Tomáš Roušar, Pavla Žáková, Roman Kanďár, Vladimíra Mužáková, Jana Křenková

Transkript

1 STUDIE VITAMINY Tomáš Roušar, Pavla Žáková, Roman Kanďár, Vladimíra Mužáková, Jana Křenková Katedra biologických a biochemických věd, Fakulta chemicko-technologická, Univerzita Pardubice, Štrossova 239, 53 3 Pardubice Oxidační stres nastává při nerovnováze v organismu, která je způsobena dysbalancí mezi vlastními volnými radikály a jejich eliminací. Volné radikály v organismu vznikají při různých fyziologických, ale také při patologických pochodech. K jejich inaktivaci slouží celá řada mechanismů, např. enzymy (superoxiddismutáza, glutathionperoxidáza), glutathion, kyselina močová a dále pak vitaminy. Mezi hlavní antioxidanty patří lipofilní vitamin-e (α-tokoferol) a β-karoten, a ve vodě rozpustný vitamin-c. Působením volných radikálů na různé biomolekuly v buňkách dochází k poškozování jednotlivých struktur díky fragmentaci DNA, poškození proteinů a lipoperoxidaci. Produktem peroxidace lipidů je malondialdehyd (MDA), který tedy může být považován za ukazatel oxidačního stresu 1. Vlastní STUDIE VITAMINY spočívá ve stanovení hladin jednotlivých vitaminů (E, C, β-karoten) a MDA ve vzorcích plazmy získaných od pacientů. Tito účastníci studie musí splňovat předem daná kriteria. Jejich věk je vyšší než 6 let. Dále jsou rozděleni do čtyř skupin: 1. sk. kontrolní skupina; 2. sk. lidé po infarktu myokardu; 3. sk. lidé trpící onemocněním Diabetes Mellitus; 4. sk. hypercholesterolemici. Vlastní data získaná stanovením jednotlivých parametrů jsou porovnána mezi kontrolní 1. skupinou a zbylými třemi skupinami, čímž se zjistí, zda vlastní hladina vitaminů může mít vliv na daná onemocnění, resp. zda je možno doporučit suplementaci vitaminy. 1) Stanovení vitaminu-e pomocí HPLC/UV Princip stanovení: α-tokoferol je lipofilní látka, a proto pro její izolaci z plazmy je nutno použít extrakci do hexanu, kam je extrahována společně s dalšími lipofilními látkami (β-karoten).

2 Po odpaření rozpouštědla v dusíkové atmosféře je reziduum před vlastní analýzou rozpuštěno v mobilní fázi. Detekce je prováděna při λ = 292 nm. Postup analýzy: a) Kalibrační řada Náležitým ředěním zásobního roztoku vitaminu-e pomocí ethanolu byla připravena pětibodová kalibrační řada o koncentracích [1, 5, 2, 1, 5] µmol.l -1. K 2 µl odebraným z každé zkumavky s danou koncentrací bylo přidáno 2 µl vody a jako vnitřní standard pro α-tokoferol byl použit tokoferol-acetát v množství 2 µl [175 µmol.l -1 ]. b) Příprava vzorků Po rozmražení bylo k 2 µl krevní plazmy přidáno 2 µl tokoferolacetátu [175 µmol.l -1 ] a potom 2 µl ethanolu kvůli deproteinaci vzorků. Homogenizovaná plazma byla dále použita pro extrakci do hexanu. c) Extrakce a příprava rezidua Ke vzorkům i ke standardům bylo přidáno 75 µl hexanu, a po protřepání, centrifugaci (3 rpm; 1 min) a odpipetování supernatantu byl tento postup ještě jednou zopakován. Organická fáze byla potom odpařena v dusíkové atmosféře (6 C) a reziduum ve zkumavce bylo v mrazáku (-2 C) ponecháno až do doby vlastní analýzy. d) HPLC analýza Odparky byly rozpuštěny v 2 µl mobilní fáze (hexan-acetonitrilmethanol 15:4:45, v/v/v) a po nástřiku 5 µl na kolonu byl α-tokoferol detekován při 292 nm. Parametry HPLC analýzy: - mob. fáze: hexan-acetonitril-methanol [15:4:45,v/v/v] - průtok mobilní fáze:,7 ml.min -1 - teplota : 37 C - kolona : MAC 4.6x25mm Biospher PSI 12, C 18, 5µm (Labio a.s., ČR) - kontrolní systém SCL-1AVP (Shimadzu, Japonsko) - HPLC UV/VIS detektor SPD-1AVP (Shimadzu, Japonsko) - HPLC čerpadlo LC-1ADVP (Shimadzu, Japonsko) - termostat kolon CTO-1ACVP (Shimadzu, Japonsko)

3 Výsledky: a) Kalibrace Kalibrace (vitamin-e) Area y = 197,62x - 84,726 R 2 =, c [um] b) Průběžné výsledky hladin vitaminu-e ve vzorcích Skupina 1 (Kontrola) Počet vzorků: 22 Skupina 2 (Inf. myokardu) Počet vzorků : 19 Skupina 3 (Diab. Mellitus) Počet vzorků : 26 Skupina 4 (Hyperchol.) Počet vzorků : 11 Průměrná hladina Směrodatná odchylka 12,94 [µm] 4,1 [µm] 13,71 [µm] 5,61 [µm] 14,61 [µm] 5,33 [µm] 15,86 [µm] 5,63 [µm] c) Chromatografické záznamy [mv] 5 7,19 4 Voltage 3 2 8, [min.] Time Obr.1: Kalibrace (7,19 α-tokoferol [2 µm]; 8,6 tokoferol-acetát [175 µm])

4 [mv] 5 7,2 4 Voltage , Time [min.] Obr.2: Vzorek č.111 (7,2 α-tokoferol [25,89 µm]; 8,6 tokoferol-acetát [175 µm]) 2) Stanovení MDA Princip stanovení: Malondialdehyd tvoří stabilní komplex s kyselinou thiobarbiturovou (TBA), čehož se využívá při spektrofotometrickém stanovení. Komplex vznikající po hodinové inkubaci při 1 C je extrahován do butanolu a dále pak detekován při λ = 532 nm. Z důvodu nespecifity při tvorbě komplexu, kdy s TBA kromě MDA reagují další látky (např. žlučová barviva), se používá tzv. Allenovy korekce 2,3. Měření proto probíhá zároveň při třech vlnových délkách (485, 532, 56) nm, z nichž se pomocí vzorce vypočte korigovaná absorbance A kor : A kor = A 532 [(A 56 -A 485 )*,63 + A 485 ] Postup analýzy: a) Kalibrační řada Rozpuštěním 16,6 µl tetramethylpropanu (TMP) v 1 litru deionizované vody byl získán zásobní roztok MDA o koncentraci c = 1 µm. Následným ředěním byla získána kalibrační řada o daných koncentracích (1; 5; 2; 1;,5;,1)µmol.l -1. b) Vlastní analýza K rozmraženým vzorkům o objemu 3 µl a ke 3 µl každého ze standardů bylo přidáno 6 µl deionizované vody a po 3 µl TBA (28 mmol.l -1 ). Takto připravený roztok byl inkubován ve vodní lázni při 1 C 1 hodinu a po schlazení byl obsah převeden do extrakčních zkumavek. Do nich bylo připipetováno 1,5 ml n-butanolu a zkumavky byly 2 minut protřepávány. Následovala centrifugace (45 min; 35 rpm; 4 C),

5 oddělená organická fáze s extrahovaným komplexem byla přepipetována do zkumavek, z nichž se do kyvet spektrofotometru pipetovaly jednotlivé vzorky. Ty byly proměřovány při třech vlnových délkách (485, 532, 56) nm proti n-butanolu na přístroji AGILENT 8453 (Agilent, USA). Výsledky: a) Kalibrace Kalibrace MDA A y =.193x +.24 R 2 = c [um] b) Hladiny MDA ve vzorcích Vz. číslo MDA [mm] 1,11 1,16,62,92,896 1,7,91,7 Vz. číslo MDA [mm] 1,17 1,19 1,68,77 1,39 1,6 1,7,93 Vz. číslo MDA [mm] 1,33 1,49 1,5 1,8 1,38,8 1,47 1,45 Vz. číslo MDA [mm] 1,17 1,15 1,56,82 1,13 1,13 1,41,99 Průměrná koncentrace MDA naměřená u vzorků 1-32: c(mda) = 1.13 µmol.l -1

6 3) Stanovení vitaminu-c Princip stanovení: Vitamin-C (kyselina askorbová) je velmi nestabilní látka a rychle se rozkládá. Proto je nutné po oddělení plazmy od krevních buněk přidat ihned dithioerythritol, který zabraňuje degradaci kyseliny askorbové, a dále pak uchovávat vzorky při 8 C. Vlastní analýza hladiny vitaminu-c je prováděna pomocí metody RP-HPLC. Vitamin-C se váže se směsí ionpárujících činidel (dodecyltrimethylammonium chlorid, tetraoctylammonium bromid) rozpuštěných v mobilní fázi 4. Detekce je elektrochemická. Výsledky: Stanovování vitaminu-c ve vzorcích zatím nebylo započato, ale během měsíce ledna 23 s největší pravděpodobností budou k dispozici první výsledky. 4) Stanovení b-karotenu Princip a postup stanovení: β-karoten je stejně jako α-tokoferol vitamin rozpustný v tucích. Proto i princip a postup stanovení je totožný s analýzou vitaminu-e. Pro stanovení se využívá po extrakci do hexanu metody HPLC s UV/VIS detekcí, narozdíl od α-tokoferolu je ale β-karoten detekován při 45nm. Výsledky: β-karoten je velmi nestabilní a rychle se na světle rozkládá. Naměřené hladiny jsou nejspíše proto několikanásobně sníženy oproti fyziologickým hladinám. Koncentrace β-karotenu ve vzorcích se velmi často vyskytují pod mezí detekce použité metody 1) (x d =.8 µmol.l -1 ). Z těchto důvodů se budeme zabývat optimalizací stanovení β-karotenu, vč. preanalytické části. 1) detekční limit je vyjádřen jako koncentrace odlišitelná s 95% pravděpodobností od nejnižšího bodu použitého ke konstrukci kalibrační křivky. Poděkování: Tato práce byla podpořena grantem GAČR 23/2/23 a projektem MŠM

7 Literatura: 1. Halliwell B: Free radicals, reactive oxygen species and human disease: a critical evaluation with special reference to atherosclerosis. Br J Exp Pathol 7, , Hendrix T, Assman RFTA: Spectrophotometric correction for bile pigments in the thiobarbituric test for malondialdehyde-like substances in plasma. Med Lab Sci 47, 1 16, Kanďár R, Mužáková V, Čegan A: Highly specific,simple and rapid method for the determination of malondialdehyde in blood using high-performance liquid chromatography. Clin Chem Lab Med 4 (1), , Wasko PW, Hatzel WO, Levine M: Ascorbic acid analysis using high-performance liquid chromatography with coulometric electrochemical detection. AnalBiochem 181, , 1989.