ÚVOD A PROBLEMATIKA...

Transkript

1 1. Obsah 1. OBSAH POUŽITÉ ZKRATKY ÚVOD A PROBLEMATIKA PROTINÁDOROVÁ LÉČBA NA BÁZI CISPLATINY Cis-diamindichlorplatina(II) Typy cisplatinových DNA aduktů MECHANISMUS NUKLEOTIDOVÉ EXCIZNÍ OPRAVY Protein XPA Vlastnosti a funkce reparačního proteinu XPA Model vazebné reakce XPA proteinu s místem poškození na DNA Neobvyklé elektroforetické chování XPA proteinu KOMPLEX PROTEINŮ XPF-ERCC PRINCIP ELEKTROFORETICKÝCH METOD, VYUŽÍVANÝCH PRO SEPARACI BIOMAKROMOLEKUL Faktory ovlivňující pohyb iontů v elektrickém poli Klasifikace elektroforetických metod Určení molekulové hmotnosti proteinů Polyakrylamidové gely Analýza oligomerních struktur proteinů Elektroforetická separace proteinů za nativních podmínek: PFO-PAGE CÍLE BAKALÁŘSKÉ PRÁCE MATERIÁLY A METODY PROTEINY BAKTERIÁLNÍ KMENY CHEMIKÁLIE ROZTOKY A PUFRY Roztoky a pufry použité při SDS-PAGE Roztoky a pufry použité při nativní elektroforéze PŘÍSTROJE A POMŮCKY METODY Určení molekulové hmotnosti Provedení SDS-PAGE, aparatura Mini Protean II Nativní elektroforéza proteinů (PFO-PAGE) Barvení proteinů v PAA gelech (SDS, PFO) po elektroforéze Dokumentace výsledků, uchování gelů po SDS-PAGE a nativní elektroforéze sušením Příprava buněčných lyzátů Zahuštění buněčných lyzátů VÝSLEDKY SDS-PAGE MODELOVÉHO PROTEINU BSA Ověření molekulové hmotnosti BSA proteinu

2 Možnosti využití metody SDS-PAGE při optimalizaci exprese rekombinantních proteinů v buňkách E. coli Exprese proteinu p Exprese komplexu proteinů XPF-ERCC ELEKTROFORÉZA PROTEINŮ ZA NATIVNÍCH PODMÍNEK (PFO-PAGE) PFO-PAGE modelového proteinu BSA Elektroforetické chování proteinu HMGB1b7 za podmínek PFO-PAGE Využití metody elektroforézy proteinů za podmínek PFO-PAGE Chování komplexu proteinů XPF-ERCC1 za nativních podmínek PFO-PAGE analýza buněčných lyzátů při expresi XPF-ERCC NEOBVYKLÉ ELEKTROFORETICKÉ CHOVÁNÍ PROTEINU XPA SDS-PAGE chování proteinu XPA PFO-PAGE chování XPA proteinu DISKUSE ZÁVĚR LITERATURA

3 2. Použité zkratky APS AIDA bp BSA DTT DNA EMSA ERCC1 HMG HPA HR23B IPTG kda Mili Q H 2 O NER NFκB PAA PCNA PFO PFO-PAGE RFC RPA rpm RTS SDS SDS-PAGE TEMED TFIIH TrisHCl UV záření v/v w/v w/w persulphate of ammonium - persíran amonný advanced image data analyse program pro analytické vyhodnocení gelu base pairs párů bází albumin, bovine serum - bovinní sérum albumin dithiothreitol deoxyribonucleic acid deoxyribonukleová kiselina electrophoretic mobility shift assay test změny elektroforetické pohyblivosti DNA s proteinem v gelu excision repair cross complementing group 1 excizní reparační protein komplementační skupiny 1 high mobility group protein - protein skupiny vysoké pohyblivosti hydroxyapatit lidský homolog kvasinkového proteinu RAD23 isopropyl-β-d-thiogalaktosid kilodalton demineralized water - deionizovaná voda nucleotide excision repair - nukleotidová excizní oprava transcrioption factor transkripční faktor polyacrylamide - polyakrylamidový proliferating cell nuclear antigen antigen buněčný jaderný proliferační pentadekafluoroctane acid - kyselina pentadekafluorooktanová polyakrylamidová gelová elektroforéza s perfluoro-oktanovou kyselinou replication factor C faktor C replikační replication protein A replikační protein A rate per minute - počet otáček za minutu rapid translation system systém pro in vitro translaci sodium dodecylsulphate - dodecylsulfát sodný polyakrylamidová gelová elektroforéza s dodecylsulfátem sodným tetramethylethylendiamin transcription factor IIH transkripční faktor IIH tris(hydroxymethyl)aminomethan hydrochlorid ultraviolet - ultrafialové záření ratio volumes - poměr objemů ratio weight and volume - poměr hmotnosti a objemu ratio weights - poměr hmotností - 3 -

4 XPA XPB XPC XPD XPE XPF XPG XPV xeroderma pigmentosum complementation group A protein protein xeroderma pigmentosum komplementační skupiny A xeroderma pigmentosum complementation group B protein protein xeroderma pigmentosum komplementační skupiny B xeroderma pigmentosum complementation group C protein protein xeroderma pigmentosum komplementační skupiny C xeroderma pigmentosum complementation group D protein protein xeroderma pigmentosum komplementační skupiny D xeroderma pigmentosum complementation group E protein protein xeroderma pigmentosum komplementační skupiny E xeroderma pigmentosum complementation group F protein protein xeroderma pigmentosum komplementační skupiny F xeroderma pigmentosum complementation group G protein protein xeroderma pigmentosum komplementační skupiny G xeroderma pigmentosum complementation group V protein protein xeroderma pigmentosum komplementační skupiny V - 4 -

5 3. ÚVOD A PROBLEMATIKA V současné době jsou intenzivně hledány cesty pro zvýšení účinnosti protinádorové terapie. Dosud nejúčinnější jsou látky na bázi cisplatiny, které jsou schopny za podmínek in vivo se vázat k DNA, způsobit zástavu dělení a posléze smrt buňky. Přes tyto nesporné výhody, má terapeutické použití cisplatinových derivátů i některé nežádoucí účinky, které spočívají především v nefrotoxicitě či v přirozené rezistenci některých typů nádorů k působení léčby nebo po opakovaném podání vyvolat sekundární nádorovou resistenci. Jednou z možných příčin rezistence nádorových buněk k působení cisplatinových derivátů je rozpoznávání vzniklých lézí na DNA některými proteiny, které jsou schopné aktivovat účinné reparační mechanismy buňky. Proto se výzkumu reparačních mechanismů, rozpoznávajících poškození DNA vyvolanými platinovými komplexy věnuje velká pozornost a za podmínek in vitro jsou studovány interakce mezi cíleně modifikovanou DNA a vybranými proteiny, které jsou připraveny rekombinantní technologií. Jedním ze základních opravných mechanismů buňky je nukleotidová excizní reparace (NER), spočívající v rozeznání a vyštěpení poškozeného místa na DNA. Nukleotidové excizní opravy se v lidských buňkách účastní několik desítek proteinům a jedním z nich je protein xeroderma pigmentosum skupiny A (XPA), který v mechanismu NER hraje klíčovou roli, stejně tak komplex strukturně specifické endonukleázy XPF-ERCC1. Experimentální část práce je zaměřena na uplatnění elektroforetických metod při charakterizaci proteinů připravených rekombinantní technologií a současně také na získání podrobnějších informací o elektroforetickém chování reparačních proteinů zejména XPA a XPF-ERCC1 v různých typech polyakrylamidových (PAA) gelů jak v přítomnosti dodecylsulfátu sodného tak i za podmínek tzv. nativní elektroforézy s použitím kyseliny pentadekafluoroktanové (PFO) a její sodné soli Protinádorová léčba na bázi cisplatiny Při nádorové léčbě se používají cytostatika, což jsou látky, které tlumí růst a dělení buněk. Přes vysokou účinnost, která vykazují cytostatika odvozená od platiny, vyskytují se nežádoucí jevy, jako opravné mechanismy buňky, které vzniklé adukty DNA-platina odstraňují a tím významné přispívají ke snížení terapeutického efektu. Jedním z kandidátních mechanismů je nukleotidová excizní oprava, které je experimentálně věnována velká pozornost. V případě objevení účinného in vivo mechanismu ochrany vzniklých DNA lézí před reparačním mechanismem buňky v rámci nádorové tkáně, by bylo možné zvýšit účinnost léčby Cis-diamindichlorplatina(II) Cisplatina byla první anorganické léčivo nádorových onemocnění aplikované v klinické praxi. Je to jednoduchá molekula skládající se z 11 atomů (obr. č. 1). Chemoterapie založená na cisplatině je úspěšná především při léčbě rakoviny varlat, vaječníků, mozku a plic. Některé nádory však mají přirozenou rezistenci k cisplatině. Příčinou rezistence může být snížená hladina léčiva dostupná v buňce, inaktivace cisplatiny prostřednictvím glutathionu a thiol obsahujících proteinů, zvýšená oprava cisplatinových aduktů, aktivace reparačních - 5 -

6 mechanismů a zvýšená tolerance DNA cisplatinové léze k opravě. Adukty cisplatiny inhibují replikaci a transkripci, ale také mohou být přemostěny DNA a RNA polymerázou. Studie naznačují, že cisplatina inhibuje růst některých typů nádorových buněk a může způsobit zástavu v G2 fázi buněčného cyklu a apoptózu (Brabec, 2002). cisplatina transplatina Obr. č. 1: Struktura cisplatiny a transplatiny (Kartalou a Essigmann, 2001 a) Typy cisplatinových DNA aduktů Cisplatina především reaguje v buněčném jádře (obr. č. 2). Po vstupu do buňky cisplatina ztrácí své chloridové ligandy v prostředí obsahujícím nízkou koncentraci chloridových iontů. Jsou substituovány molekulami vody a tímto se stává pozitivně nabitou. Bylo prokázáno, že jen tato struktura je schopna se vázat na DNA. Cisplatina vytváří vnitrořetězcové křížové vazby mezi sousedními guaninovými zbytky nebo mezi adeninem a guaninem. Vznikají adukty - ze 65 % 1,2-d(GpG), z 25 % 1,2-d(ApG) a také z 5-10 % 1,3-d(GpNpG). V menší míře vznikají také monofunkční adukty a meziřetězcové křížové vazby. (Brabec, 2002) Ttrans-diammindichloroplatina (transplatina) (obr. č. 1) vytváří hlavně meziřetězcové křížové vazby mezi guaninem a cytosinem a asi 50% monofunkčních aduktů. Za protinádorovou aktivitu jsou zodpovědné především 1,2 vnitrořetězcové křížové vazby cisplatiny. Transplatina tento typ aduktů nevytváří, proto je terapeuticky neúčinná a nepoužívá se k léčbě (Brabec, 2002). Cisplatina inhibuje syntézu DNA in vitro a in vivo. Inhibice je způsobena přítomností vnitrořetězcových křížových vazeb mezi sousedními guaniny a cisplatinou. Monofunkční adukty cisplatiny nebo transplatiny ovlivňují replikaci zanedbatelně (Pinto a Lippard, 1985). Obr. č. 2: Tvorba cisplatinových aduktů v buňce (Kartalou a Essigmann, 2001 b) - 6 -

7 3.2. Mechanismus nukleotidové excizní opravy Jak již bylo výše uvedeno, buňka je vybavena reparačními mechanismy, které dovolují zachování integrity genomu právě schopnností odstranit poškození vzniklá na DNA ať již po působení nežádoucích látek z okolního prostředí, nebo vlivem UV záření, ale také po působení protinádorových terapeutik na bázi cisplatiny. Právě aktivace reparačních mechanismů v nádorových buňkách pak významně snižuje léčebný efekt cisplatiny. Existuje několik modelů průběhu nukleotidové excizní opravy za účasti celé řady proteinů Xeroderma pigmentosum komplementačních skupin A G, a V (XP). Nukleotidová excizní oprava (NER) je pro organismy velice důležitá, narušení tohoto procesu může mít fatální následky. Mutace v genech kódujících proteiny, zúčastňující se mechanismu NER způsobuje u lidí výskyt dědičných onemocnění. Mutace u některých z genů XPA až XPG zapříčiňují autozomálně recesivní dědičné onemocnění Xeroderma pigmentosum. Nejtěžší forma je spojena s mutacemi v genu XPA. Z toho vyplývá důležitost funkce XPA proteinu při nukleotidové excizní opravě. Onemocnění nastupuje již v ranném věku a projevuje se vysokou citlivostí k UV záření, abnormální pigmentace, zvýšenou incidencí rakoviny kůže, mentální retardací. Frekvence výskytu onemocnění je 1 : , nejvyšší procentuální zastoupení je v Japonsku a u obyvatel středomoří, u černošské populace se onemocnění nevyskytuje. (Lehmann, 2003) Jeden z posledních navržených modelů NER, konkrétně pro opravu cisplatinového aduktu je uveden na obr. č. 3 (Dip a kol., 2004): DNA - cisplatinový adukt (obr. 3A) je nejdříve rozeznán komplexem proteinů XPC.HR23B (obr. 3B). Transkripční faktor IIH (TFIIH) se připojí k místu poškození na DNA jako druhý. TFIIH obsahuje dva faktory s helikázovou aktivitou, a to XPB (ve směru 3-5 ) a XPD (ve směru 5-3 ) (Araújo a Wood, 2000). Přítomnost ATP dovoluje těmto helikázám odvinout DNA kolem místa poškození (obr. 3C). Protein RPA obsadí nepoškozený komplementární řetězec DNA (obr. 3D). Poté se připojí protein XPA. Připojení je řízeno kontaktem XPA s TFIIH a RPA. XPA dává možnost uskupení dalších faktorů RPA, XPG a konečně XPF-ERCC1. RPA, který se váže na odvinutý řetězec DNA, který je bez poškození, interaguje s XPA a zesiluje jeho interakce s DNA. RPA stabilizuje nejen XPA v komplexu, ale také XPG (obr. 3E). Vazba XPF-ERCC1 ke komplexu (obr. 3F) je podmíněna otevřením řetězců DNA prostřednictvím TFIIH a přítomností XPA, RPA a XPG. Během reakce je odvinut úsek v rozsahu až 32 nukleotidů, čímž se vytvoří substrát pro štěpení dvou specifických endonukleáz XPG na 3 konci od místa poškození a XPF-ERCC1 na 5 konci. Působením komplexu proteinů (obr. 3F) je vyštěpen až - 32 nukleotidů oligomer s místem poškození. (Araújo a Wood, 2000) Faktory jako XPC-HR23B, TFIIH a XPA jsou postupně uvolněny buď během reakce, při které dochází k vyštěpení, nebo po nasednutí faktorů pro syntézu DNA. Jediný protein RPA zůstavá přítomen, chrání templátový úsek DNA a účastní se obou procesů. Potřebnými faktory pro novou syntézu DNA jsou PCNA, RFC, RPA, DNA polymeráza δ nebo ε a ligáza (Riedl a kol., 2003)

8 Obr. č. 3: Schéma nukleotidové excizní opravy (Dip a kol., 2004) Protein XPA Gen XPA (xeroderma pigmentosum complementační skupina A) je lokalizován na lidském chromozomu v lokusu 9q22.3 a kóduje jaderný metaloprotein XPA a obsahu 273 aminokyselin. Velikost genu je 25 kbp a obsahuje šest exonů. Pomocí místně řízené mutageneze byl zjištěn vztah exonů k funkci XPA proteinu (Miyamoto a kol., 1992). V procesu nukleotidové excizní opravy XPA působí zejména jako koordinátor funkce dalších proteinů. Je-li XPA nefunkční nebo není-li exprimován, tak nukleotidová excizní oprava neprobíhá a není vyštěpeno místo poškození na DNA. Komplex proteinů XPA a RPA hraje důležitou úlohu v NER připojením a stabilizací ostatních funkčně potřebných proteinů do spravné pozice (Batty a Wood, 2000) Vlastnosti a funkce reparačního proteinu XPA Protein XPA obsahuje několik funkčních domén (obr. č. 5). Jeho N-konec (aminokyselinové zbytky 4-97) se váže k proteinům RPA p34 a ERCC1. Část proteinu vázající se k RPA p34 je kódována exonem 1 a část proteinu vázající se k ERCC1 je kódována exonem 2. Sekvence aminokyselin nezbytná k interakci XPA s ERCC1 je oblast sedmi glutamových kyselin (Glu 78 -Glu 84 ) a také tetrapeptid (Gly 72 -Phe 75 ) v exonu 2. Delece těchto částí vede ke snížení funkce XPA proteinu. Interakce XPA s ERCC1 je nezbytná pro 5' endonukleázovou aktivitu komplexu XPF-ERCC1 (Li a kol., 1995). XPA-RPA komplex má vyšší afinitu k místu poškození na DNA než každý protein samostatně. Vazba XPA k RPA je nezbytná pro nukleotidovou excizní opravu. RPA je heterotrimerický protein obsahující tři podjednotky 70kDa, 34kDa a 14kDa (Cleaver a States, 1997)

9 C-koncem (aminokyseliny ) XPA protein váže komplex TFIIH, který obsahuje helikázy XPB a XPD. Tato část XPA je kódována exonem 6, jehož delece je také fatální pro funkci XPA. (Cleaver a States, 1997) Centrální doména (aminokyselinové zbytky ) XPA proteinu byla identifikována jako minimální oblast pro preferenční vazbu k poškození na DNA (obr. č. 5). Tato doména obsahuje také sekvenci nezbytnou pro vazbu k RPA p70 - největší podjednotky heterotrimerického proteinu RPA.XPA centrální doména má dvě subdomény, a to subdoménu s motivem zinkového prstu (aminokyseliny ) a C-terminální subdoménu. Subdoména obsahující zinek je složena z antiparaleleních β-řetězců a α-šroubovice. Zinečnatý iont váže cysteiny 105, 108, 126 a 129. Tato subdoména obsahuje hydrofobní jádro vytvářené prostřednictvím β-listů z C-terminální subdomény a α-šroubovice ze subdomény se zinečnatým iontem. V oblasti se zinečnatým iontem se také vyskytují zbytky kyselých aminokyselin, a tímto se struktura odlišuje od motivů zinkových prstů jiných transkripčních faktorů (Ikegami a kol., 1998). Zinkový prst je kódován exonem 3 (obr. 4). Tato subdoména je nezbytná pro vazbu k DNA. Mutace některého z cysteinů tvořícího motiv zinkového prstu snižuje funkci XPA proteinu a delece exonu 3 úplně eliminuje správnou funkci XPA proteinu (Cleaver a States, 1997). Obr. č. 4: Schematické znázornění struktury a vazebných domén XPA proteinu ukazující pořadí jednotlivých exonů, přímka vyznačuje aminokyselinovou sekvenci, na ní jsou strukturní motivy (NLS jaderný lokalizační signál), pod přímkou a nad přímkou jsou vazebná místa pro DNA a pro proteiny nukleotidové excizní opravy (upraveno dle Cleaver a States, 1997). Obr. č. 5: Strukturní model centrální domény XPA proteinu (Ikegami a kol., 1998) - 9 -

10 Model vazebné reakce XPA proteinu s místem poškození na DNA Substráty pro opravný proces byly zkoumány iv vivo a in vitro a výsledky naznačují velmi mnohostranou opravnou kapacitu a vysokou afinitu XPA proteinu k lézím na DNA. Jsou to například fotoprodukty, benzo(a)pyrenové adukty, cisplatinové adukty, aflatoxinové adukty, syntetické cholesterolové pseudonukleotidy, triplexy DNA, pyrimidinové dimery, psoralenové adukty, apurinová místa a oxidativní poškození (Huang a kol., 1994; Missura a kol., 2001). Díky znalostem o struktuře proteinu XPA byl navržen model vazebné reakce XPA u místa poškození. Vazebná oblast XPA proteinu, která obsahuje jádro se 122 aminokyselinami, které je kódováno exonem 3, 4 a 5, obsahuje motiv zinkového prstu a větší část s velkým množstvím α-šroubovic, která interaguje s RPA (obr.5). Zinkový prst se váže k DNA v okolí léze a díky němu je XPA v DNA zakotven. Zinkový prst přímo neinteraguje s poškozením na DNA, se kterými ale reaguje oblast proteinu kódovaná exonem 4 a 5. Předpokládá se, že tento region je přizpůsobivý okolí poškození DNA a současně obsahuje doménu schopnou se vázat na jeden řetězec DNA. Tedy tato část XPA se vsune do strukturně deformované dvoušroubovice DNA v důsledku poškození, váže se na jeden řetězec a tudíž dovoluje rozpoznat široké spektrum poškození. (Hermanson a Turchi, 2000, Cleaver a States, 1997) In vivo experimenty prokázaly, že v buňkách ozářených UV světlem dochází k aktivaci exprese XPA proteinu v jádře. Množství shromážděných molekul závisí na množství lézí. Bylo zjištěno, že XPA je imobilizován během 4 až 6 minut u genomových míst poškozených UV zářením (Rademakers a kol., 2003) Neobvyklé elektroforetické chování XPA proteinu Při analýze XPA proteinu pomocí polyakrylamidové elektroforézy v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) byla zjištěna snižená pohyblivost tohoto proteinu v elektrickém poli, která neodpovídala jeho molekulové hmotnosti. Na základě znalostí o sekvenci aminokyselin byla vypočítaná hmotnost přibližně 31 kda., ale v SDS-PAA gelech se XPA jeví, jako by jeho hmotnost byla podstatně vyšší, nejméně kda. Z dalších empiricky zjištěných vlastností, dosud neobjasněných, je vztah mezi aktivní formou XPA proteinu, interagující s lézemi na DNA a zastoupením dvou až tří satelitních proužků na SDS-PAA gelech. (Robins a kol., 1991; Jones a Wood, 1993; Hermanson a Turchi, 2000; Iakoucheva a kol., 2001; Pushnova a kol., 2001). Dosud tyto neobvyklé vlastnosti XPA proteinu nebyly uspokojivě vysvětleny. Byly zkoumány příčiny anomální pohyblivosti XPA proteinu. Pomocí hmotnostní spektrometrie bylo zjištěno, že anomální pohyblivost není důsledkem posttranslační modifikace, neboť se tyto modifikace v proteinu nevyskytují a nejsou vyžadovány pro funkční formu XPA. Pomocí částečné proteolýzy XPA proteinu, hmotnostní spektrometrie a SDS- PAGE bylo zjištěno, že původ anomální pohyblivosti není lokalizován pouze do jedné oblasti proteinu. Na odchylnou elektroforetickou pohyblivost XPA proteinu má pravděpodobně vliv zejména oblast obsahující posloupnost sedmi se opakujících zbytků kyseliny glutamové, která nese vysoký náboj a stejně tak i obě terminální domény. (Iakoucheva a kol., 2001) Experimenty s použitím glutaraldehydu pro vytvoření intermolekulárních a intramolekulárních křížových vazeb prokázaly, že v případě tvorby intramolekulárních

11 křížových vazeb XPA protein na SDS-PAGE odpovídal vypočítané molekulové hmotnosti. (Iakoucheva a kol.) Za nativních podmínek gelové filtrační chromatografie byla molekulová hmotnost XPA proteinu překvapivě pozorována v oblasti okolo 92 kda. Tento výsledek se nezměnil, ani když byla při měření hmotnosti proteinu pomocí filtrační chromatografie použita DNA pro vazbu. Tato naměřená anomální hmotnost je vysvětlena tak, že protein zaujímá za nativních podmínek neobvykle rozlehlý tvar. (Iakoucheva a kol., 2001) Jedním z posledních vysvětlení pro neobvyklé elektroforetické chování XPA proteinu je hypotéza o vytváření homodimerů XPA proteinu za nativních podmínek a ve vysoké koncentraci. Při nukleotidové excizní opravě by pak byl spojen s RPA proteinem a vytvářel tak vysokomolekulární komplex. (Yang a kol., 2002) 3.3. Komplex proteinů XPF-ERCC1 Heterodimerní proteinový komplex XPF-ERCC1 je nedílnou součástí nukleotidové excizní opravy (obr. 3). (Dip a kol., 2004) Podjednotky XPF a ERCC1 jsou jadernými proteiny u savců o molekulární hmotnosti přibližně 110 kda pro XPF a 34 kda pro ERCC1. Komplex XPF a ERCC1 tvoří stabilní heterodimer v buňkách i za experimentálních podmínek in vitro za předpokladu, že rekombinantní proteiny utvořily komplex v průběhu exprese jak na úrovni prokaryontních buněk E.coli tak i např. v baculovirovém systému hmyzích buněk. Současně ale bylo prokázáno, že tyto dva proteiny samostatně jsou nestabilní. Zatím se nepodařilo rekonstituovat komplex XPF-ERCC1 za podmínek in vitro tak, aby zůstala zachována jeho strukturně specifická endonukleázová aktivita pro štěpení na 5 konci od poškozeného místa na DNA. ERCC1 také váže XPA protein za tvorby objemného proteinového komplexu v místě poškození DNA Kromě toho, že XPF-ERCC1 hraje roli v NER, má ještě další funkce v metabolismu, které zatím nejsou známy. (Araújo a Wood, 2000) 3.4. Princip elektroforetických metod, využívaných pro separaci biomakromolekul Elektroforéza (z řeckého nesený elektřinou) využívá pohybu nabitých částic v stejnosměrném elektrickém poli. Směs látek se při ní dělí podle různé pohyblivosti iontů na oddělené zóny jednotlivých složek směsí. Pohyblivost iontů závisí na velikosti náboje, velikosti a tvaru molekul, na povaze nosičů, elektrolytů aj. U amfoterních iontů jako jsou bílkoviny, velikost náboje závisí na ph. Elektroforéza má široké uplatnění při dělení látek biologického původu. (Prosser a kol., 1989) Faktory ovlivňující pohyb iontů v elektrickém poli Na kulovitou částici, nesoucí náboj q (C) v elektrickém poli o intenzitě E (V m -1 ) působí síla F daná výrazem F 1 = qe

12 Proti ní působí síla vnitřního tření daná Stokusovým zákonem F 2 = 6πη rv, Kde v je rychlost (m s -1 ), r poloměr částice, η viskozita. Z podmínek rovnováhy (F 1 = F 2 ) můžeme vypočítat rychlost pohybu částice qe v =. 6πηrv V praxi se však místo toho více používá pohyblivost µ, což je rychlost částice při jednotkové intenzitě elektrického pole (gradientu napětí) v q µ = = (m 2 s -1 V -1 ). E 6πηrv Z výrazu je patrné, že rychlost je přímo úměrná síle pole a nepřímo viskozitě. Ta je silně ovlivněna teplotou. Rychlost závisí také na tvaru a velikosti nabité částice. Uvedené výrazy platí pro velmi zředěné roztoky. V koncentrovaných roztocích se uplatňují se uplatňují některé nežádoucí jevy, které komplikují situaci: a) Kolem centrálního iontu se vytvoří iontový obal z iontů opačně nabitých. Tak se značně snižuje pohyblivost. Vliv elektrolytu vyjadřuje iontová síla I a menší pohyblivosti jsou charakterizovány přibližně vztahem 1 2 µ 1 I µ I 2 b) Elektrolýza. Působením stejnosměrného proudu se elektrolyt v okolí elektrod rozkládá. Tím se postupně mění i ph v tomto prostoru u katody roste, u anody klesá. Proto se pufr v elektrodovém prostoru buď kontinuálně vyměňuje, nebo se účinnými přepážkami (diafragma) mezi elektrodovým a separačním prostorem zabraňuje konvekci, resp. difúzí. c) Elektroosmóza. Její podstatou je transport vody hydratovanými ionty od jedné elektrody k druhé podél rozhraní kapalné a pevné fáze. Smysl proudění závisí na povaze rozhraní, kvalitě pevné fáze a složení elektrolytu. Elektroosmotický tok ovlivňuje pohyb všech částic, tedy i neutrálních. Při určování pohyblivosti elektricky migrujících částic je nutné provést korekci. Ta se dělá právě pomocí zdánlivého elektroforetického pohybu neutrálních částic. d) Jouleovo teplo Q, které vzniká průchodem elektrického proudu elektrolytem je další problém elektroforézy. Platí pro něj vztah 2 U t Q =, R kde R je odpor (Ω), t čas v (s) a U napětí (V). Uvolněné teplo může způsobit změnu viskozity, a tím pohyblivost, odpařování, změnu vodivosti a konečně i denaturaci labilních látek. Proto jsou elektroforetická zařízení, pracující s vyšším napětím, vybavena účinným chlazením. (Prosser a kol., 1989) Klasifikace elektroforetických metod Elektroforetické metody můžeme dělit podle několika hledisek např. podle děleného množství na analytické a preparativní. Dále podle vloženého napětí na vysokonapěťovou

13 elektroforézu (U > 1000 V), která se využívá hlavně pro dělení nízkomolekulárních látek a nízkonapěťovou (U ~ 220V) pro látky vysokomolekulární. Významné je třídění na elektroforetické metody základní a kombinované a dále podle způsobu stabilizace prostředí (volná elektroforéza a na nosiči). Elektroforéza na nosičích, zónová. Vzorky látek se nanášejí na vhodný nosič, čímž je např. polyakrylamidový gel nebo agaróza. Nosič je pak přímo ponořen do roztoku pufru do něhož jsou rovněž zavedeny elektrody. Po zavedení elektrického proudu dochází k migraci nabitých částic k opačně nabitým elektrodám stejně jako u volné elektroforézy, ovšem pohyb se děje na nosiči, což umožňuje lepší průběh, zpracování a vyhodnocení elektroforetického dělení. Částice pak na nosiči vytváří zóny, které jsou seřazené podle elektroforetické pohyblivosti. Protože je hodnota elektrického proudu nastavena na určitou konstantní hodnotu, pohybují se zóny konstantní rychlostí, ale vytváří se stupňovitý gradient potenciálu. Projevuje se zde tzv. samozaostřující efekt. Zpozdí-li se některý ion za svou zónou, tj. za zónou odpovídající příslušné pohyblivosti, octne se tak v prostředí s větší hodnotou potenciálu, který ho urychlí tak, aby dohnal svou zónu (a naopak). Zónovou elektroforézu lze realizovat buď v kontinuálním nebo diskontinuálním systému. Diskontinuita může být jak v koncentracích gelu, tak především v ph a iontové síle. V případě ph se diskontinuita volí použitím různé hodnoty ph pufru elektrodového a pufru v gelu. Při diskontinuální elektroforéze získáváme ostřejší zóny než v případě kontinuální elektroforézy. Jako elektrodového pufru se mimo jiné používá Tris(hydroxymethyl)- aminomethan/glycinátový pufr ph 8,3 (Tris/glycin). Gel pak obsahuje pufr Tris/HCl ph = 9,2. Po skončení elektroforézy se rozdělené bílkoviny v gelu fixují v 10% roztoku kyseliny octové a poté obarví např. pomocí Coomassie Brilliant Blue R 250. Nakonec se gel odbarví v roztoku methanolu a kyseliny octové, přičemž zóny bílkovin zůstanou zbarveny modře. (Prosser V. a kol. 1986) Určení molekulové hmotnosti proteinů Pro elektroforetické stanovení molekulové hmotnosti (M) u bílkovin a malých molekul nukleových kyselin se používají polyakrylamidové gely (PAAG), zatímco v případě nukleových kyselin velkých rozměrů se častěji používají agarosové gely (AG) Polyakrylamidové gely Polyakrylamidové gely jsou v praxi velice často využívané. Jsou inertní, mechanicky pevné, průhledné a nabízí možnosti přípravy nosiče různých předem určených vlastností (hustota, zesiťování gelu, gradient hustoty gelu aj.). Polyakrylamidový gel se připravuje polymerizací pufrovaných roztoků akrylamidu a N,N-methylenbisakrylamidu (BIS), která je zahájena volnými radikály vzniklými při rozkladu persíranu amonného. Do reakce se přídává stabilizátor volných radikálů TEMED (N,N,N,N-tetramethylethylendiamin). CH 2 =CH-CO-NH 2 + CH 2 =CH-CO-NH-CH 2 -NH-CO-CH=CH 2 => polyakrylamid Fyzikální vlastnosti tohoto gelu jsou dány podílem akrylamidu v gelu a stupněm zesíťování. Lineární řetězce vznikají spojováním monomerů akrylamidu, příčné vazby mezi nimi jsou tvořeny BIS. Velikost pórů polyakrylamidového gelu závisí nepřímo úměrně na koncentraci akrylamidu. Čím vyšší je tedy koncentrace akrylamidu, tím jsou menší póry

14 Nejčastější koncentrace akrylamidu je (3 15)%. Koncentrace BIS obvykl odpovídá 5 % celkové koncentrace akrylamidu. Pro stanovení molekulové hmotnosti M bílkoviny je nutná interakce s iontovými detergenty. Nejčastěji je používán dodecylsulfát sodný (SDS), kdy při reakci dochází k disociaci polypeptidických řetězců a ke konformační změně takového charakteru, že Stokesův poloměr komplexu řetězce s detergentem je úměrný exponenciální funkci M. Pohyblivosti neznámých bílkovin jsou porovnávány se standardními bílkovinami o známé molekulové hmotnosti. Metoda SDS-PAGE je považována za standartní jednoduchou metodu pro stanovení molekulové hmotnosti proteinů. Při standardním provedení elektroforézy se používá 1,4 mg SDS na 1 mg bílkoviny. Za těchto podmínek se polypeptidy protahují do podlouhlého elipsoidu o délce malé poloosy 0,8 µm. Délka velké poloosy se mění v závislosti na počtu aminokyselinových zbytků v polypeptidu. To ovšem platí jen pro nevětvené polypeptidy. Proto je třeba redukovat S-S vazby přebytkem β-merkaptoethanolu při zvýšené teplotě. (Prosser V. a kol. 1986) Grafické stanovení molekulové hmotnosti proteinů na základě jejich relativní pohyblivost k PAA gelech. Relativní mobilita proteinů je vypočtena pomocí rozdělení migračních vzdáleností vyznačených na gelu bromfenolovou modří. Všechna měření vzdáleností obarvených proužků elektroforeticky rozdělených proteinů od startů jsou prováděna uprostřed proužků. Nerovné změny ve velikosti gelu, které mohou vzniknout během barvící procedury jsou kompenzovány měřením velikosti gelu před sušením a po něm. Sestrojí se přímá závislost log10 molekulárních hmotností jednotlivých proteinů o známé molekulové hmotnosti ku vypočtené relativní pohyblivosti. Poté se vnese relativní mobilita neznámého proteinu a z lineární závislosti se odečte jeho molekulová hmotnost. (Piljac, V., Piljac, G. 1986) Pro stanovení molekulové hmotnosti neznámých proteinů nebo pro sledování jejich anomálních elektroforetických vlastností je vhodné použít více typů pufrů, rozdílných koncentrací gelů a různé metody samotné přípravy vzorku. Obvykle je ale možné přibližně stanovit molekulovou hmotnost proteinu s chybou v rozmezí ± 10%. (Piljac, V., Piljac, G. 1986)

15 Analýza oligomerních struktur proteinů Elektroforetická separace proteinů za nativních podmínek: PFO- PAGE Jak bylo uvedeno, SDS-PAGE je metoda vhodná k určení molekulové hmotnosti proteinů viz. kap. (1.4.2). Použitím SDS a 2-merkaptoethanolu v gelové elektroforéze jsou proteiny disociovány na jednotlivé části polypeptidového řetězce, přičemž SDS udává jeden negativní náboj na vazbu molekuly. (Prosser V. a kol. 1986). Narušení homo-multimerních interakcí proteinů za podmínek SDS-PAGE nedovoluje analýzu multimerních komplexů proteinů, sledování vzájemných interakcí mezi rozdílnými proteiny i sledování stability komplexů proteinů během uchovávání. Zcela nedávno byla navržena nová elektroforetická metoda proteinů, právě pro sledování interakcí mebránových proteinů, či pro sledování multimerních forem a vzájemných vazeb.princip metody spočívá v použití kyseliny pentadekafluoroktanové (PFO) a její sodné soli (NaPFO) jako mírného detergentu v PAGE. Za uvedených podmínek, proteiny v nanášecím pufru s NaPFO získávají negativní náboj a putují v elektrickém poli směrem ke kladnému pólu při zachování oligomerních struktur vytvořených za nativních podmínek. Kyselina PFO (chem. vzorec CF3(CF2)6CO2H) je schopna chránit a zachovat vysoce afinitní proteinové interakce i během elektroforetické separace. (Ramjeesingh a kol. 1999) Výhodou uvedené PFO-PAGE metody, na rozdíl od centrifugace v hustotním gradientu sacharózy nebo gelové filtrační chromatografie, které jsou běžně používány ke sledování vlastností proteinů a jejich interakcí za nativních podmínek, tak při PFO-PAGE je možné analyzovat jen velmi malé množství vzorku proteinů, méně jak µg. Další výhodou PFO PAGE metody je relativní nenáročnost na přístrojové vybavení a snadná proveditelnost ve většině laboratoří. Uvedená metoda vhodně doplňuje možnosti elektroforetické separace proteinů jak za podmínek SDS-PAGE pro stanovení molekulových hmotností, tak po stránce analýzy vzájemných interakcí proteinů, sledování tvorby komplexů za nativních mírných podmínek PFO-PAGE. (Ramjeesingh a kol. 1999). Zatím ještě nebyly ještě všechny možnosti aplikace této nové metody pro analýzu chování proteinů za nativních podmínek

16 4. CÍLE BAKALÁŘSKÉ PRÁCE Současně s výzkumem nových typů terapeuticky aktivních látek na bázi kovů, zejména platiny vážící se na DNA se studuje in vitro možnost rozpoznání vzniklých lézí vybranými reparačními proteiny, které jsou připraveny rekombinantní technologií. Při studiu a charakterizaci vlastností těchto rekombinantních proteinů se s výhodou uplatňují elektroforetické metody jak pro stanovení molekulové hmotnosti, tak v rámci analýzy souboru proteinů z buněčných lyzátů a současně jsou hledány metodické možnosti pro analýzu oligomerních stavů proteinů za nativních podmínek. Cíle práce jsou následující: Ověřit chování vybraných proteinů za podmínek elektroforézy v polyakrylamidových gelech v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE). Zjistit využitelnost metody SDS-PAGE při analýze buněčných lyzátů pro optimalizaci podmínek exprese rekombinantních proteinů. Zavést elektroforetickou metodu separace proteinů v polyakrylamidových gelech v přítomnosti pentafluorooktanu sodného (PFO-PAGE). Ověřit, za podmínek PFO-PAGE, stabilitu oligomerních komplexů vybraných modelových proteinů. Prohloubit znalosti o elektroforetickém chování rekombinantního XPA proteinu v polyakrylamidových gelech v přítomnosti různých detergentů (SDS, PFO). Pokusit se elektroforeticky stanovit reparační komplex proteinů XPF-ERCC1 metodou PFO- PAGE

17 5. MATERIÁLY A METODY 5.1. Proteiny BSA Bovinní sérum albumin (Sigma, St. Louis, USA) Rekombinantní proteiny byly připraveny v Laboratoři molekulární biofyziky a farmakologie: XPA (xeroderma pigmentosum komplementační skupina A) - preparát připraven v bezbuněčném systému RTS (Roche) - preparát pripraven v buňkách E. coli BL21SI - postup pro přípravu XPA proteinu a jeho purifikace uveden v Sedlářová I., Diplomová práce,brno 2005) XPF-ERCC1, preparát připraven v buňkách E. coli BL21SI a částečně purifikován na koloně hydroxyapatitu (Ambrožová K., Bakalářská práce, Brno 2004) HMGB1b7 připraven v buňkách E. coli BL21DE3 a chromatografiky purifikován p50 NFκB, exprese v buňkách E. coli plyss 5.2. Bakteriální kmeny Escherichia coli BL21DE3 Escherichia coli BL21pLysS Escherichia coli BL21SI 5.3. Chemikálie Pro experimenty byly použity chemikálie: Akrylamid (Sigma, St. Louis, USA) Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Mnichov, Německo) Bisakrylamid (Sigma, St. Louis, USA) Bromfenolová modř (Sigma, St. Louis, USA) Dithiothreitol (DTT) (Sigma, St. Louis, USA) Dodecylsulfát sodný (SDS) (Sigma, St. Louis, USA) EZBlue Gel Staining Reagent (Sigma, St. Louis, USA) Glycerol (Sigma, St. Louis, USA) Glycin (Sigma, St. Louis, USA) Hydroxid sodný Isopropyl-β-D-thiogalaktosid (IPTG) (Sigma, St. Louis, USA) Kyselina octová (Sigma, St. Louis, USA) Kyselina pentadekafluoroktanová (PFO) (Sigma Aldrich Chemie, Steinheim, Německo) Metanol (Sigma, St. Louis, USA)

18 Persíran amonný (APS) (Sigma, St. Louis, USA) Standard molekulových hmotností proteinů (Sigma, St. Louis, USA) Tetramethylethylendiamin (TEMED) (Sigma, St. Louis, USA) Tris báze (Carl Roth, Karlsruhe, Německo) Tris(hydroxymethyl)aminomethan hydrochlorid (Tris HCl) (Sigma, St. Louis, USA) 5.4. Roztoky a pufry Roztoky a pufry použité při SDS-PAGE Příprava 12 % SDS-PAAG (8,3 cm 8,1 cm): 3,4 ml Mili Q H 2 O 4,0 ml 30% akrylamid/ 2,67% bisakrylamid (29:1) 2,5 ml 1,5 M TrisHCl pufru ph 8,6 0,1 ml 10% (w/v) SDS 50 µl 10% (w/v) persíran amonný (APS) 10 µl TEMED Roztok nanést mezi elektroforetické skla přichycené ve stojanu, zasunout hřebínek pro starty a uložit v horizontální poloze 30% akrylamid: 29,2 g akrylamid 2,67% N N -bis-methylen-akrylamid: 0,8 g N N -bis-methylen-akrylamidu 100 ml Mili Q H 2 O 1,5 M Tris HCl ph = 8,6 27,23 g Tris báze 80 ml H 2 O upravit ph kyselinou HCl Nanášecí pufr pro SDS-PAGE: 3,55 ml Mili Q H 2 O 1,25 ml 0,5 M TrisHCl, ph = 6,8 2,5 ml glycerolu 2,0 ml 10% (w/v) SDS 0,2 ml 0,5% (w/v) bromfenolové modři Před použitím, k 950 µl přidat 50 µl beta mercaptoethanolu ( Merck) Elektroforetický pufr SDS-Tris-glycinový (10 koncentrovaný): 30,3 g Tris báze 144 g glycinu 10 g SDS ph = 8,3-18 -

19 destilovanou vodou doplnit do 1 litru Pro elektroforézu zásobní roztok pufru ředit 10krát Roztoky a pufry použité při nativní elektroforéze Příprava 8 % PFO-PAAG (8,3 cm 8,1 cm): 4,8 ml Mili Q H 2 0 2,7 ml 30% akrylamid/2,67% bisakrylamid (29:1) 2,5 ml 1,5 M TrisHCl pufr ph 8,6 50 µl 10% (w/v) persíran amonný (APS) 10 µl TEMED Nanášecí PFO pufr pro nativní elektroforézu (2x koncentrovaný): 100 mm Tris báze 20% glycerol (v/v) 0,005% bromfenolová modř přidat: 10% w/v NaPFO ph 8 (upraveno 4M NaOH) Připravit pufry o koncentraci NaPFO: 0.4%, 1%, 2%, 4%, 6% Podle experimentu 2x cc nanášecí PFO pufry doplnit o 25mM DTT K jednomu objemovému dílu vzorku proteinů přidat jeden objemový díl nanášecího pufru. Elektroforetický 0,2% PFO-Tris-glycinový pufr ph 8,0: 1l 1 Tris-glycin 2g PFO 1ml 4M NaOH 10 koncentrovaný Tris glycinový pufr: 30,3 g Tris báze 144 g glycinu destilovanou vodou doplnit do 1 litru Pro elektroforézu zásobní roztok pufru ředit 10krát, doplnit o NaPFO. Fixační roztok pro barvení proteinů po SDS PAGE a nativní elektroforéze za použití EzBlue (Sigma): 50% methanol 10% kyselina octová

20 5.5. Přístroje a pomůcky Autokláv Vaposteri (BMT a. s., Brno, Česká republika) Centrifuga 4K15 (Sigma, Německo) Centrifugační filtry (Microcon, USA) Laboratorní váhy CT600-S (Ohaus, USA) Mikropipety (Labsystems, Finsko) Minicentrifuga (Maneko, Praha, Česká republika) Mrazící box - pro teploty 70 o C (Environmental equipment, Cincinnati, USA) Termostat BT-120 (BMT a. s., Brno, Česká republika) Termostat s třepačkou (LabTherm, Kühner, Švýcarsko) Třepačka LT2 (Kavalier a. s., Votice, Česká republika) Vakuová sušička gelu Slabgeldryer 4050 (prodejce Biotech, Česká republika) Vortex VX100 (Labnet, Woodbridge, USA) Zařízení pro elektroforézu, vertikální MiniProtean II (BioRad, Richmond, USA) Zdroj pro elektroforézu Power Pack 300 ( Bio Rad, Richmond USA) 5.6. Metody Určení molekulové hmotnosti 1. Po elektroforéze změřit velikost gelu a vzdálenost od startu k bromfenolové modři. 2. Gel fixovat, obarvit a vysušit. 3. Po vysušení gelu změřit jeho velikost a vzdálenost mezi startem a jednotlivými elektroforetickými proužky. 4. Použít vzorec pro výpočet relativní mobility R. 5. K jednotlivým vzdálenostem od startů elektroforetických proužků hmotnostního standartu proteinů (Sigma) přiřadit molekulární hmotnosti z tabulky (Sigma Markers). 6. Sestrojit logaritmickou závislost molekulární hmotnosti na relativní mobilitě. 7. Vnesení relativní pohyblivosti neznámého proteinu do grafu a odečtení molekulové hmotnosti (M) z přímky, představující lineární závislost standartu mol. hmotností na relativní pohyblivosti v příslušném SDS-PAA gelu po elektroforéze Provedení SDS-PAGE, aparatura Mini Protean II. 1. Připravit roztok 12% PAA gelu, aplikovat mezi dvě skla umístěné v elektroforetickém stojanu a nechat polymerizovat cca 1 hod. Pokud se s gelem nepracuje ihned, uložit v komorové lednici. 2. Gel umístit do elektroforetické vany, vyčistit starty, přelít elektroforetickým pufrem. 3. Ke vzorkům proteinů přidat nanášecí SDS pufr. 4. Vzorky mírně centrifugovat. 5. Nechat inkubovat 5 minut při 95 C, poté opět mírně centrifugovat

21 6. Inkubované vzorky nanést do startů, do dráhy jedna vložit hmotnostní standard proteinů (Sigma). 7. Elektroforetickou aparaturu MiniProtean II zaplnit SDS elektroforetickým pufrem. 8. Připojit ke zdroji stejnosměrného napětí Power Pack 300. Elektroforézu nechat probíhat při konstatním protudu 10 ma až bromfenolová modř doputuje k dolnímu okraji gelu. 9. Směr elektroforetické separace proteinů probíhá o ke kladnému pólu v dolní části gelu Nativní elektroforéza proteinů (PFO-PAGE) 1. Připravit reakční směs pro 8% PAA gel, aplikovat mezi dvě skla a nechat polymerizovat nejméně 1 hod. Umístit gel do elektroforetické vany. 2. Ke vzorkům přidat PFO nanášecí pufr, promíchat, centrifugovat. 3. Vzorky nanést do vyčištěných startů, do dráhy jedna přidat hmotnostní standard roteinů (Sigma). 4. Elektroforetickou aparaturu MiniProtean II zaplnit 0.2% PFO-elektroforetickým pufrem. 5. Připojit ke zdroji Power Pack 300. Elektroforézu nechat probíhat při konstantním napětí nebo proudu až bromfenolová modř doputuje k dolnímu okraji gelu. 6. Směr elektroforetické separace proteinů od záporného pólu u startů ke kladnému pólu v dolní části gelu. Orientace na obrázcích od startů ke spodnímu okraji Barvení proteinů v PAA gelech (SDS, PFO) po elektroforéze 1. Gel uvolnit z prostoru mezi dvěmy skly. 2. Gel promýt ve vaničce třikrát po 5 minutách v destilované vodě. 3. Fixovat 15 minut v roztoku (50% MetOH, 10% kys. octová). 4. Opláchnout gel minut v destilované vodě. 5. Proteiny barvit roztokem EZBlue (Sigma), v temnu nejméně 1 hod. případně déle. 6. Odbarvit pozadí na gelu destilovanou vodou v chladu Dokumentace výsledků, uchování gelů po SDS-PAGE a nativní elektroforéze sušením 1. Obarvené proteiny na gelu byly snímány pomocí zařízení HP Scanjet 5590P s připojením na osobní počítač a záznam byl uložen na disketu. 2. Poté byl gel imobilizován na filtračním papíru Whatman, překryt fólií Saran a umístěn na sušičku gelů. Gel byl sušen pod vakuem, 40 minut při 75 C. 3. Záznam elektroforetické separace proteinů v příslušeném typu gelů na disketě byl zpracován pomocí programu pro kvantitativní vyhodnocení gelů AIDA (Advanced Image Data Analyser)

22 Příprava buněčných lyzátů 4. Sediment z l ml buněk po indukci exprese rekombinantních proteinů byl rozmíchán ve 100 µl lyzačního pufru (B-PER, Pierce) s přidání roztoku inhibitorů proteáz (Roche). Inkubace 10 min při pokojové teplotě (nebo 4 o C) podle typu proteinů. 5. Lyzáty centrifugovat při rpm po dobu 15 min při teplotě 15 C. 6. Jímat supernatanty pro elektroforetickou analýzu Zahuštění buněčných lyzátů 1. Na zkumavku (Microcon) (1,5 ml) nasadit centrifugační filtr (Microcon YM-30). Na filtr nanést vzorek proteinů (max 0,5 ml) supernatantů buněčných lyzátů. 2. Centrifugovat při rpm 3 až 4 min při teplotě 4 C. Proteiny o větší molekulové hmotnosti než 30 kda zůstanou nad filtrem, část objemu lyzačního pufru a nízkomolekulární proteiny protečou do spodní zkumavky. 3. Opatrně filtry ze zkumavky vyndat a obráceně vsunout do nové zkumavky téhož typu. 4. Centrifugovat při 1000 g po dobu 3 min. Zahuštěný vzorek proteinů elektroforeticky analyzovat

23 6. VÝSLEDKY Příprava a purifikace rekombinantních proteinů, které jsou používány pro in vitro studie reparačních mechanismů a interakcí s cíleně modifikovanou DNA platinovými deriváty v sobě zahrnuje celou řadu postupů od transformace rekombinantních plasmidů do příslušných bakteriálních buněk E. coli, kultivaci, optimalizaci podmínek exprese příslušného rekombinantního proteinu v závislosti na čase a teplotě, izolaci proteinů, chromatografickou purifikaci a charakterizaci získaného preparátu. Jako červená niť se výše popsanými postupy rekombinantních technologií nese využití elektroforetických metod ať pro kontrolu správné velikosti vklonovaného fragmentu DNA do expresního vektoru na úrovni agarózové elektroforézy nukleových kyselin, nebo např. využití elektroforetických metod pro separaci proteinů při optimalizaci a kontrole exprese proteinů na úrovni lyzátů buněk, nebo při ověření čistoty a kvality připravených rekombinantních proteinů SDS-PAGE modelového proteinu BSA Komerčně dostupný protein bovinní sérum albumin (BSA) od firmy Sigma o koncentraci 1,4 mg/ml byl v různém váhovém množství nanesen na SDS-PAA gel a elektroforeticky separován. Zjišťovalo se minimální množství BSA proteinu, které je detekovatelné na SDS- PAGE za použití barvícího roztoku EZBlue Gel Staining Reagent (Sigma) a současně tak byla ověřována kvalita elektroforetického dělení v PAA gelech o rozměrech 84 x 81 mm v elektroforetické vaně MiniProtean II.Výsledek je uveden na obr.6 A. Připravené vzorky obsahovaly protein BSA ve váhovém množství od 1,4 µg do 20 ng. EZBlue barvení prokázalo ještě 40 ng proteinu, 20 ng bylo hraničních, elektroforetický proužek proteinu byl pod hranicí detekce. V SDS-PAGE protein BSA poskytuje jeden elektroforetický proužek a jak ukazuje záznam profilu SDS-PAGE linie BSA proteinu v množství 1,4 µg, BSA protein je monomer (obr.6 A). Kvantitativním vyhodnocením gelu (obr 6B) pak byl prokázán lineární vztah mezi množstvím BSA proteinu ve vzorku a intenzitou elektroforetických proužků (obr. 6C) až do 80 ng. U nižších hodnot (60 20) ng BSA, byla zjištěna větší nepřesnost. Počítačový program AIDA vyhodnocuje plochu píku vyjadřující intenzitu elektroforetického proužku. Tyto hodnoty vynesené v závislosti na množství proteinu analyzovaného na gelu, tvořily lineární závislost

24 A B C integrál (QL) m(ng) obr.6. Elektroforetické chování proteinu BSA (A) 12% SDS-PAGE, I k = 12 ma, při pokojové teplotě; linie (1) standart molekulových hmotností proteinů; linie , vzorky BSA v klesajícím v ng. (B) Profilový záznam elektroforézy BSA proteinu v množství 1,4 ug. (C) kvantitativní vyhodnocení SDS-PAGE; (A) Graf závislosti ploch píků na množství BSA ve vzorku. V grafu je vyneseno množství proteinu BSA od 80 ng do 1400 ng

25 Ověření molekulové hmotnosti BSA proteinu Pro ověření molekulové hmotnosti BSA proteinu bylo využito SDS-PAGE uvedené na obr. 6A. Nejprve byla sestrojena kalibrační křivka vyhodnocením vzdáleností jednotlivých elektroforeticky separovaných proteinů o známé molekulové hmotnosti, které byly součástí komerčně připraveného standardu (Sigma). Hodnoty vyneseny do grafu (obr. 7). Z kalibrační křivky pak byla odečtena molekulová hmotnost vzorku proteinu BSA. Získaná hodnota činí 65 kda a liší se od uváděné molekulové hmotnosti 66 kda, či-li chyba stanovení metodou SDS-PAGE pro vzorek BSA proteinu činila 1,5%. Za podmínek SDS-PAGE je BSA protein v monomerní formě a odpovídající uváděné mol. hmotnosti. log M 2,10 2,05 2,00 1,95 1,90 1,85 1,80 1,75 1,70 β-galactosidase phosphorylase b y=2,26-1,25x, r 2 =0,97 fructose-6-phosphate kinase albumin testovaný albumin glutamic dehydrogenase 1,65 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 R. obr.7. Určení molekulové hmotnosti BSA na základě SDS-PAGE (obr. 6). Z vypočtené relativní pohyblivost R proteinu BSA (testovaný albumin) byla vypočítána jeho molekulová hmotnost. Koeficient spolehlivosti r 2 = 0,970 byl určen z lineární závislostirelativní pohyblivosti standartních proteinů o známých molekulových homotnostech (Sigma): myosin z králičích svalů (205 kda), β-galactosidasa z E. coli (116 kda), phosphorylasa b z králičích svalů (97 kda), fructoso-6-phosphat kinasa z králičích svalů (84 kda), albumin z hovězího séra (66 kda), glutamová dehydrogenasa z hovězích jater (55 kda) Možnosti využití metody SDS-PAGE při optimalizaci exprese rekombinantních proteinů v buňkách E. coli Exprese proteinu p50 Byly připraveny lyzáty buněk E. coli kmene BL21pLysS nesoucí rekombinantní plasmid pet23a.p50 a pomocí SDS-PAGE byla studována optimalizace podmínek exprese proteinu p50 podjednotky proteinu NFκB po chemické indukci 1mM IPTG při teplotě 26 o C a 37 o C v různých časových intervalech (obr. 8). Buněčné lyzáty v objemu 100 µl byly připraveny

26 z jednoho ml kultury a na SDS-PAGE byly analyzovány vzorky o objemu 6 µl. SDS-PAGE analýza lyzátů buněk prokázala optimum preferenční exprese proteinu p50 v čase 120 minut po indukci, při teplotě 26 o C (obr. 8A, linie 5). Při teplotě 37 o C pak vzrůstá celkové množství buněčných proteinů. Kvantitativní vyhodnocení exprese proteinu p50 za různých podmínek je graficky znázorněno na obr. 8B. Získané údaje optimalizace podmínek exprese proteinu p50 v buňkách E. coli kmene BL21pLysS budou využity k preparativní přípravě většího množství proteinu p50 pro další experimentální práci. A B Exprese proteinu p integrál (QL) C 37 C čas (min) obr.8 Optimalizace podmínek exprese proteinu p50, (A) 12% SDS-PAGE, I k = 10 ma, (1) standart molekulové hmotnosti proteinů; (2)kontrolní protein p50; lyzáty buněk po indukcí exprese proteinu p 50 (3, 7) 0 h, (4, 8) 1h, (5, 9) 2h, (6, 10) 3h. (3, 4, 5, 6). Exprese proteinů probíhala za teploty 26 C (3, 4, 5, 6) a 37 C (7, 8, 9, 10). (B) Grafické znázornění kvantitativního vyhodnocení ploch píků, odpovídající expresi proteinu p50 programem AIDA Exprese komplexu proteinů XPF-ERCC1 Další rekombinantní proteiny, u kterých byly hledány optimální podmínky pro expresi, byly proteiny, zúčastňující se reparačních mechanismů v lidských buňkách, ale v nádorových buňkách pak mohou působit proti účinné terapii cytostatiky na bázi cisplatiny. Do buněk E. coli BL21SI byl transformován rekombinantní plasmid pet30b. XPF-ERCC1, nesoucí uspořádání genů pro synchronizovanou expresi proteinů XPF a ERCC1. Právě komplex XPF- ERCC1 s endonukleázovou aktivitou se účastní nukleotidové excizní opravy a štěpí DNA řetězec na 5 konci od místa poškození na DNA. Endonukleázovou aktivitu nese pouze komplex obou proteinů nikoli samotné proteiny. Pro přípravu XPF-ERCC1 endonukleázy pro in vitro experimenty byly hledány podmínky optimální exprese v buňkách E. coli tohoto komplexu proteinů tak, aby komplex vykazoval enzymatickou aktivitu. Byla sledována časová závislost exprese proteinů XPF a ERCC1 v buňkách E. coli BL21SI po indukci provedenou přidáním 0,3 M NaCl do kultivačního media. V časových intervalech (30 až 180 min.) byly odebírány vzorky po jednom ml buněk, centrifugovány, lyzovány a lyzáty zahuštěny na YM 100 centrifugačních filtrech. Vzorky lyzátů (10 µl) z jednotlivých časových intervalů po indukci exprese proteinů byly analyzovány na 10% SDS-PAGE (obr. 9). Orientační kvantitativní vyhodnocení jednotlivých časových intervalů exprese programem AIDA prokázalo postupné narůstání množství XPF a ERCC1 proteinů s dosažením optimálního poměru XPF-ERCC1 v čase 150 minut od počátku