgaris, L.) Tymián se jako většina rostlin čeledi Lamiaceae celosvětově rozšířil ze Středomoří. Slouží k léčbě bronchitidy, černého kašle, bolesti zubů, při léčbě nadýmání a také vykazuje antiseptické, antimikrobiální a antioxidační účinky.[2,13,14,15] Při studiu chemického složení rostlin divoce rostoucích a vypěstovaných původem z Jordánska, bylo k extrakci využito hydrodestilace a poté byla provedena detekce GC-FID 27

28 a GC-MS. Bylo zjištěno, že typickými látkami pro studované rostliny jsou karvakrol, thymol, γ-terpinen a p-cymen. Rostliny divoce rostoucí obsahovaly převážně karvakrol (u 2 ze 3 vzorků), zatímco u vypěstovaných rostlin bylo značné množství jak karvakrolu, tak thymolu. Ostatní podstatné složky byly eukalyptol, β-karyofyllen, α-thujon a kafr.[13] Při studiu těkavých látek obsažených v tymiánu (Bukurešť, Rumunsko) byly k extrakci použity metody parní destilace a extrakce nepolárním rozpouštědlem. Kvalitativní analýza byla provedena za pomoci HPTLC a kvantitativní analýza na základě plynové chromatografie. Hlavní složkou tymiánové silice při použití metody HPTLC byl thymol, ale také byl zjištěn poměrně velký podíl linaloolu a karyofyllenu, zatímco plynová chromatografie detekovala jako hlavní složku thymol a p-cymen. Z článku také vyplývá, že lze rozeznat 6 základních chemotypů - geraniol, α-terpineol, thuyan-4-ol, linalool, karvakrol a thymol.[14] Výzkum zabývající se chemickým složením měnícím se během vegetačního cyklu každé rostliny byl proveden metodou GC-MS, které předcházela hydrodestilace. Na základě těchto metod bylo zjištěno, že hlavními komponenty rostlin pocházejících z Itálie jsou thymol a karvakrol.[15] 28

29 3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1 Rostlinný materiál a chemikálie Všechny rostliny (Ocimum basilicum L., Rosmarinus officinalis, L., Salvia officinalis, L., Thymus vulgaris, L.) byly získány od dodavatele TITBIT s.r.o, původem z Izraele. Natě rostlin byly sušeny v temnu a při pokojové teplotě po dobu 10 dní. Jako standardy pro určení retenčního indexu byly využity n-alkany od C 6 do C Pomůcky a přístroje Během experimentu byla využita destilační aparatura skládající se z topného hnízda, destilační baňky (250 ml), vzdušného a Liebigova chladiče a sběrné nádoby. Jako sběrná nádoba sloužil odměrný válec (50 ml). Dále byly využity plastové centrifugační zkumavky (15 ml), centrifuga, vialky (1,8 ml) a standardní vialky pro headspace analýzu podle doporučení EPA (40 ml), blokový termostat (Stuart SBH 130), SPME vlákno (50/30 μm, Divinylbenzen/Carboxen/Polydimethylsiloxan (DVB/CAR/PDMS) StableFlex TM (SUPELCO, Bellefonte, PA, USA) o délce 2 cm. Pro analýzu byl použit plynový chromatograf Agilent 7890A s hmotnostním detektorem Agilent 5975 C a kolona typu HP-5MS (30 m 0,25 mm i.d. 0,25 µm). Jako nosný plyn sloužilo helium (SIAD, Bergamo, Itálie, 99,998%) s průtokem 0,9 ml/min. Pro zpracování dat byl použit software ChemStation E firmy Agilent Technologies USA. 3.3 Pracovní postupy Extrakce pomocí destilace Vysušené natě bylin byly rozdrceny za pomocí třecí misky s tloučkem na co nejhomogennější směs. Do 250 ml baňky bylo dáno 150 ml destilované vody a přidán nadrcený rostlinný materiál. První destilace byla provedena s 8,7 g rozmarýnu lékařského, druhá s 6,1 g tymiánu obecného, třetí s 6,3 g šalvěje lékařské a čtvrtá destilace s 9,3 g bazalky pravé. Pokaždé byla směs přivedena k varu a destilována po dobu zhruba jedné hodiny k získání 50 ml destilátu. Jelikož se nepodařilo získat přímo vrstvu oleje, která by tvořila hladinu destilátu, byla provedena extrakce pomocí ethylacetátu. 10 ml destilátu od každého vzorku bylo umístěno do zkumavek, kam byly posléze přidány 2 ml ethylacetátu. Každá zkumavka byla lehce protřepána a následně umístěna do centrifugy na 4 minuty. Protřepání a centrifugace 29

30 byly provedeny ještě 2krát. Ze zkumavky byla do vialky odebrána vrchní (ethylacetátová) vrstva a analyzována plynovou chromatografií. Pro analýzu bylo využito metody přímého nástřiku, kdy dávkované množství činilo 1 μl, a teplota nástřiku byla 280 C. Používaný plynový chromatograf využívá dávkovacího pulsu (tlaku) k přenosu většího množství vzorku na kolonu. Velikost pulsu byla 140 kpa po dobu 24 sekund. Teplotní program využitý během analýzy byl 40 C (2 min) 5 C/min 300 C (5 min). Identifikace neznámých látek byla provedena na základě srovnání s knihovnou spekter (NIST08) a porovnáním retenčních indexů s literárními daty [35]. Pro výpočet retenčních indexů byla použita směs n-alkanů od C 6 do C Extrakce pomocí SPME vlákna Vzorky rostlin byly opět nadrceny na co nejvíc homogenní směs pomocí třecí misky a tloučku. Z každého vzorku byly odebrány 2 g a umístěny do jednotlivých vialek (objem) a poté temperovány na teplotu 40 C po dobu zhruba 15 minut před zasunutím vlákna. Tento proces byl prováděn, aby se prostor nad vzorkem nasytil těkavými složkami. Poté bylo do vialky zasunuto vlákno DVB/CAR/PDMS a využito metody HS-SPME. Vialky byly po celou dobu extrakce temperovány na 40 C a tato extrakce byla prováděna po dobu 60 minut. Poté bylo vlákno z vialky vyjmuto a zasunuto do plynového chromatografu, kde byly látky zachycené na vlákně po dobu 5 minut desorbovány. Po uplynutí této doby bylo vlákno z plynového chromatografu vytaženo. Při této analýze byla teplota nástřiku 280 C a byl použit teplotní program 40 C (2 min) 5 C/min 250 C (5 min). Identifikace neznámých látek byla opět provedena srovnáním s knihovnou spekter (NIST08) a porovnáním retenčních indexů s literárními daty [35]. Pro výpočet retenčních indexů byla použita opět směs n-alkanů od C 6 do C

31 4 VÝSLEDKY A DISKUZE Po provedení extrakce (destilace a SPME) a analýzy pomocí plynového chromatografu byly získány chromatogramy, které zobrazují těkavé látky obsažené v jednotlivých bylinách. Kromě složení byla získána data, ze kterých byly vypočteny retenční indexy, a pomocí integrace jednotlivých píků byly zjištěny jejich plochy. Plochy pomohou stanovit, jaké složky jsou v daném rostlinném materiálu majoritní a významné. Hodnoty získané při využití metody destilace jsou uvedeny v Tab. 1 a hodnoty při využití SPME v Tab. 2. Hodnoty v Tab. 1 byly přepočteny na 2 g z důvodu rozdílné navážky jednotlivých bylin při destilaci. Retenční index je veličina, při jejímž výpočtu se využívají redukované retenční časy analyzované látky a standardů (obvykle n-alkanů). Retenční index lze vypočítat podle vztahu (1), kde t Rx představuje redukovaný retenční čas sledované látky a t Rn, t Rn+1 redukované retenční časy n-alkanů s n a n+1 atomy uhlíků. Musí však platit pravidlo t Rn< t Rx< t Rn+1. Porovnáním retenčního indexu s tabulkovými hodnotami lze v mnoha případech identifikovat danou látku, avšak jelikož je retenční index ovlivněn kolonou a použitým teplotním programem, může se v některých případech lišit. Retenční indexy uváděné v literatuře platí v případě, že pracujeme izotermě, ale během prováděného experimentu byl použit teplotní program. Z tohoto důvodu byly retenční indexy srovnávané s literárními daty [35], přičemž byla snaha nalézt téměř totožný teplotní program. Pro každou bylinu bylo identifikováno 6 hlavních komponent, které by mohly zároveň sloužit jako markery pro jejich charakterizaci. Ve složení jednotlivých bylin byly určité rozdíly, avšak bylo identifikováno mnoho společných složek, které se navzájem odlišovaly relativním množstvím. V případě těchto 6 majoritních látek u každé rostliny jsou uvedeny jejich retenční indexy experimentálně zjištěné a literární. Z chromatogramu bylo u každé byliny a pro obě použité metody extrakce zjištěno časové rozmezí, ve kterém se objevilo největší množství silic, a zároveň byla zaznamenána příslušná celková plocha. Největší množství silic bylo zaznamenáno od 8. do 30. minuty analýzy. Všechny hodnoty uváděné v tabulkách jsou uvedeny na 4 platné číslice (kromě výjimek) pro zlepšení orientace a přehlednosti. V tabulkách a grafech jsou všechny 31

32 látky uváděné v anglickém jazyce, jelikož většina dat byla čerpána převážně z anglických literárních zdrojů, a tímto lze předcházet nechtěné záměně. Tab. 1 - Identifikované látky při využití destilace a jejich příslušné plochy v relativních jednotkách ( 10 5 ) přepočteno na 2 g. Identifikovaná látka RI a Ocimum basilicum Rosmarinus officinalis Salvia officinalis Tricyclene , R-α-Pinene ,04 - α-pinene Camphene ,6 - β-pinene ,7 83,19 - Thymus vulgaris 1-octen-3-ol , ,5 β-myrcene ,7 144,3 - α-phellandrene ,9 - - α-terpinene ,2 - - o-cymene ,9 Eucalyptol , ,7 Benzeneacetaldehyde ,49-31,84 γ-terpinen ,63 445,0-131,0 cis-β-terpineol ,40 98,38 235,7 158,7 Terpinolen ,7 - - β-linalool ,1 (±)-Linalool ,4 - - α-thujone β-thujone isopropyl-1-methyl-2-cyclohexen-2-ol ,3 - - Camphor , (1R,4R)-(+)-Camphor Borneol ,6 158,7 (-)-Terpinen-4-ol ,0 203,7 74,28 α-terpineol , ,90 35,10 (-)-Myrtenol ,4 - - Verbenone Thymolmethylether , ,65 Piperitone ,1 - - Bornylacetate ,53 - Thymol ,38 91, Carvacrol ,1 93, Chavibetol (m-eugenol) ,67 Eugenol ,7 199,5-3,5-di-tert-butylcatechol ,20 (-)-β-elemene , I-Verbenone ,5 - - Eugenolmethylether ,7 381,

33 Tab. 1 - Identifikované látky při využití destilace a jejich příslušné plochy v relativních jednotkách ( 10 5 ) přepočteno na 2 g. Identifikovaná látka RI a Ocimum basilicum Rosmarinus officinalis Salvia officinalis Thymus vulgaris β-caryophyllene ,87 490,5 205,6 79,03 α-bergamotene , Pyrocatechol, 4-tert-butyl ,3 trans-β-farnesene , α-caryophyllene ,77 308,8 - γ-cadinene , Caryophyllene oxide ,5 - - Ledol ,7 - τ-cadinol , ,79 epi-13-manool ,7 - RI a rozsah experimentálních retenčních indexů destilačně Tab. 2 - Identifikované látky při využití SPME a jejich příslušné plochy v relativních jednotkách ( 105) navážka 2 g. Identifikovaná látka RI b Ocimum basilicum Rosmarinus officinalis Salvia officinalis Thymus vulgaris Tricyclene ,5 142,8 - α-pinene , ,9 1R-α-Pinene Camphene , ,3 Sabinene ,84 (-)-β-pinene ,5 1-Octen-3-ol Octanone ,64-139,1 β-myrcene β-pinene Octanol ,0 α-phellandrene , ,4 190,7 (+)-(-)-3-Carene ,53 α-terpinene , o-cymene (+)-Sylvestrene ,3 Eucalyptol β-trans-ocimene ,0 138,5 262,5 - β-cis-ocimene ,57 121,4 - γ-terpinene , , Butanoic acid, 4-pentenylester ,8 cis-β-terpineol ,3 455,

34 Tab. 2 - Identifikované látky při využití SPME a jejich příslušné plochy v relativních jednotkách ( 10 5 ) navážka 2 g. Identifikovaná látka RI b Ocimum basilicum Rosmarinus officinalis Salvia officinalis Thymus vulgaris bicyclo[3.1.0]hexan-2-ol, 5-isopropyl-2-methyl Terpinolene , ,3 - α-4-dimethylstyrene ,1 β-linalool , α-thujone (±)-Linalool β-thujone iso-3-thujanol ,72-2-(hexyn-1-yl)-3-methoxymethylene-oxirane , Camphor ,6 (1R,4R)-(+)-Camphor , trans-3-pinanone ,5 - Pinocarvone ,6 - - Borneol , , Pinanone , Terpinen-4-ol ,1 180,0 364,7 p-cymen-8-ol , α-terpineol ,9 - Myrtenol ,47 180,8 - (-)-Borneol , n-octylacetate , Verbenone Thymolmethylether ,4 2-isopropyl-1-methoxy-4methylbenzen Thymoquinone ,5 Anthranilic acid , Nerol ,95 2,6-dimethyl-1,7-octadiene-3,6-diol , (-)-Bornylacetate ,3 - Thymol , Bornylacetate ,0 (-)trans-pinocarvylacetate , Carvacrol , Myrtenylacetate ,15 - Elixene ,95 - exo-2-hydroxycineolacetate , α-cubebene ,0-101,8 - Thymolacetate ,9 Eugenol Isoledene ,7 - Ylangene ,66 214,3 34

35 Tab. 2 - Identifikované látky při využití SPME a jejich příslušné plochy v relativních jednotkách ( 10 5 ) navážka 2 g. Identifikovaná látka RI b Ocimum basilicum Rosmarinu s officinalis Salvia officinalis Copaene Thymus vulgaris 3,5-di-tertbutylcatechol ,0 β-bourbonene ,6 (-)-β-elemene Eugenolmethylether ,7 170, epi-α-Cubebene β-caryophyllene β-gurjunene ,1 - β-cubebene ,3 α-bergamotene ,1-102,4 - p-tertbutylcatechol ,9 α-guaiene Eremophilene ,55 - ε-muurolene , (+)-Epibicyclosesquiphellandrene , α-caryophyllene ,3 trans-β-farnesene (-)-alloaromadendrene ,5 - γ-muurolene ,9 148,3 (+)-Ledene ,9 - γ-gurjunene β-bisabolene ,0-338,6 δ-guaiene γ-cadinene ,0 β-sesquiphellandrene , (+)-δ-cadinene ,2-118,4 282,9 (-)-Spathulenol , Caryophyllene oxide ,7-180,9 Ledol ,1-1,10-di-epi-Cubenol , τ-cadinol , ,74 RI b rozsah experimentálních retenčních indexů - SPME 35

36 4.1 Analýza bazalky pravé (Ocimum basilicum, L.) Destilace Po provedení destilace a následné analýze bylo u bazalky pravé identifikováno 18 látek, z nich byla následně zvolena šestice hlavních složek (Tab. 3). (±)-Linalool byl identifikován jako majoritní složka, a dále pak eugenol, thymol, methyleugenol, eukalyptol a τ-cadinol. Výskyt thymolu v bazalce pravé je překvapující, jelikož není běžně popisován v literatuře. Zároveň v literatuře nacházíme zmínky o výskytu methylchavikolu neboli estragolu, který často tvoří majoritní podíl, avšak při této analýze nebyl identifikován. Z chemického hlediska patří (±)-linalool a τ-cadinol mezi terpenické alkoholy, methyleugenol a eukalyptol mezi ethery a eugenol společně s thymolem mezi fenoly. Tab. 3 - Majoritní složky: bazalka pravá (Ocimum basilicum, L.), destilačně Analyzovaná látka Retenční čas Plocha ( 10 5 ) RI (exp.) RI (lit.) (±)-Linalool 14, Eugenol 21, Thymol 19, Eugenolmethylether 22,92 654, Eucalyptol 12,33 467, τ-cadinol 28,67 259, Obr. 5 - Chromatogram: bazalka pravá (Ocimum basilicum, L.), destilačně 36

37 Extrakce SPME Během analýzy bazalky pravé po použití extrakce na vlákno DVB/CAR/PDMS bylo identifikováno celkem 44 látek, z čehož bylo jako 6 hlavních složek určeno (±)-linalool, eukalyptol, eugenol, (-)-β-elemen, (-)-bornylacetát a β-cis-ocimen. (±)-Linalool byl stejně jako při použití destilace identifikován jako složka s největším podílem. Při extrakci pomocí vlákna DVB/CAR/PDMS bylo množství eukalyptolu větší, než při izolaci provedené destilačně. V zastoupení jednotlivých chemických skupin mezi hlavními složkami bylo oproti destilaci identifikováno kromě esterů ((-)-bornylacetát, eukalyptol) a fenolů (eugenol) také terpenické uhlovodíky ((-)-β-elemen, β-cis-ocimen). Tab. 4 - Majoritní složky: bazalka pravá (Ocimum basilicum, L.), SPME Analyzovaná látka Retenční čas Plocha ( 10 5 ) RI (exp.) RI (lit.) (±)-Linalool 14, Eucalyptol 12, Eugenol 21, (-)-β-elemene 22, (-)-Bornyl acetate 19, β-cis-ocimene 12, Obr. 6 - Chromatogram: bazalka pravá (Ocimum basilicum, L.), SPME 37

38 4.2 Analýza rozmarýnu lékařského (Rosmarinus officinalis, L.) Destilace Při analýze rozmarýnu lékařského bylo identifikováno 30 komponent, z kterých bylo následně určeno jako 6 majoritních složek eukalyptol, (1R,4R)-(+)-kafr, verbenon, α-pinen, borneol a kamfen. Na základě těchto informací lze určit, že se s největší pravděpodobností jedná o chemotyp s vysokým obsahem eukalyptolu a kafru. Experimentálně zjištěné složení rozmarýny lékařské se shoduje s literárními zdroji. Při rozdělení šestice hlavních látek na chemické skupiny lze sledovat, že největší zastoupení mají terpenické ketony (kafr, verbenon), dále pak uhlovodíky (α-pinen, kamfen), ethery (eukalyptol) a alkoholy (borneol). Tab. 5 - Majoritní složky: rozmarýn lékařský (Rosmarinus officinalis, L.), destilačně Analyzovaná látka Retenční čas Plocha ( 10 5 ) RI (exp.) RI (lit.) Eucalyptol 12, (1R,4R)-(+)-Camphor 16, Verbenone 17, α-pinene 9, Borneol 16, Camphene 9, Obr. 7 - Chromatogram: rozmarýn lékařský (Rosmarinus officinalis, L.), destilačně 38

39 Extrakce SPME Při analýze rozmarýnu lékařského za použití SPME a vlákna DVB/CAR/PDMS bylo identifikováno 32 látek, z nichž mezi 6 hlavních lze zařadit eukalyptol, 1R-α-pinen, β-karyofyllen, kamfen, (1R,4R)-(+)-kafr a (-)-bornylacetát. Metodou SPME byly mezi šesticí hlavních látek β-karyofyllen a (-)-bornylacetát, které se sice během destilace mezi hlavními látkami neobjevily, ale v menším množství identifikovány byly. Ve srovnání s destilací byl zjištěn vysoký obsah enantiomeru 1R-α-pinenu, přičemž v literatuře se ve většině případů obecně uvádí výskyt α-pinenu. Převládající skupinou mezi šesticí hlavních látek jsou uhlovodíky (1R-α-pinen, β-karyofyllen, kamfen). Tab. 6 - Majoritní složky: rozmarýn lékařský (Rosmarinus officinalis, L.), SPME Analyzovaná látka Retenční čas Plocha ( 10 5 ) RI (exp.) RI (lit.) Eucalyptol 12, R-α-Pinene 9, β-caryophyllene 23, Camphene 9, (1R,4R)-(+)-Camphor 15, (-)-Bornylacetate 19, Obr. 8 - Chromatogram: rozmarýn lékařský (Rosmarinus officinalis, L.), SPME 39

40 4.3 Analýza šalvěje lékařské (Salvia officinalis, L.) Destilace Analýzou šalvěje lékařské bylo identifikováno 19 látek. Za majoritní složky byly určeny α-thujon, eukalyptol, (1R,4R)-(+)-kafr, β-thujon, ledol a borneol. Ve většině literárních zdrojů je uveden α-thujon jako složka s největším obsahem, následovaná eukalyptolem, což se shoduje s výsledky experimentu. Výskyt α-thujonu ve vyšším množství a současně přítomnost β-thujonu, je pro šalvěj charakteristický. Při rozdělení šestice výše zmíněných látek do chemických skupin lze pozorovat, že převládající skupinou jsou ketony (α-thujon, kafr, β-thujon) a alkoholy (ledol, borneol). Tab. 7 - Majoritní složky: šalvěj lékařská (Salvia officinalis, L.), destilačně Analyzovaná látka Retenční čas Plocha ( 10 5 ) RI (exp.) RI (lit.) α-thujone 14, Eucalyptol 12, (1R,4R)-(+)-Camphor 15, β-thujone 15, Ledol 27,61 954, Borneol 16,42 632, Obr. 9 - Chromatogram: šalvěj lékařská (Salvia officinalis, L.), destilačně 40

41 Extrakce SPME Během analýzy šalvěje lékařské bylo identifikováno 41 látek a jako hlavní složky byly určeny α-thujon, eukalyptol, α-karyofyllen, (1R,4R)-(+)-kafr, β-karyofyllen a β-pinen. Při srovnání výsledků analýzy šalvěje u obou extrakčních metod se pouze u metody SPME vyskytuje mezi hlavními šesti látkami α- i β-karyofyllen, které jsou v literatuře uváděny jako složky charakteristické pro druh Salvia officinalis. Z hlavních 6 látek tvoří polovinu terpenické uhlovodíky (α-karyofyllen, β-karyofyllen, β-pinen). Tab. 8 - Majoritní složky: šalvěj lékařská (Salvia officinalis, L.), SPME Analyzovaná látka Retenční čas Plocha ( 10 5 ) RI (exp.) RI (lit.) α-thujone 14, Eucalyptol 12, α-caryophyllene 24, (1R,4R)-(+)-Camphor 15, β-caryophyllene 23, β-pinene 11, Obr Chromatogram: šalvěj lékařská (Salvia officinalis, L.), SPME 41

42 4.4 Analýza tymiánu obecného (Thymus vulgaris, L.) Destilace Při analýze tymiánu obecného bylo identifikováno celkem 18 složek. V destilačním preparátu byly pouze 3 látky vyhodnoceny jako majoritní a zbylé identifikované látky se vyskytovaly pouze v malém množství. Majoritními složkami byly thymol a karvakrol (fenoly), což se shoduje s literárními zdroji, a 4-tert-butylkatechol (alkohol). Dalšími detekovanými látkami byly například β-linalool, borneol a cis-β-terpineol. Jiné látky zmíněné v literatuře, které byly také identifikovány během tohoto experimentu, jsou β-linalool i γ-terpinen, avšak jejich množství bylo poměrně malé. Během analýzy byl identifikován také 4-tert-butylkatechol, který však v literatuře není uváděn jako charakteristická látka obsažená v tymiánové silici. Tab. 9 - Majoritní složky: tymián obecný (Thymus vulgaris, L.), destilačně Analyzovaná látka Retenční čas Plocha ( 10 5 ) RI (exp.) RI (lit.) Thymol 19, Carvacrol 20, tert-butyl-pyrocatechol 23,91 898, β-linalool 14,39 239, Borneol 16,37 158, cis-β-terpineol 13,42 158, Obr Chromatogram: tymián obecný (Thymus vulgaris, L.), destilačně 42