VARIABILITY IN H-FABP, C-MYC, GH, LEP, LEPR GENES IN LARGE WHITE, LANDRACE AND DUROC BREEDS OF PIGS

Transkript

1 VARIABILITY IN H-FABP, C-MYC, GH, LEP, LEPR GENES IN LARGE WHITE, LANDRACE AND DUROC BREEDS OF PIGS VARIABILITA GENŮ H-FABP, C-MYC, GH, LEP, LEPR U PLEMEN PRASAT BÍLÉ UŠLECHTILÉ, LANDRASE A DUROK Mikolášová R., Urban T. Ústav genetiky, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, Brno, Česká republika. renem@post.cz ABSTRACT We genotyped 313 pigs, breeds Large White (BU), Landrace(LA) and Duroc(D) in loci for H- FABP, MYC, GH, LEP, LEPR genes. All of the breeds were in genetic equilibrium in the tested loci, except the breed BU in LEP loci. Observed heterozygosity was calculated from allele frequency with Popgene programme and range of levels was: BU/0,7 LEP - 0,5 H-FABP, LA/0,11 GH HaeII - 0,53 LEPR, D/0,38 GH MspI -0,53 GH HaeII. Observed heterozygosities were neare expected heterozygosities. Low values of average heterozygosity and in LA than those in BU and D were determined. Keywords: candidate genes, H-FABP, MYC, GH, LEP, LEPR, heterozygosity, pig ABSTRAKT V souboru celkem 313 prasat plemen BU, LA, D jsme pomocí DNA testu stanovili genotypy v lokusech genů kandidátních pro masnou užitkovost prasat, H-FABP, MYC, GH, LEP, LEPR.. Byla zjištěna genetická rovnováha ve všech lokusech u všech tří testovaných plemen s výjimkou plemene BU v lokusu LEP. Heterozygotnost pozorovaná se pohybovala v tomto rozmezí: BU/0,7 LEP - 0,5 H-FABP; LA/0,11 GH HaeII - 0,53 LEPR; D/0,38 GH MspI -0,53 GH HaeII a těmito hodnotami se blížila heterozygotnosti očekávané. Klíčová slova: kandidátní geny, H-FABP, MYC, GH, LEP, LEPR., heterozygotnost, prase ÚVOD Při studiu asociací kandidátních genů s užitkovými parametry v populacích prasat vycházíme také z analyzování variability na genetické úrovni v rámci plemen a mezi jednotlivými plemeny, populacemi. Jako nástroj pro tuto analýzu slouží tzv. F-statistiky, pro jejichž výpočet je nutné určit heterozygotnosti studovaných populací. Cílem této práce bylo určení molekulárně genetické variability u šesti lokusů kandidátních genů a stanovení míry heterozygotnosti a polymorfního informačního obsahu u tří plemen prasat. 1

2 MATERIÁL A METODIKA Populace Analýza zahrnuje jedince plemen bílé ušlechtilé (n = 1) a landrase (n = 76), durok (n=16), kteří byly testováni ve stanici pro kontrolu výkrmnosti a jatečné hodnoty. Poměr pohlaví vepřík : prasnička byl přibližně 1:1. Izolace DNA Pro určení genotypů byla použita DNA: 1/ obsažená v 7-9µl lyzátu - dle kvality lyzátu a dle konkrétního polymorfismu - získaného izolací z krve testovaných zvířat proteinázovou metodou, modifikovanou v naší laboratoři (Nebola, Dvořák, 1994) / obsažená v 1µl lyzátu získaného izolací pomocí QIAamp kitu (QIAGEN). Genotypování metodou PCR-RFLP V následujícím přehledu uvádíme stručný přehled podmínek pro PCR amplifikaci jednotlivých genů, teplotní podmínky a počty cyklů naprogramované v termocykleru PTC- 100 TM (MJ Research, Inc.), délky amplifikovaných fragmentů s polymorfními místy a literární zdroje. Název genu Teplotní podmínky PCR PCR produkt Zdroj H-FABP 95/60s 57/60s 7/10s, 30x 700bp Gerbens et al.(1997) MYC 95/40s 58/60s 7/60s, 30x 3bp Reiner et al.(000) GH 95/40s 60/60s 7/90s, 30x 506bp Schellander et al.(1994) LEP 95/40s 55/60s 7/60s, 30x 15bp Stratil et al.(1997) LEPR 94/60s 55/60 7/10s, 30x 000bp Stratil et al. (1998) Metodou RFLP dle literatury byly určeny tyto genotypy: Gen Restrikční endonukleáza Genotypy H-FABP: HinfI HH 195, 59; Hh 56, 195, 59; hh 56 bp MYC: MspI AA 3; AB 3, 01, 11; BB 01, 11 bp GH: MspI AA,147, 137; AB 8,, 147, 137; BB 8, bp GH: HaeII AA 333, 173; AB 506, 333, 173; BB 506 bp LEP: HinfI TT 15; CT 15, 84, 68;- CC 84, 68 bp LEPR: HpaII AA 000; AB 000,1450, 550; BB 1450, 550 Statistická analýza Pomocí programu Popgene version 1.31 (1999) bylo provedeno vyhodnocení sledované populace na základě zjištěných genotypů. Rozdíly ve frekvencích genotypů mezi plemeny byly

3 testovány chí kvadrát testem pro kontingenční tabulku k x m. Zjišťované populační parametry: frekvence genotypů a alel, Hardy-Weinbergova rovnováha, heterozygotnost pozorovaná (Pozor. het.), očekávaná (Oček. het.) a hodnoty podle vzorců níže. H = 1 q i ( 1 q ) N H = N 1 i 1 n n 1 = pi i= 1 n i= 1 j= i+ 1 p ipj (podle Nei 1973) (podle Nei 1978) (podle Botstein et al., 1980) VÝSLEDKY A DISKUZE Při hodnocení jednotlivých plemen pomocí genotypových a alelových frekvencí v tabulkách 1,, 3 byl zjištěn rovnovážný stav pro danou populaci ve všech lokusech s výjimkou lokusu LEP u plemene bílé ušlechtilé. Frekvence alely A lokusu GH MspI a GH HaeII u plemene LW uvádí Handler (1996) 0,71 resp. 0,53, u plemene LA stejný autor uvádí v lokusech GH MspI a GH HaeII frekvence alely A 0,98 resp. 0,16. Huang a kol. (001) uvádí v lokusu H- FABP HinfI u plemene LA frekvence alely H 0,75. Tab. 1: Frekvence genotypů a alel vybraných genů u plemene bílé ušlechtilé Genotypy Alely H-W (χ ) HH Hh hh H h H-FABP n NS rel. freq. 0,41 0,5 0,07 0,67±0,04 0,33±0,04 TT CT CC T C LEP n * rel. freq. 0,70 0,7 0,03 0,84±0,0 0,16±0,0 LEPR n 8 9 NS rel. freq. 0,11 0,4 0,47 0,3±0,08 0,68±0,08 MYC n NS rel. freq. 0,51 0,4 0,07 0,7±0,03 0,8±0,03 GH-MspI n NS rel. freq. 0,57 0,36 0,07 0,75±0,03 0,5±0,03 GH-HaeII n NS rel. freq. 0,47 0,4 0,11 0,68±0,04 0,3±0,04 3

4 Tab..: Frekvence genotypů a alel vybraných genů u plemene landrase Genotypy Alely H-W (χ ) HH Hh hh H h H-FABP n NS rel. freq. 0,7 0,0 0,08 0,8±0,04 0,18±0,04 TT CT CC T C LEP n NS rel. freq. 0,84 0,13 0,03 0,91±0,0 0,09±0,0 LEPR n NS rel. freq. 0,06 0,54 0,40 0,33±0,05 0,67±0,05 MYC n NS rel. freq. 0,79 0,19 0,0 0,89±0,03 0,11±0,03 GH-MspI n NS rel. freq. 0,87 0,11 0,0 0,9±0,03 0,08±0,03 GH-HaeII n NS rel. freq. 0,1 0,6 0,6 0,5±0,04 0,75±0,04 Tab. 3.: Frekvence genotypů a alel vybraných genů u plemene durok Genotypy Alely H-W (χ ) LEP TT CT CC T C n NS rel. freq. 0,57 0,43-0,79±0,08 0,1±0,08 MYC n NS rel. freq. 0,53 0,47-0,77±0,08 0,3±0,08 GH-MspI n NS rel. freq. 0,47 0,53 0,73±0,08 0,7±0,08 GH-HaeII n NS rel. freq. 0,38 0,38 0,5 0,56±0,09 0,44±0,09 Note: NS neprůkazné; * P 0.05; ** P 0.01 Další statistickou charakteristikou zjištěnou pro celý soubor i jednotlivá plemena je heterozygotnost (Tabulky 4, 5, 6). U plemene BU nejnižší heterozygotnost pozorovaná i očekávaná v genu LEP a nejvyšší heterozygotnosti u tohoto plemene byly vypočteny pro H- FABP lokus. U plemene LA byla nejnižší a nejvyšší heterozygotnost vypočtena pro lokusy GH- MspI a LEPR resp. U plemene Durok byly zjištěny velmi podobné hodnoty heterozygotnosti lokusů testovaných u tohoto plemene, ale v důsledku malého počtu testovaných jedinců lze těžko srovnávat s ostatními plemeny. Průměrná pozorovaná heterozygotnost u plemene BU byla 0,40, u LA 0,4 a u D 0,45. 4

5 Tab. 4: Hodnoty heterozygotnosti a pro jednotlivé lokusy zjištěné pro BU Pozor, het, Oček, het, Oček, het, (Nei 1973) (Nei 1978) H-FABP 0,517 0,4405 0,4431 0,3440 LEP 0,715 0,77 0,733 0,360 LEPR 0,411 0,431 0,4438 0,3390 MYC 0,400 0,403 0,404 0,30 GH-MspI 0,411 0,431 0,4334 0,3390 GH-HaeII 0,3550 0,3794 0,3805 0,3070 průměr 0,4010 0,3934 0,3964 s x 0,0819 0,0634 Tab. 5: Hodnoty heterozygotnosti a pro jednotlivé lokusy zjištěné pro LA Pozor. het. Oček. het. Oček. het. (Nei 1973) (Nei 1978) H-FABP 0,051 0,945 0,984 0,50 LEP 0,1316 0,167 0,1683 0,1530 LEPR 0,5385 0,4401 0,4443 0,3430 MYC 0,1935 0,003 0,019 0,1800 GH-MspI 0,63 0,3793 0,387 0,3070 GH-HaeII 0,113 0,1396 0,1409 0,1300 průměr 0,408 0,70 0,78 s x 0,1554 0,116 Tab. 6: Hodnoty heterozygotnosti a pro jednotlivé lokusy zjištěné pro D Pozor. het. Oček. het. Oček. het. (Nei 1973) (Nei 1978) LEP 0,486 0,3367 0,349 0,800 MYC 0,4667 0,3578 0,3701 0,940 GH-MspI 0,3750 0,49 0,5081 0,3710 GH-HaeII 0,5333 0,3911 0,4046 0,3150 průměr 0,4509 0,3945 0,4080 s x 0,0666 0,0689 Pozn.: Pozor. het. pozorovaná heterozygotnost; Oček. het. očekávaná heterozygotnost ZÁVĚR Zjistili jsme, že mezi plemeny BU, LA a D jsou průkazné rozdíly ve frekvencích genotypů sledovaných genů, při použití χ testu. Tyto výsledky jsou ovlivněny zejména nestejným počtem zjištěných genotypů. S těmito výsledky korespondují také rozdílné frekvence alel mezi plemeny. U všech tří testovaných plemen s výjimkou plemene BU v lokusu LEP byla zjištěna genetická H.-W. rovnováha ve všech lokusech. Zjištěné hodnoty heterozygotnosti a byly opět různé mezi jednotlivými plemeny, kdy plemeno landrase vykazovalo nižší úroveň genetické variability. 5

6 POUŽITÁ LITERATURA Botstein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.W. (1980): Construction of genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet., 3, Gerbens F., Rettenberger G., Lenstra J.A., Veerkamp J.H., tepas M.F.W. (1997): Characterization, chromosomal localization, and genetic variation of the porcine heart fatty acid-binding protein gene. Mammalian Genome, 8 (5): Huang L., Lin W., Gao J., Ren J., Deng S. (001): H-FABP polymorphism frequencies in ten pig breeds. Manuscript Handler J., Schmoll F., Stur I., Brem G., Schellander K. (1996): Distribution of ApaI and CfoI polymorphisms of the porcine growth-hormone (pgh) gene in two ryr 1 genotyped Austrian pig breeds. J. Anim. Breed. Genet., 113, Dvorak J., Nebola M. (1994): Analysis of genotype distribution in Hal locus in pigs of landrace breed. Zivocisna Vyroba 39 (9): Nei M. (1973) Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proc Natl Acad Sci. USA 70: Nei M. (1978) Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics 89: Reiner G., Willems H., Geldermann H., Dzapo V. (000): Four PCR-RFLPs and a sequence polymorphism in the porcine c-myc proto-oncogene and confirmation of the chromosomal localisation on SSC4 by linkage mapping. Anim. Genet. 31 (): Schellander K., Peli J., Kneissl F., Schmoll F., Mayr B. (1994): Variation of the growthhormone gene in RYR-1 genotyped austrian pig breeds. J. Anim. Breed. Genet., 111 (): Stratil A., Peelman L., VanPoucke M., Cepica S. (1997): A HinfI PCR-RFLP at the porcine leptin (LEP) gene. Anim. Genet. 8 (5): Stratil A., Kopecny M., Moser G., Schroffel J., Cepica S. (1998): HpaII and RsaI PCR-RFLPs within an intron of the porcine leptin receptor gene (LEPR) and its linkage mapping. Anim. Genet., 9 (5): Práce byla zpracována s podporou MŠMT MSM č