MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2013 SYLVIE SKALIČKOVÁ

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie Izolace a stanovení laktoferinu z lidských slin pomocí kapalinové chromatografie Diplomová práce Vedoucí práce: doc. RNDr. Vojtěch Adam, Ph.D. Vypracovala: Bc. Sylvie Skaličková Konzultant: Mgr. Ondřej Zítka, Ph.D. Brno 2013

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Izolace a stanovení laktoferinu z lidských slin pomocí kapalinové chromatografie, vypracovala samostatně a použila jsem jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne... podpis...

4 Experimentální část této diplomové práce byla realizována na výzkumné infrastruktuře vybudované v rámci projektu CZ.1.05/2.1.00/ Centrum senzorických, informačních a komunikačních systémů (SIX) operačního programu Výzkum a vývoj pro inovace. Finanční podpora byla poskytnuta Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky.

5 PODĚKOVÁNÍ Tímto chci poděkovat za odborné vedení mé diplomové práce Mgr. Ondřeji Zítkovi, Ph.D. a doc. RNDr. Vojtěchu Adamovi, Ph.D. Mé poděkování také patří celé pracovní skupině prof. Ing. René Kizeka, Ph.D. za vytvoření příjemných pracovních podmínek. Dále děkuji své rodině, která mi poskytla zázemí a podporu při mém studiu.

6 ABSTRAKT Glykoprotein laktoferin se nejvíce vyskytuje v mateřském mléce, krevní plasmě, potu, slzách a slinách. Mimo železotransportní funkce v organismu, také vykazuje antibakteriální, protikarcinogenní a protizánětlivé účinky. Jeho zvýšená koncentrace v organismu ukazuje na probíhající zánětlivé onemocnění a díky tomu je laktoferin považován za potencionální marker imunitních onemocnění, pro které jsou sliny perspektivním diagnostickým médiem. Cílem této práce bylo optimalizovat podmínky separace a stanovení laktoferinu z lidských slin pomocí iontově-výměnné kapalinové chromatografie s monolitickou kolonou a off-line fotometrickou detekcí využívající metody pyrogallovou červeň, metodu dle Bradfordové a Biuretovu metodu. Pomocí metody SDS-PAGE bylo ověřeno, že izolované frakce obsahovaly pouze laktoferin. Tato metoda vykazuje vysokou citlivost a selektivitu. Získané výsledky byly porovnány se standardní enzymově značenou imunoanalýzou, která se pro stanovení laktoferinu běžně využívá v klinických studiích. Klíčová slova: iontově výměnná kapalinová chromatografie, monolitická kolona, spektrofotometrie, laktoferin, sliny

7 ABSTRACT Lactoferrin, which is globular glycoprotein, is an important component of mamalian milk, blood, sweat, tears and saliva. This ferro-transfering protein has antibacterial, anticancerogenic and anti-inflammatory activity. The highest level of lactoferrin in organism signifying the inflammatory processes due to saliva is the perspective diagnostic medium. The aim of this study was to optimize conditions for separation and determination of lactoferrin from human saliva using ion exchange chromatography with monolithic column off-line coupled with spectrometric detection using Pyrogallol red, Bradford s method and Biuret method. The purity of the isolated fractions was verified by SDS-PAGE. This method proved very sensitive detection and hight selectivity. Results were correlated with standard enzyme-linked immunosorbent assa kit wich is generally used in clinical practice. Keywords: ion exchange liquid chromatography, monolithic column, spectrophotometry, lactoferrin, saliva

8 OBSAH 1 ÚVOD LITERÁRNÍ ČÁST Sliny Laktoferin Regulace syntézy laktoferinu a jeho metabolismus Laktoferin v diagnostice imunitních onemocnění Význam laktoferinu Metody stanovení laktoferinu Iontově výměnná kapalinová chromatografie Kolony využívané v IELC Monolitická kolona Spektrofotometrické metody Enzymově značená imunoanalýza (ELISA) CÍLE PRÁCE MATERIÁL A METODY Chemikálie Příprava vzorků slin Iontově výměnná kapalinová chromatografie s UV detekcí Polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS-PAGE) Fotometrická detekce laktoferinu Enzymově značená imunoanalýza Statistické vyhodnocení VÝSLEDKY A DISKUZE Optimalizace izolace laktoferinu z lidských slin Optimalizace gradientu Vliv rychlosti průtoku mobilní fáze na eluci laktoferinu Vliv iontové síly mobilní fáze na eluci laktoferinu Van Deemterova rovnice SDS-PAGE analýza vzorků slin Optimalizace off-line fotometrické detekce Analýza vzorků slin... 32

9 5.3.1 Návratnost Analýza vzorků slin Korelace IELC s ELISA analýzou ZÁVĚR ZDROJE INFORMACÍ SEZNAM ZKRATEK SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK... 52

10 1 ÚVOD V současné době, kdy se neustále zvyšuje výskyt nových civilizačních onemocnění, je kladen důraz na jejich včasnou diagnózu. Díky tomu narůstá tlak společnosti pro nalezení nových markérů, které by pomohly rychle a spolehlivě tyto onemocnění odhalit, a tím zvýšit úspěšnost jejich léčby. Zároveň vzniká požadavek na nalezení takového markéru, který by pro odběr nevyžadoval invazivní zákrok, což splňuje například moč, stolice, sliny a ostatní tělní sekrety. Právě sliny jsou významným diagnostickým médiem pro stanovení onemocnění, které vykazují spojitost s imunitním systémem organismu. Jednou z významných složek slin je laktoferin, který je v této práci studován. V literatuře je spojován se zánětlivými procesy v organismu, a to díky jeho výjimečným vlastnostem. Poprvé byl jeho výskyt zaznamenán v mateřském mléce, kde spolu s ostatními biologicky významnými látkami podporuje tvorbu imunity mláďat. Avšak laktoferin se uplatňuje i jako nutriční doplněk ve výživě dospělých jedinců. Jedná se tedy o velmi významný protein, který se stává v současné době předmětem mnoha experimentů a studií v oblastech proteomiky, genomiky, metalomiky, nutriomiky a mnoha dalších. Rozvoj metod a zdokonalení analytických přístupů pro jeho analýzu je tedy nezbytný a hraje významnou roli v oboru instrumentálních technik. Dosud bylo publikováno mnoho metod, které umožňují laktoferin velmi přesně detekovat, například iontově-výměnná kapalinová chromatografie, enzymově značená imunoanalýza či hmotnostní spektrometrie. Avšak čím více se budou rozvíjet nároky laktoferinu jako markéru imunitních onemocnění, tím více budou požadovány senzitivnější metody pro jeho detekci. Součastně je také třeba brát ohled na jeho izolaci z biologických vzorků, protože jak již mnohé studie naznačují, laktoferin je považován za potenciální lék proti zánětlivým onemocněním, ale i například proti rakovině. Tyto aspekty dělají z laktoferinu velice slibnou sloučeninu, významnou nejen pro vědeckou sféru, ale také pro komerční účely. 10

11 2 LITERÁRNÍ ČÁST 2.1 Sliny Sliny jsou směsí biologicky významných glykoproteinů, proteinů, enzymů, hormonů, minerálů, elektrolytů rozpuštěných ve vodě (Schenkels, Lcpm, Veerman, E. C. I. et al. 1995; Humphrey, S. P. and Williamson, R. T. 2001) a jsou produkovány především velkými párovými velkými slinnými žlázami. Obsah vody a v ní rozpuštěných látek kolísá v závislosti na momentálním fyziologickém stavu organismu, přičemž tyto procesy jsou řízené vegetativním nervovým systémem na základě podmíněných a nepodmíněných reflexů (Humphrey, S. P. and Williamson, R. T. 2001). Sliny se podílejí na přenosu chuti k chuťovým pohárkům, zvlhčují dutinu ústní, štěpí sacharidy a tuky na jednodušší sloučeniny, mají antimikrobní, desinfekční a ochranné účinky (Amerongen, A. V. N. and Veerman, E. C. I. 2002). Sliny jsou potencionálním diagnostickým médiem pro mnoho nemocí, které jsou především spojené s funkcí imunitního systému, rakoviny, onemocnění zubů a dásní i psychiatrických a neurologických poruch (Castagnola, M., Picciotti, P. M. et al. 2011). Sliny byly již v mnoha předchozích studiích využity pro stanovení laktoferinu, který je spojován se vznikem řady nemocí (Kirstila, V., LenanderLumikari, M. et al. 1996; Rudney, J. D., Hickey, K. L. et al. 1999; Fine, D. H., Furgang, D. et al. 2002; Haghighat, N. and Al- Hashimi, I. 2003; Grange, P. A., Marcelin, A. G. et al. 2004; Jentsch, H., Sievert, Y. et al. 2004; Komine, K., Kuroishi, T. et al. 2007). 2.2 Laktoferin Laktoferin je glykoprotein o molekulové hmotnosti 80 kda, který je složen z 692 aminokyselin (Powell, M. J. and Ogden, J. E. 1990; Rey, M. W., Woloshuk, S. L. et al. 1990) a jeho isoelektrický bod (pi) byl stanoven v rozmezí 8 8,5 (Levay, P. F. and Viljoen, M. 1995; Lonnerdal, B. and Iyer, S. 1995). Struktura laktoferinu je uspořádána do peptidového řetězce, který je strukturovaný do dvou domén N a C (Obr. 1). Obě tyto domény mají schopnost na sebe vázat atom většiny divalentních kovů jako je Fe 2+ nebo také Cu 2+, Zn 2+ a Mn 2+ (Levay, P. F. and Viljoen, M. 1995; Lonnerdal, B. and Iyer, S. 1995). Výskyt tohoto proteinu byl zaznamenán v sekretech mucinózních buněk a lze jej detekovat v mateřském mléce, slzách, krevní plasmě, potu, spermatu, vaginálním výtoku a také ve slinách (Levay, P. F. and Viljoen, M. 1995). 11

12 Obrázek 1: 3-D struktura lidského laktoferinu obsahujícího dva ionty Fe 2+ vázané v každé z jeho dvou domén (zdroj: V mnoha studiích bylo prokázáno, že laktoferin vykazuje antimikrobní, Obr. 1: 3-D struktura lidského Laktoferinu obsahujícího dva ionty Fe 2+ vázané v každé z jeho dvou domén (zdroj: antikarcinogenní, protizánětlivé a protiplísňové účinky, a to díky schopnosti vázat na sebe aktivní ionty kovů, které některé druhy bakterií vyžadují pro svůj růst (Arslan, S. Y., Leung, K. P. et al. 2009). Proto je laktoferin zařazován do nespecifického imunitního systému savců. V lékařských studiích je jeho zvýšená koncentrace v organismu spojována s probíhajícím zánětlivým onemocněním (Sukharev, A. Ye, Yermolayeva, T. N. et al. 2009) Regulace syntézy laktoferinu a jeho metabolismus Regulace syntézy laktoferinu závisí na typu buněk produkujících tento protein. V mléčné žláze je jeho syntéza řízena hormonem prolaktinem (Nakajima, K., Nakamura, M. et al. 2008). V endometriu je syntéza laktoferinu řízena epidermálním růstovým faktorem a estrogenem (Teng, C. T., Gladwell, W. et al. 2002). Bylo také zjištěno, že exogenní žlázy jej produkují nepřetržitě. V neutrofilních buňkách je laktoferin syntetizován během jejich diferenciace a poté je uložen ve speciálních granulech a následně se produkce laktoferinu zastavuje (Inoue, M., Yamada, J. et al. 1993). V mnoha studiích bylo potvrzeno, že hladina laktoferinu se mění s věkem, je závislá na pohlaví jedince a také se jeho koncentrace v krevním séru zvyšuje v proliferační fázi menstruačního cyklu (Adlerova, L., Bartoskova, A. et al. 2008). Biologické vlastnosti laktoferinu jsou zprostředkovány určitými receptory na povrchu 12

13 cílových buněk. Tyto receptory jsou specifické pro každý typ buňky a mohou se nacházet například v nosních epitelech, hepatocytech, monocytech, makrofázích, lymfocytech, trombocytech, fibroblastech a některých bakteriích jako je Staphylococcus aureus nebo Pseudomonas hydrophila (Beddek, A. J. and Schryvers, A. B. 2010). V některých buňkách se mimo receprotrů pro laktoferin, nachází receptory pro transferin, které současně umožňují navázání transferinu (Lopez, S. A., Nonnecke, E. B. et al. 2012). V organismu je laktoferin metabolizován přes receptorem zprostředkovanou endocytózu fagocytujících buněk s následným přenosem železa do feritinu skrze přímé vstřebávání v játrech (Regoeczi, E. 1997). Do metabolismu laktoferinu jsou zapojeny pravděpodobně i ledviny, které odebírají laktoferin z krevního oběhu, odkud jsou jeho fragmenty vyloučeny močí (Abrink, M., Larsson, E. et al. 2000) Laktoferin v diagnostice imunitních onemocnění Díky tomu, že se laktoferin vyskytuje v mnoha sekretech a spadá do nespecifického imunitního systému, je často označován jako markér některých onemocnění. Ve slinách byla jeho zvýšená koncentrace zaznamenána u pacientů s paradontózou (Glimvall, P., Wickstrom, C. et al. 2012), u lidí se zánětlivým onemocněním střev (Nakao, K., Imoto, I. et al. 1997) a také u lidí trpící Sjögrenovým syndromem, který se projevuje sníženou produkcí slin a pocitem sucha v ústech. Zvýšená hladina laktoferinu byla také potvrzena v krevní plasmě u lidí s diseminovanou intravaskulární koagulopatií (Ozsan, H. G., Pehlivan, M. et al. 2000) a dědičnou meningitidou (Maffei, F. A., Heine, R. P. et al. 1999). Naopak sníženou hladinu laktoferinu v krevní plasmě vykazují jedinci s AIDS (Van der Strate, B. W. A., Harmsen, M. C. et al. 1999). Laktoferin je také často spojován se zánětlivými onemocněními střevního traktu. V nedávno publikované studii byla prokázána korelace hladiny laktoferinu ve stolici u pacientů postižených chronickým průjmem a Crohnovou chorobou (Langhorst, J. and Boone, J. 2012). V praxi tak může být laktoferin využit jako doplňkový markér výše zmíněných onemocnění Význam laktoferinu Je známo, že laktoferin má nenahraditelný význam v imunitním systému všech savců. Spolu s ostatními proteiny v mateřském mléce přispívá k posílení imunity mláďat, 13

14 v dospělosti se podílí na řízení získané imunity, a vykazuje další účinky, které jsou uvedeny na Obrázku 2 (Brock, J. H. 2002). Protizánětlivé Protinádorové Homeostáza železa Absorbce železa Transkripční faktor Tvorba granulocytů Autoprotilátka Immunomodulátor LAKTOFERIN Prokoagulant Antioxidant Protiparazitní Protiplísni Antivirální Proteáza Antimicrobiální Inhibitor proteáz Obrázek 2: Role laktoferinu v lidském organismu. Díky těmto vlastnostem, je laktoferin považován za potencionální konkurenci dosud hojně využívaným antibiotikům, ale taky jako podpůrný lék pro léčbu rakoviny, Alzheimerovy nemoci a onemocnění spojené se zánětlivými procesy probíhajícími Obr. 2: Role laktoferinu v lidském organismu ve střevním traktu (Ward, P. P., Paz, E. et al. 2005). Jeho synergické působení na medikamentní léčbu bylo prokázáno u hepatitidy C, AIDS, cytomegalovirů a H. Pylori (van der Strate, B. W. A., Beljaars, L. et al. 2001) (Viani, R. M., Gutteberg, T. J. et al. 1999) (Kaito, M., Iwasa, M. et al. 2007) (Tursi, A., Elisei, W. et al. 2007). Rekombinantní lidský laktoferin podáváný vaginálně, zabraňuje předčasnému porodu (Otsuki, K., Yakuwa, K. et al. 2005). Nezanedbatelný je i jeho protektivní vliv proti rakovině tlustého střeva (Kozu, T., Iinuma, G. et al. 2009), ale i proti rakovině plic, jazyka, močového měchýře, štítné žlázy (Tsuda, H., Fukamachi, K. et al. 2006). Mimo pozitivní účinky na lidské zdraví, bylo prokázáno, že laktoferin prodlužuje dobu údržnosti masných výrobků (Umuhumuza, Liliane Clarisse 2011), (Naidu, A. S. 2002). Do budoucna by tedy mohl být využíván v potravinářském průmyslu pro své protektivní účinky. V současnosti se laktoferin začíná objevovat jako účinná látka v potravinových doplňcích pro zvýšení imunity, zubních pastách, nosních či očních kapkách (Brouwer, 14

15 Počet publikací Počet citací Cpjm, Rahman, M. et al. 2011). Pro tyto účely jsou prováděny studie, které by umožnily produkci laktoferinu pomocí mikroorganismů či transgenních organismů (Conesa, C., Calvo, M. et al. 2010). 3.3 Metody stanovení laktoferinu Vzhledem k významnosti laktoferinu jako markéru některých zánětlivých onemocnění, se objevují analytické studie s cílem zlepšit senzitivitu a selektivitu jeho detekce v různých biologických matricích. Dle databáze Web of Science počet článků s klíčovým slovem lactoferrin od roku 1965 neustále narůstá (Obr. 3A) a je také zřejmý zvyšující se trend citací těchto článků (Obr. 3B). A 180 B Rok Rok Obrázek 3: A) Počet publikací a B) počet citací článků s klíčovým slovem lactoferrin dle databáze Web of Science. Nejvíce využívanými metodami pro stanovení laktoferinu je iontově výměnná Obr. 3: A) Počet publikací a B) počet citací článků s klíčovým slovem laktoferin dle databáze Web of Science. kapalinová chromatografie s UV detekcí, spektrofotometrické, elektrochemické a imunoseparační metody. Literatura se však také zmiňuje o stanovení laktoferinu pomocí vysoko-účinné kapalinové chromatografie s detektorem diodového pole (DAD) (Drackova, M., Borkovcova, I. et al. 2009) nebo pomocí vysoko-účinné kapalinové chromatografie s UV detekcí (Palmano, K. P. and Elgar, D. F. 2002). Vzhledem k vhodnosti metod kapilární elektroforézy pro stanovení proteinů (Ptacek, P. 1991) byl laktoferin stanoven i pomocí čipové gelové elektroforézy (Zitka, O., Krizkova, S. et al. 2010). 15

16 3.3.1 Iontově výměnná kapalinová chromatografie Iontově výměnná chromatografie (IELC), patří do separačních průtokových technik. Poprvé byla použita pro analalýzu neorganických iontů v roce 1975 (Small, H., Stevens, T. S. et al. 1975). Její specifitou je, že stacionární fází je iontoměnič, který může obsahovat buď kladně (anex) či záporně (katex) nabité skupiny, kovalentně imobilizované na částicích nosiče. Principem je pak vzájemná výměna iontů mezi analytem, stacionární a mobilní fází. V protékající mobilní fázi obsažené nabité ionty jsou elektrostatickými silami přitahovány a zadržovány ke stacionární fázi. Pro uvolnění imobilizovaných iontů na stacionární fázi pak musí dojít ke změně podmínek jako je teplota kolony, ph a iontová síla mobilní fáze. Poté dochází k uvolnění analytů a tak k jejich separaci (Staby, A., Nielsen, J. et al. 2009). Přístrojové uspořádání pro iontově výměnnou kaplinovou chromatografii je stejné jako u většiny chromatografických metod s rozdílem použitých kolon. Někdy bývá zapojen i sběrač frakcí (Obr. 4A). Pro detekci se u IELC nejvíce používá UV (Ye, X. Y., Yoshida, S. et al. 2000) či fluorescenční detekce (Ravindran, G. and Bryden, W. L. 2005), která je pro analyty nedestruktivní. V literatuře je také popsáno využití hmotnostní spetrometrie (Pont, F., Luciani, B. et al. 2001) či detektorů na principu měření konduktivity (Palermo, C., Muscarella, M. et al. 2013). Tento typ chromatografie tak lze využít pro separaci a purifikaci aminokyselin, peptidů, proteinů a nabitých organických i anorganických sloučenin. Ze vzorku lze laktoferin pomocí IELC izolovat díky podstatně odlišnému izoelektrickému bodu od pi proteinů ostatní matrice vzorku (Hynek, R. 1995; Recio, I. and Visser, S. 1999),(Salmon, V., Legrand, D. et al. 1997),(Ye, X. Y., Yoshida, S. et al. 2000). V literatuře je také popsána IELC ve spojení s afinitní chromatografií (Uchida, T., Dosako, S. et al. 2003) Kolony využívané v IELC Kolony pro IELC bývají nejčastěji na bázi syntetických polymerů s příslušnými funkčními skupinami: triethylaminoetyl-, sulfo-, karboxy-, které jsou zejména vhodné pro výměnu protiiontů, zakoncentrování látek po jejich adsorpci, separaci příbuzných iontů jako je tomu u aminokyselin, a separaci látek iontového charakteru od neiontových (Dinh, N. P., Cam, Q. M. et al. 2009). Ionexy na bázi celulosy, jsou především vhodné pro chromatografii biopolymerů. Připravují se reakcí celulosy v alkalickém prostředí s příslušnou funkční skupinou, například: 16

17 karboxymethylcelulosy, fosfocelulosy, sulfoetylcelulosy a anexy pro vazbu kyselých a neutrálních bílkovin dietylaminoelycelulosy a trietylaminoetylcelulosy. Speciálně pro vazbu nukleových kyselin se využívá tris-etanolaminoaminoetyl celulosa. Výhodou celulosových nosičů oproti ostatním je možnost separace v rozsahu ph 2 10, opakované použití po regeneraci a značná schopnost vázat bílkoviny (Kim, U. J. and Kuga, S. 2001). Další skupina iontoměničů je na bázi polysacharidu dextranu zesíťovaného epichlorhydrinem. Tyto vynikají velkou adsorpční kapacitou pro bílkoviny, avšak dochází u nich k objemovým změnám v důsledku mechanického namáhání (Yu, L. L., Shi, Q. H. et al. 2011). Větší mechanické odolnosti vůči matrici vykazují iontoměniče na bázi polysacharidu agarosy, ve které byly odstraněny nabité polysacharidy a reakcí s 2,3-dibromopropanolem v alkalickém prostředí byly zesíťovány (Tiainen, P., Per-Erik, G. et al. 2007). Různorodost kolon pro IELC tak umožňuje separaci velkého množství látek, proto je tato analytická metoda dosud jednou z nejvyužívanějších pro analýzu proteinů Monolitická kolona Rychlým a robustním nástrojem pro separaci proteinů se staly monolitické kolony, které jsou tvořeny jedním kusem pórovitého materiálu vhodným pro analýzu velkých molekul (Obr. 4B). Kolony mohou být vyrobeny jako klasické válcové kolony nebo ve tvaru disku. Jako sorbent se zde využívá methakrylát nebo silika, které mohou být modifikovány různými funkčními skupinami. Díky jejich konstrukci jsou vhodné pro separaci velkých molekul za vyššího průtoku a také nižšího tlaku, který by je mohl poškodit (Barut, M., Podgornik, A. et al. 2005). Vykazují výborné separační vlastnosti a vysokou vazebnou kapacitu (Krenkova, J., Gargano, A. et al. 2009). V neposlední řadě mohou být modifikovány a tak značně vylepšují efektivitu separace, například modifikace epoxidovými skupinami s dietylaminem byly použity pro analýzu oligonukleotidů (Sykora, D., Svec, F. et al. 1999). Kyselinou fosforečnou modifikovaný methakrylát vykazuje dobré separační výsledy, dynamickou vazebnou kapacitu a polopropustnost, taktéž i nízký zpětný tlak pro separaci peptidů a proteinů (Chen, X., Tolley, H. D. et al. 2010). Methakrylátové monolitické kolony nesoucí 3-N,Ndiethylamino-2-hydroxypropyl a kvartérní amin jsou velice stabilní i v extrémních podmínkách, například alkalickém ph (Mihelic, I., Krajnc, M. et al. 2001; Vidic, J., Podgornik, A. et al. 2007). Pro výrobu monolitických kolon lze také využít grafting 17

18 (proces, kdy dochází k pevnému spojení interkalačního činidla s povrchem použitého vrstevnatého silikátu a tím k vyšší teplotní stabilitě), který umožňuje vysoké zastoupení funkčních skupin monomeru na povrchu. Monolitická vrstva tak byla připojena na plastovou stěnu mikrofluidního čipu (Stachowiak, T. B., Rohr, T. et al. 2003). V nedávno publikované studii byla popsána příprava kolony pomocí UV fotopolymerizace, která výrazně zlepšila separační vlastnosti monolitické kolony (Takahashi, M., Hirano, T. et al. 2012). V současnosti je snaha o výrobu monolitických kolon s normalizovanými a přesnými póry. Uniformní póry o velikosti cca 1500 nm jsou zejména vhodné pro separaci DNA (Ivancic-Jelecki, J., Brgles, M. et al. 2009; Sousa, A., Bicho, D. et al. 2011), virových částic (Gutierrez-Aguirre, I., Banjac, M. et al. 2009) nebo mikroorganismů jako je Staphylococcus aureus (Buszewski, B., Szumski, M. et al. 2009). Monolitické disky CIM byly také využity pro 2D separaci proteinů pomocí jedné chromatografické kolony, tzv. conjoint liquid chromatography (CLC) (Branovic, K., Lattner, G. et al. 2002). A Mobilní fáze A B PC Software: BioLogic DuoFlow Sběrač frakcí B O S O O A B Chromatografické pumpy Monolytická Nástřikový kolona ventil UV Odpad ~ 50µm Obr. 4: A) Obrázek Schéma iontově 4: A) Schéma výměnné iontově kapalinové výměnné chromatografie kapalinové využívající chromatografie monolitickou využívající CIM kolonu s UV detektor Kapalina byla na CIM kolonu dopravována pomocí dvou pump za pomocí vysokotlakého gradientu. Výstup z kolony byl n UV detektor, monolitickou který sloužilcim pro úpravu kolonu nastavení s UV detektorem sběru frakcí. a B) sběračem Monolitická frakcí. kolona. B) Monolitická kolona. 18

19 3.3.2 Spektrofotometrické metody Pro rychlé stanovení proteinů jsou zejména vhodné spektrofotometrické metody, které vynikají jednoduchostí instrumentace a možnosti automatizace. Výhodou je i možnost využití chromogenních činidel ke zvýšení citlivosti těchto metod. Pro stanovení bílkovin se jsou v literatuře nejčastěji popsány metody s využitím biuretova činidla, pyrogallové červeně a metody dle Bradfordové, ale i ostatní jako je Lowryho metoda nebo BCA metoda. Tyto metody pracují na principu tvorby barevného komplexu s proteiny, který je následně kvantifikován pomocí spektrofotometru. Biuretova metoda závisí na reakci peptidové vazby s Cu(II) v alkalickém prostředí, kde vzniká modrofialový komplex s absorbančním maximem λ max = 540 nm. Nevýhodou metody je nízká citlivost (100 mg.l -1 ) a závislost správnosti a přesnosti výsledků na aminokyselinovém složení (Levin, R. and Brauer, R. W. 1951). Jednou z nejcitovanějších metod je Lowryho metoda, která se vyznačuje vyšší citlivostí po přidání Folinova činidla, avšak vzniklý barevný komplex není v čase stabilní (Peterson, G. L. 1977). Podobných výsledků dosahuje také BCA metoda, která má větší stabilitu jak vzniklého komplexu, tak i reagencií (Krieg, R. C., Dong, Y. et al. 2005). Dalším činidlem, vhodným pro stanovení proteinů, je pyrogallová červeň. Tato metoda je založena na tvorbě modře zbarveného proteinového komplexu v přítomnosti molybdenu(vi) v kyselém prostředí (Fiorina, J. C., Aimone-Gastin, I. et al. 2001) detekovatelném při λ max = 280 nm. Nejvyšší citlivost pro stanovení bílkovin vykazuje metoda dle Bradfordové, kterou poprvé v roce 1976 popsala Dr. Marion Bradford (Bradford, M. M. 1976). Principem je adsorpční vazba barviva Coomassie Brilliant Blue G-250 na molekulu proteinu. Vznik tohoto komplexu je spojován s přítomností bazických aminokyselin (primárně argininu, lysinu a histidinu) v proteinu. Do těchto interakcí jsou zapojeny především Van der Waalsovy síly a hydrofobní interakce. Počet ligandových vazeb barviva ke každé proteinové molekule je proporcionální k celkovému počtu pozitivních nábojů v celém proteinu. Absorbance vzniklého komplexu je nejčastěji detekována při λ max = 595 nm. Výhodou této metody je, že barvivo neinteraguje s většinou solí, rozpouštědel, pufrů, thiolů, redukčních činidel a kovových chelatačních agentů, které se mohou nacházet ve vzorcích (Compton, S. J. and Jones, C. G. 1985). Na druhou stranu barvivo Coomassie nereaguje s volnými aminokyselinami, peptidy a nízkomolekulárními proteiny. Také byl zaznamenán 19

20 negativní vliv surfaktantů, které i v minimálních koncentracích zapříčiňují precipitaci reagentu (Martin, M. M., Rockholm, D. C. et al. 1985) Enzymově značená imunoanalýza (ELISA) Imunochemické metody vynikají svojí citlivostí pro stanovení a měření koncentrace proteinů. Principem je reakce antigenu a protilátky (z nichž jeden je fixován na nosiči) a promývání nenavázaných reaktantů. K detekci se používá navázání protilátky ke značenému enzymu, který obvykle za katalýzy mění zbarvení substrátu, které je následně možné kvantifikovat pomocí spektrofotometrických metod. Nejvíce využívané metody pro kvantitativní stanovení laktoferinu jsou dosud imunoseparační metody jako je enzymově značená imunoanalýza (Hutchens, T. W., Henry, J. F. et al. 1989), ale také afinitní membránová chromatografie (Wolman, F. J., Gonzalez Maglio, D. et al. 2007) či nověji pseudoafinitní chromatografie (Ng, Paul K. and Yoshitake, Tomohiko 2010), radioimunoanalýza (Sykes, J. A. C., Thomas, M. J. et al. 1982),(Boxer, L. A., Coates, T. D. et al. 1982), či luminiscenčně založená imunoanalýza (Maacks, S., Yuan, H. Z. et al. 1989). Pro tyto metody se limity detekce pohybují v rozmezí 10 ng.ml -1 0,2 mg.ml -1. V současnosti se však pro stanovení laktoferinu více využívají komerční kyty. 20

21 3 CÍLE PRÁCE optimalizace izolace laktoferinu pomocí iontově-výměnné kapalinové chromatografie optimalizace fotometrické detekce pro stanovení laktoferinu izolovaného ze vzorků slin korelace ELISA a iontově-výměnné kapalinové chromatografie s off-line fotometrickou detekcí pro stanovení laktoferinu ze vzorků slin 21

22 4 MATERIÁL A METODY 4.1 Chemikálie Standard bovinního laktoferinu byl zakoupen od firmy Sigma Aldrich (USA). HPLC metanol (>99,9%; v/v) byl zakoupen od firmy Merck (Dortmund, Německo). Ostatní chemikálie byly pořízeny od firmy Sigma-Aldrich v ACS čistotě, pokud není uvedeno jinak. Zásobní roztoky laktoferinu (1 mg.ml -1 ) byly připraveny v ACS vodě a uchovány v temnu při -20 C. Pracovní standardy byly denně připraveny ředěním zásobních roztoků v mobilní fázi A. Hodnoty ph byly zaznamenány pomocí WTW inolab Level 3 s terminal Level 3 (Weilheim, Německo), kontrolovaným programem MultiLab Pilot (Weilheim, Německo). ph-elektroda (SenTix H, ph 0..14/ C/3 mol.l -1 KCl) byla pravidelně kalibrována sadou WTW pufrů (Weilheim, Německo). Deionizovaná a demineralizovaná voda byla vyrobena pomocí reverzní osmózy za použití Aqua Osmotic 02 (Aqua Osmotic, Tišnov, Česká republika) a následně přečištěna pomocí Millipore RG (Millipore Corp., USA, 18 MΏ) na Mili-Q vodu. 4.2 Příprava vzorků slin K experimentu bylo vybráno 9 zdravých osob ve věku let (7 žen a 2 muži) a 1 osoba trpící celiakií (vzorek č. 10, žena). Vzorky slin byly odebírány pomocí odběrových zkumavek Salivette (Sarstedt, Německo). Přiložená buničina byla žvýkána po dobu 2 min. Následovala centrifugace vzorků v Salivette zkumavce při 3000 rpm, 5 min (Universal 320, Hettich Zentrifugen, Německo). Odebraný vzorek byl naředěn 1:1 s 25 mm Tris-HCl (ph = 7) a přefiltrován přes mikrofiltr (microstar 0.45µm CA, Costar Cambridge). Takto připravený vzorek byl analyzován pomocí iontově výměnné kapalinové chromatografie s UV detekcí a vyseparované frakce byly off-line fotometricky analyzovány pomocí automatického spektrofotometru. 4.3 Iontově výměnná kapalinová chromatografie s UV detekcí Systém kapalinového chromatografu Biologic DuoFlow (Biorad, USA) byl složen ze dvou chromatografických pump pro dopravu elučních pufrů, monolitické kolony s jedním CIM diskem, který byl modifikován -SO 3- funkčními skupinami (Bia Separations, Slovinsko), dávkovacího ventilu s 2 ml dávkovací smyčkou, UV-VIS detektoru a automatického sběrače frakcí. Kapalina byla na CIM kolonu dopravována 22

23 pomocí dvou pump za pomocí vysokotlakého gradientu. Výstup z kolony byl napojen na čtyřkanálový UV detektor, který sloužil pro úpravu nastavení sběru frakcí. Jako mobilní fáze A (MFA) byl použit 25 mm Tris-HCl o ph 7, mobilní fáze B (MFB) byla složena z 2 M NaCl v MFA. Průtok mobilní fáze byl 4 ml.min -1. Laktoferin byl eluován lineárně se zvyšujícím gradientem NaCl: 0-6 ml (0% B) 6-12 ml (100% B) ml (100% B) ml (0% B), ml (0% B). Detektor byl nastaven na 280 nm (maximum absorpce aromatických aminokyselin). Frakce laktoferinu o objemu 1 ml byla sbírána v elučním objemu 10,6 ml 11,6 ml pomocí automatického sběrače frakcí (Biorad, USA). 4.4 Polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS-PAGE) Izolované frakce laktoferinu byly analyzovány polyakrylamidovou gelovou elektroforézou v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE). Pro studium laktoferinu byl použit 7,5% separační gel a koncentrace zaostřovacího gelu byla 5 %. SDS-PAGE probíhala na aparatuře Maxigel od firmy Biometra (Německo). Separace probíhala při napětí 150 V, dokud čelo proteinů nedosáhlo dolního konce gelu (~ 1 h). Během separace byl gel chlazen vodou. SDS-PAGE a detekce proteinů stříbrem byly provedeny podle klasických protokolů (Krizkova, S., Hrdinova, V. et al. 2008). Gel byl inkubován 1 hod v roztoku 1 (1,14% kyseliny octové, 6,4% metanolu, 0,1% formaldehydu) s následným propláchnutím 3 15 min v roztoku 2 (metanol s MiliQ vodou v poměru 1:1). Poté byl opět inkubován 1 min v roztoku 3 (0,02% thiosíran sodný) a propláchnut 2 20s destilovanou vodou. Následovala další inkubace 20 min v roztoku 4 (0,02% AgNO3, 0,076% formaldehydu) a propláchnutí 20s destilovanou vodou. Na závěr byl gel inkubován v roztoku 5 (6% Na 2 CO 3, 0,0004% Na 2 S 2 O 3, 0,05% formaldehydu) a byl pozorován vznik zbarvení. Po získání optimálního zabarvení (asi 3 min) byl gel ihned propláchnut 2 2 min destilovanou vodou. Pro zafixování byl hotový gel inkubován v roztoku 6 (6,4% methanolu a 1,14% kyseliny octové). 4.5 Fotometrická detekce laktoferinu Pro fotometrickou analýzu laktoferinu byl použit automatický spektrofotometr BS 200 (Mindray, Čína), který se skládá z kyvetového prostoru (temperovaný na 37 ±0,1 C), reagenčního prostoru s karuselem pro reagencie a přípravu vzorků (temperovaný na 4 ±1 C) a optického detektoru (Sochor, J., Ryvolova, M. et al. 2010). Zdrojem 23

24 světla byla halogen-wolframová žárovka. Přenos vzorků a reagencí byl zabezpečen robotickým ramenem s dávkovací jehlou (chyba dávkování do 1 % objemu). Kontaminace byla minimalizována díky proplachování jak dávkovací jehly, tak míchadla MilliQ vodou. Ke stanovení laktoferinu pyrogallovou červení bylo ke 200 µl reagencie (50 mm sukcinová kyselina, 3,47 mm benzoát sodný, 0,06 mm molybdát sodný, 1,05 mm oxalát sodný a 0,07 mm pyrogallová červeň) (Yang, Jui-Yi, Chien, Tzu- I. et al. 2009), (Pupkova, V. I. and Prasolova, L. M. 2007), (da Silva, Adriana Scotti and Falkenberg, Miriam 2011) (Skalab-kit, Svitavy Česká republika) přidáno 4 µl vzorku. U metody dle Bradfordové (Seevaratnam, Rajini, Patel, Barkha P. et al. 2009), (Field, Anjalie and Field, Jeffrey 2010), (Carlsson, Nils, Borde, Annika et al. 2011) bylo k 190 µl reagencie (0,01% Coomassie Brilliant Blue G-250, 4,7% ethanol, 8,5% kyselina fosforečná v destilované vodě) přidáno 10 µl vzorku (Zor, T. and Seliger, Z. 1996). Pro stanovení bílkovin biuretovým činidlem bylo do kyvety napipetováno 150 μl biuretového činidla (100 mm vinan sodno-draselný, 100 mm NaOH, 15 mm KI, 6 mm CuSO 4 ) a následně 3 μl vzorku. Po 10 minutách inkubace při 37 C byla změřena absorbance při vlnové délce λ = 546 nm. Obsah kyvet po nadávkování vzorku byl ihned promíchán automatickým míchadlem a analyzován. Detekce probíhala při 578 nm a doba reakce byla 10 min. Absorbance byla odečítána v čase, kde byla zaznamenána maximální absorbance pro všechny body kalibrace a to v čase 18 sekund. 4.6 Enzymově značená imunoanalýza Mikrotitrační destička byla pokryta 100 µl kozími anti-laktoferin protilátkami (SantaCruz Biotechnology, USA) zředěnými 1:5000 nebo 1:3000 0,05 M uhličitanovým pufrem (0,032 M Na 2 CO 3 a 0,068 M NaHCO 3, ph 9,6) při 4 C po dobu 16 hodin. Poté byl volný povrch jamek 30 minut při 37 C blokován 1 % bovinním sérovým albuminem (w/v) v PBS pufru (137 mm NaCl, 2,7 mm KCl, 1,4 mm NaH 2 PO 4, a 4,3 mm Na 2 HPO 4, ph 7,4) s následným promýváním jamek 5 s 350 µl 0,05 % (v/v) PBS-T (Hydroflex, TECAN, USA). Do takto připravených jamek bylo napipetováno 100 µl standardu nebo připraveného vzorku slin a mikrotitrační destička byla inkubována při 37 C 1 hodinu. Po promytí jamek PBS pufrem, bylo přidáno 100 µl monoklonální myší protilátky proti laktoferinu (SantaCruz Biotechnology, USA) ředěné 1:5000 nebo 1:10000 v PBS pufru. Mikrotitrační destička byla inkubována 60 min při 37 C. Po promytí PBS pufrem, bylo do jamek přidáno 100 µl kuřecích protimyších 24

25 protilátek značených křenovou peroxidázou (SantaCruz Biotechnology, USA) ředěných 1:1500 nebo 1:2000 a destička byla inkubována 60 min při 37 C. Po inkubaci a promytí 100 µl 0,001% (w/v) TMB v 0,2 M acetátu sodném okyseleném na ph 5,8 kyselinou citronovou s 0,037 % (v/v) H 2 O 2. Po 30 minutách byla reakce ukončena 50 µl H 2 SO 4 a po 5 minutách byla měřena absorbance při 450 nm (Infinite M200 Pro, TECAN, USA). 4.7 Statistické vyhodnocení Data byla zpracována pomocí programu MICROSOFT EXCEL (USA). Výsledky jsou vyjádřeny jako ± standardní odchylky (SD), pokud není uvedeno jinak (EXCEL ). Limity detekce (3 signál/šum, 3S/N) byly vypočteny dle Long and Winefordner (Long, G. L. and Winefordner, J. D. 1983), kde N je standardní odchylka signálu šumu, pokud není uvedeno jinak. Návratnost metody byla vyhodnocena metodou standardního přídavku. Před extrakcí bylo přidáno ke vzorkům slin 100 µl standardu laktoferinu (50 µg.ml -1 ) a 100 µl vody. Koncentrace laktoferinu byly následně odvozeny z kalibrační křivky. Současně byl analyzován samotný standardní přídavek. Výpočet návratnosti byl proveden dle Causon (Causon, R. 1997) a Bugianesi et al. (Bugianesi, R., Serafini, M. et al. 2000). 25

26 5 VÝSLEDKY A DISKUZE Pro separaci laktoferinu byl využit kapalinový chromatograf, ke kterému byla připojena monolitická kolona. Tato kolona je díky své konstrukci šetrná ke struktuře proteinu, neboť lze separaci provádět při vysokém průtoku a přitom při velmi nízkém tlaku, aniž by došlo k poškození struktury proteinu (Adam, V., Zitka, O. et al. 2008; Zitka, O., Krizkova, S. et al. 2010). Tyto strukturní změny proteinů v závislosti na tlaku v koloně byly již v minulosti studovány (Kukacka, J., Zitka, O. et al. 2007; Zitka, O., Horna, A. et al. 2007; Zitka, O., Krizkova, S. et al. 2013). Pro separaci byl využit postup, jehož parametry byly optimalizovány v práci (Adam, V., Zitka, O. et al. 2008). V tomto experimentu byla provedena optimalizace postupu pro izolaci laktoferinu ze slin, kde byla sledována rychlost průtoku mobilní fáze a koncentrace solí obsažených v elučním pufru. Dále byly testovány metody fotometrické detekce. Získané výsledky byly nakonec korelovány s klinicky běžně využívanou ELISOU pro stanovení laktoferinu. 5.1 Optimalizace izolace laktoferinu z lidských slin Jako mobilní fáze A byl použit 25 mm Tris-HCl (ph 7), který vykazoval minimální vliv na eluci laktoferinu z monolitické kolony během nástřiku, avšak vykazoval dobrou účinnost pro eluci ostatních bílkovin obsažených ve slinách. Jako mobilní fáze B byl zvolen 2 M NaCl v 25 mm Tris HCl (ph 7). Eluce probíhala vzestupným gradientem Optimalizace gradientu Pro efektivní separaci laktoferinu od ostatních proteinů bylo nezbytné optimalizovat lineárně zvyšující se gradient, který byl určen z výšky a šířky píku. (Obr. 5A). Standard laktoferinu (50 µg.ml -1 ) byl z kolony eluován 5 ti různými zvyšujícími se gradienty s následnou isokratickou elucí a zakončením re-ekvilibrací kolony: i, 0-6 ml (0% B), 6-7 ml (100% B), ml (100% B), ml (100% B), ml (0% B); ii, 0-6 ml (0% B), 6-10 ml (100% B), ml (100% B), ml (100% B), ml (0% B); iii, 0-6 ml (0% B), 6-12 ml (100% B), ml (100% B), ml (100% B), ml (0% B); iv, 0-6 ml (0% B), 6-14 ml (100% B), ml (100% B), ml (100% B), ml (0% B) a v, 0-6 ml (0% B), 6-16 ml (100% B), ml (100% B), ml (100% B), ml (0% B). Na obrázku 5B je vidět, že se signál laktoferinu zvyšoval s delší eluční části gradientu a výška píku dosahovala maxima 65 mau 26

27 Gradient (% B) Šířka píku (min) při použití gradientu iii. Delší eluční gradient iv, a v, následně vykazoval klesající trend výšky píku. Při sledování vlivu rychlosti elučního gradientu na šířku píku byl zaznamenán rostoucí lineární trend, tedy s delší eluční části gradientu docházelo k pomalejší eluci laktoferinu a rozmývání píku. Na základě získaných výsledků byl jako nejvhodnější gradient pro eluci laktoferinu zvolen lineárně zvyšující se gradient iii. A i, 0-6 ml (0% B), 6-7 ml (100% B), ml (100% B), ml (100% B), ml (0% B) ii, 0-6 ml (0% B), 6-10 ml (100% B), ml (100% B), ml (100% B), ml (0% B) B 0,7 0,6 0,07 0,06 iii, 0-6 ml (0% B), 6-12 ml (100% B), ml (100% B), ml (100% B), ml (0% B) iv, 0-6 ml (0% B), 6-14 ml (100% B), ml (100% B), ml (100% B), ml (0% B) 0,5 0,05 v, 0-6 ml (0% B), 6-16 ml (100% B), ml (100% B), ml (100% B), ml (0% B) i ii iii iv v 0,4 0,3 0,2 Šířka píku (min) Výška píku (AU) 0,04 0,03 0,02 Výška píku (AU) 0,1 0, Objem mobilní fáze (ml) 0 i ii iii iv v Gradient 0 Obrázek Obr. 5: A) Optimalizace 5: A) Optimalizace lineárně vzestupného lineárně gradientu vzestupného označené jakogradientu i, ii, iii, iv a označené v. B) Závislost jako výškyi, aii, šířky iii, píku iv naa gradientu. Pro optimalizaci byl použit 2 M NaCl v mobilní fázi A a rychlost průtoku byla 4 ml.min -1. Detaily metody jsou v. uvedeny B) Závislost v kapitole 4.3. výšky a šířky píku na gradientu. Pro optimalizaci byl použit 2 M NaCl v mobilní fázi A a rychlost průtoku byla 4 ml.min -1. Detaily metody jsou uvedeny v kapitole Vliv rychlosti průtoku mobilní fáze na eluci laktoferinu Optimální rychlost průtoku mobilní fáze (2 ml.min -1, 2,5 ml.min -1, 3 ml.min -1, 3,5 ml.min -1, 4 ml.min -1, 4,5 ml.min -1 a 5 ml.min -1 ) byla testována na základě porovnání výšky a šířky píku standardu laktoferinu (50 µg.ml -1 ). Cílem bylo laktoferin z kolony eluovat v co nejkratším čase a v nejmenším možném objemu, aby nedocházelo k jeho naředění. Z výsledků je patrné (Obr. 6A), že se zvyšujícím se průtokem se píky zvyšují a to do průtoku 4 ml.min -1, poté dochází k opětovnému poklesu signálu. Stejný trend byl zaznamenán při sledování šířky píku. S rychlejším průtokem se šířka píku snižovala. Tento výrazný pokles je zřejmý do rychlosti průtoku 4 ml.min -1, kdy při rychlejších průtocích se již šířka píku výrazně nemění, což vyplývá i z grafického znázornění na Obr. 6B. Pro eluci laktoferinu z monolitické kolony byla tedy vybrána rychlost průtoku 4 ml.min -1, kdy byly píky nejvyšší a vykazovaly dobrou symetrii. 27

28 Absorbance (mau) Šířka píku (min) Absorbance (mau) Šířka píku (min) Vliv iontové síly mobilní fáze na eluci laktoferinu Vedle rychlosti průtoku je pro izolaci laktoferinu také nezbytné optimalizovat iontovou sílu mobilní fáze, kterou je laktoferin vysolen z monolitické kolony. Proto byly testovány koncentrace NaCl 1,5 M, 2 M, 2,5 M a 3 M v 25 mm Tris-HCl (ph 7) (MFB). Ze získaných výsledků vyplývá, že vyšší koncentrace NaCl usnadňuje eluci laktoferinu. Tento trend dokazuje i chromatogram na Obr. 6C, kde je vidět, že se píky zvyšují se silnější iontovou silou a to až do koncentrace NaCl 2 M. S vyšší koncentrací NaCl byl následně zpozorován pokles signálu. Bylo také zaznamenáno, že šířka píku se snižuje do koncentrace 2 M a s vyšší koncentrací NaCl je přibližně stejná. Efektivní eluce bylo tedy dosaženo při koncentraci NaCl 2 M (Obr. 6D). Podle některých studií bylo prokázáno, že vyšší koncentrace solí v izolovaných frakcích může způsobit denaturaci laktoferinu a proto byla vybrána nejnižší možná koncentrace NaCl, aby bylo zabráněno možné destabilizaci struktury laktoferinu (Verheul, M. and Roefs, Spfm 1998). A C ,0 ml.min -1 3,5 ml.min -1 5,0 ml.min-1 3,0 ml.min -1 4,5 ml.min -1 2,5 ml.min-1 4,0 ml.min ,0 M NaCl 1,5 M NaCl 2,0 M NaCl Retenční čas (min) 2,5 M NaCl 3,0 M NaCl Retenční čas (min) Obrázek 6: A) Chromatogram proložení píků standardu laktoferinu (50 µg.ml -1 ) při různém průtoku mobilní fáze. B) Závislost průtoku MF na šířce a výšce píků. C) Chromatografický záznam při proložení píků standardu laktoferinu (50 µg.ml -1 ) eluovaného zvolenou iontovou sílou mobilní fáze B. D) Závislost průtoku MF na šířce a výšce píků. Detaily metody jsou uvedeny v kapitole B D 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Šířka píku (min) Výška píku (AU) Rychlost průtoku (ml.min -1 ) Šířka píku (min) Výška píku (AU) 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Koncentrace NaCl (M) Obr. 6: A) Chromatogram proložení píků standardu laktoferinu (50 µg.ml -1 ) při různém průtoku (2 5 ml.min -1 ) mobilní fáze. B) Závislost průtoku MF na šířce a výšce píků. C) Chromatografický záznam při proložení píků standardu laktoferinu (50 µg.ml -1 ) eluovaného zvolenou iontovou sílou (1 M 3 M NaCl) mobilní fáze B. D) Závislost průtoku MF na šířce a výšce píků. Detaily metody jsou uvedeny v kapitole ,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, ,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 Výška píku (AU) Výška píku (AU)

29 Výška teoretického patra (µm) Van Deemterova rovnice Pro stanovení optimální průtokové rychlosti CIM diskové kolony byla vypočítána van Deemterova rovnice: (H=L/N; N=16 (t r /W base ) 2 ), která vyjadřuje závislost výšky ekvivalentní teoretickému patru na rychlosti průtoku mobilní fáze. Analýza účinnosti kolony byla vypočítána z lineárních rychlostí průtoku při optimálním gradientu, který je popsán výše. Na základě získaných výsledků z van Deemterovy rovnice vyplývá, že optimální výška teoretického patra HETP byla stanovena mezi rychlostmi průtoku 4 až 5 ml.min -1 (Obr. 7) Rychlost průtoku (ml.min -1 ) Obrázek 7: Závislost výšky ekvivalentu teoretického patra na lineárně zvyšujícím se průtoku mobilní fáze pro CIM monolitický disk. Další detaily jsou uvedeny v kapitole 4.3. Obr. 7: Závislost výšky ekvivalentu teoretického patrana lineárně zvyšujícím se průtoku mobilní fáze pro CIM monolitický disk Dependence of height equivalent of theoretical plate (HETP) on linear flow rate of mobile SDS-PAGE phase for CIM analýza monolithic vzorků disc. Další slin detaily jsou uvedeny v kapitole 4.3. Optimalizovaná metoda byla použita pro izolaci laktoferinu z lidských slin. Vzorky připravené dle kapitoly 4.2 byly izolovány a frakce o objemu 1 ml byly sbírány v čase 2,6 3,1 min, jak je znázorněno na Obrázku 8A. Ze získaného chromatogramu je patrné, že většina proteinů, které se ve slinách nachází, mají nižší pi než laktoferin a jsou eluovány v dřívějším retenčním čase. Izolovaný laktoferin byl společně se vzorkem plných slin podroben analýze pomocí SDS-PAGE, jejíž parametry jsou uvedeny v kapitole 4.4. Elektroforeogram vzorku neizolovaných slin, je zobrazen na Obrázku 8B. Je zde patrné, že sliny obsahují mnoho proteinů, které je třeba od laktoferinu oddělit. Na dalším elektroforeogramu (Obr. 8C) jsou stejné vzorky slin, ze kterých byl 29

30 Absorbance (AU) izolován laktoferin pomocí monolitické kolony. Na všech dráhách je patrný pouze jeden proužek, který v porovnání s žebříčkem má molekulovou hmotnost 77 kda, což odpovídá přibližné molekulové hmotnosti laktoferinu. Intenzita proužku izolovaného laktoferinu koresponduje se zjištěnou koncentrací laktoferinu pomocí optimalizované metody pro jeho izolaci. Zároveň bylo pomocí SDS-PAGE potvrzeno, že vzorky s izolovaným laktoferinem neobsahovaly žádné kontaminace. A 0,60 0,50 0,40 Vzorek Standard B kda Mr ,30 0,20 0,10 0,00 Standard laktoferinu 50 µg.ml -1 Vzorek C kda Mr Retenční čas (min) 25 Obrázek 8: A) Proložení chromatogramu vzorku a standardu laktoferinu (50 µg.ml 1 ). Čárkovanou čarou je vyznačená sbíraná frakce. B) Elektroforeogram 7 testovaných vzorků slin C) Elektroforeogram izolovaných frakcí vzorků slin Obr. 8: A) Proložení chromatogramu vzorku a standardu laktoferinu (50 µg.ml -1 ). Čárkovanou čarou je vyznačená sbíraná frakce. B) Elektroforeogram 7 testovaných vzorků slin C) Elektroforeogram izolovaných frakcí vzorků slin po iontově-výměnné kapalinové chromatografii. po iontově-výměnné kapalinové chromatografii. Parametry jsou uvedeny v kapitole Parametry jsou uvedeny v kapitole 4.3 a a Optimalizace off-line fotometrické detekce Dále byly testovány metody pro off-line fotometrickou detekci. Pro fotometrické stanovení koncentrace laktoferinu z izolovaných frakcí byly vybrány tři metody, které se běžně používají ke stanovení proteinů a to pyrogallová červeň (Pupkova, V. I. and Prasolova, L. M. 2007; Yang, J. Y., Chien, T. I. et al. 2009; Silva, A. S. and Falkenberg, M. 2011), metoda dle Bradfordové (Seevaratnam, R., Patel, B. P. et al. 2009; Field, A. and Field, J. 2010; Carlsson, Nils, Borde, Annika et al. 2011) a biuretovo činidlo (Ohnishi, S. T. and Barr, J. K. 1978). Ke zjištění limitu detekce (3*S/N (Long, G. L. 30

31 Absorbance (mau) Absorbance (mau) Absorbance (mau) and Winefordner, J. D. 1983)) metod byla sestavena 15 ti bodová kalibrační závislost laktoferinu, která byla připravena v roztoku 2 M NaCl v koncentračním rozmezí od 1 µg.ml -1 do 1000 µg.ml -1. V případě metody využívající pyrogallovou červeň (Obr. 9A) byla linearita kalibrační křivky R 2 = 0,9899 v koncentračním rozmezí 15, µg.ml -1 s limitem detekce 1 µg.ml -1 (RSD = 6 %, n = 3, Tab. I). Kalibrační řada analyzovaná biuretovou metodou (Obr. 9B) vykazovala linearitu R 2 = 0,999 v koncentračním rozmezí 62, µg.ml -1. Limit detekce 3S/N činil 10 µg.ml -1 (RSD = 5 %, n = 3, Tab. I). Kalibrace laktoferinu získaná pomocí metody dle Bradfordové (Obr. 9C, D) byla lineární ve dvou částech. Pro analýzu laktoferinu bylo vybráno koncentrační rozmezí od 1 do 62,5 µg.ml -1 s R 2 = 0,9916. Limit detekce této metody byl 0,01 µg.ml -1 (RSD = 4 %, n = 3, Tab. I). A LOD = 1 µg.ml -1 y = x R² = B LOD = 10 µg.ml -1 y = 0,9285x + 208,53 R² = 0, C Koncentrace (µg.ml -1 ) Koncentrace (µg.ml -1 ) D LOD = 0,01 µg.ml Koncentrace (µg.ml -1 ) y = x R² = Obrázek 9: Graf závislosti absorbance na koncentraci laktoferinu v získaných frakcích pomocí iontově-výměnné kapalinové chromatografie analyzovaných v offline provedení pomocí A) pyrogallové červeně, B) biuretova činidla a C) metody dle Obr. 9: Graf závislosti absorbance na koncentraci laktoferinu v získaných frakcích pomocí iontově-výměnné kapalinové ch analyzovaných v off-line provedení pomocí (A) pyrogalové červeně, (B) biuretova činidla a (C) metody dle Bradfordové v rozmezí 0,061 µg.ml µg.ml -1. (D) Lineární část kalibrační křivky laktoferinu detekovaného metodou dle Bradfordo µg.ml -1. Ostatní detaily jsou uvedeny v kapitole 4.5. Bradfordové v koncentračním rozmezí 0,061 µg.ml µg.ml -1. D) Lineární část kalibrační křivky laktoferinu detekovaného metodou dle Bradfordové od 0,2 do 62,5 µg.ml -1. Další parametry jsou uvedeny v kapitole

32 Tabulka 1: Fotometrické stanovení proteinů. Metoda Rovnice regrese Lineární dynamický rozsah R 2 LOD a LOQ b RSD c (µg.ml -1 ) (µg.ml -1 ) (µg.ml -1 ) (%) Pyrogallová červeň y = 0,065x + 3, , Biuretovo činidlo y = 0,928x + 208,530 62, , dle Bradfordové y = 2,027x + 8,461 0,1 62,5 0,992 0,01 0,03 4 a Limit detekce, b Limit kvantifikace, c Relativní směrodatná odchylka Pro dosažení vysokého limitu detekce stanovení laktoferinu je nejvhodnější metoda dle Bradfordové. Vzhledem k tomu, že v publikovaných studiích byly naměřené koncentrace laktoferinu ve slinách v rozmezí 10,54 µg.ml -1 (Jentsch, H., Sievert, Y. et al. 2004) až 47 µg.ml -1 (Rudney, J. D. and Smith, Q. T. 1985), byla pro off-line detekci zvolena fotometrická metoda dle Bradfordové. Pro ověření detekce i v off-line provedení byla 15 ti bodová kalibrační závislost připravena také v pufru, který je součástí mobilní fáze A pro separaci laktoferinu, a kterým jsou sliny ředěny, aby byla vyvrácena možnost interference laktoferinu s NaCl. Tato kalibrační řada laktoferinu byla analyzována pomocí iontově výměnné kapalinové chromatografie s následnou fotometrickou detekcí izolovaných frakcí metodou dle Bradfordové. Zjištěné hodnoty absorbance byly při porovnání stejné jako u kalibrace laktoferinu připraveného v prostředí eluentu tedy mobilní fáze B. V porovnání s ostatními autory Adam et al. 100 µg.ml -1 (Adam, V., Zitka, O. et al. 2008), Yoshise et al. 100 µg.ml -1 (Yoshise, R. E., Matsumoto, M. et al. 2007), Sykes et al. 200 µg.ml -1 (Sykes, J. A. C., Thomas, M. J. et al. 1982) a Drackova et al. 4,5 µg.ml -1 (Drackova, M., Borkovcova, I. et al. 2009) vykazuje námi optimalizovaná metoda nižší limity detekce. 5.3 Analýza vzorků slin Návratnost Sliny jsou komplexem mnoha látek, které spolu mohou interferovat a tím zkreslovat získané výsledky, proto byla stanovena návratnost separace laktoferinu metodou standardního přídavku o koncentraci 50 µg.ml -1 dle optimalizované metodiky. Ze získaných hodnot byla vypočítána průměrná návratnost 51 ± 5 % (n=3). Nedostatečná návratnost je způsobena nízkou přenosovou kapacitou hmoty CIM disku. Na druhou 32