Stanovení antioxidační aktivity a redukční síly na ječmeni jarním (Hordeum vulgare, L. cv. Bonus)

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Stanovení antioxidační aktivity a redukční síly na ječmeni jarním (Hordeum vulgare, L. cv. Bonus)"

Rostislav Prokop
před 8 lety
Počet zobrazení:

1 Stanovení antioxidační aktivity a redukční síly na ječmeni jarním (Hordeum vulgare, L. cv. Bonus) Autor: Bc. Ursula Ferretti Spoluautor: Mgr. Jakub Nezval Ostravská Univerzita v Ostravě Přírodovědecká fakulta Katedra Fyziky SGS20/PřF/2013 a IET (CZ.1.05/2.1.00/ )

2 Obsah: Cíl práce Úvod do problematiky Metodika Experiment Výsledky Závěr

3 Cíl práce: Navrhnout a otestovat průběh vybraných metod ORAC DPPH FRAP Zkalibrovat metody standardním antioxidantem Trolox Sledovat změny antioxidační aktivity (AoA) v extraktech rostlin vystavených vybranému abiotickému faktoru Zda je AoA extraktů získaných z rostlin pod abiotickým stresem vyšší oproti kontrolním rostlinám? Vyhodnotit získaná data

4 Úvod do problematiky: Stresové faktory Abiotické Biotické Aktivní formy kyslíku 1 O 2, H 2 O 2, O 2 -, OH, HO 2 Antioxidanty Enzymatické Superoxiddismutasa, Katalasa Nízkomolekulární polyfenoly, karotenoidy Oxidativní stres Obr. 1: Schéma působení abiotického stresu

5 Metodika: Metoda DPPH (1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl) Principem metody je stanovení antioxidační aktivity pomocí stabilního radikálu DPPH a jeho reakce s antioxidanty, doprovázená barevnou změnou Obr. 2: Křvika TEAC - Závislost průměrného poklesu absorbance měřícího roztoku DPPH při 515 nm na koncentraci Troloxu (n=3, +SD). Trojice koncentračních řad Troloxu byla vytvořena ředěním ze stejného zásobního roztoku. Amax nm a 517 nm Použití: ke stanovení antioxidační kapacity potravin, hydrofobních systémů, vybraných rostlinných extraktů a metabolitů

6 Metoda FRAP (FERRIC REDUCTION ANTIOXIDANT POWER) Nepracuje s volnými radikály, ale je založena na principu redukce železitých iontů na železnaté Složení činidla: Roztok železitého komplexu TPTZ (2,4,6-tripyridyl-S-triazin) Roztok bezbarvého hexokyanatu draselného - K 3 [Fe(CN) 6 ] Acetátový pufr o ph 3,6 V poměru 1:1:10 Po reakci činidla FRAP s antioxidanty dochází taktéž k barevné změně (z průhledného roztoku vznikne modrý) Amax 593 nm Obr. 3: Křivka TEAC - Závislost průměrného nárůstu absorbance měřícího roztoku FRAP při 593 nm na koncentraci Troloxu (n=3, +SD). Trojice koncentračních řad Troloxu byla vytvořena ředěním ze stejného zásobního roztoku.

7 Metoda ORAC (Oxygen Radical Antioxidant Capacity) Principem metody je sledování úbytku signálu fluorescenční sondy, která je zhášena působením AFK, vygenerovaných azoiniciátorem. Složení činidla: Obr. 4 : Křivka TEAC - Závislost průměrné změny plochy pod křivkou [rel.] měřícího roztoku ORAC na koncentraci Troloxu [µm] (n=3, +SD), kdy trojice koncentračních řad Troloxu byla vytvořena ředěním ze stejného zásobního roztoku. PBS (ph=7,4), extrakt, standard (Trolox) Fluorescein Azo-iniciátor-AAPH (2,2 -azobis(2-amidinopropan)dichloridu) Hodnoty měření: Reakční čas: 30 min Teplota 37 C Excitační vlnová délka na 485 nm a emisní vlnová délka na 600 nm. Šířka štěrbin excitačního a emisního monochromátoru byla nastavena na 10 nm. K vyhodnocování se využívá technika pro kvantifikaci : Plocha pod křivkou/area Under Curve (AUC)

8 Metoda TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) Všechny výše uvedené metody stanovení antioxidační aktivity/kapacity produkují relativní výsledky Aby bylo možné srovnávat mezi sebou výsledky různých metod, je nezbytné metody kalibrovat za pomoci zvoleného antioxidantu a získat tak hodnotu TAC (Total Antioxidant Capacity) Využívá ke kalibraci derivátu vitamínu E 6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchroman 2-dikarboxylové kyseliny, Troloxu Relativní změna signálu je poté vztažena ke hmotnosti nebo látkovému množství Troloxu ve vzorku

9 Experiment: Ječmen jarní (Hordeum vulgare L. cv. Bonus) Růstové komory 8 dní Vystaveny světlu 16 hod denně Světelná intenzita FAR byla pro LI rostliny byla 100 µmol.m -2.s -1 a HI 1000 µmol.m -2.s -1 Teplota vzduchu 20 C, rel.vlhkost vzduchu 65% Výkon UV-B lamp: 0,5 W 8.den byl ječmen nasbírán a ze středních segmentů primárních listů bylo naváženo celkově 72 vzorků po 100 mg. Z těchto vzorků byly postupně připravovány extrakty ve vybraných rozpouštědlech tj. voda, 40% a 100% metanol.

10 Výsledky: U metody DPPH bylo zjištěno, že množství antioxidantů ve vzorcích bylo natolik malé, že nedošlo k žádné evidentní změně. Tento problém byl již vyřešen změnou objemu přidávaného vzorku. Obr. 5: (A 1) Srovnání průměrnýchtrolox ekvivalentů [mm] rostlin pěstovaných při různých světelných ozařenostech a extrahovaných v různých rozpouštědlech (ve vodě, 40% a 100%),(n=6, +SD) (A 2) Detail předchozího grafu.

11 Obr. 6: Srovnání průměrnýchtrolox ekvivalentů [mm] rostlin pěstovaných při různých světelných ozařenostech a extrahovaných v různých rozpouštědlech,(n=6, +SD), (B 1) voda, (B 2) 40% methanol, (B- 3) 100% methanol U metody FRAP jsou výsledky rozporuplné, podle y osy lze i u této metody (a taktéž po následném přezkoumání) říci, že množství antioxidantů ve vzorcích bylo příliš malé a tudíž se musí pozměnit objem přidávaného vzorku.

Obr. 7: Srovnání průměrnýchtrolox ekvivalentů [mm] rostlin pěstovaných při různých světelných ozařenostech a extrahovaných v různých rozpouštědlech,(n=6, +SD), (C 1)

12 Obr. 7: Srovnání průměrnýchtrolox ekvivalentů [mm] rostlin pěstovaných při různých světelných ozařenostech a extrahovaných v různých rozpouštědlech,(n=6, +SD), (C 1) voda, (C 2) 40% methanol, (C- 3) 100% methanol U metody ORAC se výsledky shodují s hypotézou AoA vzrůstá s ozářeností (LI x HI) i po přidání stresového faktoru (UV-B)

13 Závěr: Metoda ORAC plně souhlasí s hypotézou, že extrakty obdržené z listů rostlin vystavených UV-B radiaci a FAR mohou vykazovat vyšší antioxidační aktivitu (oproti kontrolním vzorkům), což je zřejmě způsobeno změnou regulace biosyntézy nízkomolekulárních antioxidantů, indukovanou nadměrnou produkcí aktivních forem kyslíku a dusíku. Nemodifikovanou metodu DPPH není možné použít pro stanovení antioxidační aktivity extraktů z ječmene jarního připravených z malého množství rostlinného materiálu. Metoda FRAP je velmi citlivá na přesnost a bylo by lepší ji modifikovat podobně jako metodu DPPH

14 A co bude dál?... Modifikace metody DPPH Modifikace metody FRAP Zavést metodu stanovení celkových polyfenolů s použitím činidla Folin-Ciocalteu Modifikovat metodu ABTS

15 Děkuji za pozornost

16 Literatura: PITERKOVÁ, Jana, Kateřina TOMÁNKOVÁ, Lenka LUHOVÁ, Marek PETŘIVALSKÝ a Pavel PEČ. Oxidativní stres: Lokalizace tvorby aktivních forem kyslíku a jejich degradace v rostlinném organismu. Chemické listy. 2005, č. 99, s FERRETTI, Ursula. Stanovení antioxidační aktivity rostlinných exktraků in-vitro. Ostrava, Bakalářská práce. Ostravská Univerzita v Ostravě. INZÉ, Dirk a Marc VAN MONTAGU. Oxidative stress in plants. Current opinion in biotechnology. 1995, č. 6, s ISSN IMPA, S.M. et al Drought Stress Induced Reactive Oxygen Species and Anti-oxidants in Plants. AHMAD, Parvaiz a M PRASAD. Abiotic stress responses in plants: metabolism, productivity and sustainability. New York: Springer, c2012, s ISBN NAGUIB, Yousry M.A. A Fluorometric Method for Measurement of Oxygen Radical-Scavenging Activity of Water-Soluble Antioxidants. Analytical Biochemistry. 2000, roč. 284, č. 1, s ISSN DOI: /abio Dostupné z: eve/pii/s

Podobné dokumenty

1 Metody stanovení antioxidantů

1 Metody stanovení antioxidantů Antioxidanty nazýváme látky schopné i v relativně nízkých koncentracích konkurovat ostatním potenciálně oxidovatelným substrátům, a tím oddálit či zcela inhibovat jejich