Stafylokoky obalene protilátkami. Mikroorganismus s příslušným antigenem

Transkript

1 Určeno pro diagnostické použití in vitro , Břez-06 Phadebact Streptococcus Tests (A,B,C,G) Phadebact Streptococcus Tests (A-D,F,G) Phadebact Streptococcus Tests (A-D,G) Phadebact Strep Respiratory Test (A,C,G) Phadebact Strep A Test Phadebact Strep B Test Phadebact Strep D Tests Phadebact Strep F Test NÁVOD K POUŽITÍ Výrobce: MKL Diagnostika AB (dříve BACTUS AB) Kung Hans Väg Sollentuna Švédsko Stafylokoky obalene protilátkami Ko-aglutinace Mikroorganismus s příslušným antigenem ROZSAH POUŽITÍ Phadebact Streptococcus Tests, Phadebact Strep Respiratory Test (A, C, G), Phadebact Strep A Test, Phadebact Strep B Test, Phadebact Strep D Tests, Phadebact Strep F Test jsou určené na identifikaci beta-hemolytických streptokoků patřících do skupin A, B, C, D, F a G. SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ TESTU Rozdělení beta-hemolytických streptokoků do skupin podle Lancefiledové je důležité kvůli léčbě a prognóze pacienta (1). V případě, že lékař dostane informaci o serologické skupině streptokoka, může pak zvolit správnou léčbu a vyhnout se nevhodnému použití antibiotik (2). Nejčastěji jsou s humánními streptokokovými infekcemi asociované streptokoky skupin A, B, C, D, F a G (3-9). Existuje několik metod na identifikaci streptokoků. Na předběžnou identifikaci se používají biochemické reakce a bacitracinový test. Definitivní identifikace poskytují precipitační metoda podle Lancefildové, imunoelektroforéza a latexová aglutinace. Avšak při těchto metodách je potřebná extrakce skupinově-specifických antigenů. Phadebact Streptococcus Test je založený na ko-aglutinační metodě (10), která umožňuje identifikaci streptokokových skupin A, B, C, D, F a G s použitím jednoduché a rychlé aglutinační metody. PRINCIP METODY Ko-aglutinační metoda: Protilátky získané od králíků a specifické proti streptokokovým skupinám A, B, C, D, F a G, jsou vázané na Protein A neživých stafylokoků. Pokud je vzorek obsahující streptokoky patřící do některé z těchto skupin a je smíchaná s těmito protilátkami, specifické antigeny na povrchu streptokoků se naváží na příslušnou specifickou protilátku. Vzniká ko-aglutinační salát viditelný pouhým okem.

2 REAGENCIE Každá Phadebact souprava na testování streptokoků obsahuje reagencie dostatečné na následující počet stanoveni. Produkt Počet stanoveni Phadebact Streptococcus Test (A, B, C, G) 300 Phadebact Streptococcus Test (A-D, F, G) 300 Phadebact Streptococcus Test (A-D, G) 250 Phadebact Strep Respiratory Test (A, C, G) 200 Phadebact Strep A Test 100 Phadebact Strep B Test 100 Phadebact Strep D 100 Test 100 Phadebact Strep D Test 50 Phadebact Strep F Test 50 Reagencie jsou modré (metylenová modrá), aby se ulehčila interpretace výsledků. Součásti testu Phadebact Streptococcus Test (A, B, C, G) - 1 lahvička pro každou skupinu A, B, C a G. Phadebact Strep A-D, F, G Test - 1 lahvička pro každou skupinu A, B, C, D, F a G. Phadebact Strep A-D, G Test - 1 lahvička pro každou skupinu A, B, C, D, a G. Phadebact Strep Respiratory Test (A, C, G) - 1 lahvička pro každou skupinu A, C a G. Phadebact kontrolní reagencie: Gamaglobulin z neimunizovaných králíků navázaný na neživé stafylokoky- 1 lahvička Phadebact Strep A Test Strep A reagencie: Skupinově specifické antiserum, získané od králíků, navázané na neživé stafylokoky 1 lahvička Phadebact kontrolní reagencie: Gamaglobulin z neimunizovaných králíků navázaný na neživé stafylokoky- 1 lahvička Phadebact Strep B Test Strep B reagencie: Skupinově specifické antiserum, získané od králíků, navázané na neživé stafylokoky 1 lahvička Phadebact kontrolní reagencie: Gamaglobulin z neimunizovaných králíků navázaný na neživé stafylokoky- 1 lahvička Phadebact Strep D 100 Test Strep D reagencie: Skupinově specifické antiserum, získané od králíků, navázané na neživé stafylokoky 2 lahvičky Phadebact kontrolní reagencie: Gamaglobulin z neimunizovaných králíků navázaný na neživé stafylokoky - 2 lahvičky Phadebact Strep D Test Strep D reagencie: Skupinově specifické antiserum, získané od králíků, navázané na neživé stafylokoky 1 lahvička Phadebact kontrolní reagencie: Gamaglobulin z neimunizovaných králíků navázaný na neživé stafylokoky - 1 lahvička Phadebact Strep F Test Strep F reagencie: Skupinově specifické antiserum, získané od králíků, navázané na neživé stafylokoky 1 lahvička Phadebact kontrolní reagencie: Gamaglobulin z neimunizovaných králíků navázaný na neživé stafylokoky - 1 lahvička Další součásti: Kapátka Jednorázové aglutinační karty Návod na použití Upozornění Pouze pro in vitro diagnostické účely! POZOR! Činidla obsahují azid sondý jako ochranné činidlo. Může reagovat s olovem a mědí za vzniku velmi explozivních kovových azidů. Pokud dojde k vylití, nalejte na plochu velké množství vody, abyste zabránili vzniku azidů. Dekontaminace podle pravidel jako např. u CDC (18) Příprava reagencií Reagencie jsou PŘIPRAVENÉ NA POUŽITÍ. Datum exspirace a skladování Datum exspirace je uvedený na vnějším obalu a na štítcích lahviček. Skladujte při teplotě 2-8 C. Nezmrazujte! Odběr vzorků a zpracování Odběr a zpracování vzorků se řídí standardními mikrobiologickými postupy. Vzorky na detekci se odebírají z jakýchkoli částí těla, kde mohou být přítomné živé bakterie. Při transportu vzorků do laboratoře by se měli použít transportní média, jako např. Stuartovo transportní médium. Vzorek by se měl dostat do laboratoře do hodin. V průběhu transportu a kultivace není nutné přidávat žádné aditiva nebo ochranné látky. Vzorky pacientů užívajících antibiotika mohou obsahovat velmi málo nebo žádné živé baktérie.

3 TEST Poskytnutý materiál viz REAGENCIE. Materiál, který je potřebný, ale není součástí testu Primární kultura Obohacený bujon (doporučený je Todd-Hewittův bujón od BBL) potřebný jen pro referenční bujonovou metodu Pasteurovy pipety Jednorázové kličky nebo jejich ekvivalent Inkubátor na C potřebný jen pro referenční bujonovou metodu Hodiny s jednoduchým odčítáváním minut Parametry metody Teplota reakce - pokojová teplota Celkový čas reakce - 1 minuta Objem reagencií jedna kapka na každou testovanou skupinu Příprava vzorků Příprava vzorků z primární kultury se řídí standardními mikrobiologickými postupy. Existují tři alternativy při přípravě vzorku u Phadebact Streptococcus testu. I. Příprava vzorků přímo z kolonií Zkontrolujte důsledně plotnu s primární kulturou na přítomnost beta-hemolytických kolonií. Odeberte 1-5 kolonií beta-hemolytických streptokoků jednorázovou kličkou nebo ekvivalentem v dostatečném množství tak, abyste je rozetřeli do 2 6 kroužků označených na kartičce. Tyto kolonie se použijí na testování II. Přímá extrakce kolonie Metoda přímé extrakce kolonie používá Phadebact extrakční roztoky nabízené fy. MKL Diagnostics. Metoda často využívá v případech kdy: - je přítomné nedostatečné množství vzorků na použití první alternativy (1-5 kolonií na reagencii). - výsledky při použití I. alternativy jsou nepřesvědčivé Poznámka! Při Strep D a Strep F se nepoužívá extrakce (doporučená je inokulace do bujonu). III. Inokulace do bujonu Zkontrolujte důsledně plotnu s primární kulturou na přítomnost beta-hemolytických kolonii. Odeberte 1 a víc kolonií beta-hemolytických streptokoků. Inokulujte do 2 ml obohaceného bujonu. Inkubujte pří C přes noc nebo dokud se nestane turbidita evidentní (odpovídá Mac-Farlandovej stupnici 2-3). Obvykle je dostatečný růst už po 4 hodinách, pokud se inkubuje několik kolonií v 0.5 ml obohaceného bujonu. Na testování se používají kapky této suspenze. Pracovní protokol Pořádně protřepejte roztoky před použitím. Všechny reagencie mají mít v čase použití pokojovou teplotu. Správné laboratorní postupy předpokládají znalost použití negativních a pozitivních kontrol tak, jako při jiných metodách

4 I. Test přímo z kolonie Na aglutinační kartě označte všechny ovály příslušnými vybranými testovacími skupinami. Důkladně a jemně rozetřete kolonie po celé ploše vnitřních kruhů označených oválů. Obrázek č.1 Kápněte 1 kapku vybrané reagencie na rozetřené kolonie v příslušně označeném ovále. Obrázek. č. 2 Obr. 1. Obr. 2. Použijte čisté dřevěné tyčinky nebo jednorázové kličky na úplné smíchání kapky reagencie s rozetřenou kolonií. Použijte na každý ovál novou tyčinku nebo kličku. POZOR! - papírové tyčinky mohou absorbovat reagencii, což může vést k nesprávné nebo žádné reakci.. - rozetření reagencie na větší plochu v rámci oválu než jsou rozetřené kolonie ve vnitřním kruhu umožňuje jednodušší odčítání reakce. Obrázek č.3 Uchopte kartičku do ruky a promíchávejte kývavým pohybem. Výsledek odčítejte do 1 minuty. Obrázek č.4. Obr. 4. Obr. 3. II. Metoda přímé extrakce kolonie Ze soupravy Phadebact Extraction Solutions smíchejte 4 kapky Extraction Solution 1 se 4 kapkami Extraction Solution 2 v malé zkumavce (např. o rozměrech 8 x 50 mm). Vyberte 1-3 kolonie beta-hemolytických streptokoků z primární kultury a smíchejte je s extrakční směsí. Inkubujte při pokojové teplotě minut nebo pri 100 C jednu minutu. Použijte Pasteurovu pipetu na kápnutí jedné kapky extrahovaných kolonií na každý oznacený ovál určený na testování na aglutinační kartě. Přidejte jednu kapku z každé Phadebact reagencie vybrané na testování vedle příslušně označených kapek s extrahovanými koloniemi. Použijte čisté dřevěné tyčinky nebo jednorázové kličky na úplné smíchání kapky reagencie s rozetřenou kolonií. Rozetřete kapky na plochu v rámci oválu větší jak rozetřené kolonie ve vnitřním kruhu. Ujistěte se, že jste důkladně smíchali reagencie s extrakčními roztoky v každém oválu. Použijte na každý ovál novou tyčinku nebo kličku. Chyťte kartičku do ruky a promíchejte kývavým pohybem. Výsledek odčítejte do 1 minuty. III. Referenční bujónový test Na aglutinační kartě označte každý ovál patřící k vybrané testované skupině. Kápněte jednu kapku bujónové kultury do malého vnitřního kruhu v každém označeném oválu. Přidejte jednu kapku z každé Phadebact reagencie vybrané na testování vedle kapek v příslušně označeném oválu. Použijte čisté dřevěné tyčinky nebo jednorázové kličky na úplné smíchání kapky reagencie s kapkami bujónové kultury. Rozetřete kapky na plochu v rámci oválu větší jako jsou rozetřené kolonie ve vnitřním kruhu. Ujistěte se, že jste důkladně smíchali reagencie s extrakčním roztokem v každém oválu. Použijte na každý ovál novou tyčinku nebo kličku. Chyťte kartičku do ruky a promíchejte kývavým pohybem. Výsledek odčítejte do 1 minuty. Stabilita výsledné reakční směsi Ko-aglutinace je stabilní, ale na základě standartních laboratorních postupů se výsledek odečítá do 1 minuty (může dojít k vysychání reagencií, které můžete mylně považovat za pozitivní reakci)

5 Kalibrace Kalibrace není nutná. Kontrola kvality Pozitívna kontrola Phadebact Strep Positive Controls poskytuje fy. MKL diagnostics. Souprava obsahuje oddělené lahvičky s antigenem z čisté kultury streptokoků skupiny A, B, C, D, F a G. Protože tyto antigeny jsou separované a purifikované, mohou se použít na testování specifičnosti a reaktivity Phadebact streptokokovych reagencií. Proto kontroly se živými mikroorganismy nejsou potřebné. Tyto pozitivní kontroly se testují tak, jako neznáme bakterie z bujónové kultury Alternativně se mohou použít standardní laboratorní kmeny streptokoků, např. Strep A (ATCC 19615), Strep B (ATCC 12401), Strep C (ATCC 9892), Strep D (ATCC 9812), Strep F (ATCC 12392) a Strep G (ATCC 12395). Negatívna kontrola Simultáním použití několika reagencií na testování kontrolního vzorku nebo neznámého vzorku se vytváří negativní kontrola. Jestliže neznámou baktérií je streptokok skupiny A, dojde k pozitivní ko-aglutinaci s reagencií A. S reagenciemi B, C, a G je výsledek negativní (žádná nebo signifikantně slabší reakce). Pokud se testuje jen s jednou reagencií např. u Phadebact Strep A testu, Phadebact Strep B testu, Phadebact Strep D testu nebo Phadebact Strep F testu, jako negativní kontrola se použije streptokok s jinou skupinou (kontrolní nebo laboratorní kmen). Vzhled reakce Žádná reakce Pozitivní reakce VÝSLEDKY Pozitivní výsledek Pozitivní výsledek je tedy, jestliže dojde k signifikantně silnější a o mnoho rychlejší reakci v jedné z reagencií v porovnání s ostatními. Phadebact kontrolní reagencie se musí použít i na ostatní testy. Negativní výsledek Negativní výsledek je tedy, jestliže nepozorujete žádnou reakci v kterékoli reagencii. Znamená to, že testované bakterie nepatří do skupiny A, B, C, D, F nebo G; nebo vzorek neobsahuje dostatek antigenního materiálu (viz LIMITY TESTU) Neinterpretovatelný výsledek Pokud je ko-aglutinace stejně intenzivní a rychlá s více skupinovými streptokokovými reagenciemi, čtěte více v kapitole LIMITY TESTU. LIMITY TESTU Streptokokové kmeny používané na produkci antiser rostou v Todd-Hewittovo bujóně firmy Difco. Proto není doporučené používat bujon Difco na růst vzorků, které jsou testované s Phadebact reagenciemi. Pokud jsou výsledky po vykonání testu přímo z kolonie nepřesvědčivé (I) kvůli nedostatečnému množství materiálu, doporučuje se zopakovat test pomocí volitelného testu přímé extrakce kolonie (II). Pokud jsou výsledky 4 hodinového bujonového testu (III) nepřesvědčivé kvůli nedostatečnému růstu, je doporučené bujon reinkubovat přes noc a znovu testovat podle návodu. Pokud dochází k stejně silné a rychlé ko-aglutinaci u více jako jedné streptokokové reagencie, doporučuje se test opakovat použitím volného testu přímé extrakce kolonie (II). Kmeny Listeria mají podobnou antigenicitu jako streptokoky skupiny B a mohou tedy reagovat pozitivně s reagencií skupiny B. Na odlišení Listerie od streptokoků skupiny B se používá katalázový test: streptokoky jsou kataláza-negativní a Listeria je kataláza-pozitivní. U Phadebact Strep D a Phadebact Strep F se nepoužívá test přímé extrakce kolonie (II).

6 HODNOTENIE TESTU Specifita a sensitivita I. Testování kolonií V klinických studiích (11,12) bylo správně identifikovaných 263 z 279 (94,3%) beta-hemolytických streptokoků. II. Testování bujonové kultury po 4 hodinové inkubaci Klinické studie (13,14,15) dokázali identifikovat v porovnání s metodou Lancefieldové 272 z 285 (95,4%) betahemolytických streptokoků po 4 hodinové inkubaci. III. Testování bujonové kultury po 24 hodinové inkubaci Klinicke studie (16,17) ukázaly, že 99% streptokoků bylo identifikovaných po 24 hodinové inkubaci (přes noc). Poznámka! Nesprávné výsledky se mohou objevit pokud se testují jiné jak beta-hemolytické streptokoky. Například, kmeny Streptococcus faecalis mohou slabě ko-aglutinovat s C reagencií. Streptococcus pneumoniae (Diplococcus pneumoniae) může koaglutinovat s C reagenciou, což je v souladu se známými podobnostmi mezi antigeny S. pneumoniae a streptokoky skupiny C. Reprodukovatelnost Reagencie, které se používají v tomto testu jsou pravidelně kontrolované použitím známých kmenů na zachování reprodukovatelnosti testu. ZÁRUKA Údaje, které jsou tu prezentované byly získané vykonáním testu podle návodu. MKL diagnostics nedoporučuje jakoukoli změnu nebo modifikaci, protože by mohlo dojít k ovlivnění výsledků. V tomto případě nenese MKL diagnostics žádnou odpovědnost a záruku, MKL dg a autorizovaní distributoři nenesou žádnou zodpovědnost za vzniknuté jakékoli škody, ať už přímé, nepřímé nebo následné. Literatura: 1. Moody M D: p 182 in Streptococci and streptococcal diseases. Eds. Wannamaker & Matsen. Academic Press (New York, London) Wadström T, Nord C-E, Lindberg A & Möllby R: Rapid grouping of streptococci by immunoelectrophoresis. Med Microbiol Immunol 159 (1974), Pollock, H M & Dahlgren B J: Distribution of streptococcal groups in clinical specimens with evaluation of bacitracin screening, Appl Microbiol 27 (1974), Horn K, Meyer W T, Wyrick B C & Zimmerman R A: Group B streptococcal neonatal infections. JAMA 230 (1974), Reid T M S: Emergence of group B streptococci in obstetric and perinatal infections. Br J Med (1975:2), Feingold D S, Stagg N L & Kunz L J: Extra-respiratory streptococcal infections. New Eng J Med 275 (1966),

7 Finnegan P, Fitzgerald M M, Cumming G & Geddes A M: Lancefi eld group C streptococcal endocarditis. Thorax 29 (1974), Baker C: Unusual occurence of neonatal septicaemia due to group G streptococcus. J Pediatr 53 (1974), Facklam R: Isolation and identifi cation of streptococci, part II. US. HEW/Public Health Service/Center for Disease Control/Atlanta Georgia Christensen P, Kahlmeter G, Johnson S & Kronvall G: New method for the serological grouping of streptococci with specifi c antibodies absorbed to protein A containing staphylococci. Inf Imm 7 (1973), Pillot S, Lebrun L & De Maneville M: Progress in the identifi cation of pathogenic Streptococcus. La Nouvelle Presse Medicale 6 (1977), Slifkin M, Engwall C, Pouchet G R: Direct-plate serological grouping of beta-hemolytic streptococci from primary isolation plates with the PhadebactR Streptococcus Test. J Clin Microbiol 7 (1978), Rosner R: Clinical evaluation of a rapid four hour serological grouping of groups A, B, C and G beta-streptococci using the PhadebactR Streptococcus Test. J Clin Microbiol 6 (1977), Farrel B & Amirak I: Agglutination grouping of streptococci. Lancet (1976:2), West M E and Jacobs P F: Abstract C 162, presented Annual Meeting American Society for Microbiology, Arvilommi H: Grouping of beta-hemolytic streptococci by using co-agglutination, precipitin or bacitracin sensitivity. Acta Path Microbiol Scand 84 (1976), Finch R G & Philips I: Serological grouping of streptococci by a slide co-agglutination method. J Clin Pathol 30 (1977), Manual Guide-Safety Management, No CDC-22, 4/30/76. Další výrobky: Phadebact COA System Phadebact Streptococcus Tests Phadebact Streptococcus Respiratory Test Phadebact Strep A Test Phadebact Strep B Test Phadebact Strep D Tests Phadebact Strep F Test Phadebact Strep Positive Controls Phadebact Pneumococcus Test Phadebact Haemophilus Test Phadebact GC Positive Controls Phadebact CSF Test Phadebact CSF Positive Controls Phadebact Extraction Solutions Phadebact Monoclonal GC Test Phadebact ETEC-LT Test Phadebact Salmonella Test Phadebact Staph Aureus Test Testování u pacienta Phadirect Strep A Phadirect Rapid CRP Test