Protilátky proti Helicobacter pylori (IgA). Návod k testu pro WESTERN BLOT

Transkript

1 Protilátky proti Helicobacter pylori (IgA). Návod k testu pro WESTERN BLOT OBJEDNACÍ PROTILÁTKY IG-TŘÍDA SUBSTRÁT FORMÁT ČÍSLO PROTI DY A Helicobacter pylori IgA WESTERN BLOTové 16 x 01 (16) (kompletní antigeny) stripy potažené antigenem Indikace: Chronická aktivní gastritida (antrální gastritida), duodenální a žaludeční vřed. Principy testu: Testovací souprava pro WESTERN BLOT umožňuje kvalitativní, in vitro detekci lidských protilátek proti Helicobacter pylori. Testovací souprava obsahuje testovací stripy s extraktem elektroforeticky oddělených antigenů Helicobacter pylori. V prvním kroku reakce se tyto stripy blokují a inkubují s ředěným sérem pacienta. Jde-li o positivní vzorek, váží se specifické protilátky třídy IgG (i IgM a IgA) na antigeny. Detekce navázaných protilátek se provádí další inkubací s protilátkou proti lidským IgA označenou enzymem (konjugát), která dávají barevnou reakci. Součásti testovací soupravy: Testovací stripy s elektroforeticky separovanými antigeny Helicobacter pylori: 16 testovacích stripů Kontrolní strip na vyhodnocovací šabloně: 1 testovací strip inkubovaný s pozitivním kontrolním sérem Alkalickou fosfatázou značené protilátky (kozí) proti lidským IgA: 1x3 ml 10x koncentrované, tj. množství dostačující pro přípravu 30 ml konjugátu hotového k použití Koncentrát pufru: 1 x 50 ml 10 x koncentrovaného pufru, tj. množství dostačující pro přípravu 500 ml univerzálního pufru hotového k použití Roztok substrátu: 1 x 30 ml, připravený k použití, Nitrobluetetrazoliumchloride/5-Bromo-4- chloro-3- indolylphosphate (NBT/BCIP) Vyhodnocovací šablona a vyhodnocovací protokol: 1 papír Vaničky k inkubaci: 2 x 8 kanálků Plastová folie Pracovní návod Uskladnění: Skladujte testovací soupravu při +2 C až +8 C. Upozornění k použití: Používejte pouze součásti se stejným číslem šarže. Varování: Kontrolní sérum, které se používá k inkubaci kontrolního proužku, bylo testováno na negativitu HBsAg, anti-hiv-1 a anti-hiv-2 s použitím EIA a nepřímé imunofluorescence. Přesto musí být s veškerým materiálem nakládáno jako s možným zdrojem infekce, a proto s ním zacházejte opatrně. Některé reagencie jsou potenciálně toxické (pufr, roztok substrátu). Vyvarujte se jejich kontaktu s kůží. Dojde-li ke kontaktu s kůží, umyjte ji mýdlem a proudem vody.

2 Příprava reagencií Pozor: Všechny složky nechte před použitím vytemperovat na laboratorní teplotu. Potažené testovací stripy: Připraveny k použití. Skleněnou zkumavku s testovacími stripy otvírejte teprve když stripy mají laboratorní teplotu, aby se předešlo kondenzaci vodní páry na stripech. Po vyjmutí stripů zkumavku těsně uzavřete a skladujte při teplotě +2 C až +8 C. Univerzální pufr: Koncentrát pufru je dodán 10 x koncentrovaný. K přípravě pracovního univerzálního pufru odpipetujte čistou pipetou potřebné množství a zřeďte v poměru 1 : 10 destilovanou nebo deionizovanou vodou. K inkubaci jednoho testovacího stripu naředˇte 1,5 ml koncentrovaného pufru 13,5 ml destilované nebo deionizované vody. Zředěný pufr je stálý maximálně jeden týden při teplotě +2 C až +8 C. UPOZORNĚNÍ: Jestliže dojde v koncentrovaném pufru ke krystalizaci, zahřejte ho před ředěním na 37 C a dobře promíchejte. Konjugát: Koncentrát protilátek proti lidským IgA je 10 x koncentrovaný. K přípravě pracovní koncentrace konjugátu odpipetujte čistou pipetou potřebné množství a zřeďte v poměru 1 :10 univerzálním pufrem. Pro jeden testovací strip se ředí 0,15 ml koncentrátu s 1,35 ml univerzálního pufru. Roztok substrátu: Připravený k použití. Uzavřete lahvičku ihned po použití, komponenty jsou citlivé na světlo. Příprava vzorků Vzorky séra pro analýzu jsou naředěny 1:51 universálním pufrem (30 µl séra se přidá k 1,5 ml universálního pufru a dobře promíchá.) Blokování: Inkubace se sérem: (1. krok) Promývání: Inkubace s konjugátem: (2.krok) Promývání: Inkubace se substrátem: (3.krok) Zastavení: Inkubace Počet kanálků inkubační vaničky shodný s počtem testovaných sér se naplní 1,5 ml univerzálního pufru. Ze skleněné zkumavky vyjměte požadovaný počet testovacích stripů a dejte do každého kanálku jeden tak, aby se citlivá vrstva nedotýkala dna vaničky (značka a číslo stripů musí být viditelné). Inkubujte na kývavé třepačce 15 minut při laboratorní teplotě. Potom všechen pufr odsajte. Naplňte každý kanálek 1,5 ml předem zředěného vyšetřovaného séra a inkubujte na kývavé třepačce 30 minut při laboratorní teplotě. Odsajte sérum z každého kanálku a promývejte je 3 x po pěti minutách na kývavé třepačce vždy 1,5 ml ředěného univerzálního pufru. Napipetujte 1,5 ml předem zředěného konjugátu do každého kanálku a inkubujte 30 min na kývavé třepačce při laboratorní teplotě. Odsajte konjugát z každého kanálku a promývejte je 3 x po pěti minutách na kývavé třepačce vždy 1,5 ml ředěného univerzálního pufru. Napipetujte 1,5 ml roztoku substrátu do každého kanálku a inkubujte 10 min na kývavé třepačce při laboratorní teplotě. Odsajte substrát z každého kanálku a promyjte každý strip třikrát v deionizované nebo destilované vodě.

3 Helicobacter pylori - WESTERN BLOT Postup provedení testu 1. PŘÍPRAVA: umístěte blotovací stripy do inkubačních kanálků obsahujících 1,5 ml univerzálního pufru 15 min třepat 2. INKUBACE VZORKU: odsajte, napipetujte 1,5 ml zředěného séra (1:51) do inkubačních kanálků 30 min třepat 3. PROMÝVÁNÍ 1,5 ml univerzálního pufru 3 x 5 minut 4. INKUBACE S KONJUGÁTEM: odsajte, napipetujte 1,5 ml konjugátu (1:10) do inkubačních kanálků 30 min třepat 5. PROMÝVÁNÍ 1,5 ml univerzálního pufru 3 x 5 minut 6. INKUBACE SE SUBSTRÁTEM: odsajte, napipetujte 1,5 ml roztoku substrátu do inkubačních kanálků 10 min třepat 7. ZASTAVENÍ: odsajte, 1,5 ml destilované vody 3 x 1 minutu 8. VIZUÁLNÍ HODNOCENÍ

4 Vyhodnocení a interpretace výsledků Anti-Helicobacter pylori - WESTERN BLOT (IgA) Manipulace: Položte inkubované blotovací stripy na filtrační papír, opatrně je přetřete savým papírem a pomocí čistého adhesivního pásku připevněte na plastový film. Nyní přilepte plastový film s blotovacími stripy k vyhodnocovacímu protokolu. (Upozornění: Jestliže bylo inkubováno méně než 16 stripů, je možné plastový film odstřihnout a část se stripy připevnit k protokolu.) Přiložte vyhodnocovací šablonu k blotovacím stripům a umístěte ji tak, že černá čára nad číslem blotovacího stripu tvoří linii s orientační čárou na vyhodnocovací šabloně. Číslo šarže na vyhodnocovací šabloně musí být shodné s číslem na zkumavce s používanými blotovacími stripy. Zřetelně rozpoznatelné proužky na blotovacích stripech, které se shodují se značkami na vyhodnocovací šabloně, zaneste do protokolu. Antigeny: Antigen pro EUROIMMUN Anti-Helicobacter pylori WESTERN BLOT je získán z typového kmene Helicobacter pylori (1, 2). Vykultivovaný helikobakter byl izolován a solubilizované proteiny byly diskontinuální polyacrylamidovou gelovou elektroforézou rozděleny podle molekulové hmotnosti a přeneseny na nitrocelulózu. Z každé testovací soupravy byly 2 testovací stripy inkubovány s referenčním sérem. Jeden z těchto barvených stripů obsahuje souprava, druhý zůstává ve výrobním závodě Euroimmun k dokumentaci. Specifita antigenů na testovacích stripech: (5,6,7) Band Antigen Specifita 120 kda Cytotoxin A associated protein, CagA, p120 vysoce specifický 95 kda Vacuolizing cytotoxin A,VacA, p95 vysoce specifický 75 kda p75 nespecifický 67 kda Flagellar Sheath Protein, FSH, p67 nespecifický, zkřížená reakce s ostatními bakteriemi 66 kda UreB, p66 těžká podjednotka ureázy, zkřížená reakce s dalšími bakteriemi s ureázou 57 kda Heat Shock Protein homolog, p57 nespecifický 54 kda Flagellin, p54 nespecifický, zkřížená reakce s ostatními bakteriemi s bičíkem 50 kda p50 Nespecifický 41 kda p 41 Nespecifický 33 kda p33 Pravděpodobně specifický 30 kda Outer membrane protein, p30 druhově specifický 29 kda UreA, p29 lehká podjednotka ureázy, vysoce specifický 26 kda p26 vysoce specifický 19 kda Outer membrane protein, p19 druhově specifický 17 kda p17 Pravděpodobně specifický 13 kda p13 Nespecifický

5 Protilátky proti Helicobacter pylori Po kontaktu s Helicobacter pylori se v séru mohou objevit protilátky IgA, IgG a IgM. Specifické IgM protilátky vymizí během několika týdnů. IgA protilátky přetrvávají výrazně déle, zvýšené titry IgA se často nacházejí po poklesu protilátek IgM a mohou přetrvávat po mnoho let. IgA protilátky se tvoří lokálně, ne vždy se nacházejí v séru. Pozitivní výsledek IgA dobře koreluje s aktivitou gastritidy. Zvýšené titry IgA protilátek jsou považovány za známku chronické infekce. Protilátky proti Helicobacter pylori se vyskytují u asi 70% pacientů s chronickou aktivní gastritidou, v 60-90% případů jsou spojeny s výskytem vředu. Testy na stanovení specifických IgA protilátek jsou vhodným ukazatelem při monitorování terapie pro kompletní eradikaci Helicobactera pylori. Signifikantní skok titru IgA protilátek po zhruba 6-ti týdenní terapii je ukazatelem úspěšnosti léčby. Kategorie protilátek proti Helicobacter pylori K vyhodnocení signálů musí být brána v úvahu pozice a intenzita zabarvení proužků, protože negativní séra mohou vyvolat na stripech slabý signál. Antigeny Helicobacter pylori mohou být obecně rozděleny do tří kategorií (6). Kategorie Antigeny 1 Zkříženě reagující a nedefinované antigeny s molekulovou hmotností, 13 kda, 41 kda, 50 kda, 54 kda, 57 kda, 67 kda a 75 kda 2 Antigen s molekulovou hmotností 66 kda (urease B) 3 Druhově specifické a vysoce specifické antigeny s molekulovou hmotností 17 kda, 19 kda, 26 kda, 30 kda, 33 kda, 95 kda a 120 kda.

6 Interpretace výsledků IgA protilátek: Výsledky Charakteristika Negativní Žádné proužky nebo několik slabých proužků z kategorie 1 a 2, nebo 1 slabě pozitivní proužek z kategorie 3 (antigeny z kategorie 3 mají ve vyhodnocovacím protokolu šedý odstín) Hraniční Pozitivní Minimálně 2 slabé proužky z kategorie 2 nebo 3 nebo jeden zřetelný proužek z kategorie 3 (antigeny z kategorie 3 mají ve vyhodnocovacím protokolu šedý odstín) Minimálně 2 zřetelné proužky z kategorie 2 nebo 3 (antigeny z kategorie 3 mají ve vyhodnocovacím protokolu šedý odstín) Klinické projevy infekce Helicobacter pylori První úspěšná izolace Helicobactera pylori (syn. Campylobacter pylori a C. pyloridis) se podařila v roce 1982 ze žaludeční mukózní membrány pacienta s chronickou gastritidou. Fakt, že baktérie přežívá v žaludečních mukózních membránách byla známa již zhruba 100 let. Domněnka o spojitosti s gastritidou a žaludečním vředem byla poprvé vyslovena ve 40. letech.0 Helicobacter pylori je gramnegativní spirálovitá baktérie s neobvykle vysokou tvorbou ureázy, která se hromadí intracelulárně na luminální straně epiteliálních buněk žaludečních mukózních membrán. Existují dva typy manifestace: spirální, stočená skutečně infekční forma a kokovitá dlouhoživotná forma. Helicobacter pylori je jediná pro člověka patogenní varieta Helicobactera. Prevalence je celosvětová. Biopsie ukazují, že baktérie kolonizuje především mukózní membrány při vstupu do žaludku, méně často je nacházena ve vlastním těle žaludku a v duodenu (při metaplazii žaludku). Infekce se nevyléčí samovolně, tzn. že infekční agens může perzistovat doživotně. Celosvětově je infikováno asi 50% populace. V epidemiologických studiích bylo prokázáno, že prevalence infekce stoupá s věkem. Helicobacter pylori je považován za původce chronické gastritidy typu B. Klinicky se infekce může manifestovat formou dyspepsie s bolestí v horní části břicha, histologicky může být viditelná povrchová gastritida s atrofií mukózních membrán. Většina infekcí však většinou zůstává klinicky asymptomatická. Klinické izoláty Helicobactera pylori mohou být rozděleny na dva typy. Kmeny Helicobacter pylori typu I mohou exprimovat specifický cytotoxin (VacA) stejně tak jako asociovaný protein (CagA). Kmeny, které nejsou schopny syntetizovat tento protein jsou zařazeny k typu II. Infekce typem I se zdají být spojeny s vyšší patogenitou. Klinické symptomy zahrnují gastritidu a tvorbu vředů, možnými pozdními následky jsou MALT lymfomy a adenokarcinomy. Perzistenci Helicobactera pylori napomáhají relapsy způsobené rekolonizací reziduálními organizmy z krypt mukózních membrán. V případě diagnostikované infekce Helicobacterem pylori vede kompletní a trvalá eradikace bakterie ke snížení výskytu relapsů o 80% u případů peptického vředu a o 20% u vředu duodenálního (1,2,3,4).

7 Literatura 1. Barthel, J.S., Everett, E.D.:Diagnosis of Campylobacter pylori Infections: The Gold Standard and the Alternatives Rev. Infect. Dis. 12 (Suppl.2): , (1990). 2. Kuipers, E.J., Schenk, B.E., Meuwissen, S.G.M.:Helicobacter pylori: who is positive and who not?europ.j.gastroent.hepatol. 7: (1995). 3. Zoeller,L., Sobe, D., Faulde, M.: Nachweis von Helicobacter pylori-in fektion:rolle der Pathogenesis.Klin. Lab. 39: (1993). 4. Mobley, H.L.T., Hu, L.T., Foxall, P.A.: Helicobacter pylori urease: Properties and Role in Pathogenesis. Scand.J.Gastroent. 26 (Suppl. 187):39 46 (1991). 5. Boellin, I., Loenroth, H., Svennerholm, A.-M.: Identification of Helicobacter pylori by Immunological Dot Blot Method Based on Reaction of a Species-Specific Monoclonal Antibody with a Surface-Exposed Protein. J.Clin.Microbiol. 33: (1995). 6. Faulde, M., Cremer, J., Zoeller, I.: Humoral Immune Response against Helicobacter pylori as Determined by Immunoblot. Electrophoresis 14: (1993). 7. Dunn, B.E.: Proteins, antigens, and typing methods for Helicobacter pylori. In Helicobacter pylori: Biology and Clinical Practice Edited by C.S. Goodwin and B.W. Worsley. CRC Press (1993). Verze 7/99