Spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR)

Transkript

1 Václav Míka a kol. Spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR) Výběr praktických aplikací v zemědělství METODIKA PRO PRAXI Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i. 2008

2 Metodika vznikla za finanční podpory MZe a je výstupem řešení výzkumného záměru VÚRV, v. v. i., reg. č.: MZE Principy vytváření, kalibrace a validace trvale udržitelných a produktivních systémů hospodaření na půdě. Foto na obálce : Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i., 2008 ISBN

3 Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i. v Ústavu zemědělské ekonomiky a informací, Slezská 7, Praha 2 Václav Míka, Alois Kohoutek, Pavel Nerušil Spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR) Výběr praktických aplikací v zemědělství METODIKA PRO PRAXI Praha 2008

4 Metodika shrnuje naše zkušenosti s provozem přístroje NIRSystems 6500 na VS Jevíčko od roku 1995 při měření parametrů kvality objemné píce, semen řepky, půd a dalších vzorků. Vedle běžných rozborů byly kalibrace pořízeny rovněž k predikci frakcí N v krmivech (PDI), vodorozpustných sacharidů (WSC), energie (ME, NEV, NEL), některých specifických látek (IANP), k botanickému rozboru sena z dočasných a trvalých travních porostů a rozpracována je otázka predikce příjmu píce zvířetem. Jsou tu uvedeny příklady dalších aplikací NIR v zemědělství, potravinářství aj. v přítomnosti i v nejbližším výhledu, včetně předností i omezení nasazení pro rutinní měření. Jedná se o metodu na výrazném vzestupu, která má reálné předpoklady se prosadit i v našem zemědělství s ohledem na rychlost (2 minuty jeden vzorek), přesnost, ekologickou nezávadnost rozboru, přičemž např. proměřená semena neztrácejí klíčivost a lze je vysít. Vzorek se měří v suchém semletém stavu, lze však i v přirozeném (neupravovaném) stavu, např. siláže, čerstvá píce, a při měření se nespotřebovává. Klíčová slova: NIR spektroskopie; kvalita rostlinných výrobků; metodiky rozborů; laboratorní kontrola Metodika je určena pro zemědělskou praxi, poradce v oblasti zemědělství, pracovníky ve výzkumu, zemědělském školství a šlechtění. Pro její využití byla uzavřena smlouva se Svazem marginálních oblastí se sídlem Horní Police č. 1. SMO doporučuje tuto metodiku pro využití v praxi. Metodika byla schválena Ministerstvem zemědělství ČR odborem vědy a výzkumu k datu pod č.j / a doporučuje se její využití v zemědělské praxi.

5 Obsah Cíl metodiky 5 Úvod 5 Srovnání novosti postupů 6 1. Historie vývoje techniky NIR a základy měření Nástin teorie NIR spekter Měření reflektance (odraženého světla, R) nebo transmitance (v procházejícím světle, T) Derivatizace spekter Referenční metody Strukturalizace populací Kalibrace Regresní modelování Externí validace Ověření kalibrace na slepo Používání repeatability file při kalibracích Globální, lokální a rozšířené kalibrační rovnice Testy na outliery jejich interpretace Přístrojové sítě Rutinní měření Statistika při měření NIR Chemometrické metody analýzy NIR spekter Kvalitativní analýza Kvantitativní analýza pomocí NIR Příklady aplikací Aplikace na bázi kvalitativní NIR analýzy Aplikace na bázi kvantitativní NIR analýzy NIR v systému kontroly deklarované kvality zemědělských a lesnických produktů s chráněnou známkou Potenciál NIR analýzy a výhled 40 LITERATURA 42

6

7 Cíl metodiky Na základě téměř 15 letých zkušeností s využíváním techniky NIRS k hodnocení kvality rostlinných výrobků předložit v uceleném pohledu předložit možnosti využití vysoce progresivního postupu, přitom ekologicky šetrném k životnímu prostředí, v oblasti operativního a exaktního hodnocení kvality potravinářských surovin a výrobků (např. kvalitu semen řepky, obilovin, luskovin), dále výživné hodnoty krmiv (např. objemné píce v čerstvém i konzervovaném stavu), rozbor složení směsných vzorků (botanické složení píce z travních porostů, zastoupení komponent v krmných směsích apod.), monitoringu půdních charakteristik aj. Metodika je určena pro potřeby kontroly v zemědělském provozu, ve sféře operativního rozhodování na základě exaktních rozborů, dále ve šlechtění a odrůdovém zkušebnictví (šlechtitelé zemědělských plodin, ÚKZÚZ), zemědělské vědě a výzkumu a také dalších zájemců z řad odborné zemědělské praxe a poradenství. Přínosem je podstatné zvýšení efektivnosti a rychlosti prováděných exaktních rozborů ve smyslu naplnění praktických potřeb široké obce uživatelů, dále významná podpora ve sféře rozhodování, monitoringu procesů v oblasti primární zemědělské výroby až po oblast zušlechťování jejich produktů. Je v ní poukázáno na další směry rozvoje techniky NIRS a využití ve sféře zemědělské praxe, šlechtění a výzkumu opřené o fundované zkušenosti řešitelského kolektivu. Úvod Čas širokého praktického využití spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR) již nastal i v podmínkách ČR. Tato technika nabývá na popularitě zejména pro kvantitativní analýzu v průmyslu, službách, a ne naposledy i v zemědělství a lesnictví. Její potenciál je však daleko větší, proto v této publikaci chceme upozornit na další možnosti jejího praktického využití v zemědělství s upozorněním na event. limity nasazení. Pro potenciální uživatele proto podáváme průřezovou informaci, se zaměřením na rutinní analýzy velkých sérií poměrně stejnorodých vzorků, při

8 nichž se klade zvláštní důraz na rychlost, přesnost a nízké jednotkové náklady. Všechny tyto požadavky NIR může kvalitně plnit: Je to metoda nedestruktivní, t.j. vzorek se ani nerozkládá ani při analýze nespotřebovává, není potřeba žádné náročné přípravy vzorku k rozborům, měření s vyhodnocením trvá méně než ca 2 minuty, simultánně lze měřit více parametrů. Podstatné je, aby materiál obsahoval vazby C H, N H, S H či O H a koncentrace měřené látky v něm byla větší než ca 1 g.kg 1. V zásadě lze měřit vzorky všech tří skupenství, při obvyklé teplotě. Měřící přístroj ve spojení s počítačem může fungovat jako stacionární (např. v laboratoři s měřením přímo na místě či k měření v okruhu několika metrů pomocí externího čidla k přístroji připojeného kabelem ze skleněných vláken) nebo jako mobilní (na sklízecím stroji, na dopravním prostředku pohybujícím se po pozemku a pod.). Měření lze provádět jako jednotlivá nebo kontinuální (ve zvoleném časovém intervalu). Pro konkrétní požadavky měření je třeba zvolit určité uspořádání a technické vybavení. Jelikož se jedná o metodu sekundární, tj. její přesnost se vždy musí testovat na metodu standardní (např. klasické metody mokré chemie ), nelze a priori očekávat, že přesnost NIR analýzy bude vyšší než metody se kterou je tato srovnávána. Technika NIR může přinášet užitečné informace řídícím pracovníkům ve výrobě k operativnímu rozhodování, pracovníkům kontroly jakosti na všech stupních, nákupu zemědělských a potravinářských surovin a výrobků, ve sféře obchodu k objektivizaci ceny ve vazbě na kvalitu atd. Hodnota těchto rychlých informací se zužitkuje zvláště tenkrát, budou-li součástí určitého vytvořeného systému na podporu jakosti, jak je naznačeno u některých příkladů aplikací v druhé polovině publikace. Pokud čtenář nalezne alespoň pár pro něj zajímavých tipů, snaha autorů nebyla marná. 6 Srovnání novosti postupů Metodika shrnuje nejnovější tuzemské a zahraniční poznatky a zkušenosti s přístrojem NIRSystems 6500 na VS Jevíčko při měření parametrů kvality objemné píce, řepky, půd a dalších vzorků. Vedle běžných rozborů byly kalibrace nově pořízeny rovněž k predikci frakcí N v krmivech (PDI), vodorozpustných sacharidů (WSC), energie (ME, NEV, NEL), některých specifických látek (IANP), k botanickému rozboru sena z dočasných

9 a trvalých travních porostů a rozpracována je otázka predikce příjmu píce zvířetem. Jsou tu uvedeny příklady dalších aplikací NIR v zemědělství, potravinářství aj. v přítomnosti i v nejbližším výhledu, včetně předností i omezení nasazení pro rutinní měření. Jedná se o metodu na výrazném vzestupu, která má reálné předpoklady se prosadit i v našem zemědělství s ohledem na rychlost (2 minuty jeden vzorek), přesnost, ekologickou nezávadnost rozboru, přičemž změřená semena neztrácejí klíčivost a lze je vysít. Vzorek se měří v suchém semletém stavu, lze však i v přirozeném (neupravovaném) stavu, např. siláže, čerstvá píce, a při měření se nespotřebovává. V evropském rozměru se rozvíjí vytváření sítí přístrojů měřících kvalitu semen řepky a dalších komodit s využitím jednotných kalibračních rovnic a jednotných metodických postupů. 1. Historie vývoje techniky NIR a základy měření Objev NIR energie se připisuje Williamu Herschelovi, který v r publikoval zprávu o záření za viditelnou oblastí červeného spektra. Až do začátku 2. světové války se oblast NIR pro spektroskopii nepovažovala za užitečnou, neboť NIR pásy se velice překrývají a bylo je obtížné interpretovat. NIR pokrývá přechod od viditelné oblasti spektra (VIS, nm) do střední infračervené (MIR, nm), tedy nm, resp. vlnočty cm 1. V ní se nalézá většina vibrací vazeb CH, OH, SH a NH. Všechny absorpční pásy jsou výsledkem svrchních tónů (angl. overtones) či kombinací přechodů do základních MIR pásů /1/. O teorii NIR bylo vydáno mnoho příruček a vědeckých pojednání /např. 2, 3, 4/. Většina aplikací kvantitativní analýzy prováděné v reflektanci se odbývá v oblasti nm. Pod 1200 nm jsou totiž absorpční pásy tak slabé, že měření reflektance je obtížné, zatímco nad 2500 nm jsou absorpční pásy příliš silné a měření je rovněž obtížné. Zájem o NIR vzrostl v letech padesátých minulého století na základě zjištění, že vodíkové (X H) stretching vibrace jsou odpovědné za téměř všechny absorpční pásy v NIR oblasti. To v letech šedesátých vedlo k vývoji metody monitorování obsahu vody v různých materiálech. Zjištění, že zrniny vykazují v oblasti NIR specifické absorpční pásy, vedlo Karl Heinz 7?

10 Norrise v r k převratnému návrhu, použít NIR spektrometru s filtry 1680, 1940, 2100, 2180, 2230 a 2310 nm ke stanovení obsahu bílkovin, vody v zrnu obilovin, resp. bílkovin, oleje a vody v sojových bobech. V sedmdesátých letech Norris se spolupracovníky /5, 6/ na přístroji Cary* 14 se scanujícím monochromátorem ukázali, že v pícninách lze stanovovat parametry kvality, včetně stravitelnosti (bilančně stanovovanou na skopcích) a příjmu píce. Již v r Shenk se spolupracovníky /7, 8/ umístili NIR přístroj na dodávkový automobil tak, aby se mohl použít v terénu, přímo na amerických farmách a při obchodu se senem. Od r byly dodávány komerční filtrové přístroje se softvérem pro analýzy pícnin a krmiv. Pro další rozvoj techniky NIR měl mimořádný význam technický pokrok ve vývoji přístrojů a též optických vláken, dovolující delokalizaci měření (pomocí optické sondy) v pevných a kapalných materiálech. Záření se vede optickými vlákny ze zdroje do vzorku a odtud zpět na detektor, kde se snímají NIR spektra vzorku /9/. Vedle toho pro další rozvoj techniky NIR měl velký význam též pokrok v počítačích a vývoj nových matematických metod dovolujících globální zpracování obrovských datových souborů. Zatímco MIR spektra a zejména absorpční spektra lze přímo interpretovat díky specifickým vlastnostem chemických piků, NIR spektra se interpretují obtížně. K tomu je zapotřebí chemometrie. To je disciplina, využívající matematické a statistické metody pro výběr optimálního experimentálního postupu a zpracování dat chemické analýzy. Pokrývá problematiku uspořádání pokusu, metod získávání informací (modelování, klasifikace a testování hypotéz a techniky k pochopení chemických mechanismů (viz kap. 2). O ní byla vydána řada dobrých příruček /např. 10, 11, 12/ Nástin teorie NIR spekter Molekula je schopna absorbovat elektromagnetické záření tím, že mění stav svého elektronového obalu vibračními pohyby atomů a svojí rotací jako celku. Tomu odpovídají tři druhy energetických přechodů: elektronový, vibrační a rotační. Vibrace a rotace molekul se řídí zákony kvantové mechaniky. Principiálně, vibrační pohyb v nejjednodušším případě dvouatomové molekuly lze popsat modelem harmonického oscilátoru /4, * nyní společnost Varian 8

11 9/, kde vibrující hmoty m 1 a m 2 vedou ke změnám internukleární vzdálenosti < 10 %. Ve skutečnosti lze ve spektrech pozorovat kromě základních frekvencí i vibrace s násobným vlnočtem (harmonické) a vibrace součtové (kombinační). Odtud vyplývá, že molekula se ve skutečnosti chová jako anharmonický oscilátor. Pohyb molekuly tedy vede k emisi nebo amsorpci záření Vibrace polyatomové molekuly si lze představit jako soubor vibrací řady oscilátorů, jejichž pohyby jsou na sebe vázány a vzájemně se ovlivňují. S výjimkou plynné fáze a aplikací při vysoké teplotě NIR zahrnuje molekulární absorpci svrchních tónů ( nm) a kombinačních pásů ( nm) obr. 1. NIR absorpční pás se vytváří, jestliže NIR záření při specifické frekvenci vibruje na téže frekvenci jako molekulární vazba ve vzorku. Údaje NIR bodů ze vzorku se obvykle sbírají ve formě log reciproké hodnoty reflektance (log 1/R). Pásy se definují umístěním, výškou a šířkou. Nejpřesněji lze měřit polohu pásu, avšak výška a šířka v případě překrývání vedle sebe ležících pásů se může projevit posunem pásu či změnou polohy zbývajících překrytých pásů. 0,300 C H vibrační spektrum 0,225 oblast overtónů kombinační pásy O H N H N H log(1/r) 0,150 O H N H S H 0,075 0, Vlnová délka (nm) 1. Obecné znázornění X H vibračních informací v zemědělských produktech /13/ 9

12 1.2. Měření reflektance (odraženého světla, R) nebo transmitance (v procházejícím světle, T) Jestliže světelný tok (I 0 ) dopadá na vzorek, některé fotony mohou vzorkem procházet (I t ), odrážet se od vzorku (I r ) či být absorbovány (I a ) rezonujícími kovalentními vazbami vzorku, které fyzikálně fungují jako oscilační můstek, přesně zachycující frekvenci (nebo vlnovou délku) NIR záření. Absorpce je proto na určitých frekvencích selektivní a poskytuje informace o molekulárních skupinách v chemické struktuře vzorku. Absorbované protony vyvolávají molekulární vibrace, které se roztýlí ve vzorku a projeví jako jeho nepatrné zahřátí. Při měření R i při měření T se rovná dopadající I součtu I, I a I 0. Při měření T se I měří v černé kyvetě s roztokem (jako kontrolou) a I 0 r v neznámém a t r vzorku (t.j. vzorku dodaném ke změření). U neznámého vzorku se tedy měří procházející tok I tak, že I t a se získává jako rozdíl. V případě měření T je vrstva vzorku dostatečně tlustá (neprůhledná, t.j. I = 0), zatímco I se t 0 měří v porovnání s matnou (nelesklou) difuzně odrážející bílou plochou, která neabsorbuje. U neznámého vzorku se pak měří I a I r se získává jako a rozdíl. Odražený tok záření I r představuje zrcadlovou reflexi, k níž je přidána difusní reflexe. Z toho vzniká problém rozptylu podle velikosti částic (angl. particle size scattering), k jehož překonání při NIR analýze je nutný počítač. Difuzně reflektující komponent proniká částicemi vzorku a je vystaven různému stupni absorpce než se dostane zpět či znovu vyzáří ze vzorku na různých frekvencích či vlnových délkách, vykazující zmenšení své intenzity o absorpci. Z toho je zřejmé, že T i R způsob měření poskytuje stejné absorpční profily. V případě T je absorbance (A) definována jako log 1/T (tedy log I 0 / I t ) a v případě R je absorbance definována jako log 1/R (tedy log I 0 / I r ). V obou případech platí Lambert Beerův zákon, který říká, že absorbance při jakékoliv vlnové délce je úměrná počtu absorbujících molekulárních chromoforů na jeho délce dráhy průniku vzorkem, tedy molární koncentraci. A = k.c.d, kde k = konstanta, c = koncentrace a d = dráha. U opticky jasných roztoků se může dráha (síla kyvety) používat jako neměnná (obvykle 1 cm), takže vztah absorbance a koncentrace je lineární. Avšak při způso- 10

13 bu R, resp. u vzorků pevného skupenství obecně, rozptyl záření znamená, že dráha se nemůže kontrolovat a máme tu problém o dvou neznámých (c, d). Proto je třeba měření alespoň při dvou vlnových délkách k řešení dvojice rovnic. Při praktické kalibraci NIR se používají měření absorbance při více vlnových délkách, za použití multivariačních metod modelování k tomu, aby se ze spekter vyextrahovaly potřebné informace. Obecně lze analyzovat směs látek řešením matric za použití měření mnoha vlnových délek. Tak je tomu např. při uměle vytvořených směsích čistých substancí (např. ve farmacii), ale je to způsob těžko použitelný při analýze přírodních produktů (např. píce). Úskalí je, že suchý semletý rostlinný materiál je složen z částeček, jejichž reflektanční spektra budou zahrnovat celou škálu v závislosti na velikosti částeček a rozdílech v refrakčním indexu mezi částečkami a póry (většinou vzduch). Naopak mokré vzorky (např. siláž o sušině 22 %) se bude zdát mnohem tmavší a mít větší hloubku průniku paprsků (vzhledem k výskytu vody převážně v pórech). V případě mokrých vzorků je způsob měření T zjevně vhodnější než R. Nicméně dnešní přístroje dokážou úspěšně a přesně měřit absorbanci na úrovni 2 3 jednotek absorbance, kde se dostává do detektoru pouze 1 0,1 % dopadajícího světla. Ačkoli jednotlivé údaje NIR snímané monochromátorem se zdají být jako spojité spektrum (obr. 2), protože se jedná o absorpční pásy, tyto se ve skutečnosti překrývají. Pásy jsou definovány třemi kritérii: polohou, výškou a šířkou. Protože šířka pásu se měří v polovině výšky, mnoho absorpčních pásů této výšky nedosahují a mají tvar ramen. To způsobuje závažné odchylky od běžného tvaru pásu, aniž by tento dosáhl místního maxima. Typické spektrum pícnin obsahuje 7 10 piků s mnoha rameny. Při překrývání pásů (složené pásy) může změna výšky jednoho pásu vyvolat posun polohy piku. Za této situace se poloha piku stanovuje z odvozených (derivovaných) spekter. Charakteristiky piků jsou tedy stanovovány kombinací rozvinutí a rozložení spekter, přičemž krok při rozvinutí bývá 5 10 nm. Např. transmisní spektrum čisté vody se jeví jako jednoduché ve tvaru log (1/R). Jestliže se rozloží, objeví se řada podružných piků. A tak absorpčí pásy vody v pícninách při a se sestávají z mnohonásobně překrývaných jednotlivých pásů, jejichž poloha se mění podle typu vzorku. 11

14 0,9 0,7 log(1/r) 0,5 0,5 0,1 Vlnová délka průměr (nm) Průměrná spektra trav (spodní čára), jetelovin (prostřední čára) a bylin (horní čára) /20/ Pokud se jedná o vliv velikosti částic ve vzorku, hlavní efekt jejich kolísání je, že rozšiřují či zužují spektum součinitelem velikosti. Protože to není nezbytně třeba vztahovat k chemickému složení, efekt se hodnotí jako interference, která se eliminuje matematicky nebo se prostě ignoruje. Tak třeba mnohonásobnou lineární regresí se vyrovnává mnohonásobný rozptyl až na průměrnou hodnotu kalibračního souboru. Rovněž i transformace spekter minimalizují vliv různé zrnitosti, třebaže pouze eliminují posun od základny, nikoli však mnohonásobný efekt rozptylu. Matematicky se rušivý účinek odlišné velikosti částic ve vzorku může eliminovat Fourierovým rozvinutím (anglicky deconvolution), odklonem (detrending) a standardní transformací normálního rozdělení četností (standard normal variate transformations), mnohonásobnou korekcí rozptylu (multiplicative scatter corrections), vyloučením hlavních komponent (principal components elimination), a současným odstraněním vlivu velikosti částic a kolísání obsahu vody. Tyto korekce na velikost částic nemusí vždycky vést ke zlepšení přesnosti NIR analýzy. Jednak žádná z nich rušivé vlivy neodstraní 100%ně a jednak samo zastoupení velikostních částic ve vzorku poskytuje samo o sobě dobrou informaci pro kalibraci. Průměrná velikost částic ve vzorku a jejich rozdělení jsou nepřímým ukazatelem chemického složení 12

15 vzhledem k interakci s různými strukturami rostliny (stébla versus listy, způsob sušení a mletí atd.). Měřené zemědělské materiály však nejsou nikdy dokonale homogenní a vždy vyvolávají rozptyl dopadajícího záření. Dochází ke ztrátám energie, např. odrazem záření od vzorku. Proto se v NIR měří t.zv. difuzní reflektance a nemluví se o absorbanci nýbrž o optické hustotě. Běžně se využívá pro měření suchých vzorků (jemně zrnité až práškovité struktury). Měření v transmitančním modu se dává přednost u kapalných a kašovitých vzorků. V poslední době se začínají více prosazovat NIR spektrometry s Fourierovou transformací (FT NIR). Pracují na principu interference záření, kdy se získaný signál matematickou operací převede na infračervené spektrum. V podstatě jde o spojení s interferometrem, nejčastěji Michelsonova typu, s citlivým detektorem a počítačem. Jako příklad budiž jmenován přístroj ANTARIS fy Nicolet Instruments (9), s možnostmi výběru způsobu měření podle přání zákazníka v reflektanci, transmitanci či vláknivou optikou. Oproti disperznímu fotometru má tu výhodu, že stejný vzorek se proměřuje za stejnou dobu vícekrát a díky tomu je lepší výsledný poměr signálu a šumu (tzv. Felgetova multiplexní výhoda). Dále na jejich detektor dopadá většina emitovaného záření, a proto lze využívat i techniky s energetickými ztrátami (t.zv. Jacquinova energetická výhoda). Přistupují ještě další přednosti /9, 18/. Snímat spektra lze i akusticky (ultrazvukem), čímž se podstatně urychlí rychlost snímání a v přístroji absence pohyblivých částí zvyšuje jeho spolehlivost. Jsou to t.zv. AOTS spektrometry, které představují nejmodernější vývojový stupeň. Nacházejí uplatnění ve výrobě i v laboratoři /9/ Derivatizace spekter Spektra zemědělských vzorků vykazují v oblasti NIR obvykle ca 10 piků /13/. Ke zlepšení vypovídací schopnosti (potlačení rušivých momentů, dát přednost užitečným informacím) je lze derivovat matematickými postupy D, G, S 1 a S 2, kde D znamená pořadí derivace, G vzdálenost mezi body, které se používají k výpočtu rozdílů, S 1 a S 2 počet bodů k vyhlazení dat (vyrovnání průběhu). Derivatizace log (1/R)1. řádu poskytuje křivku s piky a údolími, které korespondují s body inflexe na každé straně log (1/R) piku. Derivatizace 13

16 2. řádu bývá užitečná, neboť zachovává intensitu a polohu pásů a zlepšuje se rozlišitelnost pásů. Při použití malého kroku (G) při ní ve spektru většiny zemědělských produktů (2,2,2,1) se objevuje piků. Hlavní výhodou je, že derivace 2. řádu generuje jen ojediněle piky v negativním smyslu. Derivatizace třetího řádu se používá k interpretaci spekter zřídka a produkt se nechá interpretovat ještě obtížněji než při 1. derivatizaci. Derivatizace 4. řádu bývá velice užitečný matematický postup pro interpretaci spekter. Velmi krátký krok (G) při 4,4,3,1 vyvolává zřejmých absorpčních piků. Jejich poloha se tak stává zřetelnější, neboť se tolik nepřekrývají. Na druhé straně mohou se objevovat některé matematické artefakty /13/ Referenční metody NIR spektrum je přesně určeno na základě X H vazeb ve vzorku. Je to souhrn NIR absorpčních pásů fukčních skupin určujících hlavní chemické a fyzikální vlastnosti píce. Naproti tomu referenční metoda, na jejíž výsledky se kalibruje NIR, mnohdy není dobře definována chemicky, takže není vždycky snadné k ní vztáhnout spektroskopická data s náležitou přesností. Např. obsah vody se běžně stanoví sušením vzorku při 105 C do konstantní váhy nebo při 135 C po 2 hodiny. Ve skutečnosti i po této proceduře rostlinný materiál obsahuje ještě zbytkovou vodu, zatímco jiné těkavé (nevodné) látky nekontrolovaně unikají. Proto NIR měření obsahu vody poskytlo shodnější výsledky s alternativní metodou podle Karl Fishera (titračně) než s uzanční metodou sušením. Při stanovení dusíkatých látek (NL)se podle klasického postupu vychází z obsahu N vynásobeného faktorem 6,25 (s ohledem na průměrný obsah N v rostlinné bílkovině). NIR je schopna měřit N H molekulární vazby, zastoupené v molekule bílkoviny. Nepřekvapuje, že shoda NIR měření byla lepší s obsahem N ve vzorku než s obsahem NL. Při predikci netto energie pomocí NIR jsme dosáhli daleko lepších výsledků byla-li tato vyjádřena jako NEL či NEV v porovnání se š.h. /25/. Vyplývá to ze samotného postupu výpočtu š.h., který používá odhad koeficientů stravitelnosti jednotlivých živin (subjektivní odečet z tabulek) a další průměrné koeficienty, korekci na vlákninu atd. Koncepce stanovení NEL či NEV se více blíží exaktním principům. Přesnější predikce NEL či NEV jsme dosáhli, pokud jsme predikovali obsah jednotlivých živin a výpo- 14

17 čet provedli standardním postupem, než když se predikovala NEL či NEV pomocí NIR přímo. Podobně i stravitelnost in vivo lze přesněji predikovat jako stravitelnost in vitro a s použitím regresních rovnic (in vitro vs. in vivo) provést následně kalkulaci na in vivo než ji predikovat přímo. Dalším zdrojem disproporcí se může stát vzorkování (odběr průměrného vzorku a následná homogenace), sušení (ke kalibraci celého souboru vzorků se doporučuje používat pouze jednu metodu sušení), mletí (vzorek se při něm nesmí zahřívat /26/, a velikost síta by měla být normalizována, např. 1 mm), promíchání vzorku a plnění do kyvet. Dříve se prezentace vzorku omezovala na suché semleté seno či semleté zrniny. Dnešní přístroje a software dovolují prezentaci celých semen (nasypaných do kyvety nebo analýzu jednotlivých semen), píce v jejich přirozené podobě (sena, siláží, čerstvé píce, napěchovaných ručně do kyvet většího objemu). Nám se osvědčilo měřit referenční vzorky vícekrát a z dílčích výsledků vypočítat medián. Průměr je méně vhodný Strukturalizace populací Pomocí postupu CENTER a SELECT lze vybrat z početných kolekcí vzorků zástupce s charakteristickými spektry, které jsou potřeba ke kalibraci. Oba postupy používají metodu hlavních komponent ke zhuštění informací o celém spektru na malý počet bodů, a hodnoty vzdálenosti sousedů H (Mahalanobis distance). Postup SELECT vychází z předpokladu, že pro reprezentaci vzorků se stejnými sousedy postačí pouze jeden vzorek. Kalibrační soubor musí nejen stejnoměrně pokrývat celé rozpětí spekter a obsahových látek v měřené kolekci vzorků, ale i rozpětí typů vzorků Kalibrace Je to pojem používaný k popsání postupu konverze informací o NIR absorpci do hodnot laboratorní referenční metody. Přesnost této konverze se posuzuje na základě směrodatné odchylky kalibrace (SEC) a směrodatné odchylky predikce (standard error of performance, SEP). SEP při úspěšné NIR kalibraci bývá asi dvojnásobně veliká ve srovnání se směrodatnou odchylkou při laboratorním stanovení. Vlastní postup je znázorněn na obr

18 Vzorky ke kalibraci by měly být odebrány z podobných souborů, které by se měly měřit v budoucnosti. Rovněž i příprava (sušení, mletí, skladování atd.) by měla být podobná přípravě vzorků, které se budou sériově měřit. Je třeba získat co nejširší škálu vzorků s různým chemickým složením, nejen svoji zájmovou oblast pro momentální měření. Získat dostatek extrémních vzorků však neznamená zařazovat sem vzorky, které do zájmového souboru exidentně nepatří! Naše zkušenosti ukazují, že kalibrace postavená na méně než 100 vzorcích bývá málokdy dostatečně robustní, ledaže by se jednalo o velmi jednoduchá stanovení (např. voda, N) u relativně homogenních materiálů (např. jednotlivé druhy obilovin). Referenční hodnoty by měly vycházet ze zaručených (přesných) rozborů, provedených duplicitně a zprůměrovaných (pokud vyhovují toleranci). Při dodatečné kontrole vzorků, které vybočovaly z běžného okruhu měření (outliers), se nám ve 45 % případů ukazuje, že se jedná o vzorky nepřesně analyzované klasickými postupy mokré chemie, a zbytek jsou vzorky spektrálně zvláštní. Důležitá je pečlivá kontrola identifikace vzorků (zda se nepomíchalo pořadí a pod.), neboť neuvěřitelně mnoho chyb měření (včetně kalibrace) jde na vrub lidského faktoru. Vzorky je třeba chránit před extrémy světla, tepla a vlhkosti. Pokud se v obsluze střídají dvě osoby, obě by měly pracovat stejně pečlivě. Snímání NIR spekter musí předcházet každodenní kontrola monochromátoru (diagnostika) před měřením abychom byli jisti, že přesnost nastavení vlnových délek (± 0,3 nm), opakovatelnosti (± 0,2 nm) a charakteristiky pozadí (20 μod, RSM) odpovídá specifikacím od výrobce. Laboratorní teplota a vlhkost by během měření neměla podstatně kolísat, naprosto nevhodný je průvan. Rovněž zacházení se vzorky a postup vlastního měření by měl být metodicky spíše pomalejší, aby se tím zajistilo, že hodnoty nebudou kvůli tomu vybočovat z řady. Duplicitní (paralelní) plnění materiálu do kyvet a jedno měření je rozhodně vhodnější než dvojí měření jedné naplněné kyvety. Duplicitní snímání spekter (měření) je sice instruktivní, ale ne striktně nezbytné. Na konci měření je vhodné zopakovat diagnostiku, abychom se přesvědčili o stabilitě přístroje. Spektra je vhodné zálohovat. Při prohlížení spekter na obrazovce je třeba kriticky posoudit každou abnormitu. 16

19 vylou ení velkých H outlier standardizovat prost edí v etn teploty chemické zkušenosti vylou it nevhodné vzorky chybná duplicitní stanovení stanovení H statistiky histogram pravidlo ukon ení SEC; r 2 díl í F - statistika SEC; r 2 díl í F - statistika F < 10 Bn > sm r. p ímky ca 1,0 standardizovaná p íprava sušení, mletí, skladování vzork výb r kalibra ního souboru n > 100 referen ní chemické rozbory široké rozp tí hodnot stejnom rné rozd lení p esné analýzy typické vzorky zkontrolovat laboratorní výsledky kontrola diagnostiky p ístroje scanování vzork, soust ed ní spekter transformace dat regresní modelování zkontrolovat abnormity scanování opakovaná analýza rekalibrace t outlie i H outlie i SMLR PLS PCA zkontrolovat p vod, autenti nost a p ípravu vzork vhodná rovnice predikce valida ního souboru nejlepší rovnice t outlie i H outlie i zkontrolovat p vod, autenti nost a p ípravu vzork SEA; r 2 spojit kalibra ní a valida ní soubor precizovat nejlepší rovnici regresní koeficienty nejlepší rovnice adjustovat BIAS dobré; adjustovat sm rnici p ímky - riskantní odolej pokušení zasahovat do kalibrace nedovoleným zp sobem slepý test na otev enost souboru do budoucna robustní kalibrace zobrazení na monitoru kompromis mezi ší í kalibrace a p esností seznam vzork stanovení limit v etn nových vzork 3. Rámcové schéma postupu NIR kalibrace 17

20 1.7. Regresní modelování Nejdříve s vloží referenční hodnoty do souboru spekter (spectra file) a vyvolá se graf korelace vlnové délky oproti korelačnímu koeficientu za použití log 1/R (1. či 2. derivace log 1/R). Jestliže korelační graf je slabý, se šumy či nestrukturovaný, je málo pravděpodobné, že mnohonásobné modelování bude úspěšné. Pomocí SMLR (postupná mnohonásobná lineární regrese) na log 1/R a její 1. či 2. derivace se nejdříve zjistí outlieři. Ti mohou být dvojí: Jednak tzv. t outlieři (zjištěné pomocí t statistiky), u ichž jsou referenční hodnoty (z laboratoře) podezřelé, a H outlieři (zjištěné pomocí H statistiky), u nichž spektrum vzorku se odlišuje od jiných v kalibračním souboru. V prvním případě je kritická úroveň 2,5, ve druhém 3,0. Avšak rozdělení H hodnot je rovněž důležité. Dále je třeba vyzkoušet, zda by technika rozkladu spekter za použití PCA (analýza hlavních komponent) zlepšila přesnost predikce. Nám se s jejím použitím podařilo snížit chybu predikce o pětinu ve srovnání s SMLR a obecně ji považujeme za velice spolehlivou. Je třeba se vyhnout t.zv. overfitting (přílišné precisování spektrálních dat různými derivacemi, až tyto ztratí výpovědní sílu informací). Je třeba mít na paměti, že korelace může vzejít z overfitting příliš velkého počtu vlnových délek a příliš malého počtu vzorků. Kritériem pro výběr rovnice je SEC a r 2 (koeficient determinace). Zadáváním dalších vlnových délek se vždycky snižuje SEC a zvyšuje r 2. Vybraná kalibrační rovnice by měla mít co nejmenší SEC při malém počtu vlnových délek, z nichž žádný by měl mít dílčí statistiku F < 10. Regresní koeficienty v rovnici by neměly přesáhnout 10, jestliže analytická data jsou vyjádřena v %. Většina druhů software obsahuje postup zvaný vnitřní křížová validace (internal cross valiation), jímž se kalibrační soubor opakovaně segmentuje na skupiny. Jedna skupina se ponechává pro validaci, zbylá (zbylé) pro kalibraci. Tento postup se opakuje, dokud všechny skupiny nebudou pro validaci použity alespoň jednou Externí validace Část souboru vzorků s referenčními hodnotami, ponechaná mimo kalibrační soubor, se označuje jako validační soubor a slouží k prvnímu ověření kalibračních rovnic. Nejlepší rovnice se vybírá na základě SEP a r 2. 18