Molekulární epidemiologie a možnosti zoonotického přenosu viru hepatitidy E v České republice

Transkript

1 Molekulární epidemiologie a možnosti zoonotického přenosu viru hepatitidy E v České republice P. Vašíčková, M. Kubánková Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i. Brno HRADECKÉ VIROLOGICKÉ DNY 2016 Jubilejní XX celostátní konference virologů

2 Virus hepatitidy E (HEV) Neobalený virus, nm Genom +ss RNA, velikost 7,2 kb ORF1, ORF2, ORF3 (Johne et al., 2014) (Anderson and Shrestha, 2002)

3 HEV - klasifikace (

4 HEV - klasifikace Čeleď Rod Druh Hostitel Genotyp Hepeviridae Ortohepevirus Ortohepevirus A člověk HEV-1 člověk člověk, prase domácí a divoké, jelenovití, králík, promyka člověk, prase domácí a divoké, jak, skot HEV-2 HEV-3 HEV-4 prase divoké HEV-5 prase divoké HEV-6 velbloud, člověk HEV-7 Ortohepevirus B kur Ortohepevirus C hlodavci, rejskové HEV-C1 fretka, norek HEV-C2 Ortohepevirus D netopýr Piscihepevirus Piscihepevirus A pstruh (Anderson and Shrestha, 2002) (Smith et al., 2014)

5 HEV živočišné druhy (Scobie a Dalton, 2013; Johne et al., 2014) Hlavní hostitel Průkaz Ab Genom Zoonotický přenos Člověk A A A Prase domácí A A A Prase divoké A A A Jelenovití A A A Králík A A? Kůň A N N Velbloud A A? Kočka A N N Pes, liška A N N Koza A N N Ovce A A N Skot A A N Kur domácí A A N Promyka A A N Primáti A A N Potkan, krysa A A N Fretka A A N Netopýr N A N Pstruh žlutohrdlý N A N

6 HEV - klasifikace Čeleď Rod Druh Hostitel Genotyp Hepeviridae Ortohepevirus Ortohepevirus A člověk HEV-1 člověk člověk, prase domácí a divoké, jelenovití, králík, promyka člověk, prase domácí a divoké, jak, skot HEV-2 HEV-3 HEV-4 prase divoké HEV-5 prase divoké HEV-6 velbloud, člověk HEV-7 Ortohepevirus B kur Ortohepevirus C hlodavci, rejskové HEV-C1 fretka, norek HEV-C2 Ortohepevirus D netopýr Piscihepevirus Piscihepevirus A pstruh (Anderson and Shrestha, 2002) (Smith et al., 2014)

7 HEV genotypy 3 a 4 Člověk, prase domácí i divoké, jelenovití Sporadické případy celý svět Onemocnění střední až pokročilý věk (muži) Asymptomatická infekce (68 98 %) Chronicita (Johne et al., 2014)

8 HEV průběh infekce u zvířat Přenos fekálně orální cestou (přímý kontakt, prostředí) Inkubační doba cca 2 týdny Imunitní odpověď podobně jako u lidí IgM (IgA), IgG Vylučování viru trusem cca 3 7 týdny, virémie 1-2 týdny (chronicita?)

9 HEV průběh infekce u zvířat Infekce není rozpoznatelná běžnou veterinární prohlídkou (ante- i post-mortem) maso a vnitřnosti volně šířeny do tržní sítě Mikroskopické změny v jaterním parenchymu Nejcitlivější jedinci - staří 2 až 4 měsíce (Han et al., 2014)

10 HEV genotypy 3 a 4 - přenos Kontakt se zvířaty Zvýšená prevalence IgG proti HEV rizikové skupiny osob (WHO) Chovatelé, lovci Veterináři Pracovníci na jatkách (Kubankova et al., 2016)

11 HEV genotypy 3 a 4 zoonotický přenos Experimentální infekce Infekce makaků prasečím HEV Infekce prasat lidským HEV Vysoká podobnost genomů Lidské a zvířecí izoláty HEV ze stejných geografických oblastí (Johne et al., 2014)

12 HEV genotypy 3 a 4 - přenos Nedostatečně tepelně upravené potraviny Maso a droby z rezervoárových zvířat (figatellu, grilovaná játra, sashimi) Ústřice Ovoce, zelenina (zdroj kontaminovaná voda) Teplota ( C) Čas (min) Vylučování HEV prasaty Imunitní odpověď bez ošetření 0 ano ano 62 5 ano ano ano ano ano ano 68 5 ano ano ano ne? ano ano 71 5 ano ano ano ano ne ne (Barnaud et al., 2012)

13 Zaměření našich studií Výskyt HEV u různých živočišných druhů v ČR Epidemiologie epizootologie Analýza sekvencí získaných izolátů Zjištění možných podobností (příbuzností) humánních a zvířecích izolátů Stanovení možných zdrojů infekce

14 Metody detekce HEV Triplex RT-qPCR ORF2/3 ORF2 RNA gradient IAC EC KVANTIFIKACE

15 Metody detekce HEV Triplex RT-qPCR ORF2/3 ORF2 RNA gradient IAC EC KVANTIFIKACE Nested RT-PCR ORF1 (ORF2/3) ANALÝZA SEKVENCÍ

16 Spolupráce s lékaři Vzorky: sérum, stolice, bioptát (jaterní tkáň), likvor Kladen důraz na včasný odběr vzorku, řádné skladování/transport RT-qPCR možno použít k potvrzení/stanovení diagnózy Analýza sekvencí Spolupráce Nemocnice Na Bulovce FN Brno (Nemocnice Bohunice) ZÚ Ostrava, FN Ostrava NRL pro virové hepatitidy KHS MN Ústí n/labem IFCOR (Dalton et al., 2008)

17 Výsledky přímého (RT-qPCR) a nepřímého (komerční testy, protilátky) průkazu infekce HEV Protilátky (IgM, IgG) RT-qPCR sérum RT-qPCR stolice Počet osob Celkem 93 Diagnóza VHE - spojení sérologického průkazu protilátek proti HEV a detekce RNA HEV v séru i stolici

18 G2 G1 Lidské izoláty G4 Prase domácí Prase divoké, volnost Prase divoké, obory G3

19 (EPIDAT)

20 Prasata domácí chovy, ČR 62,6 % (21) chovů HEV pozitivních 17,7 % (70) prasat HEV pozitivních (trus)

21 Prasata domácí jatky, ČR Typ chovu Játra Žluč Obsah střevní Celkem Bio 2/113 (1,8 %) 8/112 (7,14 % 2/113 (1,77 %) 10/113 (8,8 %) Konvenční 4/150 (2,7 %) 5/150 (3,33 %) 0/150 (0 %) 9/150 (6,0 %) Infekce není rozpoznatelná během běžné veterinární prohlídky (ante- i post-mortem), pouze mikroskopické změny maso a vnitřnosti volně šířeny do tržní sítě

22 Masné výrobky prodejny, ČR Vzorek HEV Masné výrobky (čajovka, tatarský biftek, klobása) 0/89 Mleté maso 1/100 Masné výrobky (zabíjačky) 1/145 Krájené masné výrobky (šunka, poličan, herkules...) 0/135 Stěry prostředí 0/160

23 G2 G1 Prase domácí G4 Lidské izoláty Prase divoké, volnost Prase divoké, obory G3

24 HEV prasata domácí, ČR U prasat domácích zjištěn výskyt dvou hlavních fylogenetických skupin (Holandsko, Německo, Švédsko Srbsko, Kyrgyzstán) Zjištěna významná podobnost specifické oblasti genomu humánního izolátu a izolátů od prasat domácích potvrzení zoonotického přenosu HEV

25 Zvěř volně žijící x obory Volnost Prase divoké Jelen lesní Daněk evropský Srnec obecný Muflon obecný Jelen sika 1 16/62 2/145 0/19 0/23 0/0 0/0 2 4/22 0/4 0/1 1/4 0/0 0/0 3 8/17 0/10 0/0 0/0 0/0 0/0 4 0/26 0/0 0/0 0/2 0/1 0/0 5 2/26 0/5 0/0 0/0 1/1 0/0 6 5/37 0/5 0/0 0/1 0/0 0/18 Celkem 35/190 2/169 0/20 1/30 1/2 0/18 Obory A 14/63 0/0 0/36 0/0 2/15 0/0 B 39/91 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 C 0/0 0/0 0/0 0/0 2/22 0/0 D 8/106 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 (Foto M. Klimeš) Celkem 61/260 0/0 0/36 0/0 4/37 0/0

26 Zvěř volně žijící x obory Věkové kategorie Množství ve vyšetřených vzorcích celkem volnost obory

27 Prase divoké, volnost Prase divoké, obory G2 G4 G1 Lidské izoláty Prase domácí G3

28 HEV - prasata divoká, ČR U prasat divokých zjištěna vyšší diverzita izolátů (podobnost s izoláty z okolních států Německo, Rakousko) Zjištěna příbuznost izolátů od prasat divokých a domácích přenos HEV z prasat domácích na prasata divoká (kontaminované prostředí, podpořeno publikovanými údaji) Zjištěna příbuznost izolátů od prasat divokých a lidí možnost zoonotického přenosu HEV Ostatní druhy zvěře zřejmě nejsou tak významným rezervoárem HEV v ČR

29 Děkuji za spolupráci Nemocnice Na Bulovce FN Brno (Nemocnice Bohunice) ZÚ Ostrava, FN Ostrava NRL pro virové hepatitidy KHS MN Ústí n/labem IFCOR 99 Vojenský veterinární ústav se sídlem v Hlučíně Farmaceutická fakulta UK Laboratoř Virologie potravin Lenka Palasová Monika Kubánková Pavel Mikel Marcel Bena Jakub Hrdý Práce byla provedena s podporou grantů MZ (NT /2012), MZe (QJ ) a MV ČR (VG ).