Vliv exprese různých mutantů proteinu MntH na regulaci vnitrobuněčného ph bakterie E. coli

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Matematicko-fyzikální fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Iva Doležalová Vliv exprese různých mutantů proteinu MntH na regulaci vnitrobuněčného ph bakterie E. coli Fyzikální ústav UK Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Eva Urbánková, Ph.D. Studijní program: Fyzika Název studijního oboru: Obecná fyzika Praha 2008

2 Prohlašuji, že jsem svou bakalářskou práci napsala samostatně a výhradně s použitím citovaných pramenů. Souhlasím se zapůjčováním práce a jejím zveřejňováním. V Praze dne Iva Doležalová 2

3 Obsah 1 Úvod Membránový transport Protein MntH Bakterie E. coli Pufrační kapacita a regulace vnitrobuněčného ph Využití pufrační kapacity při měření transportu protonů Metody měření Použité kmeny Materiál Pěstování bakterií E. coli Měření fluorescence Použitá kalibrace a výpočet vnitrobuněčného ph Určení pufrační kapacity Naměřené výsledky a diskuze Meření pufrační kapacity Pufrační kapacita a vnitrobuněčné ph mutantů Vztah mezi ph int a pufrační kapacitou Srovnání s předchozími výsledky Regulace ph v delším časovém úseku Kovem indukovaný transport protonů Seznam zkratek 31 5 Závěr 32 Literatura 33 3

4 Název práce: Vliv exprese různých mutantů proteinu MntH na regulaci vnitrobuněčného ph bakterie E. coli Autor: Ústav: Iva Doležalová Fyzikální ústav UK Vedoucí bakalářské práce: vedoucího: RNDr. Eva Urbánková, Ph.D. Abstrakt: Protein MntH (Proton-dependent Manganese transporter) je bakteriální protein patřící do rodiny Nramp (Natural resistence-associated macrophage protein), který zajišt uje průchod dvojmocných kovových iontů spolu s protony přes buněčnou membránu. Tato práce se zabývá kvantifikací pufrační kapacity cytosolu bakterie E. coli u kmenů exprimujících protein MntH a osm jeho jednobodových mutantů. Byly zvoleny kmeny, u kterých se snažíme mutací v klíčovém reziduu přiblížit skupině MntH C (A25G, A138D, M332R) nebo jiné podobné skupině (outgroup D34G, H211Y, H216A, N401G, N401T) [6]. Měření byla prováděna v pufrech o ph 4,7, 5,0 a 5,5. Pufrační kapacity a rovnovážné hodnoty vnitrobuněčného ph byly srovnány s kmenem bez exprese MntH. U žádného z kmenů exprimujících MntH (nebo jeho mutant) nebyla pufrační kapacita vyšší než u kontrolního kmenu, což dobře odpovídá předpokladu, že protein MntH částečně zprostředkuje tok protonů i v nepřítomnosti kovových iontů. Bylo zjištěno, že některé mutanty (M332R, N401G, N401T) tento odpřažený tok dále zesilují. Naměřená data budou v budoucnu sloužit ke kvantifikaci transportu protonů indukovaném dvojmocnými kovovými ionty. Klíčová slova: MntH, symport, ph, pufrační kapacita, fluorescence 4

5 Title: Regulation of intracellular ph of E. coli bacteria and the influence of expression of various MntH mutants Author: Department: Supervisor: Iva Doležalová Institute of Physics of Charles University RNDr. Eva Urbánková, Ph.D. Supervisor s address: eva.urbankova@mff.cuni.cz Abstract: Protein MntH (Proton-dependent Manganese transporter) is a bacterial protein, which belongs to the Nramp family (Natural resistence-associated macrophage protein). It provides the transport of divalent metal ions together with protons through the bacterial inner membrane. This work is concerned with quantification of the cytosol buffering capacity of bacteria E. coli of strains, which express protein MntH and eight its single-point mutations. We chose the strains carrying MntH mutations, which represent site-specific rate shifts to MntH C group (A25G, A138D, M332R) and to more distantly related sequences (outgroup D34G, H211Y, H216A, N401G, N401T) [6]. The measurements were performed in buffers of ph 4.7, 5.0 a 5.5. The buffering capacities and the equilibrium values of intracellular ph were compared to the strain without the expression of MntH. There was no buffering capacity of any strain expressing Mnth (or its mutant) higher than the buffering capacity of the control strain. This corresponds well to our hypothesis, that MntH limitedly transmits protons without the metal ions. It was detected, that some mutants (M332R, N401G, N401T) reinforce this proton flux. Measured values of buffering capacity will be used in quantification of the metal-induced proton transport in the future. Keywords: MntH, symport, ph, buffering capacity, fluorescence 5

6 1 Úvod Protein MntH (Proton-dependent Manganese transporter) je bakteriální protein patřící do rodiny Nramp (Natural resistence-associated macrophage protein). Proteiny z rodiny Nramp se vyskytují také v eukaryotických buňkách, tedy i u člověka, kde jsou spojeny s náchylností k některým infekčním chorobám [18]. Protein MntH napomáhá prokaryotickým buňkám navodit homeostázu kovových iontů. Tento protein byl popsán jako symportér kovových iontů Mn 2+, Fe 2+ s protony přes membránu bakteriálních buněk [6,13]. Stále není téměř nic známo o stechiometrii tohoto symportu ani o regulaci množství protonů, které je tímto sekundárně aktivním transportérem dopravováno do cytosolu. Pro kvantitativní popis funkce proteinu MntH je třeba mít k dispozici metodu, která umožňuje kvantifikovat transport protonů do buňky. Při transportu protonů do nebo z buňky dochází ke změně vnitrobuněčného ph (ph int ), pokud se jedná o takové množství, při kterém již buňka není schopná udržet ph int konstantní. Vnitřní ph můžeme měřit několika způsoby. Protože slabé kyseliny (nebo zásady) jsou schopné procházet přes bakteriální membránu jako nenabité molekuly a teprve uvnitř buňky disociují, jsou tak schopny se akumulovat v buňkách, které mají vyšší, resp. nižší, ph int než okolí. Vnitrobuněčné ph tedy můžeme určit zjištěním akumulace značených kyselin (resp. zásad) uvnitř buňky. Další možností je využití fluorescenčích sond. S objevem phluorinu (zeleného fluorescenčního proteinu citlivého na ph) se měření vnitrobuněčného ph stalo efektivnější a je také možné sledovat změny ph int v reálném čase [10]. Každá buňka se snaží své ph int aktivně regulovat. Tato vlastnost je dána pufrační schopností cytosolu a dále transportními procesy umožňujícími tok protonů z nebo do buňky. Buněčnou regulaci ph int můžeme charakterizovat pomocí hodnoty pufrační kapacity, která odráží vzájemný vztah mezi množstvím prošlých protonů do cytosolu, resp. vyloučených protonů z buňky, a tím způsobenou změnou ph int. K měření pufrační kapacity se také využívá slabých kyselin a zásad vzhledem k jejich schopnosti přepravit definované množství protonů přes membránu. Úkolem této bakalářské práce bylo změřit pufrační kapacitu bakterií exprimujících několik různých mutantů proteinu MntH v modelovém systému bakterie Escherichia coli. Konkrétně byla měřena pufrační kapacita kontrolního kmene bez exprese MntH, kmene exprimujícího MntH a jeho osm jednobodových mutantů (A25G, D34G, A138D, H211Y, H216A, M332R, N401G, N401T). Dále byla zjišt ována závislost pufrační kapacity na vnějším ph (ph ext ) a vztah mezi pufrační kapacitou a počátečním ph int bakterií. Také bylo zkoumáno, jak se chová hodnota vnitřního ph int bakterie po delším čase od přidání slabé kyseliny, tj. dlouhodobá regulace ph int a její ovlivnění mutanty MntH. 6

7 1.1 Membránový transport Buněčná membrána je tvořena dvojitou vrstvou fosfolipidů a proteiny. Je polopropustná (semipermeabilní) a nepropouští polární a nabité částice s výjimkou omezeného množství vody. Tyto látky tak musí být přeneseny některým z proteinů v její struktuře, protože jsou pro správnou funkci buňky nezbytné. Příkladem částic, které nemohou volně procházet přes membránu buňky, jsou i ionty některých kovů. Kovy jsou pro buňku nepostradatelné, uplatňují se jako kofaktory při redoxních reakcích, podílejí se na DNA syntéze, elektronovém či kyslíkovém transportu, na energetickém metabolismu nebo jako obrana proti oxidativnímu stresu [4]. Buňka se snaží zachovat si homeostázu dvojmocných kovů také proto, že některé kovy mohou být ve vyšších koncentracích toxické [5,13]. Pokud transport látky nevyžaduje dodání energie, označujeme ho jako pasivní. Mezi formy pasivního transportu patří např. difuze nebo usnadněná difuze, která je navíc podpořena přítomností proteinů v membráně. Velké částice jsou do buňky přenášeny pomocí cytózy. Pokud je třeba dodat energii, aby transport proběhl, označujeme ho jako aktivní. Tuto energii je třeba dodat příslušným membránovým proteinům. Jako primárně aktivní transport se označuje ten, při kterém se potřebná energie získává chemickou reakcí (např. hydrolýzou ATP). Při sekundárně aktivním transportu se energie získaná při umožnění průchodu jedné částice po spádu gradientu využije k transportu druhé částice směrem, který je energeticky nevýhodný. Pokud jsou částice přenášeny stejným směrem, je takový transport nazývaný symport (a daný protein je symporter), jsou-li přenášeny v opačných směrech, je to antiport a příslušný protein antiporter. Prokaryotické buňky si tvoří na plazmatické membráně elektrochemický gradient protonů, takzvanou protonmotivní sílu (obvykle značenou p), kterou využívají k tvorbě ATP (pomocí ATPázy) a jako hnací sílu pro transport různých látek. Protonmotivní síla je tvořena gradientem náboje uvnitř a vně buňky, tj. membránovým potenciálem, a gradientem ph (rozdíl ph uvnitř a vně buňky). Vytvářejí ji proteiny dýchacího řetězce (podobně je tomu v mitochondriích u eukaryotických buněk) nebo obrácení funkce H + -ATPázy (viz Obr. 1.3 ). Prokaryotické buňky využívají při sekundárně aktivním transportu přes plazmatickou membránu převážně protonmotivní sílu, zatímco eukaryotické buňky využívají spíše gradientu sodíku (např. pro symport glukózy a sodíku v tenkém střevě, nebo transport neurotransmitterů na synapsích). Gradient Na + je na membránách udržován Na K-ATPázou. Transportéry iontů jsou tedy důležité pro přísun dostatečného množství potřebných látek do buňky a zároveň hrají výraznou roli při regulaci jejich množství v cytosolu, aby nedošlo k nebezpečnému nárůstu jejich koncentrace v buňce nebo jejich kritickému nedostatku. Příkladem skupiny takových proteinů, které zajišt ují transport kovových iontů a protonů do buňky, je rodina Nramp. 7

8 1.2 Protein MntH Rodina Nramp (Natural resistence-associated macrophage protein) je skupina sekundárně aktivních transportérů kovových iontů. Jsou to membránové proteiny, které fungují jako symportéry dvojmocných kovových iontů s protony [13]. Homology proteinů z této rodiny byly objeveny u zástupců všech organismů, od archebakterií až po eukaryota [4,6]. Byly popsány dva proteiny Nramp (SLC11 SoLute Carrier 11) vyskytující se u savců; Nramp1 a Nramp2. Přítomnost proteinu Nramp1 ve více formách je spojena s odolností proti některým infekcím intracelulárními parazity (např. salmonela) [4,13]. U lidí jsou mutace genu Nramp1 spojeny s náchylností k infekčním chorobám jako je tuberkulóza, lepra, nebo zánětlivým nemocem jako revmatická artritida [18]. Protein Nramp2 se účastní absorpce železa a jeho mutace způsobuje mikrocytární anémii [4]. Také kvasinkové homology Nramp2 jsou potřebné k absorpci kovů a to nejen přes plazmatickou membránu [13]. Do rodiny Nramp patří i protein MntH (Proton-dependent Manganese transporter), což je bakteriální ortolog SLC11, který buňce zajišt uje homeostázu iontů některých kovů [4,13]. Tento bakteriální protein byl původně objeven a popsán jako transportér manganu závislý na protonovém gradientu (odtud název MntH), tedy symportér Mn 2+ (a Fe 2+ ) s protony [6,13]. Transportuje však i další dvojmocné kovové kationty, např. Cd 2+, Co 2+, Zn 2+, Cu 2+ a Ni 2+ [2,4]. Eukaryotické proteiny mají až na výjimky 12 transmembránových částí. Oproti tomu analýza sekvence prokázala, že prokaryotický protein MntH z E. coli jich má pouze 11, neobsahuje poslední transmembránový úsek. Jeho N-konec je umístěný v cytoplasmě a C-konec se nachází na periplazmatické straně membrány [5,6,13]. Topologie proteinu MntH je vidět na (Obr. 2.1 ). Bakteriální MntH proteiny můžeme rozdělit do tří fylogenetických skupin MntH A, B a C, přičemž MntH A zahrnuje homolog vyskytující se v bakterii Escherichia coli [5,6]. Díky podobné topologii a z důvodu příbuznosti tohoto proteinu k eukaryotním proteinům z rodiny Nramp představuje bakteriální protein MntH vhodný modelový systém pro strukturně- -funkční studie, a byl proto použit i v této práci [6,13]. 8

9 1.3 Bakterie E. coli Experimentální část této práce byla prováděna na bakteriích E. coli. Následující kapitola proto obsahuje základní informace o této bakterii a regulaci jejího vnitrobuněčného ph. Escherichia coli (viz Obr. 1.1 ) byla poprvé popsána Theodorem Escherichem v roce 1885, po němž byla také pojmenována [15,19]. V roce 1997 byl rozluštěn její úplný genom [16]. Je to gramnegativní bičíkatá tyčinkovitá bakterie žijící v tlustém střevě teplokrevných živočichů. Je jedním z nejdůležitějších zástupců střevní mikroflóry a její přítomnost je nezbytná pro správný průběh trávicích procesů ve střevě [17]. Schopnost vyrovnat se s kyselým vnějším prostředím umožňuje E. coli přežít v trávícím traktu svého hostitele, kde se může setkat jak s extrémně kyselým prostředím (ph menší než 3), tak s přítomností slabých kyselin. Jelikož jsou slabé kyseliny používány jako konzervační látky, má výzkum kyselé ph homeostázy bakterií význam i v potravinářském průmyslu [7]. Bylo ukázáno, že růst E. coli na kyselých substrátech vede k neutralizaci media, což svědčí o tom, že její metabolismus spotřebovává protony [1]. E. coli si zachovává ph int v rozmezí od 7,4 do 7,8 [7]. E. coli je dobře uzpůsobená pro život v nejrůznějších podmínkách, dokáže přežít a rozmnožovat se za přítomnosti kyslíku ale i bez něj [16]. Je proto velmi rozšířená, kromě lidského a zvířecího zažívacího traktu se vyskytuje také ve vodě, v půdě i v rostlinách [16]. Může však být také původcem nejrůznějších onemocnění rostlin, zvířat i lidí, např. některé patogenní kmeny E. coli mohou u člověka způsobit infekci močových cest, novorozeneckou meningitidu nebo střevní choroby [16,18]. E. coli je v současné době jednou z nejvíce prozkoumaných bakterií. Jedním z důvodů je, že ji lze snadno izolovat a kultivovat (případně i geneticky upravovat) [15,16]. Je používána jako důležitý modelový organismus v genetice a mikrobiologii, který je významný zvláště pro obecné modelové studium prokaryotických buněk [16]. Dále je významným nástrojem (pro svou relativní jednoduchost) používaným v biotechnologiích (např. pro konzervování požadovaných úseků DNA, přenos rekombinantní DNA pomocí konjugace do jiných organizmů), v lékařství nebo v ekologii [17]. Obrázek 1.1 Bakterie Escherichia coli pod elektronovým mikroskopem [19]. 9

10 1.4 Pufrační kapacita a regulace vnitrobuněčného ph Všechny buňky se snaží kontrolovat a udržovat si stabilní hladinu vnitřního ph, aby dosáhly homeostázy. Snaží se tak zajistit optimální podmínky například pro dýchání, dělení buněk, syntézu proteinů a nukleových kyselin či metabolické procesy [7]. Doposud se nepodařilo najít úplný popis toho, jak buňka reguluje ph int ani jak rozpozná vnější ph (popřípadě gradient ph), ačkoliv na ně i jejich změnu reaguje [7, 11]. Buňka si dokáže udržet stabilní ph int především proto, že cytoplazmatická membrána je relativně nepropustná pro protony a navíc má nízkou permeabilitu i pro kationty obecně [1,7]. Schopnost udržet si ph int téměř konstantní spolu se schopností buňky přijímat z okolí protony nebo je vyloučit, aniž by se vnitrobuněčné ph příliš změnilo, nazýváme pufrováním. V závislosti na kyselosti prostředí, v němž se buňka vyvíjí, se mění její biologické vlastnosti, a proto jsou všechny intracelulární kapaliny silně pufrovány, aby napomáhaly zajistit stálost vnitřního prostředí [1,7,11,13]. Pufrační kapacita cytoplazmy je u všech organismů velmi podobná a nezávisí na typu jejich metabolismu ani na rozmezí ph vhodného k růstu [1]. Na vnitrobuněčném pufrování se podílejí tři typy mechanismů. Především jsou to iontové reakce související s pufrační vlastností cytoplazmy (které jsou nejrychlejší). Dále je to odezva na metabolické a transportní procesy, které jsou však již pomalejší a často také vratné, a případně může mít vliv ještě pufrace organel [11]. Pufrování prvního typu funguje na následujícím principu. Po přísunu malého množství kyseliny nebo zásady do systému tato disociuje a množství přidaných iontů H + (protonů) resp. OH reaguje s přítomnými konjugovanými bázemi A resp. kyselinami HA bez výrazného vlivu na ph. Obecně je ph definováno následujícím vztahem ph = log[h + ], (1.1) kde [H + ] je aktivita, kterou lze u zředěných roztoků aproximovat koncentrací protonů. Regulaci vnitřního ph int popisujeme pufrační kapacitou β, jejíž obecnou definici popisuje vztah β = [A ] ph, (1.2) kde [A ] reprezentuje množství silné disociované kyseliny, kterou musíme přidat do roztoku, aby došlo ke změně ph, analogicky platí pro přidání silné báze [11]. Jednotkou pufrační kapacity je M/jednotka ph 1. Protože je logaritmus bezrozměrný a jednotky ph tedy nemají rozměr, bude v následujících kapitolách používáno M, resp. mm, jako jednotka pufrační kapacity β. Pro změření pufrační kapacity buněk potřebujeme způsobit přesnou změnu v koncentraci protonů uvnitř buňky a změřit následnou změnu ph int. Jednou z možností realizace této změny, aniž bychom příliš narušili fyziologický stav buňky, je vystavit buňky působení slabých kyselin nebo zásad. Ty jsou schopny procházet přes membránu jako nenabité částice, v cytoplazmě pak disociují a uvolňují tak protony (viz Obr. 1.2 ). V našem případě (ph int > ph ext ) jsme používali slabou kyselinu, protože ta bude pravděpodobněji disociovat ve vyšším ph uvnitř buňky než ve vnějším prostředí. K výpočtu proto dosadíme za [A ] hodnotu [A ] int, což je množství disociované slabé kyseliny uvnitř buňky, které se rovná množství uvolněných protonů. Množství slabé disociované kyseliny spočteme podle vztahu 1 tj. mol/1 [A ] int = K a[ha] celk [H + ] ext [H + ] int (K a + [H + ] ext ), (1.3) 10

11 kde K a je disociační konstanta, [HA] celk je celkové množství přidané kyseliny, [H + ] ext určíme ze známé hodnoty ph pufru a [H + ] int z naměřené hodnoty rovnovážného ph int (které se po přidání kyseliny skokově sníží a dosáhne tak nové rovnovážné hodnoty 2 podle definice ph (1.1). Detailní odvození vztahu (1.3) pro výpočet disociovaného množství kyseliny, které se aktivně podílí na změně vnitrobuněčného ph int, je viz např. [13]. Obrázek 1.2 Schéma průniku kyseliny do buňky a její disociace uvnitř buňky. Pro určení pufrační kapacity je tedy nutné změřit hodnotu ph int uvnitř buňky před a po přidání kyseliny. Je známo několik metod měření, např. zjištění akumulace značených kyselin a zásad uvnitř buňky [10] nebo pomocí nukleární magnetické rezonance. Další praktikovanou metodou je použití fluorescenčních sond, které jsou citlivé na ph [14]. Tyto sondy při navázání protonu změní své fluorescenční vlastnosti [14]. Při měření ph int u živých buněk však vyvstává problém, jak dostat fluorescenční sondu do buňky, aniž by byla poškozena nebo se změnily její vlastnosti, a jak ji tam udržet. Další z možností je měření se zeleným fluorescenčním proteinem (GFP). Tento protein byl objevený v medúze Aequoera victoria [20]. Systematickým mutováním byla objevena forma GFP, která reaguje na změnu ph tak, že je možné měřit ph poměrově. Tato ph citlivá forma byla označena jako phluorin [10]. Měření pomocí phluorinu umožňuje díky rychlým odezvám zjistit ph int buňky v reálném čase, čehož bylo využito i v této práci. Tato metoda je jen minimálně invazivní, protože protein je exprimován přímo v cytosolu buněk, kam byl umístěn plazmid s příslušnou genetickou informací [10]. Schéma transportu protonů a změny vnitrobuněčného ph s následnou odezvou phluorinu v kyselém prostředí ukazuje (Obr. 1.3 ). 2 Rovnováhou v živých buňkách rozumíme stav bezprostředně po skoku, tj. v řádu sekund po přidání kyseliny. Po delším časovém úseku se už tento stav nemusí jevit jako rovnovážný. V buňkách se totiž mohou projevit pomalejší mechanismy regulace ph int a může dojít i k metabolizaci kyseliny, což také ovlivní hodnotu vnitrobuněčného ph. 11

12 Obrázek 1.3 Schéma membránového transportu protonů a kovů, související změny vnitrobuněčného ph a příslušné reakce phluorinu v kyselém prostředí. Bez přítomnosti kovu se ustaví rovnováha (tj. ph int se nemění), které se účastní procesy transportující protony ven (proteiny dýchacího řetězce) a dovnitř (zde reprezentované H + -ATPázou). Po přidání kovu přispívá další proces transportující protony dovnitř pomocí MntH a ph int se začne zmenšovat. Předpoklad je, že konstantou úměrnosti mezi těmito navíc prošlými protony a změnou ph int je právě pufrační kapacita. 1.5 Využití pufrační kapacity při měření transportu protonů Pozorujeme-li změny ph int během transportního děje (v případě proteinu MntH je to kovem indukované okyselování cytosolu) a známe-li zároveň pufrační kapacitu buňky β, můžeme pomocí těchto dvou veličin určit i množství transportovaných protonů podle vztahu H + = β ph. (1.4) Tento vztah platí za předpokladu, že pufrační kapacita zůstává během pokusu konstantní a pozorované změny ph int nejsou příliš ovlivněny dlouhodobějšími regulačními ději. V kapitole 3.6 je ukázka aplikace tohoto postupu na skutečných datech. 12

13 2 Metody měření 2.1 Použité kmeny Použité bakteriální kmeny Escherichie coli nám byly zaslány z partnerské kanadské laboratoře (Prof. M. F. M. Cellier, INRS, Laval, Kanada). Buňky E. coli (kmen DH11S) byly geneticky upraveny tak, jak je popsáno v [4]. Z bakteriálních buněk byl vyňat gen nesoucí informaci o MntH a namísto něj byl vložen gen s rezistencí na kanamycin. Dále byl do buněk vpraven plazmid pbad s genem kódujícím původní MntH patřící E. coli ( divoký typ ) a rezistencí na ampilicin. Navíc byl do buněk implantován plazmid pgbm6-phl, který obsahuje gen pro phluorin [10] a gen pro rezistenci vůči spectinomycinu. Expresi phluorinu není třeba indukovat, expresi proteinu MntH indukuje L-arabinóza. Kmen nesoucí původní gen pro MntH je v dalším textu označován jako EcoliA, kontrolní kmen s plazmidem bez genu pro MntH je označován jako pbad. Další použité kmeny nesly gen pro MntH obsahující různé jednobodové mutace: N401T, N401G, M332R, D34G, H216A, H211Y, A25G, 138D. Následující obrázek MntH (Obr. 2.1 ) má vyznačená klíčová rezidua, na jejichž pozicích byla provedena tato záměna. Obrázek 2.1 Topologie proteinu MntH s vyznačenými rezidui, jejichž mutace byly zkoumány. Proteiny z rodiny Nramp patří do několika fylogenetických skupin, které jsou si navzájem podobné, ale můžou mít různé vlastnosti. Naše měření se soustředilo na dvě skupiny mutantů proteinu ze skupiny MntH A. Jednou se snažíme mutacemi v klíčových reziduích přiblížit skupině MntH C (A25G, A138D, M332R) a podruhé se snažíme přiblížit jiné podobné skupině, 13

14 kde však má tento protein zcela jinou funkci (H211Y, H216A, N401G, N401T) [6]. Tato měření nám mohou pomoci najít reziduum, jehož změna vedla ke klíčovému rozdílu ve funkčnosti proteinu v membráně a tedy i k rozdílům mezi jednotlivými skupinami. První zde zmíněná skupina mutantů ještě nebyla téměř měřena, s druhou skupinou mutantů se měří již delší dobu a bude tedy možné porovnat naše výsledky s již dříve naměřenými [6,8]. 2.2 Materiál V experimentu byly použity dva citrát-fosfátové pufry o ph 4,7 a 5,0. Citrát-fosfátový pufr byl vyroben smícháním 50 mm K 2 HPO 4 a 25 mm kyseliny citronové tak, aby směs měla požadované ph. Další pufr měl složení MES 0,02 M, KCl 30 mm, NaCl 70 mm, pufrováno bylo na ph 5,5 pomocí NaOH. Pro měření pufrační kapacity byla použita 13,4 mm kyselina propanová. 2.3 Pěstování bakterií E. coli Použité bakteriální kmeny byly uchovávány v konzervách při teplotách 20 C a 80 C. Z konzervy bylo malé množství buňek zaočkováno na sterilní agarovou misku, kde kultivační médium Luria Bertani (LB) obsahovalo 1% Bacto-trypton, 0,5% Bacto-yeast extrakt, 0,5% NaCl a 1,5% Bacto-agar. Dále byly přidány tři druhy antibiotik 0,003% kanamycin, 0,01% ampicilin a 0,01% spectinomycin vůči nimž jsou dané kmeny rezistentní. Miska se ponechá přes noc kultivovat při teplotě 37 C. Dále se misky uchovávají v lednici při 4 C po dobu nejvýše třiceti dnů. Z misky byla odebrána očkovací kličkou jedna kolonie bakterií, která byla zaočkována do 2 ml LB média s výše uvedenými antibiotiky a roztok byl třepán při teplotě 37 C přes noc. Následující den byly narostlé buňky zředěny stokrát do 10 ml nebo 20 ml LB média a ještě se 2 hodiny za stejných podmínek kultivovaly. Poté byla do roztoku přidána L-arabinóza na koncentraci 0,06 % a vše se třepalo jestě jednu hodinu. Všechny úkony s buňkami byly provedeny sterilně, tj. v blízkosti kahanu. Takto připravené narostlé buňky byly centrifugovány při frekvenci 5000 otáček/min. po dobu 2 minut a následně byly dvakrát promyty v pufru, který byl zvolen pro dané měření. Pro experiment byly použity jednorázové spektroskopické kyvety s objemem 3 ml. Aby byly výsledky porovnatelné, bylo nutné zajistit přibližně stejný počet buněk v každém vzorku. K tomu bylo využito spektrometru Novaspec III, jehož pomocí byla nastavena optická hustota buněčné suspenze při vlnové délce 600 nm na hodnotu 0,2. 14

15 2.4 Měření fluorescence K měření vnitrobuněčného ph bylo využito fluorescence phluorinu. Experimenty byly prováděny na spektrofluorimetru Fluoromax-2 (viz Obr. 2.2 ). K měření bylo použito poměru intenzit na dvou excitačních vlnových délkách 410 nm a 470 nm (emisní vlnová délka 520 nm), aby výsledná hodnota ph nebyla závislá na koncentraci phluorinu v buňkách v měřeném vzorku. Obrázek 2.2 Schéma měřicího přístroje Fluoromax-2. Jako zdroj záření byla použita xenonová lampa. Před každým měřením byla provedena kalibrace přístroje (emisního monochromátoru) pomocí Ramanova pásu vody, který je vždy ve stejné pozici vůči excitaci. Kvůli eliminaci případných nestabilit zdroje záření, které by mohly mít negativní vliv na výsledek měření, byly intenzity signálů z měřených excitačních vlnových délek ještě poděleny příslušnou intenzitou signálu z referenční diody. Výsledkem měření je tedy poměr odpovídající vnitrobuněčnému ph v daném čase (viz Obr. 2.3 ). 15

16 2.5 Použitá kalibrace a výpočet vnitrobuněčného ph K přepočtu naměrených hodnot poměru R na ph bylo použito kalibrační křivky, která byla naměřena v průběhu let Tato kalibrace byla měřena v pufrech o různém ph s přidáním protonoforu CCCP (carbonylcyanid-m-chlorophenylhydrazone), který zajistí propustnost membrány pro protony a dojde tak k vyrovnání vnitřního a vnějšího ph. Hodnoty byly fitovány pomocí vztahu (2.1). Hodnoty konstant (Tabulka 1 ) byly následně dosazeny do vztahu (2.1), resp. z něho odvozeného vztahu (2.2), odkud byla vypočtena výsledná hodnota vnitrobuněčného ph. R = I maxph n H K n H 0,5 + ph n H + konst, (2.1) ph = K n H 0,5 n H R konst I max + konst R. (2.2) I max 1,41 n H 13,03 K 0,5 7,6 konst 0,4 Tabulka 1: Kalibrační konstanty pro phluorin. 2.6 Určení pufrační kapacity Pro každý kmen bylo připraveno několik vzorků v kyvetách o objemu 3 ml s optickou hustotou 0,2 při 600 nm. Vnitrobuněčná pufrační kapacita byla měřena metodou přidávání slabých kyselin, takže ke každému vzorku bylo přidáno přesně definované množství kyseliny propanové. K jednotlivým vzorkům jsme přidali množství kyseliny pouze jednou, protože při opakovaném přidání změny ph int neodpovídaly přidanému množství kyseliny (viz kapitola 3.5). Po tomto přidání kyseliny do vzorku došlo ke skokovému poklesu poměru intenzit fluorescence phluorinu. Ve Fluoromaxu byl tedy naměřen odpovídající poměr úměrný průběhu změn ph int po dobu měření (ukázka viz Obr. 2.3 ). Tento poměr jsme podle kalibrace (vztah (2.2)) přepočítali na ph int. Z naměřeného průběhu jsme odečetli hodnotu skoku ph. Abychom z ní mohli vypočíst pufrační kapacitu, bylo potřeba znát ještě množství disociované kyseliny. Při znalosti ph ext (ph pufru) a změny ph int, po přepočtu přidaného množství kyseliny propanové na její celkovou koncentraci v kyvetě (3 ml) [HA] celk, jsme dosadili do vztahu (1.3) spolu se známou disociační konstantou K a = 1, Z výsledné hodnoty množství disociované kyseliny získáme za použití vztahu (1.2) výslednou pufrační kapacitu pro jeden každý vzorek pro daný mutant v určitém pufru. 16

17 přidána kyselina 1.2 ~ph 0 R 1.1 ~ ph int ~ph t [s] Obrázek 2.3 Příklad poklesu poměru intenzit fluorescence phluorinu ve spektrometru po přidání slabé kyseliny. 17

18 3 Naměřené výsledky a diskuze 3.1 Meření pufrační kapacity Měřili jsme pufrační kapacitu pro každý studovaný kmen v pufrech o ph 4,7 a 5,0 nejméně desetkrát alespoň ve dvou nezávislých kultivacích. Vybrané kmeny jsme otestovali i v pufru o ph 5,5 sedmkrát až osmkrát. Pro měření byla použita koncentrace kyseliny propanové ve vzorku od 44 µm do 263 µm. Pro 44 µm kyselinu propanovou však často nedocházelo k odpovídajícím změnám v poměru intenzit fluorescence, a proto byla později používána nejnižší koncentrace kyseliny ve vzorku 89 µm. Jednou možností kontroly vhodnosti zvolených koncentrací je linearita závislosti ph int na množství disociované kyseliny A int (viz Obr. 3.1, Obr. 3.2, Obr. 3.3 ). Jen v případě, že je tato závislost lineární, je možné použít vztah (1.2) a získat jednoznačně definovanou hodnotu pufrační kapacity. Protože buňka může některé protony nebo část přidané kyseliny metabolizovat a snažit se tak vrátit na své přirozené (počáteční) ph int, byl skok ph int odečten ihned po přidání kyseliny (viz Obr. 2.3 ), aby se vliv metabolismu bakteriálních buněk ještě nestihl projevit v našem měření ph int EcoliA pbad 4.7 Ecoli-A25G Ecoli-A138D 4.7 Ecoli-M332R A - int [M] Obrázek 3.1 Závislost množství disociované kyseliny A int na změně vnitrobuněčného ph v pufru o ph 4,7 s proloženými závislostmi. Úhel, který svírají proložené přímky s osou x odpovídá převrácené hodnotě pufrační kapacity 18

19 ph int EcoliA pbad Ecoli-M332R 5 Ecoli-N401T A - int [M] Obrázek 3.2 Závislost množství disociované kyseliny A int v pufru o ph 5,0 s proloženými závislostmi. na změně vnitrobuněčného ph ph int EcoliA Ecoli-D34G 5.5 Ecoli-H216A A - int [M] Obrázek 3.3 Závislost množství disociované kyseliny A int v pufru o ph 5,5 s proloženými závislostmi. na změně vnitrobuněčného ph 19

20 Z výše uvedených grafů (Obr. 3.1, Obr. 3.2, Obr. 3.3 ) je vidět, že zobrazené závislosti jsou skutečně lineární a námi zvolené koncentrace kyseliny propanové je tedy možné použít pro měření pufrační kapacity. 3.2 Pufrační kapacita a vnitrobuněčné ph mutantů Z naměřených dat poklesů ph int a množství disociované kyseliny A int jsme spočítali hodnoty pufrační kapacity β. Bylo naměřeno dostatečné množství hodnot, z nichž některé bylo nutné vyřadit. K vyřazení dat došlo například v případě, že se nepovedlo přidání kyseliny, vzorek byl již starší než hodinu, míchátko v kyvetě nefungovalo správně nebo nebyla nastavena správná optická hustota vzorku (např. u mutantu H211Y se tento poměr s časem měnil). Dodatečně jsme také zjistili plíseň v jednom z použitých pufrů, i proto jsme některá data označili jako neplatná. Stejně tak více než dvě přidání kyseliny k jednomu vzorku se neosvědčila, protože nedocházelo k odpovídajícím skokům (viz kapitola 3.5). Jedním z možných vysvětlení je, že buňky již část kyseliny metabolizovaly. V naší laboratoři se již měřila pufrační kapacita EcoliA a pbad (viz Tabulka 2 ). Tyto kmeny jsou tedy v této práci měřeny jako kontrolní. Námi naměřené hodnoty jsou konzistentní s již dříve naměřenými (jak je vidět při porovnání hodnot z Tabulky 2 a 3 ). Hlavním úkolem tedy bylo změřit ostatní mutanty a porovnat, jak se liší od těchto dvou kmenů. pufr ph 4,7 ph 5,0 kmen ph int σ phint β [mm] σ β [mm] ph int σ phint β [mm] σ β [mm] EcoliA 7,7 0, ,0 0,1 52,8 10 pbad 7,9 0, ,1 0,1 63,6 13 Tabulka 2: Dlouhodobé průměry pro kontrolní kmeny EcoliA a pbad. Ze souboru výsledných použitelných dat jsme pak spočítali aritmetický průměr pro každý mutant v každém pufru (viz Tabulka 3, Obr. 3.4 ). Pufrační kapacita se nejčastěji pohybuje mezi 30 mm a 50 mm. Nejvyšší pufrační kapacity dosahuje pbad v pufrech o ph 4,7 (52 mm) a 5,0 (67 mm). EcoliA dosahuje hodnoty 37 mm v ph ext 4,7 a 47 mm v ph ext 5,0 (viz Tabulka 3 ). Pro testování shody naměřených průměrných hodnot byl použit Studentův t-test (dvojvýběrový s různými rozptyly). Za hladinu významnosti jsme zvolili 5 %. Hladina významnosti pufrační kapacity kmenu A138D vůči pbad v ph 4,7 je 42 %, což je nad hraniční hladinou významnosti 5 %. Tato data tak můžeme interpretovat jako shodná. Dále se s pbad shoduje H211Y (17 %). Ostatní mutanty se s pbad v pufrační kapacitě v ph ext 4,7 neshodují. V tomto pufru se ale dobře shodují s hodnotou pufrační kapacity EcoliA kmeny N401T (85 %), N401G (40 %), H216A (40 %) a A25G (7 %). V tomto ph ext se neshoduje D34G téměř vůbec a M332R vůbec s žádným z referenčních kmenů, oba tyto kmeny mají nižší hodnoty pufrační kapacity než EcoliA, M332R ještě výrazněji. Ve vnějším ph 5,0 se s pbad shoduje pouze mutant H216A (20 %) v hodnotě pufrační kapacity, její hodnoty však byly velmi rozptýlené a shoda tak není příliš dobrá. S EcoliA se shodují mutanty A138D (32 %), H211Y (13 %) a H216A (13 %). S žádným z kontrolních kmenů se neshodují A25G (pouze 2 % s EcoliA), D34G, M332R a N401G, hodnoty jejich pufračních kapacit jsou nižší než hodnota pro EcoliA, M332R je opět nejníže z nich, nejvýše je A25G. Pufrační kapacita v MES pufru (ph 5,5; složení viz kapitola 2.2) byla měřena jen pro kmeny EcoliA, A138D, D34G a N401T. Nejvyšší hodnoty pufrační kapacity v tomto ph ext dosahuje EcoliA, nejnižší hodnotu má kmen N401T, což dobře odpovídá naměřeným hodnotám v ostatních ph ext, kde tento mutant také dosahoval jen nízkých hodnot pufrační kapacity. 20

21 pufr ph 4,7 ph 5,0 kmen ph int σ phint β [mm] σ β [mm] vzorků ph int σ phint β [mm] σ β [mm] vzorků EcoliA 7,7 0, ,9 0, A138D 7,6 0, ,8 0, A25G 7,8 0, ,1 0, D34G 7,83 0, ,92 0, H211Y 7,8 0, ,1 0, H216A 7,8 0, ,8 0, M332R 6,88 0, ,49 0, N401G 7,3 0, ,5 0, N401T 7,4 0, ,85 0, pbad 8,0 0, ,0 0, pufr ph 5,5 kmen ph int σ phint β [mm] σ β [mm] vzorků EcoliA 7,9 0, D34G 7,9 0, H216A 7,6 0, N401T 7,6 0, Tabulka 3: Průměrné hodnoty vnitřního ph int a pufrační kapacity β včetně chyb a počet průměrovaných vzorků pro jednotlivé mutanty v daných pufrech. Uvedené chyby jsou určeny jako průměry absolutních hodnot odchylek od střední hodnoty. H216A je hodnotou β nejblíže EcoliA, jen o něco menší hodnotu pufrační kapacity má D34G, což je analogické vzájemnému vztahu mezi těmito mutanty v pufru o ph 4,7. Obrázek 3.4 Hodnoty pufrační kapacity mutantů MntH ve třech různých pufrech, modré čáry jsou hodnoty pufrační kapacity pro EcoliA a pbad v pufru 4,7 a vínové vodorovné přímky jsou pro pufr 5,0; plné čáry jsou hodnoty mutantu EcoliA, přerušované čáry pro pbad, sloupce označené značkou + označují mutanty v daném ph ext, jejichž pufrační kapacita se statisticky významně liší od EcoliA. Protože vnitřní ph int bakterií je různé vzhledem k vnějšímu ph ext pufru, zajímaly nás i počáteční hodnoty vnitrobuněčného ph int (viz Tabulka 3, Obr. 3.5 ), abychom zjistili možný vliv exprimovaného MntH na ph int, na pufrační kapacitu a jejich vzájemný vztah. 21

22 Hodnota ph int se nejčastěji pohybuje mezi 7,5 a 7,9. Tři ze studovaných mutantů (M332R, N401G, N401T) měly signifikantně nižší ph int stejně v obou ph ext 4,7 a 5,0. Nižší ph int než EcoliA měl ještě kmen A138D v obou pufrech a v ph ext 5,0 kmen H216A (ten však měl výrazně rozptýlené hodnoty pro jednotlivá měření v tomto pufru). S hodnotou počátečního ph int se mezi EcoliA a pbad objebvil kmen D34G v obou pufrech, H211Y, A25G a H216A v ph ext 4,7. Dva z mutantů (A25G, H211Y) pak měly mírně (ale statisticky významně) zvýšené ph int v pufru 5,0; hodnoty jsou vyšší než pro pbad. Ve většině případů se s vyšším ph ext pufru zvýšila i hodnota pufrační kapacity, což odpovídá tomu, že vyšší ph ext je blíže optimálnímu vnitřnímu ph int buněk a ty si tak lépe tuto hodnotu udržují. Výjimku tvoří mutant A138D, který má obě hodnoty téměř stejné (viz Tabulka 3 ). Velmi výjimečný se zde ukazuje být mutant M332R, kde pozorujeme naprosto opačný trend, tj. s vyšším ph ext se snížila hodnota pufrační kapacity. Celkově je jeho pufrační kapacita nejnižší ze všech měřených mutantů. Při porovnání Studentovým t-testem bylo zjištěno, že v ph ext 4,7 se s pbad v počátečním ph int shoduje pouze H211Y, ale shoduje se také s EcoliA (79 %), protože jeho hodnoty jsou velmi rozptýlené, a Studentův t-test tak nevyloučil shodu ani s jedním z kmenů. V ph ext 5,5 dosahuje opět nejnižší hodnoty kmen N401T, v souladu s naším očekáváním, že bude z měřených kmenů nejníže jako v ostatních ph ext. Vyšší hodnotu má kmen H216A (stále pod hodnotou pro EcoliA). Tento kmen měnil hodnotu ph int v porovnání s EcoliA, v pufru 4,7 měl vyšší hodnotu než EcoliA, v 5,0 nižší. Mutant H216A se navíc chová odlišně, protože s rostoucím ph ext klesá jeho ph int. Tento jev nepozorujeme u žádného jiného kmenu, pouze u N401T se v ph ext 5,5 snížilo vnitřní ph pod hodnotu ph int v pufru 5,0. Vyšší hodnotu ph int než EcoliA v pufru 5,5 má mutant D34G, tento mutant měl vyšší ph int než EcoliA ve všech pufrech. Obrázek 3.5 Hodnoty ph int pro mutanty MntH ve třech různých pufrech, modré čáry jsou hodnoty ph int pro EcoliA a pbad v pufru 4,7 a vínové vodorovné přímky jsou pro pufr 5,0; plné čáry jsou hodnoty mutantu EcoliA, přerušované čáry pro pbad. 22

23 3.3 Vztah mezi ph int a pufrační kapacitou Hodnota vnitrobuněčného ph i hodnota pufrační kapacity úzce souvisí s regulací ph int. Zajímali jsme se tedy o vzájemný vztah obou veličin. I přes veškerou snahu o jednotné experimentální podmínky, pozorujeme u většiny kmenů poměrně velký rozptyl v hodnotách ph int. Není přesně známo, proč k tomuto jevu dochází, ale z grafů je vidět (např. pro mutant H216A Obr. 3.6 ), že např. pro dvě různé kultivace se může počáteční ph int lišit velmi výrazně. Zaznamenáním vztahu mezi počátečním vnitřním ph bakterií a jejich pufrační kapacitou pro jednotlivé vzorky v rámci jednoho kmene MntH (viz Obr. 3.6 ) můžeme zjistit, zda existuje nějaká přímá závislost těchto veličin. U většiny mutantů je pufrační kapacita na počátečním ph int zjevně nezávislá. V následujícím grafu (Obr. 3.6 ) jsou tyto nezávislé mutanty reprezentovány příkladem EcoliA ve dvou pufrech. Velmi podobně se jeví i ostatní nezobrazené kmeny. Pro některé mutanty se ale objevuje jistá závislost počátečního ph int na pufrační kapacitě, konkrétně pro typ N401G (pufr 4,7; Obr. 3.6 ). Při měření dat pro tuto práci byla naměřena závislost také pro mutant H216A v pufru 5,0 (je možné pozorovat slabou závislost i v ph ext 4,7). Tato závislost u tohoto mutantu nebyla ještě nikdy pozorována, a tak pro objasnění by bylo potřeba ještě tento mutant více prostudovat. Pokud se v grafu (např. Obr. 3.6 ) objeví tato závislost pufrační kapacity na počátečním ph int, pak se průměrováním hodnot dopouštíme chyby, protože jejich pufrační kapacita je ve skutečnosti charakterizována rovnicí v závislosti na počátečním ph int. Obrázek 3.6 Závislost počátečního ph int na pufrační kapacitě pro jednotlivá měření pro vybrané mutanty v daných pufrech. Mutanty, u kterých pozorujeme nižší ph int a pufrační kapacitu ve srovnání s kontrolou mají zřejmě nějak změněnou propustnost membrány pro protony. Protože se liší pouze membránovým proteinem MntH, popisujeme tedy jeho vliv na buňky. Navíc je o proteinech Nramp známo, že mohou značně měnit stechiometrii (tj. poměr mezi transportovanými kovy a protony) a v případě potřeby transportovat jen protony, což v důsledku může ovlivnit celkovou bilanci v tocích protonů (Obr ) a regulaci ph int. U mutantů M332R, N401G a N401T mohlo 23

24 tedy dojít ke zvýraznění této vlastnosti. Tyto kmeny mají velmi nízké ph int v obou pufrech, nižší než všechny ostatní. Mají i nižší pufrační kapacitu, ale kromě M332R žádný výrazněji. Hodnoty pro M332R jsou velmi nízké, zřejmě proto, že buňkám s nižším vnitrobuněčným ph se hůře regulují změny v ph int, a tak mohou mít i menší hodnotu pufrační kapacity. Je tedy možné, že M332R způsobuje zvýšenou propustnost membrány pro protony i v nepřítomnosti dvojmocných kovových iontů. Průměrné hodnoty pro všechny mutanty v ph ext 4,7 a 5,0 jsou vidět na (Obr. 3.7 ). Z obou grafů je patrná slabá závislost mezi oběma veličinami. Podle těchto grafů bychom mohli rozdělit mutanty do dvou skupin, na ty, které se nacházejí hodnotou pufrační kapacity mezi hodnotami pro kontrolní kmeny pbad a EcoliA, a tedy jimi způsobený na kovu nezávislý (tj. nespecifický) protonový tok je menší než u divokého typu EcoliA, a ty, které jsou pod hodnotou pro EcoliA, tj. jejich nespecifický protonový tok je větší než u EcoliA. Žádný mutant nedosahuje vyšší hodnoty pufrační kapacity než pbad, což je v souladu s naším předpokladem. Tento kmen totiž představuje negativní kontrolu, a pokud jsou rozdíly mezi mutanty skutečně způsobené funkcí MntH, pak musí jejich hodnoty být nižší než pro tento kontrolní kmen bez proteinu MntH. V obou pufrech se mezi hodnotami pro kontrolní kmeny objevuje mutant H211Y, A138D (v ph ext 4,7 je blíže pbad, v ph ext 5,0 je blíže EcoliA). V pufru 4,7 je ještě v této oblasti kmen A25G a v pufru 5,0 H216A (který má velmi rozptýlené hodnoty). Pod hodnotou pro EcoliA je vždy mutant M332R, který tvoří dolní hranici naměřených hodnot, pod níž už jiné mutanty nejsou. Hodnoty pufrační kapacity jen o velmi málo nižší než EcoliA mají N401T, N401G a D34G v obou pufrech. V pufru 4,7 je blízko EcoliA ještě H216A a v pufru 5,0 A25G. Všechny mutanty, které jsou pod hodnotou EcoliA jsou dostatečně blízko tomuto referenčnímu kmeni (kromě M332R). Kmeny, které jsou mezi EcoliA a pbad jsou již více rozptýlené (viz Obr. 3.7 ). Obrázek 3.7a Závislost ph int na pufrační kapacitě β v pufru o ph 4,7. 24

25 Obrázek 3.7b Závislost ph int na pufrační kapacitě β v pufru o ph 5, Srovnání s předchozími výsledky Ve srovnání s Chaloupka et al. [6] jsou výsledky ph int v ph ext 4,7 pro EcoliA (ph int 7,7) a H211Y (ph int 7,8) shodné, pro D34G jsme naměřili vyšší hodnotu než v [6] (7,75) a pro N401G a N401T (7,2 a 7,25) vyšší hodnoty. V porovnání s EcoliA mají však tyto kmeny v obou případech nižší hodnoty a kmen D34G vyšší hodnotu než EcoliA. Dále můžeme porovnat hodnoty počátečního ph int a pufrační kapacity s diplomovou prací E. Strakové [13]. Pro kmen EcoliA je počáteční ph int v pufru 4,7 shodné a pufrační kapacita je mírně nižší, ale v rámci chyby také shodná. V ph ext 5,0 je hodnota počátečního ph int opět v obou případech téměř stejná, ale výrazný rozdíl je v hodnotách pufrační kapacity. Zatímco v [13] vychází hodnota 75 mm, námi naměřené výsledky dávají hodnotu 47 mm, což je výrazně nižší. Při srovnání hodnot pro mutant N401G už dostáváme větší rozdíly, v [13] je ve vnějším ph 4,7 hodnota pro počáteční ph int výrazně nižší než jsou naše hodnoty a pufrační kapacita se sice v rámci chyby ještě shoduje, ale hodnotou je také nižší než v našem měření. Zde však může být zásadní námi naměřená závislost ph int na pufrační kapacitě a nelze tedy srovnávat průměrné hodnoty (ale spíše tvar závislosti). V ph ext 5,0 jsou naopak hodnoty velmi vysoké, jak pro ph int, tak pro pufrační kapacitu a vůbec se neshodují s našimi výsledky, podobně jako pro EcoliA v tomto pufru. Z již provedených měření v laboratoři FÚ UK vyplývá, že při indukci Cd2+ ve vnějším ph 5,0 mutant A25G nemění množství transportovaných protonů. Tomuto výsledku odpovídají i změřené hodnoty pufrační kapacity, které nejsou příliš rozdílné od hodnot pro EcoliA. Pro mutant A138D je množství transportovaných protonů s přidáním kovu vyšší než pro nemutovaný kmen MntH a pro M332R dochází u kovem indukovaného transportu k výrazně nižšímu toku protonů než u EcoliA, zatímco naměřené výsledky bez indukce kovem vypovídají o zvýšené propustnosti pro protony (zvýšený odpřažený transport protonů). Tuto interpretaci podporuje jak snížená hodnota pufrační kapacity, tak nižší ph int. Také v [6] byl zkoumán kovem indukovaný transport protonů. Bylo zjištěno, že mutant D34G při indukci Mn 2+ snižuje množství transportovaných protonů. Tento kmen měl v našem měření nižší pufrační kapacitu než EcoliA ve všech měřených ph ext. Dále se v [6] uvádí, že kmen H211Y dobře transportuje protony spolu s ionty Cd 2+, v našem měření měl tento mutant vyšší pufrační kapacitu než EcoliA. Pro N401G nastává zvýšení transportu při indukci Cd 2+, 25

26 ostatní kovy jsou transportovány méně, a při indukci Mn 2+ tento mutant proteinu MntH zřejmě zcela zastaví transport protonů a přenáší pouze kovové ionty. Je zde také zmíněno snížené ph int bakterií s touto mutací proteinu MntH a velká podobnost s mutantem N401T. To dobře odpovídá našim naměřeným datům, protože tyto mutanty měli jak nižší ph int než EcoliA, tak nižší hodnotu pufrační kapacity. V práci Mackenzie et al. [8] (měřen byl eukaryotický protein Nramp2) je zmíněna nezávislost transportu iontů Fe 2+ na vnějším ph pro mutant H216A. Měření probíhala ve vyšších ph ext než v našem měření a bylo naměřeno zvýšení toku protonů do buněk při přidání iontů Fe 2+. Na druhé straně byl pozorován i odpřažený tok protonů do buněk (bez kovu). Tyto výsledky nebyly ještě u nás potvrzeny (nezjistili jsme ani sníženou pufrační kapicitu, ani snížené ph int ) a tento jev tak může souviset i s rozdíly mezi MntH a Nramp2 nebo s rozdílnými experimentálními podmínkami. 26

27 3.5 Regulace ph v delším časovém úseku Při měření jsme si všímali i regulace ph int po jeho změně způsobené přidáním kyseliny propanové (Obr. 3.9 ). Po delším časovém úseku totiž buňka uplatní pomalejší mechanismy regulace a metabolismu. Část kyseliny se v některých případech může metabolizovat a hodnota ph int začne opět růst, buňka se totiž snaží vrátit k počáteční hodnotě svého vnitrobuněčného ph. Přebytečné protony se také mohou spotřebovat nějakou chemickou reakcí, či se zvýší metabolizmus a tím i aktivita dýchacího řetězce. Při většině měření tak hodnota ph int po přidání kyseliny nezůstává konstantní. Na počátku měření jsme zkoušeli i postupné přidávání kyseliny k jednomu měřenému vzorku. Pomocí regrese bychom dostali výsledek a nepotřebovali bychom k měření tolik vzorků bakterií. Po několika přidáních (i přes zvyšující se množství přidávané kyseliny) docházelo však ke stále menším změnám v ph int (nebyly již úměrné množství přidané kyseliny), a také se postupně snížila míra dlouhodobé regulace vnitrobuněčného ph (Obr. 3.8 ). Nemůžeme vyloučit, že je to vlivem relativně velkého množství kyseliny déle inkubovaného a metabolizovaného v buňce. 1,4 R 1,3 1,2 1,1 ~β = 54mM ~β = 89mM ~β = 136mM 1 0,9 0, t [s] Obrázek 3.8 Příklad regulace ph int v delším časovém úseku po několika přidáních kyseliny propanové k jednomu vzorku mutantu EcoliA v pufru o ph 5,0. V grafu jsou vyznačeny i hodnoty pufračních kapacit po jednotlivých přidáních. Průměrná kapacita pro tento kmen v daném pufru byla 47 mm. 27

28 ph in t 0,38 0,36 0,34 0,32 0,3 0,28 0,26 0,24 0,22 0,2 0,019 0,021 0,023 0,025 0,027 0,029 0,031 A - int Obrázek 3.9 Závislost A int na změně ph int pro vícenásobná přidání kyseliny propanové (EcoliA v ph ext 5,0). Na (Obr. 3.9 ) je vidět, že ani závislost změny ph int na množství disociované kyseliny zjevně není lineární, což také ukazuje na neodpovídající metodu měření, a je tedy správné, že tyto výsledky neuvažujeme a tento postup již dále nepoužíváme. Ke každému vzorku jsme tedy přidávali jen jednou přesně definované množství kyseliny propanové. Z naměřených výsledků jsme vybrali několik reprezentativních v ph ext 4,7 a ph ext 5,0. V obou případech je vidět, že mutant N401G reguluje ph int jen velmi pomalu a po skokové změně nemá téměř tendenci se vracet k původní hodnotě ph int (zvlášt po přidání většího množství kyseliny). Naopak pbad a EcoliA se vrací po skoku k původní hodnotě ph int velmi rychle. Z námi naměřených vzorků však není zcela jasné, který z nich má rychlejší tendenci, téměř v polovině případů se vrací rychleji EcoliA. Naší předpokladem je, že pokud buňka lépe reguluje vnitřní ph (tj. má větší ph int a větší pufrační kapacitu), mohla by být schopna vracet se rychleji k původní hodnotě ph int. Tento návrat však vůbec nemusí souviset s regulací vnitrobuněčného ph (může to být nějaký pomalejší efekt související s přítomností kyseliny propanové). 28

29 R pbad pbad EcoliA po přidání 133µM kyseliny propanové 220µM kyseliny 133µM kyseliny 220µM kyseliny EcoliA 133µM kyseliny N401G N401G 220µM kyseliny t [s] Obrázek 3.10 Příklady poklesů poměru R pro mutanty pbad, EcoliA a N401G po přidání určitého množství kyseliny propanové v pufru o ph 4,7. R pbad pbad EcoliA EcoliA N401G N401G 133µM 133µM kyseliny 220µM kyseliny 220µM kyseliny 133µM kyseliny kyseliny 220µM kyseliny t [s] Obrázek 3.11 Příklady poklesů poměru R pro mutanty pbad, EcoliA a N401G po přidání určitého množství kyseliny propanové v pufru o ph 5,0. V grafu na (Obr ) a (Obr ) jsou vidět nejen rozdílná počáteční ph int různých kmenů, ale také rozdílné hodnoty počátečního ph int pro vzorky stejného mutantu. 29