ANALÝZA SLG GENU U ŘEPKY OLEJKY (BRASSICA NAPUS) METODOU PCR-RFLP

Transkript

1 ANALÝZA SLG GENU U ŘEPKY OLEJKY (BRASSICA NAPUS) METODOU PCR-RFLP *** Metoda PCR-RFLP kombinuje amplifikaci určitého specifického úseku genomové DNA a následné štěpení amplifikovaného produktu různými restrikčními endonukleázami. Po elektroforetické separaci na gelu lze detekovat polymorfismus uvnitř sekvencí, které se jinak v počtu bází příliš neliší. SLG (S-locus glycoprotein; NASRALLAH ET AL. 1985) Jedná se o gen, který se podílí na průběhu autoinkompatibilní reakce (zábrana samosprášení) u některých druhů rostlin z čeledi Brassiceae. Tento gen se nachází na tzv. S-lokusu. Je známo několik desítek variant SLG genu. Výsledky analýz SLG genu pomocí metody PCR-RFLP lze využít jako molekulární marker pro identifikaci autoinkompatibilních rostlin a odlišení jednotlivých haplotypů. SLG geny u rodu Brassica lze rozdělit do dvou tříd. SLG třídy I pocházejí z dominantních haplotypů, k jejich amlifikaci se používají primery PS5 a PS15. Po amplifikaci dostaneme produkt o velikosti asi bp. U Brassica napus se jedná o nefunkční gen, pravděpodobně v důsledku mutace. Naamplifikování tohoto genu z určitého haplotypu automaticky tedy znamená autokompatibilní fenotyp. K amplifikaci genů SLG II z recesivních haplotypů je nutné použít odlišné primery PS3 a PS21. Výsledkem je produkt o velikosti asi bp. Jedná se o funkční gen. Jednotlivé AI haplotypy mají odlišná štěpná místa pro jednotlivé restrikční endonukleázy v tomto SLG genu. PCR SLG of class I general reaction mixture for PCR (total 25 μl): 1,5 μl genomic DNA template ( 75 μg ) 2,5 μl 10 x PCR Buffer (TaKaRa) 2 μl dntp Mixture (TaKaRa) 0,25 μl (0,0125 nmol) primer PS 5 0,25 μl (0,0125 nmol) primer PS 15 1

2 0,2 μl (1 U) Taq DNA polymerase (TaKaRa) up to 25 μl (18,3 μl) sterillized distilled water SLG of class II general reaction mixture for PCR (total 25 μl): 3 μl genomic DNA template ( 150 μg ) 2,5 μl 10 x PCR Buffer (TaKaRa) 2 μl dntp Mixture (TaKaRa) 0,19 μl (0,0095 nmol) primer PS 3 0,19 μl (0,0095 nmol) primer PS 21 0,2 μl (1 U) Taq DNA polymerase (TaKaRa) up to 25 μl (16,92 μl) sterillized distilled water primers: sequences ( 5 3 ): PS 5 (for SLG of class I) ATG AAA GGC GTA AGA AAA ACC TA PS 15 (for SLG of class I) CCG TGT TTT ATT TTA AGA GAA AGA GCT PS 3 (for SLG of class II) ATG AAA GGG GTA CAG AAC AT PS 21 (for SLG of class II) CTC AAG TCC CAC TGC TGC GG termal cycling denature et 93 C for 1 min anneal et 58 C for 2 min polymerize et 72 C for 3 min (elongation) - this 3 temperatures repeat 35 times 4 C until gel electrophoresis or restriction 2

3 RFLP restriction enzymes: EcoR I, Mbo I, Msp I, Afa I (Rsa I) reaction: 22 μl PCR 2,5 μl 10 x reaction Buffer 0,5 1 μl enzyme ( 5 U) ± 1 μl 0,02 % BSA reaction temperature : 37 C for 4 hrs (in thermocycler) Agarose gel electrophoresis preparation of 2 % gel: 2 g of agarose ml of 1 x TBE (or TAE) buffer heat up until the agarose melts competely cool down (60 C) and add 2 μl of ethidium bromid solution (0,2 μg/ml of gel) and mix 3. pour the cooled, liquified agarose into the gel mold, put the wells and allow it to solidify loading : 25 μl PCR after restriction add 4 μl loading buffer (0,25 % bromophenol blue and 40 % (w/v) sucrose in H 2 O) and mix 2. load DNA with loading buffer in the wells by pipetting 3. include one (or two) lane of DNA molecular-weight markers ( 1μl of 100 bp λ markers + 20 μl H 2 O + 4 μl loading buffer) electrophoresis: Add a sufficient volume of the 1 x buffer (TAE or TBE) to the electrophoresis chambe to cover the gel 1 2 mm. Perform electrophoresis at 30 V for 30 min and then at 80 V for 2,5 3 hrs. Visualization Place the gel on UV light box and photograph. 3

4 Ukázka fotografie PCR-RFLP genu SLG: (amlifikace genu SLG třídy I, štěpení restriktázou Mbo I, separace na 2 % agarózovém gelu) 4

5 PCR-RFLP ANALÝZA U MYKORHIZNÍCH HUB *** Extrakce DNA se provádí pomocí kitu DNeasy Plant Mini Kit QIAGEN podle standardního protokolu.vzorky DNA jsou uchovávány při -20 C. Pro PCR se používají univerzální primery ITS1 a ITS4: ITS1 (5 3 ) - TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS4 (5 3 ) - TCCTCCGCTTATTGATATGC (White et al. 1990). Schéma pipetování PCR reakce (TAKARA): 2,5 µl reakčního pufru 0,5 µl dntps 0,25 + 0,25 µl primeru (ITS1, ITS4) 0,2 µl DNA polymerázy 1 µl DNA dh 2 O voda do objemu 25 µl Amplifikace DNA probíhá v termocykleru PTC (MJ RESEARCH) s následujícími parametry: 94 C (2 min) pro počáteční separaci DNA řetězců a 35 cyklů: 94 C (30 sek.) - denaturace, 62 C (3 min) - annealing primerů, 72 C (1 min) - elongace. Termální cyklus je zakončen elongační teplotou 72 C (10 min). Amplifikované PCR produkty jsou použity pro RFLP analýzu. Digesce amplifikovaných fragmentů DNA je prováděna pomocí různých restrikčních endonukleáz (MboI, HinfI a EcoRI) tak, že 15 µl PCR produktu je smícháno s 2 µl bufferu, 0,5 µl restrikční endonukleázy a doplněno 2,5 µl H 2 O do konečného objemu 20 µl. Směs je inkubována v termocykleru 6 hod při 37 C. Produkty po štěpení jsou separovány pomocí PAGE (10% polyakrylamidový gel v TBE pufru) a detekovány ethidium bromidem. Doba trvání elektroforézy je 6 hodin při napětí 150 V. Gely jsou fotografovány pod UV světlem. Získané elektroforeogramy jsou zpracovávány pomocí speciálního software - BioProfil 1D+ pro vyhodnocování molekulárních dat. 5

6 AFLP ANALÝZA *** Technika AFLP (Amplification Fragment Lenght Polymorphism - polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů) je modifikací RFLP, která pro konečné zviditelnění fragmentu používá PCR. Dochází tak ke kombinaci specifičnosti restrikčního štěpení se snadností PCR. Tato metoda spočívá v selektivní amplifikaci sub-souboru restrikčních fragmentů po štěpení celkové genomové DNA restrikčními enzymy. Polymorfismus se zjišťuje na základě rozdílů ve velikosti amplifikovaných fragmentů po separaci na PAGE. Oproti metodám RFPL a RAPD má řadu výhod, mezi nejdůležitější patří generování velkého množství markerů. Kromě využití pro identifikaci genotypů kulturních rostlin je cílena zejména pro účely mapování významných kvalitativních a kvantitativních znaků. Tato metoda nachází uplatnění také při studiu biodiverzity a přípravě markerů. AFLP generuje dominantní markery a představuje velký počet signálů v jedné reakci. 6

7 AFLP protokol Pozn. Označení STOP krok znamená, že v tomto kroku je možné sled reakcí přerušit. Polymeráza není součástí kitu. 1. Restikční štěpení genomické DNA komponenty kontrola μl vzorky μl 5X reakční pufr 5 5 kontrolní DNA rajčete (100ng/μl) 2,5 - DNA vzorku (250ng v 18μl) - 18 EcoR I/Mse I 2 2 destilovaná voda 15,5 doplnit 25 celkový objem μl Všechny komponenty smícháme v 1,5 ml eppendorfce a krátce centrifugujeme. Vzorky necháme inkubovat 2 h při 37 C. Po inkubaci zahřejeme vzorky na 15 min. na 70 C, aby došlo k inaktivaci restrikčních enzymů. Vzorky dáme na led a po té krátce centrifugujeme. 2. Ligace adaptorů Ke vzorkům po restikčním stěpení přidáme: komponenty objem μl adapter ligation solution 24 T4 DNA ligase 1 Vzorky promícháme při pokojové teplotě, krátce centrifugujeme a potom inkubujeme 2 h při 20 C. Ředění 1:10 Ze vzorků po ligaci odebereme 10μl reakční směsi a přidáme 90μl TE pufru, dobře promícháme. Zředěné i nezředěné vzorky uchováváme při 20 C pro další použití. STOP krok 7

8 3. Preamplifikační reakce komponenty objem μl zředěný templát DNA 5 pre-amp primer mix 40 10X PCR pufr plus Mg 5 Taq DNA polymeráza (5U/μl) 1 celkový objem μl 51 Vzorky promícháme, krátce centrifugujeme a dáme preamplifikovat (program AFLP 1). Reakční cyklus: 20 cyklů: 94 C 30s 56 C 60s 72 C 60s Ředění 1:50 Ze vzorků po preamplifikaci odebereme 3μl reakční směsi a přidáme 147μl TE pufru, dobře promícháme. Zředěné i nezředěné vzorky uchováváme při 20 C pro další použití. STOP krok 4. Selektivní AFLP amplifikace Pozn. Pro neradioaktivní detekci nepoužíváme značení primerů radioaktivním fosforem 32 P nebo 33 P, ale ředíme primer EcoR I. Ředění primeru EcoR I: odebereme 18μl primeru a přidáme 32μl destilované vody. Mix 1 (na 10 vzorků) komponenty objem μl ředěný primer EcoR I 5 Mse I primer 45 celkový objem μl 50 Mix 2 (na 10 vzorků) komponenty objem μl destilovaná voda 79 10X PCR pufr plus Mg 20 Taq DNA polymeráza (5U/μl) 1 celkový objem μl 100 8

9 Z DNA, kterou jsme po preamplifikaci naředili 1:50, Mix 1 a Mix 2 připravíme reakční směs pro selektivní amplifikaci. komponenty objem μl DNA ředěná po preamplifikaci 1:50 a/nebo 5 kontrolní preamplifikavaná DNA rajčete (součást kitu) Mix 1 (primery/dntp) 5 Mix 2 (Taq DNA polymeráza/pufr) 10 celkový objem μl 20 Vzorky promícháme, krátce centrifugujeme a dáme amplifikovat (program AFLP 2). Reakční cyklus: 1 cyklus: 94 C 30s 65 C 30s 72 C 60s 12 cyklů: při, kterých během annealingu v každém kroku klesne teplota o 0,7 C, tzn. cyklus C 30s 64,3 C 30s 72 C 60s atd. 23 cyklů: 94 C 30s 56 C 30s 72 C 60s STOP krok Separace amplifikovaných produktů na sekvenační elektorforéze Po PCR přidáme ke vzorku (20μl) 16μl 98% formamidu a 4μl Loading buffer. Před nanášením na gel necháme vzorky denaturovat 3 min při 90 C (denaturaci opakujeme vždy před další separací na gelu). Po denaturaci vzorky zchladíme na ledu. 9

10 Příprava sekvenační elektroforézy Roztoky: Bind silane: 4 ml bind silane rozmícháme v 1 l ultračisté vody (lze opakovaně použít) Pozn. Při přípravě sekvenační elektroforézy a PAGE pracujeme pouze s ultračistou vodou (UHP water) Obě skla, která se používají pro sekvenační elektroforézu, spacery a hřeben důkladně umyjeme detergentem a pečlivě odstraníme případné zbytky gelu. Po osušení skel, spacerů a hřebenu, vše opláchneme v ultračisté vodě a po té ve 100% ethanolu. Spodní sklo (to, na kterém po ELFO zůstává gel) vložíme na 1 h do roztoku bind silane a necháme ho silanizovat tzn. že na skle se vytvoří vrstva, která po té váže gel. Sklo opláchneme ultračistou vodou a potom 100% ethanolem. Na vrchní sklo (to, které odpuzuje gel) nalijeme cca 5 ml repel silane, dobře rozetřeme po skle, tak aby po celé ploše vznikla tenká vrstva a necháme 15 min působit. Sklo opláchneme ultračistou vodou. Sestavení skel pro sekvenační elektroforézu Na spodní bind sklo položíme k dlouhým okrajům spacery a přiložíme vrchní repel sklo tou vrstvou, kterou jsme potřeli repel silane. Soupravu pečlivě urovnáme a spojíme svorkami na jedné z dlouhých a jedné z krátkých stran. Tu stranu, na které není žádná ze svorek důkladně zalepíme přes hranu izolepou, tak aby skla zůstala pevně spojena. Svorky přendáme a postup opakujeme na druhé nezalepené straně. Když jsou obě dlouhé strany zalepené, zalepíme spodní stranu skel. Dbáme na to, aby tato strana byla velmi pečlivě zalepená, jinak gel bude vytékat. Spodní rohy skel zalepíme dvakrát popřípadě třikrát. Příprava denaturačního PAGE DNA gelu Chemikálie: 10% persíran amonný: 0,1g do 1ml vody (připravujeme čerstvý před každou ELFO) 100ml gelu připravíme podle tabulky, vše smícháme, zahříváme ve vodní lázni při 55 C (pozor ochlazuje se) po dobu 3 min, objem doplníme do 100ml. 6% 8% 10% AC/BIS 30% ml 20 26,6 33,3 5X TBE ml voda ml 24,7 18,1 11,4 močovina g

11 Z takto připraveného gelu odebereme 10ml přidáme 60μl 10% persíranu amonného a 5μl TEMEDU. Gel ihned nanášíme pipetou mezi skla, tak aby nevznikly žádné bubliny. Tato vrstva gelu má po ztuhnutí zabránit vytékaní zbývajícího gelu. Když spodní vrstva dobře ztuhne přidáme ke zbývajícím 90ml gelu 540μl 10% persíranu amonného a 45μl TEMEDU a pomocí střičky gel naneseme mezi skla, tak aby nevznikly žádné bubliny. Gel naneseme přesně k okraji vyříznutí vrchního skla, přebytečný gel odstraníme a přesah spodního skla očistíme, aby ne něm neulpívaly zbytky gelu. Hřeben zasuneme mezi skla asi 4mm hluboko tou stranou, na které nejsou zuby. Gel necháme ztuhnout. Trubičku ze střičky ihned umyjeme, aby v ní gel neztuhnul a neucpal ji. Pre-run sekvenační elektroforézy Když je gel dobře ztuhlý odstraníme izolepu ze spodní části, skla vložíme do vany a připevníme je k vaně pomocí svorek. Do vany nalijeme 1X TBE pufr a prázdný gel necháme cca min běžet při 1800V. Vlastní elektroforéza Po pre-run vypneme proud, vyndáme hřeben a do štěrbiny, kterou hřeben v gelu vytvořil, naneseme Loading buffer, po té vsuneme zpátky hřeben tou stranou, na které jsou zuby, tak hluboko, aby hřeben vytvořil mezi skly sloty pro vzorky. Do slotů naneseme vzorky (které jsme těsně před tím denaturovali) cca 3-4μl a necháme ELFO běžet při 1800V (cca 1 h). Po doběhnutí ELFO vypneme proud, odpojíme zdroj (!!!) a vyndáme skla. Odstraníme izolepu, vyndáme spacery a opatrně od sebe odlepíme skla. Na spodním bind skle by měl zůstat gel. Barvení stříbrem Roztoky: Fix/stop solution (10 % kyselina octová): 100 ml kyseliny octové přimícháme do 900ml ultračisté vody Staining solution: 1 l ultračisté vody, 1 g AgNO 3, 1 ml formaldehydu Developing solution (vývojka): 30 g NaCO 3, 1 l ultračisté vody, těsně před použitím přidáme 1,5 ml formaldehydu a 200 μl 1 % thiosulfátu sodného 1% thiosulfát sodný: 0,01 g do 1 ml vody (připravujeme čerstvý před každou ELFO) 11

12 Spodní sklo, na kterém zůstal gel vložíme do fix/stop solution a 20 min oplachujeme a třepeme. V tomto roztoku může gel zůstat přes noc bez třepání. STOP krok Gel přeneseme do nové misky a 3krát 5 min dobře oplachujeme ultračistou vodou za současného třepání. Gel ponoříme do staining solution a 30 min barvíme a třepeme. Po barvení gel 15 s oplachujeme ultračistou vodou a po té ho vložíme do vychlazeného developing solution, ke kterému jsme přidali 1,5 ml formaldehydu a 200 μl 1 % thiosulfátu sodného. 6 7 min omýváme, dokud nejsou proužky dobře viditelné. Po zviditelnění proužků přeneseme gel zpět do fix/stop solution a 3 min necháme působit, aby došlo k ukončení vyvíjecí reakce. Gel 2krát 5 min omyjeme ve vodě. Gel překryjeme celofánem, necháme uschnout a po té oscanujeme. Získaný elektroforeogram je takto připraven k hodnocení. Všechny pomůcky důkladně umyjeme. 12

13 Příprava sekvenační elektroforézy - Piešťany Roztoky: Při přípravě sekvenační elektroforézy a PAGE pracujeme pouze s ultračistou vodou (UHP water) Obě skla, která se používají pro sekvenační elektroforézu, spacery a hřeben důkladně umyjeme detergentem a pečlivě odstraníme případné zbytky gelu. Po osušení skel, spacerů a hřebenu, vše opláchneme v ultračisté vodě a po té ve 100% ethanolu. Spodní sklo (to, na kterém po ELFO zůstává gel) potřeme roztokem Bind silane a necháme ho silanizovat tzn. že na skle se vytvoří vrstva, která po té váže gel. Roztok 3 ml vody + 40 µl led. kys. octové + 40 µl Bind Silane. Roztok naneseme pipetou na sklo, rozetřeme, po zaschnutí přetřít 100% ethanolem. Na vrchní sklo (to, které odpuzuje gel) nalijeme cca 2-3 ml Repel silane, dobře rozetřeme po skle, tak aby po celé ploše vznikla tenká vrstva, po zaschnutí přetřít 100% ethanolem. Sestavení skel pro sekvenační elektroforézu Na spodní bind sklo položíme k dlouhým okrajům spacery a přiložíme vrchní repel sklo tou vrstvou, kterou jsme potřeli repel silane. Soupravu pečlivě urovnáme a spojíme svorkami, zalepí se pouze horní okraje skel u uší. Příprava denaturačního PAGE DNA gelu Chemikálie: 6% 8% 10% AC/BIS 30% ml 20 26,6 33,3 5X TBE ml voda ml 24,7 18,1 11,4 močovina g Smíchat vodu, AC/BIS, TBE, nalít horký roztok močoviny (močovinu rozehřát v mikrovlnce), nechat vychladit v mrazáku, jinak moc rychle tuhne. k vychlazenému roztoku na 100 ml přidat 500 µl 10 % PSA µl TEMED. 10% persíran amonný: 0,1g do 1ml vody (připravujeme čerstvý před každou ELFO) Roztok nalijeme do mírně šikmých skel (2-3 cm šikmina), po nalití se položí do roviny, snad to ztuhne a nevyteče. Přes noc na skla položit vlhký filtrák, vatu a alobal. 13

14 Hřeben zasuneme mezi skla asi 4mm hluboko tou stranou, na které nejsou zuby. Gel necháme ztuhnout. Pre-run sekvenační elektroforézy Když je gel dobře ztuhlý odstraníme izolepu ze spodní části, skla vložíme do vany a připevníme je k vaně pomocí svorek. Do vany nalijeme 1X TBE pufr a prázdný gel necháme cca min běžet při 1000V. Vlastní elektroforéza Vsuneme hřeben tou stranou, na které jsou zuby, tak hluboko, aby hřeben vytvořil mezi skly sloty pro vzorky. Do slotů naneseme vzorky (které jsme těsně před tím denaturovali) cca 3-4μl a necháme ELFO běžet při 1000V, 39 ma a 38 W. Nanášecí pufr LB: 4.8 g močovina, 10 ml voda, 0,05 g BPB, 10 µl 10 M NaOH, důkladně rozmíchat, min. 30 min., trvanlivost 2 týdny. LB se smíchá se vzorkem v poměru 1 : 1. Po doběhnutí ELFO vypneme proud, odpojíme zdroj (!!!) a vyndáme skla. Odstraníme izolepu, vyndáme spacery a opatrně od sebe odlepíme skla. Na spodním bind skle by měl zůstat gel. Barvení stříbrem Roztoky: Fix/stop solution (10 % kyselina octová): 200 ml kyseliny octové přimícháme do 1800ml ultračisté vody, vychlazené Staining solution: 2 l ultračisté vody, vychlazená, 2 g AgNO 3, 3 ml formaldehydu Developing solution (vývojka): 50 g NaCO 3, 2 l ultračisté vody, těsně před použitím přidáme 3 ml formaldehydu a 400 μl thiosulfátu sodného (10 mg/ml), vychlazený roztok, 6 min. před použitím do mrazáku 1% thiosulfát sodný: 0,01 g do 1 ml vody (připravujeme čerstvý před každou ELFO) Spodní sklo, na kterém zůstal gel vložíme do fix/stop solution a 25 min** třepeme. Gel přeneseme do nové misky a 2x 5 min** dobře oplachujeme vychlazenou ultračistou vodou (1 l). Gel ponoříme do staining solution a 25 min** barvíme a třepeme. Po barvení gel s oplachujeme vychlazenou ultračistou vodou (2 l), velmi intenzivně se protřepává a po té ho vložíme do vychlazeného developing solution, ke kterému jsme přidali 3 ml formaldehydu a 400 μl thiosulfátu sodného. 5-6 min velmi intenzivně 14

15 protřepáváme, v chlaďáku, ve tmě, při červeném fotosvětle. Barvit do objevení se skvrn, pak fixovat fix/stop solution, 30 min, pak sušit. Všechny pomůcky důkladně umyjeme. ** velmi intenzivní třepání s velkou amplitudou Všechny pomůcky důkladně umyjeme. 15

16 HYBRIDIZACE A NERADIOAKTIVNÍ DETEKCE DNA SOUTHERN BLOTT + ALKPHOS DIRECT *** 16

17 Elektroforéza agarózový gel v 1x TBE pufru Blot - na pozitivně nabitou nylonovou membránu HYBOND N+ přenos pomocí alkalického pufru Elfo po ukončení elektroforézy vyfotit gel (na UV jen po nezbytně nutnou dobu) oříznout gel gel přenést do ATB na 15 min, mírně třepat přenést do nového ATB na 20 min, mírně třepat odstříhnout membránu (ostré nůžky, nesahat, označit polohu levý spodní roh) položit membránu na povrch dh 2 O! dokud se nezvlhčí přenést membránu na 5 min do ATB ponořit připravit transfer ručníky, buna suchý W 3MM vlhký W 3MM folie membrána gel (orientace jako při elfo) folie vlhký W 3MM most z filtráků závaží 2 hod transfer, zvlhčovat filtrák - ATB membránu protáhnout v 2x SSC v případě alkalického transferu a Hybond N+ není potřeba croslinkovat DNA na membránu nablottovanou membránu je možno vložit do sterilního W 3MM a mikroténového sáčku do lednice 17

18 Příprava sondy po elektroforéze vyříznout band sondy z gelu co nejmenší a co nejmenší expozice na UV (nestrkat nos a oči moc blízko k UV) izolace DNA z gelu pomocí GelElute Kit Sigma přidat Gel Solubilization pufr 300 µl na 100 mg gelu 10 min v C, protřepávat přenést na kolonku, stočit promýt přidat eluční pufr změřit koncentraci DNA a upravit na 20 ng/µl Značení sondy DNA koncentrace 20 ng/µl denaturace DNA 10 µl DNA 5 min povařit, zchladit 5 min na ledu, krátce stočit přidat 20µl cross-linkeru do 80 µl vody (lze uchovat 1 týden v lednici) k DNA přidat 10 µl reaction pufru, lehce promíchat přidat 2 µl labeling reagent, lehce promíchat přidat 10 µl cros-linkeru (pracovní konc.), lehce promíchat, stočit inkubace 30 min při 50 C lze uchovávat na ledu 2 hod Hybridizace hybridizační pufr součást kitu přidat: NaCl na konc. 0.5 M blocking reagent na 4% Salmon sperm (100 µg/ml = 10 µl/ml hybridizačního roztoku) na 200 ml hybridizačního roztoku: 8 g blocking reagent 5.84 g NaCl velmi špatně se rozpouší, nesmí se vysrážet, rozdělit do alikvot a dát zamrazit 0.25 ml/cm 3 pufru předehřátého na 60 C prehybridizace 30 min přidat sondu 5-10 ng/ml hybridizace přes noc Wash 2-5 ml / cm 2 WASH I, 10 min při 60 C opakovat WASH II, 5 min při pokojové teplotě opakovat 18

19 Detekce membránu nechat okapat, položit na folii, přidat substrát substrát 25µl / cm 2 poňahňat 3 min při pokojové teplotě vložit do kazety s filmem Hypefilm MCL po cca 1 hod vyvolat 3 min ve vývojce (Fomadon R09, ředit 1:20), 10 min v ustalovači (Fomafix, ředit 1:5) REPROBING BLOTS Blots which have been used to generate a signal on film can be reprobed several times. Due to the length of the light output in this system, it is first necessary to 'strip' the blots of old probe before starting second, and subsequent hybridizations. Blots can be stripped using the following method. For blots detected with ECF substrate, start at step 1. For blots detected with CDP-Star, step 1 can be omitted. 1. Incubate blots in absolute alcohol (99% ethanol) at room temperatures with agitation (1ml/cm2, 2x10 minutes). 2. Incubate blots in 0.5%(w/v) SDS solution at 60 C for 60 minutes. 3. Rinse blot in 100mM Tris ph 8.0 for 5 minutes at room temperature. Membranes should be kept moist between reprobings, for example wrapped in SaranWrap, and stored in a refrigerator at 2-8 C. The limit to the number of reprobings is likely to be governed by physical damage to the blots. It is therefore recommended that blots are always handled carefully. 19

20 Detekce 20

21 Pufry: Alkaline transfer buffer 0.4 N NaOH 1 M NaCl 20x SSC g NaCl 88.2 g Na-citrát rozpustit v 800 ml vody, upravit ph na 7.0 (HCl) doplnit na 1 l Neutralization buffer II 0.5 M Tris-HCl, ph=7.2 1 M NaCl Hybridization buffer Add NaCl (analytical grade) to the hybridization buffer to give a concentration of 0.5M. Add blocking reagent to a final concentration of 4%(w/v). Immediately, mix thoroughly, to get the blocking reagent into a fine suspension. Continue mixing at room temperature for 1-2 hours on a magnetic stirrer or roller mixer. This buffer can be used immediately or stored in suitable aliquots at -15 C to -30 C. Primary wash buffer (1 litre) WASH I močociva 2M - 120g SDS 0.1% 1g Na phosphate ph7.0 50mM 100 ml 0.5M Na 3 PO 4 NaCl 150mM 8.7g MgCl 2 10ml 1.0M MgCl 2 Blocking reagent 0.2% 2g 0.5M Na 2 PO g 500 ml vody ph=7.0 pomocí NaOH Secondary wash buffer - 20x stock WASH II Tris base 1M 121g NaCl 2M 112g Adjust ph to Make up to 1 litre with water. This can be kept for up to 4 months in a refrigerator at 2-8 C. Secondary wash buffer working dilution Dilute stock 1:20 and add 2ml/l of 1M MgCl 2 to give a final concentration of 2mM magnesium in the buffer. This buffer should not be stored. 21