MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA. Ramanova spektroskopie DNA modifikované protinádorově účinnými komplexy platiny RIGORÓZNÍ PRÁCE

Rozměr: px
Začít zobrazení ze stránky:

Download "MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA. Ramanova spektroskopie DNA modifikované protinádorově účinnými komplexy platiny RIGORÓZNÍ PRÁCE"

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Ramanova spektroskopie DNA modifikované protinádorově účinnými komplexy platiny RIGORÓZNÍ PRÁCE Brno 2008 Veronika Kohoutková

2 Anotace DNA je cílovým místem působení platinových cytostatik. Bylo prokázáno, že mechanismus působení platinových komplexů spočívá v jejich schopnosti vytvářet s molekulou kovalentní adukty. Cisplatina vytváří kovalentní vazbu zejména s nukleofilními místy guaninových zbytků v DNA, a protože je cisplatina bifunkčním činidlem, má schopnost vázat se k jednomu (monofuknční adukt) nebo ke dvěma (vnitrořetězcové a meziřetězcové můstky) místům v řetězci DNA. Všechny tyto adukty výrazně narušují konformaci DNA. K zásadním nedostatkům léčby cisplatinou patří snižování citlivosti nádoru vůči cisplatině při opakovaném podávání tohoto léčiva. Léčba s sebou nese celou řadu doprovodných nežádoucích vedlejších účinků. Cílem této práce je na vybraných platinových komplexech sledovat změny v Ramanových spektrech a porovnat tyto změny s již známými spektry cisplatiny a transplatiny. Byly připraveny krátké fragmenty DNA a ty byly modifikovány různými komplexy platiny. Od všech komplexů byly připraveny tři rb a výsledná diferenční spektra byla srovnána s diferenčními spektry cisplatiny a transplatiny. Největší změnu v Ramanově diferenčním spektru pozorujeme při záměně jedné aminoskupiny transplatiny za ligand a to piperidin. Klíčová slova: platinová cytostatika, DNA, Ramanova spektroskopie 1

3 Anotation DNA is a critical target for the activity of platinum cytostatics. There is a large body of experimental evidence that success of platinum complexes results from their ability to form on DNA various types of covalent adducts. Cisplatin forms covalent bonds with nucleophilic sites on guanine residues present in DNA and because of a cisplatin is a bifunctional agent it is able to bind to one (monofunctional adduct) or two (intrastrand crosslinks, interstrand crosslinks) places in a DNA chain. All of these adducts distort characteristicly the conformation of DNA. The main problem in the curing with cisplatin is the cutting down the sensitiveness of the tumor towards the cisplatin when the cisplatin is repeating in the treatment. A medical treatment is connected with a lot of unadvisable effects. The aim of this study is the following of changes in Raman spectras of chosen platin complexes and compare this changes with the known spectras of cisplatin and transplatin. A short fragments of DNA were prepared through the sonication and they were modified with platinum complexes of three rb. The comparations were taken in differences Raman spectras of cisplatin and transplatin. The largest change in the difference Raman spectra was found in the replacement of one ammine ligand for piperidine. Keywords: platinum cytostatics, DNA, Raman spectroscopy 2

4 Prohlašuji, že jsem pracovala samostatně a použila pouze literatury uvedené v seznamu. Veronika Kohoutková 3

5 Ráda bych poděkovala doc. RNDr. O. Vránovi, CSc. za odborné vedení, všestrannou pomoc a zájem, který věnoval mé práci. Zvláštní poděkování patří Mgr. Jarmile Mlčouškové za pomoc při měření na Ramanovu spektrometru. Rovněž děkuji všem spolupracovníkům na oddělení molekulární biofyziky BFÚ AV ČR za vytvoření příjemného pracovního prostředí. 4

6 OBSAH Seznam nejdůležitějších zkratek 8 I. ÚVOD 9 II. TEORETICKÁ ČÁST Koordinační sloučeniny kovů s protinádorovými účinky Vývoj platinových komplexů Struktura platinových komplexů Využití cisplatiny Toxicita cisplatiny, rezistence vůči cisplatině Mechanismus působení cisplatiny Reaktivita platnatých komplexů Distribuce cisplatiny v buňkách Vazba cisplatiny na DNA Struktura DNA Reakce cisplatiny s DNA Poškození DNA po modifikaci cisplatinou Reparace DNA Proteiny se specifickou vazbou na DNA modifikovanou cisplatinou Platinové komplexy druhé generace Klinicky používané deriváty cisplatiny Karboplatina Oxaliplatina Nedaplatina Protinádorové deriváty transplatiny Vícejaderné platinové komplexy Síly stabilizující DNA Denaturace DNA Ramanova spektroskopie Princip vibrační spektroskopie Výhody a nevýhody vibrační spektroskopie Vibrace molekul Objev a princip Ramanova rozptylu 32 5

7 5.5. Povrchem zcitlivěná Ramanova spektroskopie: SERS a SE(R)RS Povrchem zcitlivěná rezonanční Ramanova spektroskopie SE(R)RS Povrchem zcitlivěná Ramanova spektroskopie SERS Princip SERS Experimentální espekty SERS SERS DNA Fluorescence Komponenty Ramanova spektrometru Popis a aplikace Ramanovy spektrometrie Ramanova spektroskopie nukleových kyselin Nukleotidy a jejich analoga Syntetické nukleové kyseliny a krátké fragmenty DNA Nukleové kyseliny (DNA) Ramanovo spektrum DNA Přehled pásů Ramanova spektra ctdna v B-konformaci ( cm -1 ), 42 porovnání A a B-konformace Úspěchy v Ramanově spektrometrii 45 III. CÍL PRÁCE 47 IV. MATERIÁL A METODY 48 1.Materiály Použité chemikálie Použité roztoky 48 2.Metody Sonikace UV spektrometrie Elektroforéza v agarózovém gelu Polarografie Dialýza DNA Lyofilizace DNA Purifikace DNA Modifikace DNA platinovými komplexy Ramanův spektroskop 52 6

8 V. MĚŘENÍ, VÝSLEDKY A DISKUSE Studium vlivu sonikace na DNA Spektrofotometrická analýza Polarografická analýza Analýza modifikovaných DNA pomocí Ramanovy spektroskopie Analýza spektra DNA modifikované cisplatinou Analýza spektra DNA modifikované transplatinou Srovnání spekter DNA modifikovaných cisplatinou a transplatinou Analýza spektra DNA modifikované komplexem cis-ptcl 2 (NH 3 )(pip) Analýza spektra DNA modifikované komplexem trans-ptcl 2 (NH 3 )(pip) Srovnání spekter DNA modifikovaných cisplatinou, transplatinou 73 a komplexy cis-ptcl 2 (NH 3 )(pip) a trans-ptcl 2 (NH 3 )(pip) 4.7. Analýza spektra DNA modifikované komplexem trans-ptcl 2 (NH 3 )(pz) Analýza spektra DNA modifikované komplexem trans-ptcl 2 (4-pic)(pip) Analýza spektra DNA modifikované komplexem trans-ptcl 2 (4-pic)(pz) Analýza spektra DNA modifikované komplexem cis-ptcl 2 (NH 3 )(4-pic) Analýza spektra DNA modifikované komplexem trans-ptcl 2 (NH 3 )(4-pic) Srovnání spektra DNA modifikovaných cisplatinou, transplatinou 84 a komplexy cis-ptcl 2 (NH 3 )(4-pic) a trans-ptcl 2 (NH 3 )(4-pic) Srovnání některých významných změn ve spektrech všech měřených 85 DNA modifikovaných vybranými komplexy platiny Shrnutí výsledků všech naměřených Ramanových spekter DNA 87 modifikovaných vybranými platinovými komplexy VI. ZÁVĚR 97 VII. POUŽITÁ LITERATURA 100 7

9 Seznam nejdůležitějších zkratek bp pár bází bk backbone (cukrfosfátová kostra) cisplatina, cis DDP cis-[(nh 3 ) 2 Cl 2 Pt] ct DNA thymová DNA dienplatina [PtCl(dien)]Cl da deoxyadenosin dc deoxycytidin dg deoxyguanosin DNA deoxyribonukleová kyselina DPP diferenční pulzní polarografie dt deoxythymidin HMG High Mobility Group IAC vnitrořetězcová křížová vazba ( intrastrand crosslink ) IEC meziřetězcová křížová vazba ( interstrand crosslink ) intensity intenzita pic picolin pip piperidin pz piperazin r b RNA stacking transplatina, trans DDP wavenumber vlnočet (cm -1 ) množství molekul komplexu navázaných na jeden nukleotid (c Pt /c DNA ) ribonukleová kyselina vrstvení bazí trans-[(nh 3 ) 2 Cl 2 Pt] 8

10 I. ÚVOD Jako rakovinu nebo též nádorové onemocnění označujeme skupinu nemocí, které se vyznačují nekontrolovaným buněčným dělením. Rychle se dělící nádorové buňky mají schopnost napadat ostatní tkáně a rozšiřovat se do jiných částí těla. Když jsou normální buňky poškozené nebo staré, spustí se program kontrolované buněčné smrti - apoptózy. Rakovinové buňky se však dokáží apoptóze vyhnout. Ke vzniku rakoviny dochází tehdy, když je genetickými nebo environmentálními faktory poškozena DNA takovým způsobem, že dojde k deregulaci buněčného dělení. Všechny naše orgány jsou tvořeny buňkami, které, pokud to tělo potřebuje, se dělí a vytváří tak buňky další. Toto je normální stav ve zdravém těle. Jestliže se však buňky dělí i bez potřeby vzniku nových buněk, vytvoří masu tkáně, která je považována za nádor. Nádory mohou být benigní (ne rakovinové, nezhoubné) a maligní (rakovinové, zhoubné). Zhoubný nádor se sestává z rakovinových buněk, které mají schopnost rozšiřovat se do svého bezprostředního okolí a ničit buňky zdravé. Někdy se nádorové buňky odtrhnou od původního (primárního) nádoru a nádor se rozšiřuje do dalších orgánů v těle a to buď krví nebo lymfatickým systémem. Když se tyto buňky dostanou na nové místo, mohou se dělit dál a vytvořit nový nádor, který se nazývá sekundárním nádorem čili metastázou. Ačkoliv některé typy nádorů nemůžeme dnes zcela vyléčit, existuje mnoho způsobů jak zastavit nádorové bujení. Chemoterapie je oproti chirurgickým a radioterapeutickým metodám nejmladší, avšak zaznamenává mohutný celosvětový vývoj. Na trhu je několik desítek léků s prokázanou účinností při léčbě nádorových onemocnění. Farmaceutické společnosti v současné době provádějí výzkum více než 300 potenciálních preparátů, které jsou určeny k léčbě zhoubných nádorů. Cytostatika, neboli protinádorová chemoterapie, svým zásahem do buněčného cyklu nádorové buňky brání této buňce v dalším dělení. Při chemoterapii chemickými cytostatiky však dochází nejen k ničení rychle se množících buněk nádorových, ale i k ničení přirozených rychle se množících buněk, jako jsou buňky jaterní tkáně, bílé krvinky, červené krvinky, spermie, vajíčka. Sledování změn nukleových kyselin po vazbě protinádorově účinných komplexů vedoucích k zastavení růstu nádorů je důležité pro pochopení primární příčiny úspěchu daného léku. Tyto poznatky pak mohou být využity pro navrhování nových typů léčiv, které by mohly účinkovat proti jiným typům nádorů (než stávající používaná cytostatika) nebo snižovat vedlejší účinky provázející léčbu pacientů trpících rakovinou. 9

11 II. TEORETICKÁ ČÁST 1. Koordinační sloučeniny kovů s protinádorovými účinky Využití anorganických kovových sloučenin pro léčbu nádorových onemocnění se datuje již do 19. století, kdy roku 1865 Lissauer publikoval výsledky své práce s arsenoterapií [1]. V roce 1931 Collier a Kraus publikovali teorii platnou dodnes a to, že protinádorové účinky sloučenin těžkých kovů nezávisí jen na použitém kovu, ale také na celkovém charakteru sloučeniny a její chemické struktuře [1] Vývoj platinových komplexů Nejznámější dosud používané cytostatikum na bázi platiny je cis-diammindichloroplatnatý komplex neboli cisplatina. Ačkoliv tento komplex byl syntetizován již roku 1844, schopnost platinových komplexů zastavovat buněčný růst byla objevena náhodně Barnettem Rosenbergem až v roce Tento americký biofyzik studoval vliv elektrického pole na růst bakterií Escherichia coli, přičemž k měření používal platinové elektrody ponořené do roztoku s chloridem amonným. Po jisté době došlo k zastavení buněčného dělení bakterií a k jejich filamentóznímu růstu, čímž se až třistakrát prodloužila jejich délka. Následně bylo prokázáno, že příčinou tohoto jevu není elektrické pole, ale tetrachlorodiamminplatičitý komplex vzniklý uvolněním malého množství platiny do roztoku elektrolytu. Rosenberg pokračoval v syntéze jednoduchých aminoplatnatých a aminplatičitých komplexů a jejich testování na experimentálních nádorových modelech. Ukázalo se, že po aplikaci některých těchto komplexů opravdu dochází ke zmenšení nádorů a prodloužení doby života u pokusných zvířat [2]. První klinické pokusy s cisplatinou proběhly v roce 1971 a koncem 70. let se již cisplatina běžně používala v klinické praxi. Ačkoliv cisplatina je velice účinné cytostatikum, jiné deriváty platiny, jako transplatina či dienplatina (obr. 1), jsou protinádorově neaktivní. 10

12 Obr. 1: Strukturní vzorce a) cisplatiny, b) transplatiny, c) dienplatiny 1.2. Struktura platinových komplexů Platina vytváří ve vodném prostředí komplexní sloučeniny a to nejčastěji ve druhém (čtyřvazebném) a čtvrtém (šestivazebném) oxidačním stupni. V prostředí živých organismů obsahujících řadu redukujících látek lze předpokládat převažující oxidační stupeň II, pro nějž je charakteristická čtvercově planární struktura komplexu. Pt(IV) komplexy tvoří nejčastěji oktaedrickou strukturu a jsou méně reaktivní [3]. V klinické praxi se využívají komplexy platiny dvojmocné i čtyřmocné Využití cisplatiny Cisplatina neboli cis-[(nh 3 ) 2 Cl 2 Pt ] je komerčně nejúspěšnější protinádorový preparát a je klinicky využívána s úspěšností dosahující až 90 % při léčbě nádorů urogenitálního traktu. Úspěšně je také aplikována v případě léčby malobuněčného karcinomu plic a některých nádorů hlavy a krku. V kombinaci s radioterapií je pomocí cisplatiny dosahováno uspokojivých výsledků také při aplikaci proti nádorům kostí a tenkého střeva. Přibližně 30 % všech pacientů umírajících na rakovinu má však nádory prsu, konečníku či tlustého střeva, kde je terapie cisplatinou, bohužel, neúspěšná [4]. 11

13 1.4. Toxicita cisplatiny, rezistence vůči cisplatině K zásadním nedostatkům léčby cisplatinou patří vznik rezistence, tedy snižování citlivosti nádoru vůči cisplatině při opakovaném podávání tohoto léčiva. Vlastní léčba s sebou nese celou řadu doprovodných vedlejších účinků. Nejčastějšími komplikacemi jsou nefrotoxicita (narušení funkce ledvin), myelotoxicita (porušení nervových drah v míše), ototoxicita (ztráta vnímání zvuků o vysokých frekvencích), poškození krvetvorby, zažívacího traktu a alergické reakce (kožní vyrážka, nevolnost, zvracení) [5]. Některé z těchto vlivů se daří potlačovat vhodnou volbou léčebného postupu (například dlouhodobá infuze cytostatika v kombinaci s podáváním většího množství tekutin a diuretik), přesto však představují vedlejší účinky tohoto cytostatika velká omezení při chemoterapii. Možným způsobem jak snížit toxicitu cisplatiny je její vazba na nosičové molekuly, které dokáží rozlišit mezi nádorovou a zdravou tkání. Mechanismus rozpoznání nádorových buněk spočívá v tom, že na povrchu nádorové buňky se vyskytuje velké množství receptorů pro steroidní hormony, které jsou nezbytné pro růst nádoru. Pokud by se podařilo na některý z účinných komplexů navázat ligand, jež se na tyto receptory bude přednostně vázat, zvýšila by se tak koncentrace cytostatika v nádorové tkáni a omezily se nežádoucí interakce. Dosud se však žádný z připravených komplexů neosvědčil natolik, aby bylo možno přistoupit ke klinickým zkouškám [6]. 2. Mechanismus působení cisplatiny Brzy po objevu protinádorových účinků cisplatiny se vědci snažili odhalit mechanismus jejího působení. Za klíčovou se považuje vazba na DNA [6] Reaktivita platnatých komplexů Cisplatina patří do skupin komplexů s centrálním atomem platiny v oxidačním stupni II a vykazuje čtvercovou planární symetrii. Chemická stabilita vazby mezi centrálním atomem platiny a ligandem závisí na jeho schopnosti poskytovat elektrony na uskutečnění vazby, tedy na tzv. elektrodonorním charakteru. Síla vazby vzrůstá s polarizovatelností elektronového obalu ligandu, přičemž afinita ligandů pro vazbu s dvojmocnou platinou klesá v pořadí: 12

14 CN - >NH 3 >OH - >Cl - >NO 3 - >ClO 4 - >H 2 O Dalším faktorem ovlivňujícím termodynamickou stabilitu vazby mezi platinou a ligandem je takzvaný trans-efekt. Tímto pojmem je myšlena schopnost ligandu usnadňovat substituci v poloze trans [8]. V případě cisplatiny jsou na centrální platinový atom navázány dva typy ligandů, chloridový iont a NH 3, z nichž chloridový atom vykazuje větší trans-efekt než NH 3. U transplatiny, kdy jsou v poloze trans vždy dva stejné ligandy, dochází k vzájemnému vyrušení trans efektů. Ligandy odstupují podstatně méně ochotně než u cisplatiny, kde proti sobě stojí vždy chloridový iont a NH 3, a vazba mezi platinou a chloridovým iontem je destabilizována v mnohem větší míře. Je tedy patrné, že chloridové anionty u cisplatiny budou ve vodném prostředí odstupovat podstatně rychleji než u transplatiny. Ve vodném prostředí bude tedy probíhat hydrolýza (výměna chloridových iontů za molekulu vody) mnohem snáze u cisplatiny, než u jejího trans izomeru. Aminoligandy jsou k výměně za vodu relativně inertní a k jejich odstupování nedochází (viz. výše uvedená afinitní řada) Distribuce cisplatiny v buňkách Při aplikaci cisplatiny dochází k neselektivní reakci s různými částmi buňky: 5-10 % je vázáno na membrány, 20 % na nukleové kyseliny a nukleoproteiny, % na proteiny a zbývající platinový komplex se dělí mezi cisplatinu vázanou na malé molekuly a volný komplex. Pouze některé interakce však mají vliv na buněčný růst a dělení. Například vazba platinových komplexů na proteiny sice inhibuje jejich enzymovou aktivitu, avšak jak dokazuje celá řada experimentů, největší cytostatickou účinnost má vazba cisplatiny na DNA [9]. Cisplatina je při chemoterapii aplikována intravenózně. V krevní plazmě je relativně vysoká koncentrace chloridových iontů (150 mm při ph 7,4), tudíž téměř 93 % cisplatiny se nachází v dichloro- nebo chlorohydroxo- formě. Tento nereaktivní stav komplexu umožňuje průnik z krevního řečiště pasivním transportem přes plazmatickou membránu do buněk. V cytoplasmatickém prostoru buněk je koncentrace chloridových iontů při stejném ph pouze 4 mm, dochází tedy k hydrolýze (asi 33 %) a cisplatina se stává kladně nabitou reaktivní molekulou. Po průchodu do jádra reaguje cisplatina ve dvou krocích. V prvním kroku reaguje hydrolyzovaná forma cisplatiny zpravidla s N7 guaninem za vzniku monofunkčního aduktu. 13

15 V následujícím kroku, pokud je v blízkosti další vhodné reakční místo, hydrolyzuje druhá chloridová skupina a vytváří se druhá vazba s DNA - vzniká bifunkční vazba komplexu s DNA (obr. 2) [10]. Obr. 2: Schematický proces vstupu cisplatiny do buňky po intravenózní aplikaci spolu se schématem reakce cisplatiny s DNA 2.3. Vazba cisplatiny na DNA Struktura DNA Molekula DNA je složena z nukleotidů, které jsou tvořeny z pětiuhlíkového monosacharidu (2-deoxy-ß-D-ribóza), z kyseliny trihydrogenfosforečné (H 3 PO 4 ) a z purinové (adenin, guanin) nebo pyrimidinové (cytosin, thymin) báze. Sloučenina vzniklá spojením purinové nebo pyrimidinové báze N-glykosidickou vazbou s deoxyribózou se označuje jako deoxyribonukleosid. Strukturní jednotkou polynukleotidového řetězce jsou zbytky 14

16 deoxyribózy, které jsou spojeny fosfodiesterovými vazbami. Nejčastěji se DNA vyskytuje v podobě tzv. dvoušroubovice, která je složena ze dvou polydeoxyribonukleotidových řetězců. Oba řetězce jsou k sobě navzájem komplementární. Uplatňuje se zde tzv. Watson-Crikovo párování bází (obr. 4). Podle tohoto pravidla se prostřednictvím vodíkových vazeb páruje adenin s thyminem a guanin s cytosinem. DNA je schopna tvořit tři základní prostorová uspořádání (komformace): A, B a Z (obr. 3). V daný okamžik je preferována ta konformace, která je energeticky nejvýhodnější s ohledem na nukleotidovou sekvenci, obsah vody a iontovou sílu. DNA v konformaci A a B je pravotočivá, zatímco v konformaci Z je levotočivá. Základní parametry jednotlivých forem jsou shrnuty v tab.1 [11]. a) 15

17 b) c) Obr. 3: Molekulární model: a) A-DNA, b) B-DNA, c) Z-DNA 16

18 Charakteristika dvoušroubovice Konformace A Konformace B Konformace Z Vinutí pravotočivá pravotočivá levotočivá Celkový tvar krátká a široká dlouhá a tenká podlouhlá a tenká Umístění osy dvoušrobovice přes větší žlábek přes páry bází přes menší žlábek Větší žlábek velmi úzký a široký a hluboký zploštělý na hluboký povrchu šířka 0,27 nm 1,17 nm 0,88 nm hloubka 1,35 nm 0,88 nm 0,37 nm Menší žlábek velmi široký úzký a hluboký velmi úzký a mělký a hluboký šířka 1,1 nm 0,57 nm 0,2 nm hloubka 0,28 nm 0,75 nm 1,38 nm Zvýšení na pár bází ~ 0,23 nm ~ 0,34 nm ~ 0,38 nm Zvýšení na jeden závit (otáčku) Počet párů bází na jeden závit ~ 2,5 nm ~ 3,4 nm ~ 4,6 nm ~ 11 ~ 10,5 ~ 12 Konformace glykosidické vazby anti anti anti u C syn u G Konformace deoxyribózy C3`-endo C2`-endo C2`-endo u dc C3`-endo u dg Tab.1: Průměrné parametry A, B a Z-konformace ds DNA Reakce cisplatiny s DNA Jakmile bylo prokázáno, že se cisplatina váže na DNA a tato skutečnost by mohla souviset s protinádorovým působením cisplatiny, rozběhla se další fáze výzkumu zaměřená na studium interakcí cisplatiny s DNA. V neutrálním prostředí je DNA polyaniontem vlivem záporně nabitých fosfátových zbytků v její cukrfosfátové kostře. Cisplatina má v hydrolyzované formě kladný náboj a dochází tedy k elektrostatickému přitahování mezi tímto komplexem a DNA. V prvním kroku reakce se cisplatina přiblíží natolik, aby, jakožto 17

19 elektrofilní činidlo, mohla reagovat s nukleofilními místy na DNA. Vazebná místa na DNA můžeme seřadit podle reaktivity s platnatými komplexy následovně: guanin-n7>>adenin-n7>cytosin-n3>adenin-n1 Atomy dusíku v poloze N7 guaninu a adeninu jsou orientovány do prostoru velkého žlábku a jsou tedy snadno přístupné pro vazbu komplexu, na rozdíl od dusíku N3 cytosinu a N1 adeninu, se kterými cisplatina v neutrálním protředí může také reagovat. Tato její vazba je však znesnadněna Watson-Crickovým párováním bází (obr. 4) [12]. Obr. 4: Schematické znázornění Watson-Crickova párování bází a umístění vazebných míst pro platinové komplexy: a) adenin-thymin, b) guanin-cytosin Nejvíce zastoupeným aduktem cisplatiny na DNA je vazba tohoto komplexu ke dvěma sousedním guaninovým zbytkům v jednom řetězci. Tento adukt je označován 1,2-GG-IAC a tvoří až 60 % všech aduktů cisplatiny. Cisplatina se také může vázat na sousední deoxyadenosin a deoxyguanosin, přičemž adeninový zbytek je vždy na 5 konci. Tento typ aduktu je označován 1,2-AG-IAC a tvoří asi 20 % navázané cisplatiny. Dalším vnitrořetězcovým typem aduktu je vazba cisplatiny na dva guaninové zbytky separované od sebe jedním nukleotidem tzv. 1,3-GG-IAC. Tento typ aduktu tvoří asi 10 % navázané cisplatiny. Cisplatina vytváří také meziřetězcovou vazbu a to mezi dvěma guaninovými zbytky v komplementárních řetězcích v sekvenci 5 -GC-3. Tento adukt (1,2-GG-IEC) tvoří společně s monofunkčně navázanou cisplatinou 5-10 % vázané cisplatiny na lineární DNA (obr. 4). Za významné z hlediska protinádorové aktivity jsou považovány bifunkční adukty. Platnaté komplexy tvoří zřejmě i adukty mezi DNA a proteiny [12]. 18

20 Vazba cisplatiny na DNA způsobuje změnu její konformace v okolí vazby. Rozsah a typ distorze závisí na typu aduktu (obr. 5) [13]. Obr. 5: Grafické znázornění aduktů cisplatiny a) 1,2-GG-IAC, b) 1,2-AG-IAC, c)1,3-gg-iac, d) 1,2-GG-IEC 2.4. Poškození DNA po modifikaci cisplatinou Poškození DNA po vazbě cisplatiny má nepochybně vliv na její funkci. Zásah do procesů replikace a transkripce může mít pro buňku vážné následky [14]. Bylo prokázáno, že cisplatina zastavuje replikaci DNA in vitro [15]. Váže se na sekvence (dg) (n > 1) a blokuje DNA polymerázu [16]. Experimenty zabývající se posouzením vztahu mezi inhibicí replikace, cytotoxicitou a buněčným cyklem iniciovaly vznik hypotézy, že podstatou protinádorových účinků cisplatiny může být inhibice transkripce [17]. Bylo také zjištěno, že buňky vystavené působení cisplatiny prošly S fází, ve které probíhá replikace DNA, ale byly zablokovány v G 2 fázi. Ukazuje se, že tato schopnost cisplatiny je různá u různých buněčných linií. U buněk s deficitním opravným systémem dochází k zablokování buněčného cyklu již při malých koncentracích cisplatiny [18]. Experimenty demonstrující schopnost cisplatiny blokovat buňky v G 2 fázi vedly k závěru, že cisplatina inhibuje transkripci a poskytly také první informace o mechanismu buněčné smrti. Degradace DNA poskytla první vodítko a následující výzkum jednoznačně potvrdil, že cisplatina je schopna vyvolat v buňkách signál ke spuštění programované smrti buňky apoptózy [19]. 19

21 2.5. Reparace DNA Adukty jsou odstraňovány za pomocí reparačních mechanismů. Na odstraňování aduktů cisplatiny se podílí především nukleotidová excizní oprava, která je využívána k opravám řady poškození DNA [20]. Postižené místo je většinou vystřiženo z DNA ve formě fragmentu [21]. Excizní opravný mechanismus je velmi dobře popsán díky dědičnému lidskému onemocnění Xeroderma pigmentosum. Kromě excizního reparačního mechanismu existují i další typy reparačních mechanismů, které také mohou mít vliv na cytotoxicitu aduktů cisplatiny. Bakterie E. Coli s mutací v rekombinačním nebo mismatch opravném mechanismu vykazují zvýšenou citlivost na cisplatinu, což naznačuje, že i tyto mehanismy hrají roli v buněčné odezvě na působení cisplatiny [22] Proteiny se specifickou vazbou na DNA modifikovanou cisplatinou Přestože cisplatina dokáže inhibovat replikaci i transkripci, je zřejmé, že na procesech vedoucích až k apoptóze buňky se podílejí ještě další faktory zřejmě buněčné proteiny, které se specificky váží na adukty cisplatiny [23]. Dnes je známa již celá řada takových proteinů. Patří sem proteiny účastnící se excizního reparačního mechanismu XPE, XPA, RPA [24] nebo ERCC1 [25] a dále proteiny, které jsou součástí mismatch opravného mechanismu např. MutSα [26]. Další skupinou proteinů vyznačující se specifickou vazbou na DNA modifikovanou cisplatinou jsou HMG proteiny (high mobility group). HMG proteiny jsou nehistonové chromozomální proteiny, které hrají důležitou úlohu při vytváření vysoce organizovaných struktur DNA v chromatinu. Tyto proteiny obsahují konzervativní doménu (80 aminokyselin), která umožňuje vazbu k DNA (takzvaný HMG box). Bylo zjištěno, že HMG1 protein se váže selektivně k 1,2-GG-IAC, 1,2-AG-IAC a 1,2-GG-IEC aduktu cisplatiny, ale neváže se k monofunkčním aduktům a 1,3-GG-IAC aduktu. Po objevení vazby HMG1 proteinu na DNA modifikovanou cisplatinou byla vyslovena teorie, která vysvětluje úlohu HMG proteinů v protinádorové účinnosti cisplatiny [27]. HMG proteiny se pevně váží k aduktům cisplatiny a brání tak jejich odstranění opravnými mechanismy buňky. Přetrvávající adukt pak vyvolává změny DNA, které brání její replikaci, případně může dojít až k indukci apoptózy buňky (obr. 6). Jiné proteiny se pak specificky naváží na DNA modifikovanou cisplatinou, např. TBP nebo YB-1 [28]. 20

22 Obr. 6: Schematické znázornění možného stínícího účinku HMG proteinů 3. Platinové komplexy druhé generace Právě kvůli vedlejším účinkům cisplatiny (viz. kap. 1.4.) a tedy velké zátěži pacientů, je stále velká snaha vyvinout léčivo se stejnými léčebnými účinky, ale menšími komplikacemi při chemoterapii. Vývoj nových protinádorově aktivních komplexů je zaměřen na přímá analoga cisplatiny, transplatinové komplexy, polynukleární platinové komplexy, komplexy s atomem platiny ve čtvrtém oxidačním stupni a koordinační sloučeniny s jiným centrálním kovem než platinou. Doposud bylo syntetizováno více než 3000 analogů cisplatiny, z nichž několik desítek postoupilo do klinických zkoušek [1]. V raných fázích vývoje platinových komplexů byl kladen důraz především na omezení toxických dopadů na organismus, jak již bylo zmíněno (kap. 1.4.). Srovnávacím modelem nově vznikajících preparátů byla vždy cisplatina, jejíž účinky na organismus jsou poměrně dobře popsány. Méně výrazná toxicita některých komplexů druhé generace napomohla ke zjednodušení léčebných postupů a umožnila rozvoj kombinované terapie [29]. 21

23 Toxicita platinových sloučenin závisí na jejich struktuře. Díky stálému ověřování předpokladu, že terčem působení platinových léčiv v buňce je DNA [30] se zdá, že rozdílná chemická struktura nově vyvíjených platinových komplexů může podstatně ovlivnit právě jejich vazbu na DNA. Vlastnosti odstupujících skupin sloučeniny totiž ovlivňují průběh distribuce léčiva ve tkáních a buňkách. Na druhou stranu charakter neodstupujících skupin má vliv na konformační změny DNA [31] Klinicky používané deriváty cisplatiny Od zavedení cisplatiny do klinické praxe byly syntetizovány a zkoumány stovky jejich bifunkčních derivátů. Mnoho z těchto sloučenin však nevedlo k výrobě nových terapeutik a nemohlo být uvedeno do klinické praxe. Kromě cisplatiny získala mezinárodní atest k léčení nádorových onemocnění pouze karboplatina (v ČR známá pod názvem Cycloplatin) a oxaliplatina (využívaná ve Francii) [31]. Další přímý analog cisplatiny, nedaplatina, je schválena pouze v Japonsku Karboplatina Karboplatina (cis-diaminocyklobutyldikarboxylát-platnatý komplex) (obr. 7) vzniká substitucí dvou odstupujících atomů chlóru v molekule cisplatiny za stabilnější cyklobutyldikarboxylátovou skupinu [32]. Do klinické praxe byla zavedena v roce 1986 [33]. Obr. 7: Strukturní vzorec karboplatiny 22

24 Na rozdíl od cisplatiny vykazuje karboplatina nižší toxické účinky, proto může být podávána i v daleko vyšších dávkách. Nežádoucí účinky, projevující se myelosupresí (útlum aktivity kostní dřeně, tedy útlum krvetvorby), zaznamenáváme pouze v extrémně vysokých dávkách karboplatiny [34]. Karboplatina vytváří podobné spektrum aduktů jako cisplatina. Adukty se odlišují pouze svojí sekvenční preferencí [35]. Další rozdíl mezi karboplatinou a cisplatinou spočívá v ochotě vázat se na DNA. K určitému stupni modifikace je zapotřebí až o dva řády vyšší koncentrace karboplatiny než cisplatiny. Karboplatina působí na podobné spektrum nádorů jako cisplatina. V praxi je používána především při léčbě nádorů vaječníků [7] Oxaliplatina Oxaliplatina (cis-diaminocyklohexyl-platnatý komplex) (obr. 8) byla poprvé syntetizována ve Francii [36]. Při jejím podávání lze pozorovat méně výrazné neurotoxické účinky. Léčba však bývá provázena nauseou. Obr. 8: Strukturní vzorec oxaliplatiny Oxaliplatina se hydrolyzuje pomaleji než cisplatina a je méně ochotná vázat se na DNA [37]. Avšak adukty karboplatiny mají podobné účinky jako adukty cisplatiny [38]. Oxaliplatina se ukazuje vhodná pro léčbu některých nádorů, které jsou rezistentní vůči cisplatině (karcinom tlustého střeva). Oxaliplatina však musí být podávána v kombinaci s 5-fluorouracilem a kyselinou folinovou [39]. 23

25 Nedaplatina Nedaplatina (cis-diaminoglykolát-platnatý komplex) (obr. 9) je látka strukturně podobná karboplatině. Byla vyvinuta v Japonsku, kde se zatím pouze používá. Nachází obdobné terapeutické využití jako karboplatina a cisplatina [37]. Obr. 9: Strukturní vzorec nedaplatiny Z pohledu vazby na DNA není příliš překvapivé, že uvedení těchto tří nových protinádorových léčiv (karboplatiny, oxaliplatiny a nedaplatiny) do klinické praxe nepředstavuje zásadní průlom v léčbě rakoviny platinovými cytostatiky [40]. Důvodem je, že adukty vytvořené přímými deriváty cisplatiny, které se používají v klinické praxi, jsou podobné jako ty, které tvoří cisplatina. Liší se pouze v relativních stupních modifikace [31] Protinádorové deriváty transplatiny Na základě srovnávání účinků cisplatiny a transplatiny se po dlouhá léta vycházelo z hypotézy, že pouze platinové komplexy v konformaci cis mohou disponovat protinádorovou aktivitou [30]. Hlavní rozdíl mezi cisplatinou a jejím trans izomerem spočívá zejména v tom, že transplatina je kineticky více reaktivní a více náchylná k deaktivaci. Zatímco cisplatina tvoří především jednořetězcové podélné vazby mezi sousedními guaninovými bázemi, transplatinové adukty mají charakter meziřetězcových vazeb a velká část aduktů je monofunkčních. Tyto adukty rovněž způsobují konformační změny DNA, ale v mnohem menší míře než je tomu u cisplatiny [41]. Biologicky aktivní transplatinové komplexy byly odvozeny od transplatiny substitucí jedné nebo obou aminových skupin - heterocyklickou aminovou skupinou, alifatickou skupinou nebo iminoéterovou skupinou (obr. 10), čímž došlo k dramatickému nárůstu protinádorové aktivity daného komplexu [42]. U některých těchto sloučenin bylo dokonce dokázáno, že jsou účinné proti širšímu spektru nádorů a celá řada komplexů působí i na buněčné linie rezistentní vůči cisplatině [43]. 24

26 Obr. 10: Strukturní vzorce transkomplexů: a) transplatina, b) trans-[ptcl 2 (NH 3 )(thiazol)], c) trans-ptcl 2 (E-iminoether) 2 Tato práce je zaměřena na srovnávání cisplatinových a transplatinových komplexů spolu s cisplatinou a transplatinou. Ve všech případech používaných komplexů byly nahrazeny jedna nebo dvě aminoskupiny za ligand a to piperidin, piperazin nebo picolin (viz. obr. 11). Některé vlastnosti platinových komplexů používáných v této práci byly již proměřeny [44,45]. Byla změřena rychlost vazby, předdenaturační a denaturační změny měřené pomocí CD spektroskopie, stabilita interstrand a intrastrand crosslinků. Dále byla proměřena teplota tání DNA modifikované těmito komplexy a cytotoxicita vůči vybraným buněčným liniím. Tato práce dále rozvíjí poznatky o těchto a dalších komplexech. Obr. 11: Strukturní vzorce: a) cisplatiny, b) transplatiny, c) cis-(ptcl 2 )(NH 3 )(pip), d) cis-(ptcl 2 )(NH 3 )(pz), e) cis-(ptcl 2 )(NH 3 )(4-pic), f) trans-(ptcl 2 )(NH 3 )(pip), g) trans-(ptcl 2 )(NH 3 )(pz), h) trans-(ptcl 2 )(NH 3 )(4-pic), i) trans-(ptcl 2 )(4-pic)(pip), j) trans-(ptcl 2 )(4-pic)(pz) [44] 25

27 3.3. Vícejaderné platinové komplexy Vícejaderné platinové sloučeniny zahrnují skupinu protinádorových látek s různými chemickými a biologickými vlastnostmi naprosto odlišnými od vlastností jednojaderných platinových léčiv [46]. Nejvýznamnější sloučeninou je tříjaderná dvojvazebná sloučenina s nábojem 4 + BBR3464 [{trans-ptcl(nh 3 ) 2 } 2 µ-trans-pt(nh 3 ) 2 {H 2 N(CH 2 ) 6 NH 2 } 2 ] 4+ (obr.12). Obr. 12: Strukturní vzorec BBR3464 Klinické testy komplexu BBR3464 prokázaly účinnost proti nádorům slinivky, plic a melanomům. Již v preklinických testech dosahovalo BBR3464 výborných výsledků. Tato látka vykazovala cytotoxicitu již při desetkrát nižších koncentracích než tomu bylo u cisplatiny. Jednou z dalších výhod byla aktivita proti lidským nádorovým liniím, které získaly rezistenci k cisplatině, a nádorům způsobeným mutací p53 [47]. Protein p53 je nádorovým supresorem, který působí jako transkripční faktor účastnící se regulace řady genů (MDM2, GADD45, p21, Bax) [48]. Bylo zjištěno, že lidské rakovinové buňky se vyznačují vysokou frekvencí mutací v p53. K aktivaci p53 dojde vlivem poškození DNA nebo jinými buněčnými stresy. P53 zablokuje buněčný cyklus a spustí apoptózu. Narušení funkce proteinu může způsobit vznik rakoviny. Ve skutečnosti se asi polovina nádorů vyznačuje poruchou funkce proteinu p53 [49]. BBR3464 může nalézt uplatnění ve více jak 60 % případů nádorových onemocnění způsobených mutací v p Síly stabilizující DNA V rovině bází je dvoušroubovice DNA stabilizována vodíkovými můstky, které vznikají mezi bázemi v rámci Watson-Crickova párování bází (viz. obr. 4). Vodíkové vazby 26

28 jsou elektrostatického typu a jejich velikost je nepřímo úměrná kvadrátu vzdálenosti a přímo úměrná velikosti parciálního náboje na atomech podílejících se na vazbě, tedy na atomech N, H a O. Vodíkové vazby jsou více než 30 krát slabší ve srovnání s kovalentní vazbou 0 ( H = 10kJ / mol ). Mezi interakce stabilizující dvoušroubovici ve směru kolmém na rovinu bází patří dipóldipólová interakce, Londonovy disperzní síly a hydrofobní interakce. Každá báze nukleové kyseliny má permanentní dipólový moment, který ovlivňuje její elektrostatické vlastnosti. Londonovy disperzní síly jsou důsledkem nerovnoměrného rozložení elektrického náboje způsobeného fluktuací elektronové hustoty. Dochází ke vzniku indukovaných dipólů, které mohou polarizovat elektronové hustoty okolních atomů. Touto polarizací vzniknou indukované paralelní dipóly, které se vzájemně přitahují [50,51]. Další síly stabilizující DNA ve vertikálním směru jsou hydrofobní interakce. Dochází jimi k minimalizaci kontaktu nepolárních skupin DNA s molekulami vody. Nepolárními částmi DNA jsou báze, které jsou umístěny uvnitř dvoušroubovice DNA. Báze se vrství v dvoušroubovici nad sebou, aby byl minimalizován kontakt nepolárních bází s vodou. Tyto interakce se v anglické literatuře označují jako stacking interakce a projevují se silněji u purinových bází než u pyrimidinových. Molekula DNA jako celek je hydratována. Molekuly vody jsou vodíkovými můstky navázány do velkého žlábku a vytvářejí tak hydratační obal molekuly, který stabilizuje strukturu dvoušroubovice. Samotná molekula DNA je polyaniont díky záporně nabitým fosfátovým skupinám v cukrfosfátové kostře DNA. Záporné náboje však také způsobují destabilizaci duplexu DNA v důsledku elektrostatického odpuzování záporně nabitých cukrfosfátových koster jednotlivých řetězců. Tyto odpudivé síly jsou odstraněny, pokud se v roztoku nacházejí kationty, které vytvářejí kolem DNA iontovou atmosféru, která odpudivé síly odstiňuje, a tak zvyšuje termodynamickou stabilitu DNA. Příspěvky jednotlivých interakcí jsou velmi malé, ale díky jejich množství a kooperativitě vzniká stabilní dvoušroubovicová molekula DNA [52]. Vazba platnatých komplexů na DNA na ní indukuje celou řadu distorzí, které se pak promítnou do termodynamických vlastností DNA. Obecně lze volnou energii vazby na DNA vyjádřit jako součet pěti základních příspěvků: 27

29 G cel = G konf + G t+r + G hyd + G ion + G mol G cel je celková energie, kterou můžeme experimentálně sledovat. G konf je příspěvek volné energie vzniklý v důsledku konformačních změn DNA a molekuly, která se váže po vytvoření aduktu. G t+r vyjadřuje ztrátu translační a rotační energie po vzniku vazby. G hyd je energie hydrofobního transportu molekuly z roztoku do místa vazby na DNA. G ion je změna volné energie po uvolnění iontů navázaných v místě vazby před vytvořením aduktu. G mol je energie uvolněná při vzniku vazby mezi DNA a jinou molekulou Denaturace DNA Tání neboli denaturace DNA je děj, při němž dochází k přerušení vazeb mezi řetězci DNA a k jejich následnému oddělení. Denaturaci DNA můžeme provést několika způsoby: zvýšením teploty, extrémním snížením koncentrace iontů v roztoku či extrémním snížením nebo zvýšením ph. Při denaturaci DNA dochází k rozpadu jejího hydratačního obalu v důsledku tepelného pohybu molekul vody, dále dochází k přerušení vodíkových můstků mezi bázemi a také k výraznému narušení stacking interakcí. Přechod dvouřetězcové DNA na dva samostatné, oddělené řetězce je charakterizován teplotou tání T m, což je teplota, při níž je zdenaturovaná právě jedna polovina molekul DNA [53]. Tato veličina je zejména závislá na sekvenci DNA a iontové síle. Aby DNA zdenaturovala, musíme do systému dodat teplo. Jedná se tedy o děj endotermický a enthalpie příslušná denaturaci je kladná. Oddělením řetězců se dostává systém do stavu s nižší uspořádaností, celková entropie tedy roste a systém přechází do entropicky stabilnějšího stavu. Denaturace DNA je charakterizována termodynamickými veličinami S (entropie), H (enthalpie), G (Gibbsova volná energie), které popisují stabilitu DNA. Hodnoty těchto veličin odpovídají veličinám příslušným vzniku dvoušroubovice DNA z jednotlivých řetězců a liší se pouze znaménkem [54]. Pokud H roste, klesá stabilita molekuly, pokud H klesá, dojde ke stabilizaci. Pokud roste míra neuspořádanosti systému, klesá S. Jestliže klesá míra neuspořádanosti systému, roste S. V případě denaturovaného stavu DNA je větší míra neuspořádanosti systému než u dvoušroubovice [55]. Tání dlouhých fragmentů DNA (například plazmidové DNA nebo DNA z telecího thymu) není dvoustavový kooperativní děj, jak je tomu u krátkých fragmentů DNA. Vzhledem ke 28

30 značné délce několika tisíc párů bází a nerovnoměrnosti rozmístění GC a AT párů, dochází k diskontinuálnímu tání po oblastech, které však tají kooperativně. Tento fakt se na termogramu projeví vznikem charakteristických píků. Píky vznikající při nižších teplotách přísluší oblastem bohatým na AT páry a naopak píky vznikající při vyšších teplotách přísluší oblastem bohatým na GC páry [56,57]. 5. Ramanova spektroskopie 5.1. Princip vibrační spektroskopie Molekuly jsou tvořeny atomy, které jsou spojeny elastickými vazbami. Proto atomy mohou vykonávat periodický pohyb mají vibrační stupně volnosti. Pohyby atomů v molekule relativně vůči sobě jsou superpozicí tzv. normálních vibrací, ve kterých všechny atomy vibrují se stejnou fází a frekvencí. Amplituda normální vibrace je popsána normální souřadnicí. Nelineární (respektive lineární) n-atomová molekula má 3n-6 (respektive 3n-5) normálních vibrací, které tvoří její vibrační spektrum. Toto spektrum závisí na hmotnostech atomů, jejich geometrickém uspořádání (rovnovážné konfiguraci) a síle vazeb mezi nimi. Molekulární agregáty (např. krystaly) se chovají jako supermolekuly, v nichž jsou vibrace jednotlivých komponent spřaženy. V prvním přiblížení jsou normální vibrace nezávislé a vzájemně neinteragují. V případě větších výchylek však přestávají být vibrace harmonické a ve vibračním spektru se mohou projevit kromě fundamentálních vibrací i vyšší harmonické nebo kombinační vibrace. Základními experimentálními metodami studia molekulárních vibrací jsou infračervená (IČ) a Ramanova spektroskopie. Jsou založeny na dvou fyzikálně rozdílných jevech - absorpci v případě IČ spektroskopie a rozptylu v případě Ramanovy spektroskopie. Obě však umožňují studovat přechody mezi vibračními stavy molekul v základním elektronovém stavu [58-61] Výhody a nevýhody vibrační spektroskopie Výhody Ramanovy spektroskopie jako metody studia biologických molekul lze shrnout do několika bodů [58]: 29

31 (a) Jak Ramanova tak i IČ spektroskopie jsou nedestruktivní metody, takže po změření spekter je možno otestovat biologickou aktivitu studovaného vzorku, případně ho recyklovat pro další experimenty. (b) Metody vibrační spektroskopie lze použít na vzorky plynné, kapalné i pevné. V případě nukleových kyselin či proteinů to mohou být roztoky (vodné i nevodné), suspenze, gely, tenké vrstvy, vlákna či amorfní vzorky. Data získaná ze vzorku v daném morfologickém stavu jsou přenositelná na stejný vzorek v jiném morfologickém stavu. Metody vibrační spektroskopie tak umožňují přímé srovnání struktury proteinu v krystalu s jeho strukturou v roztoku. (c) Lze pracovat s relativně malým objemem vzorku (přibližně 10 mikrolitrů i méně v případě Ramanovy spektroskopie). (d) Ve srovnání s fluorescencí (10-9 s) a nukleární magnetickou rezonancí (10-6 s) probíhá Ramanův rozptyl ve velmi krátké časové škále (10-15 s). Vibrační spektroskopie je tedy vhodnou metodou studia dynamicky biologických procesů. V současnosti je k dispozici rozsáhlá databáze Ramanových spekter proteinů a NK, která je přenositelná na nově zkoumané systémy, včetně složitých molekulárních komplexů. Ramanova spektroskopie má ještě některé další výhody oproti IČ spektroskopii [58]: (e) Voda jako přirozené rozpouštědlo pro biomolekuly představuje jisté komplikace při měření IČ spekter, v Ramanových spektrech však díky slabému rozptylu může být její příspěvek snadno kompenzován. (f) Vysoké intenzity Ramanova rozptylu pocházejí od molekulárních vibrací vyvolávajících velkou změnu polarizovatelnosti molekuly. V nerezonančních Ramanových spektrech proteinů jsou zpravidla nejintenzivnější ty pásy, které odpovídají vibracím peptidových skupin polypeptidového řetězce, aromatickým postranním řetězcům a postranním řetězcům obsahujícím síru a karboxyl. Ramanovým spektrům NK dominují pásy odpovídající vibracím bází a fosfátových skupin páteře molekuly. (g) Intenzity Ramanova rozptylu mohou vzrůst až o několik řádů díky rezonančnímu zesílení, tzn. při excitaci zářením, jež je v rezonanci s elektronovým přechodem molekuly. Rezonanční zesílení umožňuje výrazně snížit koncentraci vzorku. Díky 30

32 selektivitě rezonančního zesílení lze takto získat informaci například o chromoforu zabudovaném v nějaké matrici (v jeho přirozeném okolí). Vibrační spektroskopie má samozřejmě i některé nevýhody [58]: (a) Z hlediska spektrálního rozlišení nemůže konkurovat nukleární magnetické rezonanci. Nedostatečné rozlišení lze však do jisté míry překonat pomocí chemické (izotopická záměna) či biologické (bodová mutace) modifikace studované biomolekuly. (b) Ramanův jev jako nepružný rozptyl je ve srovnání s absorpcí a emisí záření velmi slabý. Proto musí být věnována mimořádná péče přípravě vzorku a jeho čistotě. (c) Ačkoliv potřebný objem vzorku je relativně malý, vzorek musí být dostatečně koncentrovaný (typicky mikrogramů na mikrolitr) Vibrace makromolekul Normálními vibrace jsou takové vibrace molekuly, při nichž dochází k současným pohybům atomů nebo funkčních skupin v molekule se stejnou fází a frekvencí. Normální vibrace jsou na sobě nezávislé a nedochází při nich ke změně těžiště molekuly (např H 2 O). Biomakromolekuly jsou tvořeny velkým počtem atomů spojených chemickými vazbami, přičemž molekula jako celek podléhá vzájemným pohybům. Díky tomu, že molekula obvykle postrádá skutečnou symetrii, jsou všechny tyto normální vibrační módy schopny Ramanova přechodu. Většina vibračních módů je však úzce lokalizována a reprezentuje vibrace relativně malé skupiny atomů, která je potom označována jako skupinová vibrace. Atomy účastnící se dané skupinové vibrace vibrují ve fázi, nicméně amplitudy jejich výchylky z rovnovážné polohy se mohou lišit. Proto lze analyzovat v aproximaci danou skupinu atomů pouze na základě nejmarkantnějších amplitud. Při analýze Ramanových spekter je třeba brát v úvahu všechny příspěvky skupinových vibrací a zejména při studiu biomakromolekul je nezbytné ověřování polohy daných vibračních pásů příslušných komponent biomakromolekuly (Ramanova analýza dané molekuly, specializované výpočetní metody [62] atd.). 31

33 5.4. Objev a princip Ramanova rozptylu Teoretické předpovězení Ramanova rozptylu bylo v roce 1923 uskutečněno A. Smékalem. Objevení Ramanova rozptylu se datuje do roku 1928, kdy C. V. Raman objevil, že při ozáření vzorku intenzivním monochromatickým světlem lze ve spektru rozptýleného záření pozorovat kromě budící čáry i symetricky rozložené slabší linie. Vzdálenost těchto linií od centrální čáry, vyjádřená ve stupnici vlnočtů, je charakteristická pro rozptylující látku a nezávisí na vlnové délce budícího záření [59]. Jednou z možností popisující Ramanův rozptyl je kvantově mechanický model, který zahrnuje vlnově-částicovou povahu kvant záření, fotonů, a kvantování energetických hladin molekuly. Lze rozlišit několik variant celého procesu (obr. 13). Podstatou Ramanova jevu je zářivý přechod mezi stacionárními stavy jedné (1) a druhé (2) molekuly (obr. 13), způsobený interakcí s optickým zářením. Molekula interagující s fotonem budícího záření současně vyzařuje sekundární foton, jehož energie splňuje podmínku zachování energie : hv = hv 0 + (E 2 -E 1 ). Při přechodu 2-1 je ve vztahu znaménko +, při opačném přechodu znaménko -. Spektrum Ramanova rozptylu se tedy skládá z dvojic čar, které jsou symetricky rozloženy vůči čáře elasticky rozptýleného záření o frekvenci v 0. Oblast nižších frekvencí se nazývá Stokesovou a oblast vyšších frekvencí antistokesovou větví Ramanova rozptylu [59]. Rayleigh λsc = λex λsc λex λex Obr. 13: Schéma vzniku Ramanova rozptylu 32

34 Obr. 14: Schématické znázornění interakcí foton-molekula Ramanova spektra vznikají při ozáření látky monochromatickým zářením o vyšší energii než je energetický rozdíl mezi základními a excitovanými rotačními a vibračními energetickými hladinami molekul studované látky. Dopadající záření (soubor fotonů) interaguje s částicemi tak, že dochází ke srážkám, z nichž některé jsou pružné a jiné nepružné. Elastických srážek je převážná většina (10 6 : 1) a mají za následek pouze změnu směru fotonu a ne jeho energie. Pro vznik spektra jsou důležité srážky neelastické, při nichž dochází k přenosu energie. Narazí-li foton na molekulu v základním stavu, předá jí část své energie, čímž ji excituje do vyššího rotačního resp. vibračního stavu a sám se odrazí s nižší energií. Naproti tomu dojde-li ke srážce fotonu s molekulou, která je jíž excitována, tato se deexcituje a foton se odráží s energií vyšší (obr. 14). Protože za běžných podmínek je počet molekul v základním stavu větší než počet molekul ve stavu excitovaném, je Stokesova část spektra intenzivnější než antistokesova. Vzhledem k tomu, že populace vyšších vibračních stavů se řídí Boltzmanovým rozdělením (rov. 1), je procento molekul nacházejících se v tomto stavu malé. N 1 /N 0 = exp(-hυ vib /kt) (1) Rovnice 1: Vztah popisující Boltzmanovo rozdělení, kde N 0, N 1 jsou populace molekul v základním, respektive vyšším, vibračním energetickém stavu, h je Planckova konstanta, υ vib je vibrační frekvence, k je Boltzmanova konstanta a T je teplota [59]. 33

35 V praxi se proto obvykle měří jen polovina spektra, a to v oblasti Stokesově. Stupnicí je relativní vlnočet. Jako zdroje monochromatického záření se v současné době používají výhradně lasery. Rozptýlené záření se měří nejčastěji pod úhlem 90 ke směru incidentního záření, ve speciálních případech i pod úhlem 0 nebo 180. Jako detektor se používal chlazený fotonásobič, nyní se používá CCD kamera [59] Povrchem zcitlivěná Ramanova spektroskopie: SERS a SER(R)S Povrchem zcitlivěná rezonanční Ramanova spektroskopie SE(R)RS Resonanční Ramanova spektroskopie se používá ke studiu složitějších látek. U této metody se využívá rezonanční Ramanův efekt, který je založen na přiblížení vlnové délky záření k maximu absorpčního pásu vzorku. Dochází tak k růstu intenzity Ramanových pásů v některých případech až o tři řády Povrchem zcitlivěná Ramanova spektroskopie SERS V roce 1977 bylo na základě experimentů zjištěno, že zesílení Ramanových signálů o několik řádů je vyvoláno do té doby neznámým efektem, který byl označen jako povrchem zesílený Ramanův rozptyl (Surface-Enhanced Raman Scattering SERS). Tato metoda se dnes, mimo jiné, používá při analýze různých biologických systémů a molekul [60] Princip SERS V roce 1974 bylo poprvé pozorováno Ramanovo spektrum pyridinu adsorbovaného na stříbrné elektrodě [63]. Původní interpretace zesílených Ramanových signálů však nebyla správná. K poznání jevu došlo až o tři roky později a efekt byl nazván povrchem zesílený Ramanův rozptyl. Přestože se SERS používá už řadu let, přesný mechanismus této metody není ještě zcela znám [64]. Existují dvě hypotézy: elektromagnetická a chemická. Elektromagnetická se zabývá indukovaným dipólem p, který při Ramanově rozptylu vzniká působením elektromagnetického světelného pole E na molekulu s polarizovatelností α (p=eα). Tento jev 34

Opakování

Opakování Slabé vazebné interakce Opakování Co je to atom? Opakování Opakování Co je to atom? Atom je nejmenší částice hmoty, chemicky dále nedělitelná. Skládá se z atomového jádra obsahujícího protony a neutrony

Více

Optické spektroskopie 1 LS 2014/15

Optické spektroskopie 1 LS 2014/15 Optické spektroskopie 1 LS 2014/15 Martin Kubala 585634179 mkubala@prfnw.upol.cz 1.Úvod Velikosti objektů v přírodě Dítě ~ 1 m (10 0 m) Prst ~ 2 cm (10-2 m) Vlas ~ 0.1 mm (10-4 m) Buňka ~ 20 m (10-5 m)

Více

NUKLEOVÉ KYSELINY. Základ života

NUKLEOVÉ KYSELINY. Základ života NUKLEOVÉ KYSELINY Základ života HISTORIE 1. H. Braconnot (30. léta 19. století) - Strassburg vinné kvasinky izolace matiére animale. 2. J.F. Meischer - experimenty z hnisem štěpení trypsinem odstředěním

Více

Typy molekul, látek a jejich vazeb v organismech

Typy molekul, látek a jejich vazeb v organismech Typy molekul, látek a jejich vazeb v organismech Typy molekul, látek a jejich vazeb v organismech Organismy se skládají z molekul rozličných látek Jednotlivé látky si organismus vytváří sám z jiných látek,

Více

Chemická reaktivita NK.

Chemická reaktivita NK. Chemické vlastnosti, struktura a interakce nukleových kyselin Bi7015 Chemická reaktivita NK. Hydrolýza NK, redukce, oxidace, nukleofily, elektrofily, alkylační činidla. Mutageny, karcinogeny, protinádorově

Více

KOMPLEXY EUROPIA(III) LUMINISCENČNÍ VLASTNOSTI A VYUŽITÍ V ANALYTICKÉ CHEMII. Pavla Pekárková

KOMPLEXY EUROPIA(III) LUMINISCENČNÍ VLASTNOSTI A VYUŽITÍ V ANALYTICKÉ CHEMII. Pavla Pekárková KOMPLEXY EUROPIA(III) LUMINISCENČNÍ VLASTNOSTI A VYUŽITÍ V ANALYTICKÉ CHEMII Pavla Pekárková Katedra analytické chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Kotlářská 2, 611 37 Brno E-mail: 78145@mail.muni.cz

Více

10A1_IR spektroskopie

10A1_IR spektroskopie C6200-Biochemické metody 10A1_IR spektroskopie Petr Zbořil IR spektroskopie Excitace vibračních a rotačních přechodů Valenční vibrace n Deformační vibrace d IR spektroskopie N atomů = 3N stupňů volnosti

Více

Vybrané spektroskopické metody

Vybrané spektroskopické metody Vybrané spektroskopické metody a jejich porovnání s Ramanovou spektroskopií Předmět: Kapitoly o nanostrukturách (2012/2013) Autor: Bc. Michal Martinek Školitel: Ing. Ivan Gregora, CSc. Obsah přednášky

Více

VIBRAČNÍ SPEKTROMETRIE

VIBRAČNÍ SPEKTROMETRIE VIBRAČNÍ SPEKTROMETRIE (c) -2012 RAMANOVA SPEKTROMETRIE 1 PRINCIP METODY Měří se rozptýlené záření, které vzniká interakcí monochromatického záření z viditelné oblasti s molekulami vzorku za současné změny

Více

Nukleosidy, nukleotidy, nukleové kyseliny, genetická informace

Nukleosidy, nukleotidy, nukleové kyseliny, genetická informace Nukleosidy, nukleotidy, nukleové kyseliny, genetická informace Centrální dogma Nukleové kyseliny Fosfátem spojené nukleotidy (cukr s navázanou bází a fosfátem) Nukleotidy Nukleotidy stavební kameny nukleových

Více

Úvod do laserové techniky KFE FJFI ČVUT Praha Michal Němec, 2014. Plynové lasery. Plynové lasery většinou pracují v kontinuálním režimu.

Úvod do laserové techniky KFE FJFI ČVUT Praha Michal Němec, 2014. Plynové lasery. Plynové lasery většinou pracují v kontinuálním režimu. Aktivní prostředí v plynné fázi. Plynové lasery Inverze populace hladin je vytvářena mezi energetickými hladinami některé ze složek plynu - atomy, ionty nebo molekuly atomární, iontové, molekulární lasery.

Více

6. Nukleové kyseliny

6. Nukleové kyseliny 6. ukleové kyseliny ukleové kyseliny jsou spolu s proteiny základní a nezbytnou složkou živé hmoty. lavní jejich funkce je uchování genetické informace a její přenos do dceřinné buňky. ukleové kyseliny

Více

Typy nukleových kyselin. deoxyribonukleová (DNA); ribonukleová (RNA).

Typy nukleových kyselin. deoxyribonukleová (DNA); ribonukleová (RNA). Typy nukleových kyselin Existují dva typy nukleových kyselin (NA, z anglických slov nucleic acid): deoxyribonukleová (DNA); ribonukleová (RNA). DNA je lokalizována v buněčném jádře, RNA v cytoplasmě a

Více

Nekovalentní interakce

Nekovalentní interakce Nekovalentní interakce Jan Řezáč UOCHB AV ČR 3. listopadu 2016 Jan Řezáč (UOCHB AV ČR) Nekovalentní interakce 3. listopadu 2016 1 / 28 Osnova 1 Teorie 2 Typy nekovalentních interakcí 3 Projevy v chemii

Více

ABSORPČNÍ A EMISNÍ SPEKTRÁLNÍ METODY

ABSORPČNÍ A EMISNÍ SPEKTRÁLNÍ METODY ABSORPČNÍ A EMISNÍ SPEKTRÁLNÍ METODY 1 Fyzikální základy spektrálních metod Monochromatický zářivý tok 0 (W, rozměr m 2.kg.s -3 ): Absorbován ABS Propuštěn Odražen zpět r Rozptýlen s Bilance toků 0 = +

Více

SPEKTRÁLNÍ METODY. Ing. David MILDE, Ph.D. Katedra analytické chemie Tel.: ; (c) David MILDE,

SPEKTRÁLNÍ METODY. Ing. David MILDE, Ph.D. Katedra analytické chemie Tel.: ;   (c) David MILDE, SEKTRÁLNÍ METODY Ing. David MILDE, h.d. Katedra analytické chemie Tel.: 585634443; E-mail: david.milde@upol.cz (c) -2008 oužitá a doporučená literatura Němcová I., Čermáková L., Rychlovský.: Spektrometrické

Více

Nekovalentní interakce

Nekovalentní interakce Nekovalentní interakce Jan Řezáč UOCHB AV ČR 31. října 2017 Jan Řezáč (UOCHB AV ČR) Nekovalentní interakce 31. října 2017 1 / 28 Osnova 1 Teorie 2 Typy nekovalentních interakcí 3 Projevy v chemii 4 Výpočty

Více

Metody nelineární optiky v Ramanově spektroskopii

Metody nelineární optiky v Ramanově spektroskopii Metody nelineární optiky v Ramanově spektroskopii Využití optických nelinearit umožňuje přejít od tradičního studia rozptylu světla na fluktuacích, teplotních elementárních excitacích, ke studiu rozptylu

Více

Molekulová spektroskopie 1. Chemická vazba, UV/VIS

Molekulová spektroskopie 1. Chemická vazba, UV/VIS Molekulová spektroskopie 1 Chemická vazba, UV/VIS 1 Chemická vazba Silová interakce mezi dvěma atomy. Chemické vazby jsou soudržné síly působící mezi jednotlivými atomy nebo ionty v molekulách. Chemická

Více

Pokročilé cvičení z fyzikální chemie KFC/POK2 Vibrační spektroskopie

Pokročilé cvičení z fyzikální chemie KFC/POK2 Vibrační spektroskopie Pokročilé cvičení z fyzikální chemie KFC/POK2 Vibrační spektroskopie Vibrace molekul mohou být měřeny buď pomocí absorpce infračerveného záření, nebo pomocí neelastického rozptylu záření, tzn. Ramanova

Více

Fluorescence (luminiscence)

Fluorescence (luminiscence) Fluorescence (luminiscence) Patří mezi luminiscenční metody fotoluminiscence. Luminiscence efekt, kdy excitované molekuly či atomy vyzařují světlo při přechodu z excitovaného do základního stavu. Podle

Více

- Rayleighův rozptyl turbidimetrie, nefelometrie - Ramanův rozptyl. - fluorescence - fosforescence

- Rayleighův rozptyl turbidimetrie, nefelometrie - Ramanův rozptyl. - fluorescence - fosforescence ROZPTYLOVÉ a EMISNÍ metody - Rayleighův rozptyl turbidimetrie, nefelometrie - Ramanův rozptyl - fluorescence - fosforescence Ramanova spektroskopie Každá čára Ramanova spektra je svými vlastnostmi závislá

Více

Diskutujte, jak široký bude pás spojený s fosforescencí versus fluorescencí. Udělejte odhad v cm -1.

Diskutujte, jak široký bude pás spojený s fosforescencí versus fluorescencí. Udělejte odhad v cm -1. S použitím modelu volného elektronu (=částice v krabici) spočtěte vlnovou délku a vlnočet nejdlouhovlnějšího elektronového přechodu u molekuly dekapentaenu a oktatetraenu. Diskutujte polohu absorpčního

Více

INSTRUMENTÁLNÍ METODY

INSTRUMENTÁLNÍ METODY INSTRUMENTÁLNÍ METODY ACH/IM David MILDE, 2014 Dělení instrumentálních metod Spektrální metody (MILDE) Separační metody (JIROVSKÝ) Elektroanalytické metody (JIROVSKÝ) Ostatní: imunochemické, radioanalytické,

Více

Urychlení úpravy krvetvorby poškozené cytostatickou terapií (5-fluorouracil a cisplatina) p.o. aplikací IMUNORu

Urychlení úpravy krvetvorby poškozené cytostatickou terapií (5-fluorouracil a cisplatina) p.o. aplikací IMUNORu Urychlení úpravy krvetvorby poškozené cytostatickou terapií (5-fluorouracil a cisplatina) p.o. aplikací IMUNORu Úvod Myelosuprese (poškození krvetvorby) patří mezi nejčastější vedlejší účinky chemoterapie.

Více

MODIFIKACE DNA NOVÝMI PROTINÁDOROVĚ ÚČINNÝMI DVOJJADERNÝMI KOMPLEXY PLATINY A TERMODYNAMICKÁ ANALÝZA TĚCHTO MODIFIKACÍ

MODIFIKACE DNA NOVÝMI PROTINÁDOROVĚ ÚČINNÝMI DVOJJADERNÝMI KOMPLEXY PLATINY A TERMODYNAMICKÁ ANALÝZA TĚCHTO MODIFIKACÍ UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE MODIFIKACE DNA NOVÝMI PROTINÁDOROVĚ ÚČINNÝMI DVOJJADERNÝMI KOMPLEXY PLATINY A TERMODYNAMICKÁ ANALÝZA TĚCHTO MODIFIKACÍ AUTOR PRÁCE:

Více

Emise vyvolaná působením fotonů nebo částic

Emise vyvolaná působením fotonů nebo částic Emise vyvolaná působením fotonů nebo částic PES (fotoelektronová spektroskopie) XPS (rentgenová fotoelektronová spektroskopie), ESCA (elektronová spektroskopie pro chemickou analýzu) UPS (ultrafialová

Více

Základy Mössbauerovy spektroskopie. Libor Machala

Základy Mössbauerovy spektroskopie. Libor Machala Základy Mössbauerovy spektroskopie Libor Machala Rudolf L. Mössbauer 1958: jev bezodrazové rezonanční absorpce záření gama atomovým jádrem 1961: Nobelova cena Analogie s rezonanční absorpcí akustických

Více

Pevné lékové formy. Vlastnosti pevných látek. Charakterizace pevných látek ke zlepšení vlastností je vhodné využít materiálové inženýrství

Pevné lékové formy. Vlastnosti pevných látek. Charakterizace pevných látek ke zlepšení vlastností je vhodné využít materiálové inženýrství Pevné lékové formy Vlastnosti pevných látek stabilita Vlastnosti léčiva rozpustnost krystalinita ke zlepšení vlastností je vhodné využít materiálové inženýrství Charakterizace pevných látek difraktometrie

Více

Úvod do spektrálních metod pro analýzu léčiv

Úvod do spektrálních metod pro analýzu léčiv Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti Úvod do spektrálních metod pro analýzu léčiv Pavel Matějka, Vadym Prokopec pavel.matejka@vscht.cz pavel.matejka@gmail.com Vadym.Prokopec@vscht.cz

Více

13. Spektroskopie základní pojmy

13. Spektroskopie základní pojmy základní pojmy Spektroskopicky významné OPTICKÉ JEVY absorpce absorpční spektrometrie emise emisní spektrometrie rozptyl rozptylové metody Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti

Více

NMR spektroskopie. Úvod

NMR spektroskopie. Úvod NMR spektroskopie Úvod Zkratka NMR znamená Nukleární Magnetická Rezonance. Jde o analytickou metodu, která na základě absorpce radiofrekvenčního záření vzorkem umístěným v silném magnetickém poli poskytuje

Více

Toxikologie PřF UK, ZS 2016/ Toxikodynamika I.

Toxikologie PřF UK, ZS 2016/ Toxikodynamika I. Toxikodynamika toxikodynamika (řec. δίνευω = pohánět, točit) interakce xenobiotika s cílovým místem (buňkou, receptorem) biologická odpověď jak xenobiotikum působí na organismus toxický účinek nespecifický

Více

Chemická vazba. Příčinou nestability atomů a jejich ochoty tvořit vazbu je jejich elektronový obal.

Chemická vazba. Příčinou nestability atomů a jejich ochoty tvořit vazbu je jejich elektronový obal. Chemická vazba Volné atomy v přírodě jen zcela výjimečně (vzácné plyny). Atomy prvků mají snahu se navzájem slučovat a vytvářet molekuly prvků nebo sloučenin. Atomy jsou v molekulách k sobě poutány chemickou

Více

Chemická vazba. John Dalton Amadeo Avogadro

Chemická vazba. John Dalton Amadeo Avogadro Chemická vazba John Dalton 1766-1844 Amadeo Avogadro 1776-1856 Výpočet molekuly 2, metoda valenční vazby Walter eitler 1904-1981 Fritz W. London 1900-1954 Teorie molekulových orbitalů Friedrich und 1896-1997

Více

Fluorescenční rezonanční přenos energie

Fluorescenční rezonanční přenos energie Fluorescenční rezonanční přenos energie Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr 1 Přenos excitační energie Přenos elektronové energie se uskutečňuje mechanismy zářivými nebo

Více

Co nás učí nádory? Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav patologie FN Brno Přírodovědecká a Lékařská fakulta MU Brno

Co nás učí nádory? Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav patologie FN Brno Přírodovědecká a Lékařská fakulta MU Brno Co nás učí nádory? Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav patologie FN Brno Přírodovědecká a Lékařská fakulta MU Brno Brno, 17.5.2011 Izidor (Easy Door) Osnova přednášky 1. Proč nás rakovina tolik zajímá?

Více

SPEKTROSKOPIE NUKLEÁRNÍ MAGNETICKÉ REZONANCE

SPEKTROSKOPIE NUKLEÁRNÍ MAGNETICKÉ REZONANCE SPEKTROSKOPIE NUKLEÁRNÍ MAGNETICKÉ REZONANCE Obecné základy nedestruktivní metoda strukturní analýzy zabývá se rezonancí atomových jader nutná podmínka pro měření spekter: nenulový spin atomového jádra

Více

OPVK CZ.1.07/2.2.00/

OPVK CZ.1.07/2.2.00/ OPVK CZ.1.07/2.2.00/28.0184 Základní principy vývoje nových léčiv OCH/ZPVNL Mgr. Radim Nencka, Ph.D. ZS 2012/2013 Molekulární interakce SAR Možné interakce jednotlivých funkčních skupin 1. Interakce alkoholů

Více

Molekulární krystal vazebné poměry. Bohumil Kratochvíl

Molekulární krystal vazebné poměry. Bohumil Kratochvíl Molekulární krystal vazebné poměry Bohumil Kratochvíl Předmět: Chemie a fyzika pevných léčiv, 2017 Složení farmaceutických substancí - API Z celkového portfolia API tvoří asi 90 % organické sloučeniny,

Více

Skupenské stavy látek. Mezimolekulární síly

Skupenské stavy látek. Mezimolekulární síly Skupenské stavy látek Mezimolekulární síly 1 Interakce iont-dipól Např. hydratační (solvatační) interakce mezi Na + (iont) a molekulou vody (dipól). Jde o nejsilnější mezimolekulární (nevazebnou) interakci.

Více

10. Energie a její transformace

10. Energie a její transformace 10. Energie a její transformace Energie je nejdůležitější vlastností hmoty a záření. Je obsažena v každém kousku hmoty i ve světelném paprsku. Je ve vesmíru a všude kolem nás. S energií se setkáváme na

Více

Autoři: Pavel Zachař, David Sýkora Ukázky spekter k procvičování na semináři: Tento soubor je pouze prvním ilustrativním seznámením se základními prin

Autoři: Pavel Zachař, David Sýkora Ukázky spekter k procvičování na semináři: Tento soubor je pouze prvním ilustrativním seznámením se základními prin Autoři: Pavel Zachař, David Sýkora Ukázky spekter k procvičování na semináři: Tento soubor je pouze prvním ilustrativním seznámením se základními principy hmotnostní spektrometrie a v žádném případě nezahrnuje

Více

"Učení nás bude více bavit aneb moderní výuka oboru lesnictví prostřednictvím ICT ". Molekulární základy genetiky

Učení nás bude více bavit aneb moderní výuka oboru lesnictví prostřednictvím ICT . Molekulární základy genetiky "Učení nás bude více bavit aneb moderní výuka oboru lesnictví prostřednictvím ICT ". Molekulární základy genetiky 1/76 GENY Označení GEN se používá ve dvou základních významech: 1. Jako synonymum pro vlohu

Více

SPEKTROMETRIE. aneb co jsem se dozvěděla. autor: Zdeňka Baxová

SPEKTROMETRIE. aneb co jsem se dozvěděla. autor: Zdeňka Baxová SPEKTROMETRIE aneb co jsem se dozvěděla autor: Zdeňka Baxová FTIR spektrometrie analytická metoda identifikace látek (organických i anorganických) všech skupenství měříme pohlcení IČ záření (o různé vlnové

Více

Struktura proteinů. - testík na procvičení. Vladimíra Kvasnicová

Struktura proteinů. - testík na procvičení. Vladimíra Kvasnicová Struktura proteinů - testík na procvičení Vladimíra Kvasnicová Mezi proteinogenní aminokyseliny patří a) kyselina asparagová b) kyselina glutarová c) kyselina acetoctová d) kyselina glutamová Mezi proteinogenní

Více

Plazmové metody. Základní vlastnosti a parametry plazmatu

Plazmové metody. Základní vlastnosti a parametry plazmatu Plazmové metody Základní vlastnosti a parametry plazmatu Atom je základní částice běžné hmoty. Částice, kterou již chemickými prostředky dále nelze dělit a která definuje vlastnosti daného chemického prvku.

Více

Projekt SIPVZ č.0636p2006 Buňka interaktivní výuková aplikace

Projekt SIPVZ č.0636p2006 Buňka interaktivní výuková aplikace Nukleové kyseliny Úvod Makromolekulární látky, které uchovávají a přenášejí informaci. Jsou to makromolekulární látky uspořádané do dlouhých. Řadí se mezi tzv.. Jsou přítomny ve buňkách a virech. Poprvé

Více

Gymnázium, Milevsko, Masarykova 183 Školní vzdělávací program (ŠVP) pro vyšší stupeň osmiletého studia a čtyřleté studium 4.

Gymnázium, Milevsko, Masarykova 183 Školní vzdělávací program (ŠVP) pro vyšší stupeň osmiletého studia a čtyřleté studium 4. Vyučovací předmět - Chemie Vzdělávací obor - Člověk a příroda Gymnázium, Milevsko, Masarykova 183 Školní vzdělávací program (ŠVP) pro vyšší stupeň osmiletého studia a čtyřleté studium 4. ročník - seminář

Více

02 Nevazebné interakce

02 Nevazebné interakce 02 Nevazebné interakce Nevazebné interakce Druh chemické vazby Určují 3D konfiguraci makromolekul, účastní se mnoha biologických procesů, zodpovědné za uspořádání molekul v krystalu Síla nevazebných interakcí

Více

Hybridizace nukleových kyselin

Hybridizace nukleových kyselin Hybridizace nukleových kyselin Tvorba dvouřetězcových hybridů za dvou jednořetězcových a komplementárních molekul Založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA. Denaturace DNA oddělení komplementárních

Více

Vzdělávací materiál. vytvořený v projektu OP VK. Anotace. Název školy: Gymnázium, Zábřeh, náměstí Osvobození 20. Číslo projektu:

Vzdělávací materiál. vytvořený v projektu OP VK. Anotace. Název školy: Gymnázium, Zábřeh, náměstí Osvobození 20. Číslo projektu: Vzdělávací materiál vytvořený v projektu VK ázev školy: Gymnázium, Zábřeh, náměstí svobození 20 Číslo projektu: ázev projektu: Číslo a název klíčové aktivity: CZ.1.07/1.5.00/34.0211 Zlepšení podmínek pro

Více

Nukleové kyseliny Milan Haminger BiGy Brno 2017

Nukleové kyseliny Milan Haminger BiGy Brno 2017 ukleové kyseliny Milan aminger BiGy Brno 2017 ukleové kyseliny jsou spolu s proteiny základní a nezbytnou složkou živé hmoty. lavní jejich funkce je uchování genetické informace a její přenos do dceřinné

Více

Vazby v pevných látkách

Vazby v pevných látkách Vazby v pevných látkách Hlavní body 1. Tvorba pevných látek 2. Van der Waalsova vazba elektrostatická interakce indukovaných dipólů 3. Iontová vazba elektrostatická interakce iontů 4. Kovalentní vazba

Více

Elektromagnetické záření. lineárně polarizované záření. Cirkulárně polarizované záření

Elektromagnetické záření. lineárně polarizované záření. Cirkulárně polarizované záření Elektromagnetické záření lineárně polarizované záření Cirkulárně polarizované záření Levotočivé Pravotočivé 1 Foton Jakékoli elektromagnetické vlnění je kvantováno na fotony, charakterizované: Vlnovou

Více

Test vlastnosti látek a periodická tabulka

Test vlastnosti látek a periodická tabulka DUM Základy přírodních věd DUM III/2-T3-2-08 Téma: Test vlastnosti látek a periodická tabulka Střední škola Rok: 2012 2013 Varianta: A Zpracoval: Mgr. Pavel Hrubý Mgr. Josef Kormaník TEST Test vlastnosti

Více

Genetika zvířat - MENDELU

Genetika zvířat - MENDELU Genetika zvířat DNA - primární struktura Několik experimentů ve 40. a 50. letech 20. století poskytla důkaz, že genetický materiál je tvořen jedním ze dvou typů nukleových kyselin: DNA nebo RNA. DNA je

Více

Seznam otázek pro zkoušku z biofyziky oboru lékařství pro školní rok

Seznam otázek pro zkoušku z biofyziky oboru lékařství pro školní rok Seznam otázek pro zkoušku z biofyziky oboru lékařství pro školní rok 2014-15 Stavba hmoty Elementární částice; Kvantové jevy, vlnové vlastnosti částic; Ionizace, excitace; Struktura el. obalu atomu; Spektrum

Více

Balmerova série. F. Grepl 1, M. Benc 2, J. Stuchlý 3 Gymnázium Havlíčkův Brod 1, Gymnázium Mnichovo Hradiště 2, Gymnázium Šumperk 3

Balmerova série. F. Grepl 1, M. Benc 2, J. Stuchlý 3 Gymnázium Havlíčkův Brod 1, Gymnázium Mnichovo Hradiště 2, Gymnázium Šumperk 3 Balmerova série F. Grepl 1, M. Benc 2, J. Stuchlý 3 Gymnázium Havlíčkův Brod 1, Gymnázium Mnichovo Hradiště 2, Gymnázium Šumperk 3 Grepl.F@seznam.cz Abstrakt: Metodou dělených svazků jsme určili lámavý

Více

Radiobiologický účinek záření. Helena Uhrová

Radiobiologický účinek záření. Helena Uhrová Radiobiologický účinek záření Helena Uhrová Fáze účinku fyzikální fyzikálně chemická chemická biologická Fyzikální fáze Přenos energie na e Excitace molekul, ionizace Doba trvání 10-16 - 10-13 s Fyzikálně-chemická

Více

a) Primární struktura NK NUKLEOTIDY Monomerem NK jsou nukleotidy

a) Primární struktura NK NUKLEOTIDY Monomerem NK jsou nukleotidy 1 Nukleové kyseliny Nukleové kyseliny (NK) sice tvoří malé procento hmotnosti buňky ale významem v kódování genetické informace a její expresí zcela nezbytným typem biopolymeru všech živých soustav a)

Více

Fyzika IV Dynamika jader v molekulách

Fyzika IV Dynamika jader v molekulách Dynamika jader v molekulách vibrace rotace Dynamika jader v molekulách rotační energetické hladiny (dvouatomová molekula) moment setrvačnosti kolem osy procházející těžištěm osa těžiště m2 m1 r2 r1 R moment

Více

ZŠ ÚnO, Bratří Čapků 1332

ZŠ ÚnO, Bratří Čapků 1332 Animovaná chemie Top-Hit Analytická chemie Analýza anorganických látek Důkaz aniontů Důkaz kationtů Důkaz kyslíku Důkaz vody Gravimetrická analýza Hmotnostní spektroskopie Chemická analýza Nukleární magnetická

Více

FYZIKA MIKROSVĚTA. Mgr. Jan Ptáčník - GJVJ - Fyzika - Fyzika mikrosvěta - 3. ročník

FYZIKA MIKROSVĚTA. Mgr. Jan Ptáčník - GJVJ - Fyzika - Fyzika mikrosvěta - 3. ročník FYZIKA MIKROSVĚTA Mgr. Jan Ptáčník - GJVJ - Fyzika - Fyzika mikrosvěta - 3. ročník Mikrosvět Svět o rozměrech 10-9 až 10-18 m. Mikrosvět není zmenšeným makrosvětem! Chování v mikrosvětě popisuje kvantová

Více

7. Měření fluorescence při excitaci kontinuálním světlem ( steady-state )

7. Měření fluorescence při excitaci kontinuálním světlem ( steady-state ) 7. Měření fluorescence při excitaci kontinuálním světlem ( steady-state ) Steady-state měření Excitujeme kontinuálním světlem, měříme intenzitu emise (počet emitovaných fotonů) Obvykle nedetekujeme všechny

Více

Mezimolekulové interakce

Mezimolekulové interakce Mezimolekulové interakce Interakce molekul reaktivně vzniká či zaniká kovalentní vazba překryv elektronových oblaků, mění se vlastnosti nereaktivně vznikají molekulové komplexy slabá, nekovalentní, nechemická,

Více

ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE

ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE Atomová spektrometrie valenčních e - 1. OES (AES). AAS 3. AFS 1 Atomová spektra čárová spektra Tok záření P - množství zářivé energie (Q E ) přenesené od zdroje za jednotku času.

Více

ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE

ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE doc. Ing. David MILDE, Ph.D. tel.: 585634443 E-mail: david.milde@upol.cz (c) -017 Doporučená literatura Černohorský T., Jandera P.: Atomová spektrometrie. Univerzita Pardubice 1997.

Více

Zkušební okruhy k přijímací zkoušce do magisterského studijního oboru:

Zkušební okruhy k přijímací zkoušce do magisterského studijního oboru: Biotechnologie interakce, polarita molekul. Hydrofilní, hydrofobní a amfifilní molekuly. Stavba a struktura prokaryotní a eukaryotní buňky. Viry a reprodukce virů. Biologické membrány. Mikrobiologie -

Více

Luminiscence. emise světla látkou, která je způsobená: světlem (fotoluminiscence) fluorescence, fosforescence. chemicky (chemiluminiscence)

Luminiscence. emise světla látkou, která je způsobená: světlem (fotoluminiscence) fluorescence, fosforescence. chemicky (chemiluminiscence) Luminiscence Luminiscence emise světla látkou, která je způsobená: světlem (fotoluminiscence) fluorescence, fosforescence chemicky (chemiluminiscence) teplem (termoluminiscence) zvukem (sonoluminiscence)

Více

John Dalton Amadeo Avogadro

John Dalton Amadeo Avogadro Spojením atomů vznikají molekuly... John Dalton 1766 1844 Amadeo Avogadro 1776 1856 Výpočet molekuly 2, metoda valenční vazby Walter eitler 1904 1981 Fritz W. London 1900 1954 Teorie molekulových orbitalů

Více

2. Z následujících tvrzení, týkajících se prokaryotické buňky, vyberte správné:

2. Z následujících tvrzení, týkajících se prokaryotické buňky, vyberte správné: Výběrové otázky: 1. Součástí všech prokaryotických buněk je: a) DNA, plazmidy b) plazmidy, mitochondrie c) plazmidy, ribozomy d) mitochondrie, endoplazmatické retikulum 2. Z následujících tvrzení, týkajících

Více

REPLIKACE A REPARACE DNA

REPLIKACE A REPARACE DNA REPLIKACE A REPARACE DNA 1 VÝZNAM REPARACE DNA V MEDICÍNĚ Příklad: Reparace DNA: enzymy reparace nukleotidovou excizí Onemocnění: xeroderma pigmentosum 2 3 REPLIKACE A REPARACE DNA: Replikace DNA: 1. Podstata

Více

INTERPRETACE HMOTNOSTNÍCH SPEKTER

INTERPRETACE HMOTNOSTNÍCH SPEKTER INTERPRETACE HMOTNOSTNÍCH SPEKTER Hmotnostní spektrometrie hmotnostní spektrometrie = fyzikálně chemická metoda založená na rozdělení hmotnosti iontů v plynné fázi podle jejich poměru hmotnosti a náboje

Více

NUKLEOVÉ KYSELINY. Složení nukleových kyselin. Typy nukleových kyselin:

NUKLEOVÉ KYSELINY. Složení nukleových kyselin. Typy nukleových kyselin: NUKLEOVÉ KYSELINY Deoxyribonukleová kyselina (DNA, odvozeno z anglického názvu deoxyribonucleic acid) Ribonukleová kyselina (RNA, odvozeno z anglického názvu ribonucleic acid) Definice a zařazení: Nukleové

Více

Nebezpečí ionizujícího záření

Nebezpečí ionizujícího záření Nebezpečí ionizujícího záření Radioaktivita versus Ionizující záření Radioaktivita je schopnost jader prvků samovolně se rozpadnout na jádra menší stabilnější. Rozeznáváme pak radioaktivitu přírodní (viz.

Více

"Učení nás bude více bavit aneb moderní výuka oboru lesnictví prostřednictvím ICT ". Základy genetiky, základní pojmy

Učení nás bude více bavit aneb moderní výuka oboru lesnictví prostřednictvím ICT . Základy genetiky, základní pojmy "Učení nás bude více bavit aneb moderní výuka oboru lesnictví prostřednictvím ICT ". Základy genetiky, základní pojmy 1/75 Genetika = věda o dědičnosti Studuje biologickou informaci. Organizmy uchovávají,

Více

V organismu se bílkoviny nedají nahradit žádnými jinými sloučeninami, jen jako zdroj energie je mohou nahradit sacharidy a lipidy.

V organismu se bílkoviny nedají nahradit žádnými jinými sloučeninami, jen jako zdroj energie je mohou nahradit sacharidy a lipidy. BÍLKOVINY Bílkoviny jsou biomakromolekulární látky, které se skládají z velkého počtu aminokyselinových zbytků. Vytvářejí látkový základ života všech organismů. V tkáních vyšších organismů a člověka je

Více

Biologie buňky. systém schopný udržovat se a rozmnožovat

Biologie buňky. systém schopný udržovat se a rozmnožovat Biologie buňky 1665 - Robert Hook (korek, cellulae = buňka) Cytologie - věda zabývající se studiem buňek Buňka ozákladní funkční a stavební jednotka živých organismů onejmenší známý uspořádaný dynamický

Více

INTERPRETACE INFRAČERVENÝCH SPEKTER

INTERPRETACE INFRAČERVENÝCH SPEKTER INTERPRETACE INFRAČERVENÝCH SPEKTER Obecné základy nedestruktivní metoda strukturní analýzy měření přechodů mezi vibračními hladinami změna dipólového momentu během vibrace v=3 v=2 v=1 v=0 fundamentální

Více

LABORATOŘ OBORU I ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE (111) Použití GC-MS spektrometrie

LABORATOŘ OBORU I ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE (111) Použití GC-MS spektrometrie LABORATOŘ OBORU I ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE (111) C Použití GC-MS spektrometrie Vedoucí práce: Doc. Ing. Petr Kačer, Ph.D., Ing. Kamila Syslová Umístění práce: laboratoř 79 Použití GC-MS spektrometrie

Více

Tabulace učebního plánu. Obecná chemie. Vzdělávací obsah pro vyučovací předmět : Ročník: 1.ročník a kvinta

Tabulace učebního plánu. Obecná chemie. Vzdělávací obsah pro vyučovací předmět : Ročník: 1.ročník a kvinta Tabulace učebního plánu Vzdělávací obsah pro vyučovací předmět : CHEMIE Ročník: 1.ročník a kvinta Obecná Bezpečnost práce Názvosloví anorganických sloučenin Zná pravidla bezpečnosti práce a dodržuje je.

Více

Stručný úvod do spektroskopie

Stručný úvod do spektroskopie Vzdělávací soustředění studentů projekt KOSOAP Slunce, projevy sluneční aktivity a využití spektroskopie v astrofyzikálním výzkumu Stručný úvod do spektroskopie Ing. Libor Lenža, Hvězdárna Valašské Meziříčí,

Více

Lékařská chemie a biochemie modelový vstupní test ke zkoušce

Lékařská chemie a biochemie modelový vstupní test ke zkoušce Lékařská chemie a biochemie modelový vstupní test ke zkoušce 1. Máte pufr připravený smísením 150 ml CH3COOH o c = 0,2 mol/l a 100 ml CH3COONa o c = 0,25 mol/l. Jaké bude ph pufru, pokud přidáme 10 ml

Více

Přednášky z lékařské biofyziky Biofyzikální ústav Lékařské fakulty Masarykovy univerzity, Brno

Přednášky z lékařské biofyziky Biofyzikální ústav Lékařské fakulty Masarykovy univerzity, Brno Přednášky z lékařské biofyziky Biofyzikální ústav Lékařské fakulty Masarykovy univerzity, Brno 1 Přednášky z lékařské biofyziky Biofyzikální ústav Lékařské fakulty Masarykovy univerzity, Brno Struktura

Více

Ch - Elektronegativita, chemická vazba

Ch - Elektronegativita, chemická vazba Ch - Elektronegativita, chemická vazba Autor: Mgr. Jaromír Juřek Kopírování a jakékoliv další využití výukového materiálu je povoleno pouze s využitím odkazu na www.jarjurek.cz. VARIACE 1 Tento dokument

Více

Spektroskopické é techniky a mikroskopie. Spektroskopie. Typy spektroskopických metod. Cirkulární dichroismus. Fluorescence UV-VIS

Spektroskopické é techniky a mikroskopie. Spektroskopie. Typy spektroskopických metod. Cirkulární dichroismus. Fluorescence UV-VIS Spektroskopické é techniky a mikroskopie Spektroskopie metody zahrnující interakce mezi světlem (fotony) a hmotou (elektrony a protony v atomech a molekulách Typy spektroskopických metod IR NMR Elektron-spinová

Více

Luminiscence. Luminiscence. Fluorescence. emise světla látkou, která je způsobená: světlem (fotoluminiscence) chemicky (chemiluminiscence)

Luminiscence. Luminiscence. Fluorescence. emise světla látkou, která je způsobená: světlem (fotoluminiscence) chemicky (chemiluminiscence) Luminiscence Luminiscence emise světla látkou, která je způsobená: světlem (fotoluminiscence) fluorescence, fosforescence chemicky (chemiluminiscence) teplem (termoluminiscence) zvukem (sonoluminiscence)

Více

Jádro se skládá z kladně nabitých protonů a neutrálních neutronů -> nukleony

Jádro se skládá z kladně nabitých protonů a neutrálních neutronů -> nukleony Otázka: Atom a molekula Předmět: Chemie Přidal(a): Dituse Atom = základní stavební částice všech látek Skládá se ze 2 částí: o Kladně nabité jádro o Záporně nabitý elektronový obal Jádro se skládá z kladně

Více

Teorie chemické vazby a molekulární geometrie Molekulární geometrie VSEPR

Teorie chemické vazby a molekulární geometrie Molekulární geometrie VSEPR Geometrie molekul Lewisovy vzorce poskytují informaci o tom které atomy jsou spojeny vazbou a o jakou vazbu se jedná (topologie molekuly). Geometrické uspořádání molekuly je charakterizováno: Délkou vazeb

Více

Metody charakterizace nanomaterálů I

Metody charakterizace nanomaterálů I Vybrané metody spektráln lní analýzy Metody charakterizace nanomaterálů I RNDr. Věra Vodičková, PhD. Molekulová spektroskopie atomy a molekuly mohou měnit svůj energetický stav přijetím nebo vyzářením

Více

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE - kvalitativní i kvantitativní detekce v GC a LC - pyrolýzní hmotnostní spektrometrie - analýza polutantů v životním

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE - kvalitativní i kvantitativní detekce v GC a LC - pyrolýzní hmotnostní spektrometrie - analýza polutantů v životním HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE - kvalitativní i kvantitativní detekce v GC a LC - pyrolýzní hmotnostní spektrometrie - analýza polutantů v životním prostředí - farmakokinetické studie - kvantifikace proteinů

Více

Ramanova spektroskopie

Ramanova spektroskopie Ramanova spektroskopie Připomentuní elmag. záření Princip Neelastický rozptyl monochromatického záření Ramanův rozptyl je jev vznikající při interakci mezi fotony dopadajícího světla s atomy, kdy se předává

Více

POKUSY VEDOUCÍ KE KVANTOVÉ MECHANICE II

POKUSY VEDOUCÍ KE KVANTOVÉ MECHANICE II POKUSY VEDOUCÍ KE KVANTOVÉ MECHANICE II FOTOELEKTRICKÝ JEV VNĚJŠÍ FOTOELEKTRICKÝ JEV na intenzitě záření závisí jen množství uvolněných elektronů, ale nikoliv energie jednotlivých elektronů energie elektronů

Více

jádro a elektronový obal jádro nukleony obal elektrony, pro chemii významné valenční elektrony

jádro a elektronový obal jádro nukleony obal elektrony, pro chemii významné valenční elektrony atom jádro a elektronový obal jádro nukleony obal elektrony, pro chemii významné valenční elektrony molekula Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti seskupení alespoň dvou atomů

Více

Vazebné interakce protein s DNA

Vazebné interakce protein s DNA Vazebné interakce protein s DNA Vazebné možnosti vn jší vazba atmosféra + iont kolem nabité DNA vazba ve žlábku van der Waalsovský kontakt s lé ivem ve žlábku interkalace vmeze ení planárního aromat.

Více

IV117: Úvod do systémové biologie

IV117: Úvod do systémové biologie IV117: Úvod do systémové biologie David Šafránek 3.12.2008 Obsah Obsah Robustnost chemotaxe opakování model chemotaxe bakterií nerozliseny stavy aktivity represoru aktivita = ligandy a konc. represoru

Více