MagNA Pure LC DNA Isolation Kit II (Tissue) Souprava k izolaci DNA z tkáně

Transkript

1 Pro všeobecné laboratorní použití JEN PRO POUŽITÍ IN VITRO MagNA Pure LC DNA Isolation Kit II (Tissue) Souprava k izolaci DNA z tkáně Verze: červenec 2006 Reagencie ve stavu připraveném k použití, potřebné pro izolaci DNA z lidských a živočišných tkání pomocí přístroje MagNA Pure LC Instrument, Kat. č izolací Tuto soupravu uchovávejte v teplotě od +15 do + 25 o C. 1

2 Obsah 1. K čemu je výrobek určen... 3 Počet zkoušek... 3 Obsah soupravy... 3 Skladování a stabilita... 3 Další potřebné vybavení a reagenč-ní činidla... 4 Aplikace... 4 Trvání série Jak je třeba výrobek používat Jak je třeba výrobek používat Předtím, než začnete... 5 Přípravná opatření... 5 Postup čištění... 6 Materiál vzorku... 6 Příprava pracovních roztoků... 7 Kontroly Kroky prováděné před izolací... 9 Obecné poznámky... 9 Rozklad tkáně pomocí přístroje MagNA Lyser... 9 Rozklad tkáně pomocí homogenizá-toru rotor - stator Rozklad tkáně pomocí třecí misky / tlouku / injekční stříkačky Volitelný krok: rozštěpení RNA Volitelný krok: externí rozštěpení proteinázou K Kroky před izolací DNA z řezů tkání, prováděné na krycím sklíčku Standardní postup deparafinace Jiný postup deparafinace Externí lýza Výsledky Neporušenost DNA Výtěžek Čistota Vliv výchozího množství na výsledek Reprodukovatenost (rozptyl uvnitř série) Křížová kontaminace Následné aplikace Odstraňování poruch Shlukování perliček nebo jejich hromadění v zásob-níku DNA je rozložená Malý výtěžek DNA Nedostatečná čistota DNA Neuspokojivý výsledek PCR Eluáty mají načervenalou barvu Dodatečné informace o tomto produktu Jak tento výrobek funguje Princip testu Reference Řízení jakosti Dodatečné informace Konvence Textové konvence Symboly Zkratky Změny oproti předchozí verzi Informace týkající se objednávání Přístroje a příslušenství Soupravy MagnaPure LC pro izolaci DNA Soupravy k izolaci RNA/ mrna Soupravy MagNA Pure LC pro úplnou izolaci nukleové kyseliny Související soupravy a rea-genty

3 6.4 Ochrana licencí Obchodní značky Kontakt a podpora K čemu je výrobek určen Počet zkoušek Obsah soupravy 192 izolací (6 x 32) z 1 10mg čerstvé / zmrazené tkáně, nebo z jednoho řezu tkáně 5-10µm, fixovaného ve formalinu a zalitého v parafinu Souprava je určena k zpracování až 192 vzorků v sériích po 32 vzorcích. Jestliže zpracováváte méně než 32 vzorků najednou, část reagencií se nevyužije a jejich zbytek již nebude dostatečný ke zpracování 192 vzorků. Lyzační / vazební pufr obsahuje modrou přísadu, potřebnou pro detekci srážení krve během automatické izolace DNA přístrojem MagNA Pure LC. Láhev / uzávěr Nálepka na víčku Obsah / funkce 1 černá Promývací pufr I 2 lahvičky, každá 100 ml, pro odstranění inhibitorů PCR 2 modrá Promývací pufr II 2 lahvičky, každá 60 ml, pro odstranění solí, proteinů, atd. 3 červená Promývací pufr III 1 lahvička, 100 ml, pro odstraňování solí, proteinů, atd. 4 zelená Lyzační / vazební pufr 1 lahvička, 100 ml, pro buněčnou lýzu a navázání DNA 5 karamelová Suspenze magnetických skleněných částic (MGP) 6 skleněných nádobek se suspenzí MGP k navázání DNA 6 žlutá Eluční pufr 1 lahvička, 10ml, pro eluci čisté DNA pro rekonstituci proteinázy K pro zředění eluátů T čirá Pufr tkáňové lýzy 1 lahvička, 100 ml, pro účinnou lýzu tkáně P růžová Proteináza K 6 skleněných nádobek s lyofilizátem pro štěpení proteinů Skladování a stabilita Složky soupravy (kitu) jsou při teplotách +15 C až +25 C stabilní až do data vypršení skladovatelnosti, které je vytištěno na štítku. Kit se dodává při teplotě místnosti.( +15 C až +25 C). Skleněné částice nesmíte ukládat ve zkumavce nebo něčem podobném. 3

4 1. K čemu je výrobek určen - pokračování Další potřebné vybavení a reagenční činidla standardní laboratorní vybavení pipety a beznukleázové špičky bránící vzniku aerosolů pro počáteční dávkování vzorků do kazety na vzorky odstředivka a vhodné beznukleázové reakční zkumavky mixér Vortex ohřívací zařízení (65 C / 95 C, pro reakční zkumavky 1,5-2ml) homogenizační zařízení, jako jsou: - přístroj MagNA Lyser Instrument* se zelenými perličkami MagNA Lyser Green Beads*(např. UltraTurrax, nebo Omni TH 220) - třecí miska / tlouk / jehla (průměr 0,8mm) Hemo-De nebo xylen Etylalkohol, absolutní * dodává Roche Applied Science; podrobnosti viz Informace o objednávání. Aplikace Trvání série Pro obecné laboratorní použití. K přípravě vysoce čisté DNA z lidských a živočišných tkání na přístroji MagNA Pure LC Instrument. Vyčištěná DNA může být použita i pro PCR na přístrojích LightCycler a na standardních přístrojích typu thermal block cycler. Seřízení přístroje MagNA Pure LC vyžaduje přibližně 15 min. Celková doba pro automatizované čištění nukleové kyseliny je přibližně: 100min při zpracovávání 32 čerstvých / zmražených tkáňových vzorků; 62 min při zpracovávání 32 odparafinovaných řezů fixovaných ve formalinu / zalitých v parafinu a také při zpracování těžko homogenizovatelných vzorků tkání (které vyžadují externí enzymatické štěpení pomocí proteinázy K) Po seřízení přístroje MagNA Pure LC již není potřebná manipulace a s tím související čas. Další manipulační čas je potřebný jen na manuální operace, prováděné před izolací. 4

5 2. Jak je třeba výrobek používat 2.1 Předtím, než začnete Přípravná opatření I) Požadavky na manipulaci Před postupem do další fáze vždy dokončete probíhající fázi postupu PCR. Např. před zahájením nastavení PCR byste nejprve měli dokončit přípravu vzorku. Příprava vzorku, nastavení PCR a samotný proces PCR by se měl provádět na různých místech. Neslévejte činidla z různých sérií nebo z různých lahví patřících do téže série. Nepoužívejte kit po prošlém datu trvanlivosti. Promývací pufr (lahvička 1), lyzační / vazebný pufr (lahvička 4) a pufr tkáňové lýzy obsahují guanidinové soli, které jsou dráždivé. Nedovolte, aby se promývací pufr I nebo lyzační / vazebný pufr dostal do kontaktu s vaší pokožkou, očima nebo sliznicemi. Jestliže ke kontaktu přesto dojde, promyjte postižené místo okamžitě velkým množství vody. Jestliže činidlo rozlijete, zřeďte ho vodou a teprve potom ho utřete. Nedovolte, aby se lyzační / vazebný pufr smíchal s roztokem chlornanu sodného (bělicím činidlem). Může přitom vzniknout vysoce toxický plyn. II) Laboratorní postupy Při zpracovávání všech potenciálně infekčních vzorků postupujte podle bezpečných laboratorních postupů. Protože citlivost a obsah potenciálních patogenů ve vzorku může být různý, musí operátor optimalizovat inaktivaci patogenů lýzou / vazebným pufrem, nebo učinit patřičná opatření podle místních bezpečnostních předpisů. V pracovním prostoru laboratoře nejezte, nepijte ani nekuřte. Nepipetujte ústy. Při manipulaci se vzorky a reagenčními činidly z daného kitu noste ochranné rukavice pro jedno použití, laboratorní pláště a ochranu zraku. Neznečišťujte činidla baktériemi, viry nebo nukleázami. Pipety na jedno použití se špičkami neobsahujícími nukleázu používejte pouze k odebrání odpovídajících množství z lahviček s reagencemi. Používejte všeobecná preventivní bezpečnostní opatření, popsaná v literatuře. Po manipulaci se vzorky a testovacími činidly si důkladně umyjte ruce. III) Manipulace s odpady Použitá činidla a odpad likvidujte ve shodě se státními, federálními a místními předpisy. V místní pobočce společnosti Roche obdržíte na požádání materiálové a bezpečnostní listy (MSDA). 5

6 2.1 Předtím, než začnete - pokračování Postup čištění Ke zpracování vzorků tkáně pomocí izolační soupravy MagNA Pure LC DNA Isolation Kit II (Tissue) je pro software MagNA Pure LC Software, Version 2.11 (nebo nižší verze) nutno instalovat nové postupy (protokoly). Na obrazovce Sample Ordering software MagNA Pure LC Software by se při volbě protokolu měly objevit nápisy DNA II Tissue a DNA II Tissue External_Proteinase K. Jestliže pracujete se verzí software 3.0 nebo vyšší, není nutná zvláštní instalace software Další podrobnosti vám sdělí zástupce společnosti Roche. Při rozhodování o tom, který protokol čištění je nejlepší pro materiál vzorku s nímž pracujete, použijte následující tabulku. Název Materiál protokolu vzorku DNA II,tkáň Vzorky čerstvé / zmražené tkáně 1 10mg DNA II, tkáň Externí proteináza K Odparafinovaný řez 5-10µm tkáně, která se obtížně homogenizuje, fixovaný formalinem/ zalitý v parafinu Postup homogenizovaný vzorek se přenese na podstavec pro reagent / vzorek a přístroj sám automaticky provede čištění objem vzorku: 80 µl až 90 µl eluční objem: 200 µl vně přístroje pro-běhne enzymatické štěpení proteinázou K.Výsledný materiál se pak přenese na podstavec pro reagent / vzorek a přístroj automaticky provede čištění. objem vzorku od: 100 µl až 110 µl eluční objem: 200 µl Materiál vzorku Aby byly získány optimální výsledky v postupech které následují, zejména v sériích PCR prováděných v reálném čase na přístroji LightCycler PCR, nezpracovávejte vzorky větší než pro jaké je tento kit určen. Maximální množství vzorku, které je možno zpracovat pomocí soupravy MagNA Pure LC DNA Isolation Kit II (Tissue), je následující: 1 10 mg čerstvé / zmražené nebo nezmražené stabilizované (např. zpracované pomocí RNAlater) (v závislosti na typu tkáně) 1 řez tkáně fixované ve formalinu / zalité v parafinu ( 5-10 µm) Nikdy nepoužívejte větší množství vzorku, než pro jaké je tento kit určen. Pokud byste toto pravidlo nerespektovali, bude to mít vliv na účinnost procesu izolace. Magnetické částice se mohou shlukovat a ztrácet a také hrozí vzájemná kontaminace vzorků. Se všemi vzorky zacházejte tak, jako by byly potenciálně infekční. 6

7 2.1 Předtím, než začnete - pokračování Příprava pracovních roztoků Před spuštěním daného postupu připravte pracovní roztoky, jak je popsáno dále. Všechny ostatní roztoky jsou připraveny k použití. Všechny pufry jsou čiré. Nepoužívejte pufr, jestliže obsahuje sraženinu. Je-li viditelná sraženina, vytemperujte lahvičku na teplotu 37 C a promíchejte ji čas od času, dokud se sraženina zcela nerozpustí. Pufr nezahřívejte na 37 C déle, než je aktuálně nutné pro úplné rozpuštění sraženiny. Před použitím pufr opět vytemperujte na pokojovou teplotu (15 až 25 C). Pufry před použitím vyhřejte na teplotu místnosti (+15 až +25 C). Jestliže použijete reagenční činidla při teplotách mimo doporučený rozsah, kit nemusí správně fungovat. Používejte jen takové množství reagentu, které je potřebné pro daný počet vašich vzorků Neskladujte proteinázu K a suspenzi MGP ve zkumavkách na reagencie. Všechna ostatní reagenční činidla, která zbyla ve zkumavkách po dokončení dané analýzy, mohou být použita pro další cyklus, je-li proveden ve stejný den. Delší skladovací období nejsou doporučena. Reagens Příprava/poznámky Skladování Magnetické skleněné částice (MGP) Proteináza K Suspenze MGP (nádobka 6) musí být důkladně promíchána. Bezprostředně před použitím promíchejte na vortexu, aby suspenze byla homogenní. Kuličky mají v klidu tendenci sedimentovat. Nejlepší výsledky dosáhnete, když přidáte MGP do přístroje těsně před zahájením cyklu (k minimalizaci sedimentace). Používejte vždy přesně to množství MGP, doporučené daným software. Každou lahvičku s proteinázou K (nádobku P) znovu rozřeďte přidáním 1,2 ml pufru (nádobka 6). Uzavřete nádobku a dobře promíchejte, aby se produkt lyofilizace zcela rozpustil. Roztok proteinázy K se po rozpuštění může zdát kalný. Způsobují to stabilizační látky, přidané do proteinázy K. Nemají vliv na funkci enzymu. Jedna lahvička proteinázy K stačí pro 32 vzorků. 7 MGP skladujte při teplotě +2 až +8 C Suspenzi MGP neskladujte v reagenční zkumavce apod. Nenechávejte MGP suspenzi neuzavřenou v lahvičce nebo v reagenční zkumavce, poněvadž odpařování alkoholu by mohlo vést k méně optimálnímu čištění. Znovu zředěná proteináza K je stabilní po dobu 1 měsíce při +2 až +8 C nebo až 12 měsíců při teplotách 15 až 25 C.

8 2.1 Předtím, než začnete - pokračování Kontroly Se vzorky vždy provádějte vhodné kontroly, zvláště pokud chcete uskutečnit kvalifikační analýzy eluovaných vzorků DNA (např. při provádění sérií PCR v reálném čase na přístrojích LightCycler ). Abyste zkontrolovali celý proces od přípravy vzorku až ke kvantifikační analýze, proveďte následující kontroly: Pozitivní kontrola - pomocí vzorku materiálu, který je z hlediska vašeho cíle pozitivní. Negativní kontrola - pomocí vzorku materiálu, který je z hlediska vašeho cíle negativní. Vnitřní kontrola (IC) - přidáním definovaného množství nějakého kontrolního standardu ( např. plasmidická DNA) ke všem vzorkům, které se mají čistit. Vnitřní standard (IC) se přidává před započetím fáze čištění a čistí se i amplifikuje společně s cílovým materiálem z vašeho vzorku, v témže cyklu PCR. Koncepce IC je zvláště užitečná pro procesy amplifikace založené na enzymech, jakým je PCR, protože účinnost procesu PCR mohou snížit inhibitory, přítomné ve vyčištěném vzorku. Metoda se také používá ke kompenzaci možných ztrát při čištění. V případě kvantifikačních sérií prováděných na přístrojích LightCycler používejte nějakou syntetickou dvouvláknovou DNA se stejnými místy k připojení priméru jaká má vaše cílová sekvence, avšak mající svůj jednoznačný úsek připojení sondy, který odlišuje IC od amplikonu specifického pro cílovou sekvenci. Signály odvozené od vaší cílové sekvence pak rozlišujte pomocí dvoubarevné série. HybProbe. Podrobnější informace, týkající se koncepce IC spolu se systémem LightCycler Carousel-based System, najdete v publikaci LightCycler Technical Note 12/2000 Absolute Quantification with External Standards and an Internal Control (absolutní kvantifikace s vnějšími standardy a vnitřní kontrolou ), která je na stránce 8

9 2.2 Kroky prováděné před izolací Obecné poznámky Účinný rozklad a homogenizace materiálu vzorku má zásadní význam pro izolaci genomické DNA z tkání. Důsledkem neúplného rozkladu tkáně je výrazně nižší výtěžek DNA. Příliš důkladný rozklad a homogenizace naopak způsobuje roztržení vysokomolekulární genomické DNA. Proto nepřekračujte doporučené časy. Při některých metodách se vzorek rozkládá a současně homogenizuje, jiné metody rozkladu vyžadují následnou homogenizaci. Rozložené vzorky tkání připravujte vždy čerstvé a okamžitě je zpracujte. Jestliže se má izolace DNA provést později, zmrazte rozložený vzorek na teplotu 20 C nebo nižší. Rozklad tkáně pomocí přístroje MagNA Lyser Níže uvedená tabulka popisuje rozklad a homogenizaci čerstvě zmražené nebo RNAlater fixované tkáně pomocí přístroje MagNA Lyser Instrument*. Přidejte 80 µl pufru Tissue Lysis Buffer (lahvička T) do zkumavky se zelenými perličkami *. Potom do zkumavky přeneste 1-10 mg tkáně. Je užitečné začít s (alespoň) dvojnásobným množstvím tkáně i pufru potřebného pro homogenizaci, protože část materiálu (který je v mezerách mezi perličkami) nelze použít. MagNA Lyser nastavte tak, jak je to popsáno v příručce pro obsluhu. Spusťte rozkladný cyklus s takovou rychlostí otáček a takovou dobu, jak je to vhodné pro konkrétní materiál. Parametry rozkladu (rychlost, čas) vždy optimalizujte předtím, než provedete vlastní čištění DNA. Nedostatečný rozklad může znamenat malý výtěžek DNA, zatímco nadměrný rozklad může mít za následek destrukci DNA. Na začátku můžete vycházet z hodnot, uvedených v následující tabulce pro vzorové typy materiálů: Materiál Otáčky Čas Játra / ledviny 6500 ot/min 15 20s Slezina/rakovinná tkáň Ocas / ucho / kůže RNAlater-fixovaná tkáň 6500 ot/min > 25 s# # Dlouhý rozkladný cyklus může způsobit degradaci DNA teplem. Ačkoli DNA má tendenci k větší odolnosti vůči tepelnému namáhání než k namáhání mechanickému, nepoužívejte rozkladný cyklus delší než 25s. Raději proveďte několik kratších cyklů. Mezi těmito cykly vzorek ochlaďte ledem. Inkubujte vzorky 30min (při teplotě místnosti). Odstřeďujte 2min při g (při teplotě místnosti). 80µl supernatantu lyzátu přeneste do kazety na vzorek. Kazetu se vzorkem umístěte na podstavec pro reagent / vzorek a spusťte postup purifikace DNA podle protokolu, jak je uvedeno v odst

10 2.2 Kroky prováděné před izolací - pokračování Rozklad tkáně pomocí homogenizátoru rotor - stator Níže uvedená tabulka popisuje rozklad a homogenizaci čerstvě zmražené tkáně, nebo RNAlater-fixované tkáně pomocí homogenizátoru rotor - stator (např. UltraTurrax, nebo Omni TH 220). Proveďte rozklad a homogenizaci tkáně s 80µl pufru Tissue Lysis Buffer (nádobka T) v homogenizátoru rotor-stator podle pokynů od dodavatele přístroje. Homogenizátor rotor-stator za přítomnosti pufru důkladně rozloží tkáň za 5-30s, v závislosti na typu vzorku. V závislosti na typu tkáně může být nutné provedení několika rozkladných cyklů. Špička homogenizátoru musí být stále ponořená a ponořený hrot musí být stále držen na jedné straně zkumavky, aby se netvořila pěna. Inkubujte vzorky 30min (při teplotě místnosti). Odstřeďujte 2min při zrychlení g (při teplotě místnosti). 80µl supernatantu lyzátu přeneste do kazety na vzorek. Kazetu se vzorkem umístěte na podstavec pro reagent / vzorek a spusťte postup purifikace DNA podle protokolu, jak je uvedeno v odst Rozklad tkáně pomocí třecí misky / tlouku / injekční stříkačky V níže uvedené tabulce je popsán rozklad a homogenizace čerstvé zmražené nebo RNAlater-fixované tkáně pomocí třecí misky, tlouku a injekční stříkačky. Pomocí třecí misky a tlouku důkladně rozmělněte 1-10 mg tkáně v kapalném dusíku. Zmražený prášek přeneste do mikrozkumavky vhodné k odstřeďování, předem vychlazené v kapalném dusíku. Nechejte odpařit zbývající kapalný dusík, avšak nedovolte, aby vzorek tkáně roztál. Ke vzorku přidejte 80µl pufru k rozkladu tkání (Tissue Lysis Buffer, láhev T) a potom proveďte homogenizaci tak, že vzorek protlačíte 6x jehlou injekční stříkačky (Ø 0.8mm). Inkubujte vzorky 30min (při teplotě místnosti). Odstřeďujte 2min při g (při teplotě místnosti). 350µl supernatantu lyzátu přeneste do kazety na vzorek. Kazetu se vzorkem umístěte na podstavec pro reagent / vzorek a spusťte postup purifikace DNA podle protokolu, jak je uvedeno v odst

11 2.2 Kroky prováděné před izolací - pokračování Volitelný krok: rozštěpení RNA Některé typy tkání mohou obsahovat značná množství RNA. Abyste eliminovali RNA, která se z takových tkání izoluje spolu s DNA, přidejte 10 ml nějakého roztoku RNase A* (40 mg/ml, rozpuštěno v elučním pufru) do 80 ml lyzátu a inkubujte po dobu 15 min při 65 C. Tímto krokem můžete zvýšit výtěžek DNA. Volitelný krok: externí rozštěpení proteinázou K Aby se usnadnila homogenizace těch materiálů s nimiž jsou problémy (např. některé typy rakovinné tkáně), je možno postupovat podle protokolu pro čištění proteinázou ( DNA II Tissue_External_Proteinase K purification ). Tento postup umožňuje provést účinné štěpení proteinázou K před automatizovanou izolací DNA: Přidejte 20µl roztoku proteinázy K k vzorku lyzátu a temperujte při 55 až 65 C do ukončení rozkladu (30 min přes noc). Krátce vzorky odstřeďte a supernatant přeneste do kazety na vzorek MagNA Pure LC Sample Cartridge. 11

12 2.3 Kroky před izolací DNA z řezů tkání, fixovaných formalinem a zalitých v parafinu, prováděné na krycím sklíčku Níže je popsán postup deparafinace jednoho řezu tkáně, fixovaného ve formalinu a zalitého v parafinu (tloušťka řezu 5 až 10µm), přímo na krycím mikroskopickém sklíčku. Tento kit je optimalizován pro izolaci DNA z řezů tkáně zalitých v parafinu a fixovaných pomocí 10%ního formalinu, neutrálně pufrovaného. Standardní postup deparafinace Sklíčko vložte do lázně Hemo-De (nebo xylen), potom inkubujte 10 min. Vypusťte přebytečnou kapalinu, potom sklíčko dejte na 10min do absolutního etanolu. Vyměňte lázeň, pak sklíčko inkubujte dalších 10 min v absolutním etanolu. Pomocí sterilního skalpelu, určeného na jedno použití, seškrábněte odparafinovaný řez ze sklíčka a přeneste ho do reakční zkumavky 1.5 ml. Abyste zabránili rozpadu tkáně, seškrábněte řez ze sklíčka před tím, než vyschne. Takto vzniklý kousek tkáně sušte 10 min při 55 C. 12

13 2.3 Kroky před izolací DNA z řezů tkání, fixovaných formalinem a zalitých v parafinu, prováděné na krycím sklíčku - pokračování Jiný postup deparafinace V reakční zkumavce 1,5ml přidejte 800µl Hemo-De (nebo xylenu) k jednomu řezu o tloušťce 5-10 µm a směs jemně promíchejte tak, že zkumavku několikrát převrátíte. Přidejte 400µl absolutního etanolu do Hemo-De ( nebo xylenu) a potom jemně promíchejte tak, že zkumavku několikrát převrátíte. Odstřeďte po dobu 2 min při maximálních otáčkách ( ot/min), pak oddělte supernatant a zlikvidujte ho jako odpad. Přidejte 1 ml abs. etanolu a potom jemně promíchejte tak, že zkumavku několikrát převrátíte. 2 min odstřeďujte při maximálních otáčkách, pak oddělte supernatant a zlikvidujte ho jako odpad. Zkumavku zbavte přebytečného alkoholu krátkým vysušením pomocí papírového ručníku. Zpracovávaný kousek tkáně sušte 10 min při 55 C. Externí lýza Ke kousku odparafinované tkáně přidejte 80 µl pufru pro rozklad tkáně (Tissue Lysis Buffer, láhev T, průhledné víčko) a 20 µl roztoku proteinázy K (viz 3.2). Několikrát krátce promíchejte a potom vzorek inkubujte O/N při 55 C za soustavného třepání. Další míchání po jednohodinové inkubaci pomocí pipetování nahoru a dolů může zlepšit homogenizaci tkáně, protože to zabrání pokračování rozkladu proteinázou K po inkubaci O/N. Odstřeďte po dobu 1min při 8000ot/min abyste si ověřili, že rozklad je úplný. Jestliže uvidíte kousek tkáně, přidejte 10µl roztoku proteinázy K (viz 3.1). Několikrát krátce promíchejte a potom vzorek ještě hodinu inkubujte při 55 C. 13

14 3. Výsledky Neporušenost DNA DNA byla izolována z různých typů tkání a analyzována na agarózových gelech. DNA měla vysokou kvalitu a její průměrná molekulová hmotnost byla cca. 10 kb. Nevykazovala žádné známky odbourání (viz obr. 1). Integrita DNA, izolované z tkáně fixované ve formalinu a zalité v parafinu může být horší, v závislosti na typu tkáně a postupu fixace (viz ref.2). játra ledviny slezina plíce mozek sval ocas ucho Obr. 1: DNA byla izolována z různých čerstvých / zmrazených myších tkání (v trojicích, řada 1: játra, ledviny, slezina, plíce; řada 2: mozek, sval, ocas, ucho), a analyzována na 1%ním agarózovém gelu. Pásy ukazují DNA o vysoké integritě. Výtěžek Čistota DNA byla připravena z různých množství a typů tkání. Výtěžky byly určeny pomocí OD260 a gelovou analýzou a porovnány s výsledky získanými konvenčními metodami. Výtěžky DNA byly stejné nebo vyšší než výtěžky získané metodami filtrační trubice. Kvantitativní analýza LC PCR potvrdila tato data (viz tabulka níže). Čištění DNA vycházelo z různých množství a různých typů výchozí tkáně Obvykle vycházela hodnota poměru OD260/280 1,8 ± 0.1, což znamená vysokou čistotu DNA. Nebyla pozorována žádná inhibice v systému LightCycler Carousel-based System (Light-Cycler 1.5 Instrument) (viz tabulka níže). Typické výsledky pokusů s čerstvou / zmraženou myší tkání Typ tkáně Množství (mg) Výtěžek DNA (µg) Čistota (OD260/280) PCR (CP) 1 LightCycler 2.0 Systém Játra ,8 18,6 Ledviny ,

15 3. Výsledky - pokračování Ocas , Typické výsledky pokusů s čerstvou / zmraženou myší tkání Typ tkáně Množství (mg) Výtěžek DNA (µg) Čistota (OD260/280) PCR (CP) 1 LightCycler 2.0 System Slezina ,9 18,0 Mozek ,7 18,1 Ucho ,7 19,9 Sval ,7 20,9 Plíce ,8 18,0 1 CP =Průsečíky odpovídají množství izolované DNA a byly vypočteny po analýze PCR pomocí systému LightCycler Carousel-based System (LightCycler 1.5 Instrument) (zde Factor V Leiden). Kvantifikace je založena na nějakém standardu DNA. Vliv výchozího množství na výsledek DNA byla izolována z různých množství tkáně (tj. 1, 2, 5, a 10 mg myších jater) a výsledky byly zjišťovány pomocí OD260 (obr. 2), na agarózovém gelu (obr.3), a také PCR analýzou pomocí přístroje LightCycler Carousel-based System (LightCycler 1.5 Instrument) (obr. 4). Všechna data ukazují dobrou korelaci výtěžku s výchozím množstvím tkáně ( scalability ). Korelace výtěžku (OD260), myší játra Výtěžek DNA (µg) Množství tkáně (mg) Obr.2: Korelace výtěžku experimentů s čerstvými / zmraženými myšími játry, zjištěná na základě měření OD260 Obr. 3: Korelace výtěžku experimentů s čerstvými / zmraženými myšími játry, zjištěná pomocí analýzy na agarózovém gelu 15

16 3. Výsledky - pokračování Korelace výtěžku (LightCycler), myší játra CP Reprodukovatelnost (rozptyl uvnitř série) Množství tkáně (mg) Obr. 4: Korelace výtěžku experimentů s čerstvými/zmraženými myšími játry, zjištěná analýzou PCR na přístroji LightCycler Carousel-based System (LightCycler 1.5 Instrument) Postup izolace DNA byl proveden na 18 vzorcích (10 mg) myších jater. Analýza na agarózovém gelu (obr.5), OD, a analýza LC-PCR ukázala dobrou reprodukovatelnost výsledků. Variační koeficient výtěžku DNA i její čistoty byl <10% a rozptyl hodnot bodu křížení LightCycler byl <3%. Obr.5: Reprodukovatelnost: izolace DNA z 18 vzorků (10 mg) čerstvých / zmražených myších jater. 16

17 3. Výsledky - pokračování Relativní kvantifikace izolace DNA z řezů tkáně rakoviny prsu, fixovaných ve formalinu a zalitých v parafinu DNA z řezů rakovinové tkáně, zalitých v parafinu CP průměr Logaritmus objemu eluátu (µl) Obr. 6: Postupně ředěná DNA, izolovaná z řezu fixovaného ve formalinu a zalitého v parafinu, byla amplifikována pomocí soupravy LightCycler HER2/neu DNA Quantification Kit. Relativní poměr signálu HER2/ neu k referenčnímu genu byl lineární v rozsahu dvou řádů. Křížová kontaminace Následné aplikace Každá druhá prohlubeň kazety na vzorky byla naplněna 5 mg homogenizované tkáně z myších jater a ve zbývajících prohlubních bylo pouze 200µl pufru (tj. vzor šachovnice). Po purifikaci MagNA Pure LC DNA nebyla pozorována žádná křížová kontaminace u 16 vzorků s pufrem po 40 cyklech PCR v systému LightCycler Carousel-based System (LightCycler 1.5 Instrument), zatímco 16 vzorků tkáně dávalo předpokládaný signál. DNA získaná z různých typů myších tkání byla testována pomocí PCR procesů v systémech LightCycler Carousel-based System (LightCycler 1.5 Instrument), blokových cyklérech, v systémech typu restriction digest a Southern blot. DNA byla vhodná pro všechny experimenty a vykazovala shodné nebo lepší chování v porovnání s DNA, připravenou konvenčními metodami. Podrobnější experimentální data a reprinty aplikací viz nebo se obraťte na vašeho zástupce firmy Roche. 17

18 4. Odstraňování poruch Shlukování perliček nebo jejich hromadění v zásobníku Rozložená DNA Malý DNA výtěžek Možná příčina Příliš velké množství vzorku, nebo neúčinná metoda homogenizace Částice MGP byly magnetické před použitím Vzorky byly špatně skladovány Příliš intenzivní homogenizace Vzorek neobsahuje dost materiálu Vzorek tkáně byl příliš velký Nedostatečná homogenizace Doporučení Vezměte menší množství vzorku (dle doporučení v kapitole Materiál vzorku ). Použijte doporučenou metodu homogenizace (viz 2.2.1) MGP nesmí přijít do styku s magnetem před použitím Používejte čerstvě zmražené vzorky. Nepoužívejte vzorky, které byly delší dobu vystaveny teplotě místnosti (15 až 25 C) Zkraťte dobu homogenizace Zvažte tkáň před použitím.optimální výsledky získáte s 1 10 mg tkáně. U některých typů tkáně je možno vyzkoušet použití většího množství (např. až 25 mg). Na jednu izolaci používejte vzorky 1-10mg. U některých typů tkáně je možno vyzkoušet použití většího množství (např. až 25 mg). Používejte doporučené metody homogenizace (viz 2.2.1) Nedostatečná čistota DNA Neuspokojivý výsledek PCR Uložení vzorků nebylo optimální Vzorek tkáně byl příliš velký Vzorek před homogenizací rozsekejte na malé kousky. Použijte intenzivnější homogenizaci Používejte čerstvě zmražené vzorky. Nepoužívejte vzorky které byly delší dobu skladovány při teplotě15 až 25 C. Zmenšete množství materiálu odebraného jako vzorek na hodnotu doporučenou v odstavci Materiál vzorku (1-10mg tkáně). Příliš mnoho DNA v PCR Zkontrolujte koncentraci DNA v eluátech a nastavte množství eluátu na PCR, nebo eluát zřeďte (např. 1 : 10). Optimum: ng/pcr, maximum. cca1 µg. Použijte méně výchozího materiálu pro izolaci DNA. Optimální výsledky dosáhnete s 1 10 mg tkáně na jednu izolaci Málo DNA v PCR Nastavte množství eluátu pro PCR, nebo použijte více výchozího materiálu. Optimum: ng/pcr, maximum: cca. 1 µg. 18

19 4. Odstraňování poruch - pokračování Možná příčina Doporučení - Použijte více výchozího materiálu - Vzorek odstředěním zkoncentrujte Nedostatečná čistota DNA Použijte méně materiálu jako vzorek pro izolaci DNA. Optimální výsledky získáte s 1 10 mg tkáně na jednu izolaci Eluáty mají načervenalou barvu Regenty a postup PCR není optimální Podmínky PCR nejsou optimální Z DNA získané z řezů tkáně fixovaných ve formalinu a zalitých v parafinu nevznikají žádné produkty PCR Minimální abraze magnetickými částicemi Zkontrolujte regenty PCR a postupy (protokoly) pomocí nějaké pozitivní kontroly DNA (např. lidská genomová DNA*). Optimalizujte PCR, např. přidejte do programu PCR nějakou počáteční denaturaci 30 s 3 min Zkontrolujte regenty PCR a postupy (protokoly) pomocí nějaké pozitivní kontroly DNA (např. lidská genomová DNA*). Jestliže je zjištěn (pro kontrolu) produkt PCR, zvolte nějaký menší amplikon PCR pro amplifikaci tkáně zalité v parafinu (např bp) (viz Ref. 2). Odstraňte jemné částice odstředěním při nízkých otáčkách (méně g) (např. 1000ot/min) Červená barva nemá při práci na přístrojích LightCycler vliv na PCR. 19

20 5. Dodatečné informace o tomto produktu Jak tento výrobek funguje Izolační kit MagNA Pure LC DNA Kit II se používá s přístrojem MagNA Pure LC k čištění vysoce kvalitní, nepoškozené DNA z 1-32 vzorků lidské nebo zvířecí tkáně. Izolovaná DNA splňuje normy pro jakost, vztahující se k vysoce citlivým a kvantitativním analýzám PCR, prováděných na systému Light Cycler 2.0. Princip testu Izolační postup je založen na technologii magnetických perliček. Vzorky se rozloží inkubací se speciálním pufrem, obsahujícím chemotropické soli a proteinázu K. Přidají se magnetické skleněné částice (MGP), na jejichž povrch se DNA naváže Nenavázané látky se odstraní několika promývacími kroky a potom se elucí izoluje vyčištěná DNA. Základní kroky izolačního postupu MagNA Pure LC DNA jsou:následující: Materiál vzorku je umístěn do jamek kazety na vzorky K vzorku se přidá lyzační / vazebný pufr, čímž dochází ke kompletní lýze buňky a uvolnění nukleových kyselin. Nukleázy jsou denaturovány. Ke vzorkům se přidá proteináza K, která rozštěpí proteiny. Nukleové kyseliny se navážou na povrch přidaných MGP, což je způsobeno chaotropními solemi, izopropanolem a vysokou iontovou silou lyzačního /vazebného pufru. MGP s navázanou DNA jsou magneticky separovány od rozloženého vzorku. MGP s vázanými nukleovými kyselinami jsou opakovaně promývány promývacím pufrem, aby se odstranily nenavázané látky jako proteiny (nukleázy), buněčné membrány, PCR inhibitory, jako jsou např. heparin nebo hemoglobin a aby se snížila koncentrace chaotropní soli. 20

21 5. Dodatečné informace o tomto produktu - pokračování Částice MGP s vázanou DNA se opět magneticky separují z promývacího pufru, obsahujícího rozštěpené zbytky vzorku. Vyčištěná DNA se eluuje při 70 C z MGP do prohlubní eluční kazety, zatímco MGP jsou udržovány v reakční špičce a pak vyřazeny. Základní kroky postupu izolace pomocí kitu MagNA Pure LC DNA Isolation Kit II (DNA II Tissue) jsou tyto: Izolace DNA je provedena automaticky pomocí přístroje MagNA Pure LC Instrument Ke všem vzorkům v kazetě na vzorky přidejte 20µl proteinázy K, zamíchejte a inkubujte 10 min. Do procesní kazety přidejte všechny požadované reagenty. K vzorku přidejte 300µl lyzačního / vazebného pufru, potom zamíchejte: uvolnění nukleové kyseliny a inaktivace nukleázy. Přeneste do 150µl suspenze MGP, pak míchejte a inkubujte. Přeneste perličky do 850µl promývacího pufru I, zamíchejte, oddělte částice. Přeneste perličky do 450 µl promývacího pufru II, zamíchejte, oddělte částice. Přeneste perličky do 450 µl promývacího pufru III, zamíchejte, oddělte částice. Přeneste perličky do elučního pufru (vyhřívací jednotka), zamíchejte, inkubujte, proveďte eluci DNA. zlikvidujte částice MGP jako odpad. Eluát přeneste do zásobní kazety (chladící jednotky) 21

22 5. Dodatečné informace o tomto produktu - pokračování Reference 1 Sambrook, J. a d. (1989) Molecular Cloning (molekulové klonování), A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 2 Wright, D.T. a d. (1990) Sample preparation from paraffin-embedded tissue. (příprava vzorků z tkáně, zalité do parafinu) In:Innis, M.A., Gelfont,D.H., Sninsky, J.J., White,T.J.,eds. PCR Protocols: A guide to methods an applications. San Diego: Academic Press, p ) 3 Fenollar, F. a d. (2006). Analysis of 525 Samples To Determine the Usefulness of PCR Amplification and Sequencing of the 16S rrna Gene for Diagnosis of Bone and Joint Infections. (analýza 525 vzorků s cílem zjistit použitelnost amplifikace PCR a sekvencování genu 165rRNA pro diagnózu infekcí kosti a s nimi souvisejících infekcí) J. Clin. Microbiol., 44, Woenckhaus, M. a d. (2005). Microsatellite Analysis of Pleural Supernatants Could Increase Sensitivity of Pleural Fluid (mikrosatelitní analýza pleurálních supernatantů mohla zvýšit citlivost pleurální tekutiny) Cytology. Mol. Diagn., 7, Řízení jakosti DNA se izoluje z myší tkáně pomocí standardního postupu a analyzuje pokud jde o neporušenost, výtěžek a možnost amplifikace v přístroji LightCycle na bázi karuselu. Typická experimentální data viz kap

23 6. Dodatečné informace 6.1 Konvence Textové konvence Aby informace byly konzistentní a snadno zapamatovatelné, jsou v tomto instrukčním manuálu použity následující textové konvence: Textová konvence Používání Očíslované etapy postupu Jedná se o etapy postupu, které atd. obvykle následují za sebou v tomto pořadí Očíslované pokyny atd. Kroky v postupu, které je nutno v tomto pořadí provést. Hvězdička * Označuje produkt, který dodává společnost Roche Applied Science Symboly Zkratky V tomto návodu se používají následující symboly k zvýraznění důležitých informací: Symbol Popis Informační poznámka: Přídavná informace týkající se aktuálního tématu nebo postupu. Důležitá poznámka: Informace která rozhodující význam pro úspěch postupu nebo pro používání výrobku. Zkratka Smysl CP Průsečík CV Koeficient variance MGP Magnetické skleněné částice 6.2 Změny oproti předchozí verzi Přidány postupy (protokoly) pro operace před vlastní izolací Kompletně revidovaná struktura textu 23

24 6.3 Informace týkající se objednávání Roche Applied Science nabízí velký výběr reagenčních činidel a systémů pro výzkum vědy o životě. Chcete-li získat úplný přehled o souvisejících výrobcích a příručkách, navštivte naši webovou stránku a také stránky se speciálními informacemi od nás, jako: řada výrobků MagNA Pure pro automatizovanou izolaci nukleových kyselin, včetně informací o plastech na jedno použití, příslušenství, izolačních soupravách a o jiných souvisejících výrobcích: systémy PCR v reálném čase (LightCycler Carousel-based System, LightCycler 480 System, a Universal ProbeLibrary): Přístroje a příslušenství Soupravy MagnaPure LC k izolaci DNA Výrobek Obsah balení Katalog. č. Přístroj: MagNA Pure LC 1 přístroj plus příslušenství Instrument Chladící blok: MagNA Pure 1 chladící blok s 32 adaptéry LC cooling block, adaptéry k odstředivce: LC Centrifuge Adapters LightCycler k odstředivce Chladící blok: MagNA Pure 1 chladící blok Cooling Block LC, karusel na vzorky: LC Sample Carousel Chladící blok: MagNA Pure 1 chladící blok LC Cooling Block, deska PC s 96-prohlubněmi: 96-well PCR Plate Polohovací rám: DNA II 1 rám Positioning Frame 03 Těsnění kazety: MagNA 200 těsnění Pure LC Cartridge Seal MagnaLyse Instrument 1 přístroj (220 V) 1 přístroj (110 V) Zelené perličky: MagNA Lyser Green Beads 03 LightCycler 480 Instrument LightCycler 2.0 Instrument LightCycler 1.5 Instrument Karuselová odstředivka: LC Carousel Centrifuge 2.0 Souprava k izolaci DNA: MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I 1) (plus rotor a blok chlazení rotoru) 100 zkumavek přístroj (96 prohlubní) přístroj (384 prohlubní) přístroj plus příslušenství přístroj plus příslušenství odstředivka plus rotor (230 V) 1 odstředivka plus rotor (110 V) souprava (192 izolací)

25 6.3 Informace týkající se objednávání - pokračování Soupravy MagNA Pure LC pro izolaci DNA Soupravy k izolaci RNA/ mrna Výrobek Obsah balení Katalog. č. Izolační souprava: MagNA 1 kit (192 izolací) Pure LC DNA Isolation Kit III (bakterie, houby) 1) Izolační souprava DNA pro velký objem: MagNA Pure LC DNA Isolation Kit - Large Volume 1) 1 kit 96 izolací z 1 ml krve 192 izolací z µl krve 288 izolací z µl krve 192 izolací z krevních buněk 192 izolací z buněk Souprava k izolaci DNA: MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I Lysis / binding Buffer Refill (náhradní náplň lyzačního / vazeb. pufru) Souprava k izolaci RNA: MagNA Pure LC RNA Isolation Kit High Performance (velký výtěžek) 1) Souprava k izolaci RNA: MagNA Pure LC RNA Isolation Kit lii (Tissue) (tkáň) 1) Souprava k izolaci mrna: MagNA Pure LC mrna Isolation Kit I (Blood, Blood Cells) (krev, krevní buňky) 1) Souprava:k izolaci mrna: MagNA Pure LC mrna Isolation Kit II (Tissue) (tkáň) 1) Souprava k izolaci mrna: MagNA Pure LC mrna HS Kit 1) kultury 100 ml kit (192 izolací) kit (192 izolací) kit (192 izolací) kit (192 izolací) kit (192 izolací) Soupravy MagNAPureLC pro úplnou izolaci nukleové kyseliny Související soupravy a reagenty Souprava k úplné izolaci nukleové kyseliny: MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit 1) Souprava k úplné izolaci nukleové kyseliny: MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit - Large Volume 1) (velký objem) Souprava k úplné izolaci nukleové kyseliny: MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit I Lysis/binding Buffer Refill (náhradní náplň lyzačního / vazeb. pufru) RNase A Lidská genomová DNA:11 1 kit (192 izolací) kit (192 reakcí) ml mg 100 mg

26 6.4 Ochrana licencí Nákup izolační soupravy MagNA Pure LC DNA Isolation Kit II (tkáně) neznamená převod licencí ani jiných práv na provádění PCR. 1) Zakoupení tohoto výrobku neznamená převod licencí ani jiných práv na provádění PCR. Licenci na technologii použitou pro systém LightCycler Carousel-based System poskytla společnost Idaho Technology Inc., Salt Lake City, UT, USA. Obchodní značky LIGHTCYCLER, LC, MAGNA PURE, MAGNA LYSER a HYBPROBE jsou obchodní značky firmy Roche. Jiné názvy nebo druhy zboží jsou obchodními značkami, které patří příslušným majitelům. 26

27 27

28 Kontakt a podpora Jestliže máte nějaké otázky nebo problémy s tímto nebo jakýmkoliv produktem RAS (Roche Applied Science), obraťte se na náš personál technické podpory. Naši vědci jsou připraveni poskytnout vám rychlou a účinnou pomoc. Čekáme, že se s námi spojíte, budete-li mít návrhy na zlepšení provozních vlastností produktu RAS, nebo na použití našich výrobků novými, nebo specializovanými způsoby. Taková informace od zákazníků se opakovaně ukázala jako neocenitelná pro RAS a celosvětovou výzkumnou komunitu. Chcete-li nám položit nějaké otázky, vyřešit problémy, navrhnout zdokonalení nebo ohlásit nové možnosti aplikace, využijte naši technickou on-line podporu na stránce /support Pokud nám chcete volat, psát, faxovat, nebo nám posílat ové zprávy, navštivte naši domovskou stránku Roche Applied Science, a zvolte vaši domovskou zem. Zobrazí se kontaktní informace přizpůsobené této zemi. Na naší domovské stránce zvolte položku Printed Materials (tištěné materiály) a zobrazí se vám detailní technické manuály protokoly Lab FAQS a odkazy na výzkum.na úseku vědy o životě naše kvartální biochemické informační bulletiny materiálové bezpečnostní listy příbalové letáky a instrukce o produktu, nebo si můžete vyžádat kopie tištěných materiálů Roche Diagnostics GmbH Roche Applied Science Mannheim Germany