MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Katedra biochemie Autoimunitní onemocnění se zaměřením na roztroušenou mozkomíšní sklerózu Bakalářská práce Brno, květen 2006 Veronika Bačíková

2 literatury. Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně, s použitím uvedené 16. května 2006 Děkuji vedoucí mé bakalářské práce Mgr. Monice Duškové, Dr. za odborné znalosti a cenné rady, které mi při mé práci poskytla. 4

3 1. ÚVOD IMUNITNÍ SYSTÉM Hlavní komponenty imunitního systému Lymfatické tkáně a orgány Buňky imunitního systému Molekuly imunitního systému Nespecifické mechanismy imunity Humorální mechanismy Buněčné mechanismy Specifické mechanismy imunity Antigen a prezentace antigenu B lymfocyty Protilátky T lymfocyty AUTOIMUNITNÍ IMUNOPATOLOGICKÉ STAVY Mechanismy tolerance Vznik autoimunitních imunopatologických stavů Vliv genetických faktorů Vliv pohlavního dimorfismu Vliv infekčních procesů na vznik AIR Lymfocyty a AIR Stres a indukce AIR Přehled autoimunitních onemocnění ROZTROUŠENÁ SKLERÓZA MOZKOMÍŠNÍ Epidemiologie Etiopatogeneze Klinické příznaky Typy nemoci, průběh a prognóza nemoci Pomocná vyšetření a diferenciální diagnóza Terapie Léčba ataky onemocnění v kterémkoli stadiu Dlouhodobá léčba v remitentním stadiu RS Léčba chronické progrese Léčba primární progrese Experimentální léčba ZÁVĚR...54 SEZNAM ZKRATEK...55 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY...58 SEZNAM OBRÁZKŮ...59 SEZNAM TABULEK

4 1. ÚVOD Schopnost imunitního systému rozpoznat antigeny vlastních tkání a reagovat s nimi je fyziologickým jevem, uplatňujícím se v homeostatických mechanismech. Poškozené, staré, apoptotické či jinak pozměněné buňky vlastního těla jsou průběžně rozpoznávány a eliminovány. O autoimunitních onemocněních hovoříme tehdy, když autoimunitní reakce vede k poškození tkání. Celková incidence autoimunitních onemocnění v populaci je kolem 5 %. Podmínkou vzniku autoimunitních onemocnění je prolomení autotolerance. Vzhledem k redundanci mechanismů udržujících autotoleranci je k jejímu prolomení obvykle nutné působení několika faktorů. Jedná se o kombinaci faktorů vnitřních (genetických) a faktorů zevního prostředí. Roztroušená skleróza patří mezi nejběžnější příčiny chronické disability z neurologické příčiny u mladých dospělých. Jako u řady jiných autoimunit je vyšší výskyt u žen, což je zřejmě způsobeno hormonálními faktory. Posledních deset let výzkumu přineslo řadu velmi podstatných poznatků, které ovlivnily dříve konzervativní postoj kliniků k této nemoci. Racionální imunoterapie autoimunit, ale i jiných imunopatologických onemocnění, je důležitým cílem, k jehož dosažení by měly zásadním způsobem přispět poznatky základního imunologického výzkumu. 2. IMUNITNÍ SYSTÉM Primární rolí imunity je chránit organismus před zevními škodlivinami a zprostředkovávat obranu proti infekci. Tím je umožněn život složitého organismu ve vnějším prostředí. Neméně důležité je udržování antigenní homeostázy organismu. To se děje eliminací buněk, které imunitní systém (IS) rozpoznává jako cizí (opotřebované, odumřelé nebo nádorové buňky). Podobně jako centrální nervová soustava i IS disponuje schopností rozlišovat prioritní situace pro imunitní odpověď a rozeznat důležitý signál od šumu. Nemůže reagovat 6

5 proti všem epitopům, které se vyskytují na všech složitých biologických makromolekulách, musí rozpoznat takový, na který je nutno imunitní odpověď zaměřit (Havrdová a kol., 2001). Současně musí mít IS schopnost rozpoznávat vlastní tkáně a udržovat vůči nim toleranci. Z repertoáru antigenně specifických lymfocytů je nutno eliminovat nebo anergizovat všechny klony, které by rozeznávaly struktury normálně přítomné ve zdravém organismu. Aby bylo vyhověno všem těmto požadavkům, IS má jednak rychlou, nespecifickou cestu jak likvidovat zevní škodliviny, tzv. první linii obrany, jednak pomalejší, specifickou cestu boje s tím, co by mohlo ohrozit jeho integritu. Jak imunita nespecifická, tak specifická jsou zprostředkovány mechanismy humorálními a buněčnými. Většina prvků IS je alespoň částečně nahraditelná jinými prvky. Tato redundance snižuje zranitelnost systému náhodnými malými poruchami (Hořejší & Bartůňková, 2002). 2.1 Hlavní komponenty imunitního systému Imunitní reakce jsou zajišťovány mnoha různými druhy buněk a molekul a jejich vzájemnými interakcemi. Buňky IS spolu s pojivovými buňkami a dalšími strukturami tvoří funkční a anatomické celky - lymfatickou tkáň a lymfatické orgány Lymfatické tkáně a orgány Lymfoidní systém je tvořen lymforetikulární tkání. Skládá se z fixních retikulárních buněk (retikulocytů), z fixních makrofágních a dendritických buněk. Tyto buňky mají četné plazmatické výběžky s retikulinovými vlákny a vyznačují se fagocytární schopností. Prostor mezi fixními buňkami je vyplněn volnými buňkami. Jsou představovány různými vývojovými stádii lymfocytů, volnými makrofágy (histiocyty), plazmatickými buňkami a granulocyty. Podle organizace lymfoidní tkáně rozlišujeme řídkou lymfoidní tkáň, ve které převažují retikulocyty (dlouhé výběžky), a hustou lymfoidní tkáň, v níž převažují lymfocyty (krátké výběžky). Jako primární lymfatické orgány jsou označovány kostní dřeň a thymus. Jsou místem vzniku, diferenciace a zrání imunokompetentních buněk. Mezi sekundární lymfatické orgány řadíme slezinu, lymfatické uzliny a jejich organizované shluky - tonsily, apendix, Peyerovy 7

6 plaky ve střevě. Lymfatická tkáň rozptýlená do funkčních, nikoliv anatomických celků, je představována zejména slizniční lymfatickou tkání (MALT mucous associated lymphoid tissue). Sekundární lymfatické orgány a tkáně jsou místem, kde probíhají hlavní fáze antigenně specifických imunitních reakcí. Lymfatické orgány jsou s ostatními orgány a tkáněmi propojeny sítí lymfatických a krevních cév. Lymfatické cévy sbírají lymfu z tkání, přivádějí ji do lymfatických uzlin a odtud ji odvádějí spolu s částí lymfocytů do krevního řečiště. Primární lymfatické orgány Thymus je trojboký dvoulaločnatý útvar uložený nad hrudní kostí (sternum). Na povrchu má vazivový obal, ze kterého dovnitř vstupují četné přepážky (septa) a dělí vnitřní prostor na velké množství laloků a lalůčků. V každém laloku rozlišujeme vrstvu korovou (kortikální) a dřeňovou (medulární). V dřeni se nachází Hassalova tělíska s koncentricky uspořádanými buňkami. Kůra obsahuje síť epiteliálních retikulárních buněk tří typů. Izolace thymocytů retikulárními buňkami zajišťuje, že nepřijdou do styku s cizím antigenem, což hraje důležitou roli při eliminaci autoreaktivích T lymfocytů. Kostní dřeň je osídlena progenitory hemopoetických a lymfopoetických buněčných linií. Kromě zrajících buněk se zde nachází i imunokompetentní B a T buňky, vcestované krevním řečištěm. Kostní dřeň je tedy nejen primárním, ale i sekundárním lymfoidním orgánem. Sekundární lymfatické orgány Lymfatické uzliny jsou malé orgány ohraničené kapsulou, obsahují lymfocyty, makrofágy a dendritické buňky. V kůře se nacházejí folikuly primárního a sekundárního charakteru. V primárních folikulech jsou zejména zralé a klidové B lymfocyty, které nebyly stimulovány antigenem. Sekundární tělíska vytváří zárodečná centra, kde B lymfocyty svými receptory rozpoznávají antigen prezentovaný folikulárními dendritickými buňkami. Plně diferencované plazmatické buňky se nachází v dřeni. Parakortikální oblast je osídlená T lymfocyty, dřeň tvoří tkáň s B i T lymfocyty, plazmatickými buňkami a makrofágy. Aferentní cévy přivádějí do uzlin lymfu a s ní případně antigeny a buňky prezentující antigen z tkání. Ty cévy, které odvádějí s lymfou do krevního oběhu zralé efektorové lymfocyty, se nazývají eferentní lymfatické cévy (Hořejší & Bartůňková, 2002). 8

7 Lymfatické uzliny jsou prvním místem, kde se začíná imunitní odpověď na antigen. Filtrují a očišťují lymfu od cizorodých částic dříve, než postupuje do další části těla. Tvoří tak bariéru, která chrání před škodlivými antigeny přicházejícími z kůže a slizničních povrchů. Slezina se nachází v břišní dutině a rozlišujeme u ní dva druhy retikulárních tkání. Bílou pulpu tvoří lymfatická tkáň, především T lymfocyty. Červená pulpa vyplňuje prostor mezi bílými pulpami. Nachází se zde erytrocyty, granulocyty, trombocyty, lymfocyty, makrofágy a plazmatické buňky. Marginální zónu, lokalizovanou na rozhraní mezi červenou a bílou pulpou, tvoří řídká lymfatická tkáň bohatá na makrofágy. V červené pulpě jsou likvidovány přestárlé erytrocyty a destičky, ale slezina slouží také jako rezervoár destiček, erytrocytů a granulocytů. Přítomností mnoha makrofágů, lymfocytů a plazmatických buněk je určena její imunologická úloha, a to vychytávání a zpracovávání antigenů, které jsou v krevním řečišti Buňky imunitního systému Podstatnou část IS tvoří různé druhy leukocytů, kterých je za normálních okolností v 1 mm 3 krve (Havrdová a kol., 2001). Všechny druhy leukocytů pocházejí z pluripotentních kmenových buněk přítomných v kostní dřeni, které jsou charakteristické adhezívní molekulou CD34. Kmenové buňky jsou multipotentní buňky s kapacitou diferencovat se v buňky různých funkcí i různých fenotypů. Rozlišujeme dvě základní linie, lymfoidní, z které se vyvíjejí T a B lymfocyty, a myeloidní, která dává základ prekurzorovým buňkám granulocytární, monocytární, erytropoetické i megakaryocytární linie. K diferenciaci dochází pod vlivem faktorů mikroprostředí, jako jsou vzájemné interakce buněk a přítomnost solubilních nebo membránově vázaných cytokinů. Proliferační kapacita kmenových buněk je obrovská, není však nekonečná (Havrdová a kol., 2001). Hlavními typy leukocytů lidské periferní krve jsou polymorfonukleární neutrofily, eozinofily a bazofily (obecně nazývané granulocyty), lymfocyty a monocyty. Polymorfonukleární leukocyty (PMN) mají laločnaté jádro a podle barvicích charakteristik cytoplazmy se dělí na neutrofilní, eozinofilní a bazofilní. Účastní se akutní zánětlivé odpovědi. Neutrofily tvoří % všech bílých krvinek. Jsou aktivně přitahovány do místa poškození chemoatraktanty a aktivně fagocytují napadající mikroorganismy. Stojí tedy v první linii obrany proti infekci. Eozinofily dovedou při reakci s cílovou buňkou ze svých 9

8 eozinofilních granulí uvolňovat kladně nabité peptidy, které mohou tuto cílovou buňku zneškodnit. Tvoří 2-5 % bílých krvinek. Z cirkulace migrují do míst exponovaných vnějšímu prostředí jako je kůže, bronchiální mukóza a gastrointestinální trakt. Jejich počet je zvýšen u alergických a parazitárních onemocnění. Granula bazofilů jsou zásobárnami heparinu, histaminu, destičkového aktivačního faktoru a dalších farmakologicky významných mediátorů okamžité hypersenzitivity. Bazofily tvoří jen 0,5 % cirkulujících polymorfonukleárů (Havrdová a kol., 2001). Mononukleární buňky jsou leukocyty s kulovitým jádrem. Lymfocyt je kulatá buňka, 7-12 µm velká. Rozlišujeme dvě hlavní skupiny lymfocytů B a T lymfocyty. Není to dělení podle morfologie, neboť ve světelném mikroskopu je nelze rozlišit, ale podle exprese určitých povrchových molekul, které hrají přesné role v imunitní reakci, a podle místa jejich vývoje (B bone = kostní dřeň, T thymus). Cirkulující lymfocyty, tedy lymfocyty přítomné v krevním oběhu, jsou většinou zralé dlouhožijící lymfocyty. Zhruba 30 % lymfocytů v krvi nerecirkuluje, jde o krátkodobě žijící nezralé lymfocyty, které buď prožijí svůj život intravaskulárně, nebo jsou aktivovány a intravaskulární prostor opouštějí (Havrdová a kol., 2001). NK (natural killers) buňky jsou lymfoidní buňky, nadané cytotoxicitou vůči různým jaderným buňkám, jako jsou buňky nádorové a virem napadené. Kromě toho se mohou účastnit ADCC (antibody dependent cell cytotoxicity) zakotvením protilátek na svém povrchu pomocí Fc gama receptoru. Jsou tak schopny zničit jakoukoli protilátkami obalenou jadernou buňku, a to bez předchozího kontaktu s antigenem. Monocyty jsou mononukleární fagocytující buňky v krvi. Po relativně krátkém pobytu v krevním řečišti migrují do tkání a transformují se v makrofágy. Jsou méně zralé než makrofágy a na svém povrchu mají Fc receptor pro IgG a receptor pro komplement CR3. Hrají podstatnou roli při zpracování antigenu. Jak již bylo uvedeno, makrofágy se v tkáních diferencují z monocytů. Tkáňově vázané makrofágy jsou např. mikroglie v CNS (centrální nervový systém), Kupfferovy buňky v játrech, Langerhansovy buňky v kůži. Tyto buňky mají obrovskou, i když nespecifickou roli v imunitní obraně. Jsou to intenzivně fagocytující buňky a pohlcené antigeny předkládají T lymfocytům v kontextu molekul MHC. Při imunitních reakcích interagují s T i B lymfocyty. Dendritické buňky (DC) jsou mononukleární fagocytující buňky kůže. DC a makrofágy jsou skutečné profesionální antigen prezentující buňky (APC). Jsou schopny zpracovat a prezentovat antigen 10

9 a produkovat stimulační cytokiny, ale také jsou schopny poskytovat kostimulační signály nutné pro aktivaci buněk rozpoznávající specifický antigen (Havrdová a kol., 2001) Molekuly imunitního systému Základními molekulami jsou antigenně specifické receptory na povrchu T a B lymfocytů (TCR, BCR), MHC glykoproteiny I. a II. třídy, Fc receptory vážící Fc části imunoglobulinových molekul, imunoglobuliny, cytokiny a složky komplementového systému. Tyto molekuly jsou součástí buněčné membrány nebo jsou různými typy buněk secernovány. Antigenně specifické receptory T a B lymfocytů Antigenně specifickými receptory B lymfocytů jsou povrchové imunoglobuliny, u T lymfocytů jsou to TCR receptory. Struktura a funkce těchto receptorů je dosti podobná. Zatímco BCR však rozeznává antigen jako takový (v nativní formě), TCR rozeznávají většinou pouze komplexy MHC glykoproteinů s peptidovými fragmenty antigenů. Komplex BCR se skládá z vlastního povrchového imunoglobulinu (rozeznává antigen) a asociovaných signalizačních molekul. Povrchový imunoglobulin je tvořen dvěma těžkými (H) a dvěma lehkými (L) řetězci. Těžké řetězce jsou transmembránové proteiny, v membráně jsou zakotveny úsekem dvaceti hydrofobních aminokyselin. S tímto základním modulem komplexu BCR jsou asociovány dva transmembránové proteiny zvané Igα a Igβ, které mohou být nekovalentně spojeny s cytoplazmatickými protein tyrosin-kinázami (PTK) skupiny Src (Obr. 1). PTK jsou enzymy, které fosforylují proteiny na některých tyrosinových zbytcích. Po navázání antigenu na dvě nebo více molekul BCR se k sobě přiblíží asociované protein-kinázy a začnou se fosforylovat. Takto aktivované kinázy pak fosforylují další cytoplazmatické proteiny, což vede ke spuštění složitých signalizačních kaskád. Tyto signály spuštěné vazbou antigenu na BCR mohou být výrazně zesíleny spoluprací BCR s dalším povrchovým receptorem B lymfocytů, komplementovým receptorem CR2. Komplex TCR se skládá z modulu rozeznávajícího antigen a z asociovaného komplexu několika proteinů (CD3 komplex), který je podstatný pro přenos signálu. Část komplexu vázající antigen je strukturně podobná imunoglobulinům. Sestává ze dvou transmembránových řetězců zvaných α a β (u menší části T lymfocytů z řetězců γ a δ), jejichž N-terminální části 11

10 jsou variabilní a tvoří vazebné místo pro antigen (Obr. 2). Při rozpoznávání antigenu, respektive komplexu peptid - MHC glykoprotein, spolupracují s TCR tzv. koreceptory CD4 a CD8. CD4 váže komplexy obsahující MHC gp II. třídy a CD8 komplexy MHC gp I. třídy. Transmembránové řetězce komplexu CD3 jsou asociovány s protein tyrosin-kinázami skupiny Src. Signalizace přes TCR je založena na podobných principech jako v případě BCR. K tomu, aby T lymfocyt dostal plný aktivační signál vedoucí k buněčnému dělení a konečné diferenciaci, je zpravidla potřeba spolupůsobení dalšího tzv. receptoru kostimulačního signálu zvaného CD28, ten rozeznává na povrchu APC kostimulační molekuly CD80 a CD86, a dále ještě kontakt T lymfocytu s APC přes adhezívní molekuly (Hořejší & Bartůňková, 2002). Obr. 1: Struktura komplexu BCR. Obr. 2: Komplex TCR. (Hořejší, V., Bartůňková, J.: Základy imunologie, 2. vydání, Triton, 2002) MHC glykoproteiny MHC (major histocompatibility komplex) glykoproteiny I. třídy (MHC gp I) jsou přítomny na všech buňkách organismu, MHC glykoproteiny II. třídy (MHC gp II) za fyziologických okolností jen na buňkách prezentujících antigen. Lidské MHC molekuly se označují jako HLA (human leukocyte antigens). Existují tři izotypy lidských klasických MHC gp I (HLA-A, -B, -C). Mezi neklasické MHC gp I patří HLA-E, -F a G. Exprese neklasických MHC gp I je omezená pouze na některé typy buněk. DR, DQ a DP jsou tři izotypy lidských MHC gp II. 12

11 MHC gp I se skládají z transmembránového řetězce α a s ním nekovalentně asociovaného β 2 -mikroglobulinu (β 2 m). V α řetězci lze rozlišit tři domény, dvě N-terminální, α 1 a α 2, vytvářejí vazebné místo pro peptidy. Třetí doména (α 3 ) a β 2 m jsou strukturně podobné imunoglobulinovým doménám. Vazebné místo pro peptidy představuje štěrbinu, jejíž dno je tvořeno β-strukturou a boky jsou ohraničeny dvěma dlouhými α-šroubovicemi. Váže téměř výhradně peptidy o délce 8-10 aminokyselin, protože je na obou koncích uzavřeno. MHC gp II se skládají ze dvou nekovalentně asociovaných transmembránových podjednotek, α a β. N-terminální domény obou řetězců (α 1 a β 1 ) společně vytvářejí vazebné místo pro peptidy o délce aminokyselin, ale i delší (Hořejší & Bartůňková, 2002). To je umožněno tím, že je vazebné místo na obou koncích otevřené. Základní funkcí MHC gp je vázat peptidové fragmenty proteinů produkovaných buňkou, hlavně MHC gp I, resp. pohlcených buňkou, hlavně MHC gp II, a vystavovat je na buněčném povrchu tak, aby byly potenciálně rozeznatelné T lymfocyty. Obr. 3: Schéma biosyntézy komplexů MHC gp I. (Hořejší, V., Bartůňková, J.: Základy imunologie, 2. vydání, Triton, 2002) Většina MHC gp se vyznačuje extrémním polymorfismem. V populaci existují desítky až stovky různých alelických forem jednotlivých izotypů. Tyto alelické formy, lišící se záměnami jedné či několika aminokyselin buď ve vazebném místě pro peptidy, nebo v jeho nejbližším okolí, se dědí kodominantně, což ještě dvojnásobně zvyšuje jejich počet. 13

12 Peptidy prezentované pomocí MHC gp I pocházejí hlavně z proteinů, které jsou degradovány v cytoplazmě proteolytickým komplexem - proteozómem. Proteozómy štěpí hlavně cytoplazmatické proteiny, jež byly označeny k likvidaci připojením polypeptidu ubiquitinu. Štěpení podléhají normální buněčné proteiny i proteiny pocházející z intracelulárních parazitů. Peptidové fragmenty jsou transportovány z cytoplazmy do endoplazmatického retikula prostřednictvím specifických membránových peptidových pump, složených z podjednotek zvaných TAP (Obr. 3). Tento děj je spřažen s hydrolýzou ATP (Hořejší & Bartůňková, 2002). Komplexy peptidů s MHC gp II vznikají jinak než u MHC gp I. Nejprve se tvoří v endoplazmatickém retikulu komplexy α a β řetězců s tzv. invariantním řetězcem - Ii (transmembránový protein). Jeho úlohou je zablokovat vazebné místo. Komplexy αβii procházejí přes Golgiho aparát a sekreční váčky z něj oddělené poté fúzují s endozómy. Endozómy jsou struktury vzniklé endocytózou proteinů zachycených na povrchu APC. Následně dochází ke splynutí s lysozómy, jejichž hydrolázy štěpí pohlcené biopolymery. Vzniklé fragmenty se mohou do vazebného místa MHC vázat ihned po proteolytickém odštěpení Ii (Obr. 4). Dimery αβ jsou ke štěpení velmi odolné. Obr. 4: Schéma biosyntézy komplexů MHC gp II s peptidy pohlcených proteinů. (Hořejší, V., Bartůňková, J.: Základy imunologie, 2. vydání, Triton, 2002) Cytokiny Leukocyty a jiné typy buněk produkují solubilní proteiny nebo glykoproteiny, nazývané cytokiny, které slouží jako chemické nástroje komunikace mezi buňkami. Většinou jsou secernovány z buněk do vnějšího prostředí, méně často jsou exprimovány na membráně buněk. Jsou to proteiny IS, které modifikují biologickou odpověď. Na povrchu cílových buněk se váží 14

13 na své receptory, které převádějí signál intracelulárně a jsou spojeny se systémem druhých poslů. Efekt cytokinů může být autokrinní, tzn. ovlivňují buňky, které je vytvářejí, parakrinní, ovlivňují buňky v jejich okolí, a někdy i endokrinní s vlivem na vzdálené buňky, jako je tomu u hormonů. Cytokiny koordinují interakce buněčné a protilátkové imunity a násobí imunitní reaktivitu. Jejich základním rysem je pleotropní a redundantní efekt. Nemají své výhradní typy cílových buněk. Většina z nich zajišťuje široké spektrum účinků. Různé cytokiny přitom mohou reagovat s toutéž buňkou a mít podobné účinky. Zajišťují zpětnovazebné systémy v imunitní odpovědi (Havrdová a kol., 2001). Cytokiny se dělí do několika skupin, jejichž názvy odrážejí spíše historický vývoj než strukturní a funkční vztahy: Interleukiny: IL-1 až IL-23; heterogenní skupina cytokinů regulujících hlavně rozličné aspekty vývoje a aktivace leukocytů. Chemokiny: IL-8 a řada příbuzných molekul s chemotaktickou aktivitou. Interferony: IFN-α, IFN-β a IFN γ; důležité složky neadaptivních antivirových obranných mechanismů a regulátory imunity. Transformující růstové faktory (transforming growth factors): TGF-α, TGF-β. Faktory stimulující kolonie (colony-stimulating factors; CSF): cytokiny stimulující v kostní dřeni diferenciaci granulocytů, monocytů nebo obou typů myeloidních buněk. Faktory nekrotizující nádory (tumour necrosis factors): TNF zvaný též TNF-α nebo kachektin a lymfotoxin (zvaný též TNF-β). Mohou působit regulačně (podobně jako IFN-γ) a cytotoxicky. Jiné růstové faktory: např. růstový faktor kmenových buněk, erytropoetin, růstový faktor fibroblastů (Hořejší & Bartůňková, 2002). Interleukiny (IL) Interleukin-1 je produkován monocyty/makrofágy, které byly stimulovány lipopolysacharidem (LPS) nebo interakcí s CD4 + T lymfocyty. IL-1α a IL-1β se váží na stejný receptor se stejnou afinitou, IL-1α funguje jako membránově vázaný, IL-1β se nachází volně v cirkulaci. Po vazbě aktivuje adenylátcyklázu zvýšením camp a pak aktivuje proteinkinázu 15

14 A, nebo působí na nukleární faktory, které slouží jako transkripční aktivátory buněčných genů. Receptory jsou na různých typech buněk, jsou hojnější na CD4 + lymfocytech než na CD8 +. Efekty působení závisí na produkovaném množství: IL-1 je mediátorem sepse, sdílí řadu vlastností s TNF. Může indukovat syntézu enzymů, které vytvářejí prostaglandiny (indukce horečky). V malých množstvích je efekt převážně imunoregulační. Při působení spolu s polyklonálními aktivátory usnadňuje proliferaci CD4 + T lymfocytů, růst a proliferaci B buněk. Stimuluje řadu buněk tak, aby fungovaly jako efektorové buňky imunitní nebo zánětlivé odpovědi. Indukuje svou vlastní syntézu a podněcuje syntézu IL-6 mononukleárními fagocyty a vaskulárním endotelem. Velká množství cytokinu, která se dostávají do periferní cirkulace, mají endokrinní efekt: horečka, produkce proteinů akutní fáze játry, indukce kachexie. Přirozený receptorový antagonista (IL-1RA) je tvořen mononukleárními fagocyty, které jsou aktivovány imunitními komplexy navázanými na receptory pro IL-1, hlavně na T lymfocytech a endoteliálních buňkách. Tvorba IL-1 je potlačována kortikosteroidy a prostaglandiny (Havrdová a kol., 2001). Interleukin-6 je produkován jako odpověď na sekreci IL-1 a TNF. Nejpodstatnější efekt má na hepatocyty a B buňky. Hepatocyty stimuluje k produkci proteinů akutní fáze včetně fibrinogenu a pro B buňky je hlavním růstovým faktorem v závěrečných fázích jejich diferenciace. Podporuje tak tvorbu protilátek. S jinými cytokiny stimuluje růst hematopoetických kmenových buněk, s IL-1 pomáhá aktivovat pomocné T lymfocyty. Interleukin-8 má chemotaktický vliv na T lymfocyty a neutrofily. Má antivirové, imunomodulační a antiproliferativní vlastnosti, účastní se zánětu a migrace buněk. Interleukin-10 je tvořen CD4 + a CD8 + T lymfocyty, monocyty, makrofágy a aktivovanými B buňkami jako inhibitor syntézy cytokinů. Inhibuje syntézu cytokinů T H 1 buňkami, blokuje prezentaci antigenu a tvorbu IFN-γ, IL-1, IL-6 a TNF-α. Interleukin-13 je produkován aktivovanými T buňkami, tlumí produkci zánětlivých cytokinů v monocytech periferní krve. Indukuje tvorbu IL-1RA v neutrofilech, což vede k inhibici aktivit IL-1, centrálního mediátoru zánětu (Havrdová a kol., 2001). Chemokiny Chemokiny patří mezi malé chemotaktické cytokiny, které řídí pohyb leukocytů ve směru chemotaktického gradientu. Je pro ně typický tzv. cysteinový motiv, tvořený jedním, resp. 16

15 dvěma páry aminokyselin cysteinů, vzájemně vázaných disulfidickou vazbou. Podle počtu cysteinů (C) a jejich uspořádání chemokiny dělíme do čtyř podskupin C, CC, CXC a CX 3 C, kde X značí jinou aminokyselinu vřazenou mezi cysteiny. Aktivované mononukleární fagocyty syntetizují CXC chemokiny, které působí hlavně na polymorfonukleární neurofily jako mediátory akutního zánětu. Aktivované T lymfocyty syntetizují CC chemokiny, které mají vliv hlavně na subpopualci mononukleárních zánětlivých buněk. K C chemokinům patří lymfotaktin, pravděpodobný lymfocytární atraktant. Fraktalkin (neurotaktin), jediný zástupce CX 3 C, je primárně vázán na buněčnou membránu endoteliálních buněk a liší se tak od ostatních rozpustných chemokinů. Podílí se na regulaci zánětlivých signálů (Havrdová a kol., 2001). Transformující růstový faktor beta (TGF-β) Existuje 5 druhů tohoto faktoru. Schopnost regulovat růst závisí na typu buněk a na tom, zda jsou přítomny další růstové faktory. TGF-β snižuje proliferaci thymocytů navozenou cytokiny a snižuje také aktivaci a proliferaci zralých T lymfocytů, která byla navozena IL-2. Má tedy potenciální hodnotu jako imunosupresivum. Může působit i protizánětlivě, díky inhibici růstu T i B buněk. Mohl by hrát roli i v léčbě některých autoimunitních onemocnění. Interferony (IFN) Jde o skupinu imunoregulačních proteinů, syntetizovaných převážně T lymfocyty, fibroblasty a dalšími typy buněk v odpověď na stimulaci viry, antigeny, mitogeny, dvouřetězcovou DNA a lektiny. Třída I (interferon-α a -β) má především antivirové vlastnosti, IFN-γ (třída II) je považován hlavně za imunomodulační a je tvořen především T lymfocyty stimulovanými antigenem nebo mitogeny. V podstatě každý virus je objektem jejich inhibičního působení. Interferony aktivují řadu genů, včetně dvou, které mají přímou antivirovou aktivitu. Jednak během několika hodin po napadení virem dojde k indukci syntézy 2 5 -oligoadenylát syntetázy, tak vzniká adenin trinukleotid a jsou aktivovány endonukleázy degradující virovou mrna, jednak je indukována proteinkináza, která blokuje translaci proteinů (Havrdová a kol., 2001). Tento stav přetrvává 1 až 2 dny. Interferony však samy o sobě viricidní nejsou. IFN-γ ještě k přímé inhibici virové replikace posiluje efektivitu adaptivní imunitní odpovědi stimulací zvýšené exprese MHC gp I i II a aktivací makrofágů a NK buněk. 17

16 Interferon alfa je syntetizován zejména makrofágy a B lymfocyty. Brání replikaci virů, je antiproliferativní a pyrogenní. Rekombinantní technologií vyrobený IFN-α je užíván v léčbě například chronické myeloidní leukémie a probíhají studie s jeho použitím u RS. Interferon beta je převážně produkován fibroblasty. Kromě toho, že brání replikaci virů, má imunomodulační vlastnosti, které jsou v současné době využívány především v léčbě RS. Interferon gama je glykoprotein syntetizovaný aktivovanými T lymfocyty a NK buňkami. Má antiproliferativní a antivirové působení, je to výrazný aktivátor mononukleárních fagocytů. Aktivuje NK buňky, neutrofily a endotel. Podporuje diferenciaci B a T lymfocytů (Havrdová a kol., 2001). Cytokiny hrají důležitou roli v homeostáze normálních tkání a buněk, ale také v indukci a udržování patologických procesů. Farmaceutický průmysl se proto v poslední době zaměřuje na blokování aktivit různých cytokinů. Je však třeba opatrnosti, protože v některých případech může dojít k vyvolání jiného imunopatologického procesu. 2.2 Nespecifické mechanismy imunity Nespecifické mechanismy (neadaptivní, vrozené) jsou evolučně starší a jsou založeny na molekulách a buňkách, které jsou v organismu připraveny předem. Jsou obvykle účinné proti mnoha různým patogenům tím, že reagují na strukturní nebo funkční rysy, patogenům společné. Buněčné nespecifické systémy jsou reprezentovány fagocytujícími buňkami a přirozeně cytotoxickými buňkami (buňky NK). Humorální složky nespecifické imunity tvoří komplementový systém, interferony, lektiny a jiné sérové proteiny. Nespecifické složky imunity reagují rychle, řádově v minutách. Narozdíl od specifických složek nemají tzv. imunologickou paměť, tzn. nejsou ovlivněny předchozím setkáním se škodlivinou Humorální mechanismy Pro obranu organismu má zásadní význam neporušený povrch kůže a sliznic a jejich přirozené neimunitní obranné mechanismy. Lze je rozdělit na mechanické, např. pohyb řasinek, longitudinální tok vzduchu v dýchacích cestách nebo tekutiny v močových cestách, chemické, 18

17 např. mastné kyseliny na kůži, lysozym ve slinách, slzách a potu, pepsin v žaludku a střevě, kyselé ph žaludku a moči, a mikrobiální, normální nepatogenní flóra soutěží s patogenními mikroorganismy jak o živiny, tak o receptorová místa a produkuje také antibakteriální látky (Hořejší & Bartůňková, 2002). Komplement Jako komplement se označuje soubor zhruba 30 sérových a membránových proteinů, které kooperují jak mezi sebou, tak s dalšími imunitními mechanismy. Hlavními složkami komplementu je devět sérových proteinů označovaných C1-C9. Po různých podnětech dochází ke kaskádovité aktivaci jednotlivých složek. Ústřední složkou je C3, jejíž fragment C3b se pevně (kovalentně) váže na povrch mikrobiální buňky. Meziprodukty této kaskádovité reakce mají výrazné biologické funkce, opsonizace a chemotaxe. Terminální produkt komplementové kaskády, komplex proteinů C5b, C6, C7, C8 a C9 označovaný jako MAC (membrane attack komplex), perforuje membrány některých mikroorganismů a způsobuje smrt buňky lýzou. Aktivace komplementu lze dosáhnout třemi cestami: klasickou - aktivace vazbou Ig na subkomponentu C1 C1q, kratší alternativní - aktivace složky C3 bez účasti protilátek, nutná přítomnost magnezia, faktoru B a faktoru D, a lektinovou - aktivace podobná klasické cestě, ale místo protilátky je iniciována sérovým lektinem mannosu vázající lektin, který se váže na sacharidové struktury povrchů některých mikrobů přímo, nezávisle na protilátkách. Efektorové mechanismy komplementového systému lze rozdělit do několika skupin: - opsonizace mikroorganismů pro fagocytózu, tzn. navázání protilátek a komplementových fragmentů, tím je částice označena jako cizorodá, což usnadňuje fagocytózu, - přímá likvidace mikroorganismů lýzou, - chemotaxe leukocytů do míst zánětu a jejich aktivace, - indukce specifické protilátkové odpovědi jednak usnadněním lokalizace antigenů B buňkám a APC buňkám, jednak snížením prahu aktivace B lymfocytů (Havrdová a kol., 2001) Buněčné mechanismy Buněčné komponenty přirozené imunity se zčásti překrývají s buňkami specifické imunity. Přirozené imunity se účastní PMN, makrofágy, dendritické buňky a NK buňky. PMN 19

18 a NK buňky jsou do místa poranění přitahovány látkami uvolňovanými makrofágy a DC buňkami. Ty zase produkují substance nutné k atrahování lymfocytů, hlavních buněčných nástrojů specifické imunity. Spektrum cytokinů a chemokinů, produkovaných během iniciálních fází přirozené imunitní odpovědi, má vliv na způsob následné specifické imunitní odpovědi. Fagocytóza Fagocytóza je evolučně velmi starý děj podobný pohlcování potravních částic amébami. Profesionální fagocyty neutrofilní a eozinofilní granulocyty a monocyty/makrofágy tímto mechanismem zabezpečují obranyschopnost lidského organismu. Odstraňují se tak odpadní produkty organismu vlastní i cizorodá tělesa. Proces začíná přilnutím částice k cytoplazmatické membráně, pak následuje invaginace, která se neustále prohlubuje, až dojde k úplnému uzavření. Adheze je zprostředkována receptory pro Fc nebo pro komplement a působí zřejmě jako spouštěcí mechanismus, který uvádí v chod biochemické děje provázející fagocytózu a usmrcení bakterie. Současně dochází k výrazné stimulaci buněčného metabolismu, projevující se vzrůstem oxidačních pochodů a zvýšenou sekrecí lysozomových enzymů. Pochod končí rozpadem částic ve fagolysozomu (Bier a kol., 1984). Zánět Základní obrannou reakcí živé tkáně na poranění je zánět. Hlavními symptomy zánětu jsou rubor (zčervenání), calor (zvýšení místní teploty), tumor (otok) a dolor (bolestivost). V některých případech může být reakcí přehnanou a sebepoškozující. Zánět je výsledkem mnoha interakcí a jeho prvním úkolem je lokalizovat proces a odstranit škodlivinu. Poté následuje fáze obnovy tkáně. Klíčové cytokiny regulace zánětlivé odpovědi jsou uvedeny v Tab. 1. Důsledkem zánětlivého procesu je: - zvýšení permeability cév, - hemokoagulace - zabrání úniku krve při poranění, - aktivace fibrinolytického systému - zabrání šíření srážení krve mimo místo poranění, - aktivace kininového systému - zvyšuje permeabilitu kapilár, 20

19 - vychytávání fagocytů a lymfocytů z krevního řečiště, - aktivace komplementového systému a fagocytů, - ovlivnění místních nervových zakončení (bolest), - zvýšení syntézy metabolitů kyseliny arachidonové (leukotrieny, prostaglandiny), - změny regulace teploty vyvolané stimulací hypothalamového centra prozánětlivými cytokiny; indukce exprese Hsp (heat shock proteins), které fungují jako tzv. chaperony váží se na nově syntetizované polypeptidové řetězce a na intracelulární denaturované proteiny a napomáhají jejich poskládání do nativních konformací, - stimulace produkce proteinů akutní fáze v játrech např. C-reaktivní protein, sérový amyloid P, složky komplementu C3, C4 (Hořejší & Bartůňková, 2002). Cytokin Produkován Hlavní funkce buňkami IL-1 Makrofágy, dendritické buňky IL-6 Makrofágy, dendritické buňky, T lymfocyty a mnoho dalších typů TNF-α Makrofágy, dendritické buňky a mnoho dalších typů IL-8 Makrofágy, dendritické buňky, fibroblasty, keratinocyty, endoteliální buňky IL-10 Th2 a makrofágy, Inhibice Th1 lymfocytů a makrofágů dendritické buňky TGF-β Makrofágy a jiné typy buněk Indukují zánětlivou reakci, endogenní pyrogeny zvyšují teplotu, indukují tvorbu proteinů akutní fáze v hepatocytech, proliferaci a uvolňování neutrofilů do krevního řečiště, aktivace endoteliálních buněk, zvýšení permeability cév a migrace fagocytů do místa zánětu Aktivace a chemotaxe fagocytů, stimulace angiogeneze Hojivé procesy stimulace proliferace fibroblastů a ukládání mezibuněčné hmoty Celkový účinek Indukce zánětlivé odpovědi Tlumí zánětlivou odpověď Tab. 1: Klíčové cytokiny regulace zánětlivé odpovědi. 2.3 Specifické mechanismy imunity Tyto evolučně mladší adaptivní, antigenně specifické mechanismy reagují na každou cizorodou strukturu prostřednictvím vysoce specifických molekul (protilátky, antigenně 21

20 specifické receptory T lymfocytů) a aktivují se až po setkání s daným antigenem. Patří mezi ně mechanismy humorální, založené na protilátkách, a buněčně zprostředkované, založené na T a B lymfocytech. K úplnému rozvoji specifické imunitní reakce je zapotřebí několika dní až týdnů. Charakteristickým rysem těchto reakcí je imunologická paměť. Neadaptivní i adaptivní mechanismy IS jsou životně důležité a vzájemně spolu kooperují. Specifická imunitní odpověď má dvě hlavní fáze: rozpoznání antigenu a reakce zaměřená na jeho zneškodnění Antigen a prezentace antigenu Antigenem (Ag) rozumíme jakoukoli strukturu, převážně bílkovinné povahy, která má schopnost vyvolat imunitní odpověď. Ag může být z vnějšího prostředí i z vlastních struktur organismu. Malá část molekuly Ag, rozeznávaná imunitními receptory, se nazývá epitop. T buňky nejsou schopny reagovat s intaktními proteiny, antigen je jim prezentován pouze v kontextu MHC molekul na APC buňkách. Pro vazbu na molekuly MHC II. třídy musí exogenní protein projít endocytózou a proteolýzou. Pevná vazba na MHC je velmi důležitá. Peptidy, které se vážou nedostatečně nebo vůbec, nejsou prezentovány a nejsou schopny vyvolat imunitní odpověď. Pro molekuly MHC I. třídy je protein degradován proteozomem. TCR specificky rozpoznává nejen nabízený Ag, ale i nepolymorfní část vlastní MHC molekuly. Vazba je dále stabilizována navázáním CD4 molekuly na MHC gp II nebo vazbou CD8 molekuly na MHC gp I. K úspěšnému rozpoznání a spuštění imunitní odpovědi je ještě potřeba adheze APC a T lymfocytu pomocí adhezívních molekul a tzv. kostimulační signál. V kostimulaci se uplatňují nejčastěji molekuly CD28 a CTLA-4 na T buňce a jejich ligandy, molekuly CD80 (B7-1) nebo CD86 (B7-2) na APC (Havrdová a kol., 2001) B lymfocyty B lymfocyty se vyvíjejí z fetální jaterní tkáně v časných embryonálních stadiích a později z kostní dřeně. Plazmatické buňky, jediné buňky v těle schopné sekrece protilátek, se vyvíjejí 22

21 z prekurzorových B buněk. Pre-B buňky obsahují imunoglobuliny v plazmě, zralé B lymfocyty exprimují povrchové imunoglobuliny a komplementové receptory. Při svém vývoji prochází B lymfocyt několika kritickými momenty, v nichž se rozhoduje, zda bude ve vývoji pokračovat nebo zahyne. Po přeskupování genů pro H a L řetězce imunoglobulinů následuje testování nezralých B lymfocytů, zda nejsou autoreaktivní. Eliminace autoreaktivních klonů B lymfocytů Děje vedoucí ke vzniku bohatého repertoáru klonů B lymfocytů vybavených individuálně specifickými BCR jsou založeny na náhodných procesech, jimiž mohou ovšem vzniknout i klony nesoucí autoreaktivní receptory a produkující autoreaktivní protilátky. Většina z nich je eliminována na úrovni nezralých B lymfocytů. Setká-li se buňka v tomto stádiu s antigenem, který se s dostatečně velkou afinitou váže na její BCR, dostane silný negativní signál, který vede k rychlé apoptické smrti. Velká většina struktur, s nimiž se nezralý B lymfocyt v kostní dřeni může setkat, jsou ovšem autoantigeny. Pokud tímto sítem některé autoreaktivní B buňky přesto projdou a dozrají, většinou se jejich škodlivá autoreaktivita neprojeví proto, že po rozeznání autoantigenu kdekoli v organismu chybí k jejich plné aktivaci příslušné pomocné T lymfocyty, u nichž je proces eliminace autoreaktivních klonů v thymu mnohem přísnější (Hořejší & Bartůňková, 2002) Protilátky Protilátky jsou glykoproteiny produkované B lymfoidními buňkami v odpověď na stimulaci imunogenem. Jsou schopny reagovat jak in vitro tak in vivo specificky a selektivně s epitopy, které vyvolaly jejich tvorbu. Molekula imunoglobulinu (Ig) sestává z těžkých a lehkých řetězců, které jsou spojeny disulfidickými můstky. Molekuly jsou rozděleny do tříd a podtříd podle antigenní specifičnosti těžkých řetězců. Ty se označují řeckými písmeny (µ, γ, α, δ, ε) a imunoglobuliny se podle nich jmenují IgM, IgG, IgA, IgD a IgE. Dva typy lehkých řetězců, κ a λ, jsou přítomny ve všech pěti třídách, v jedné molekule však je vždy jen jeden typ. IgG, IgD a IgE mají vždy dva těžké a dva lehké řetězce, zatímco IgM a IgA jsou polymery těchto základních molekul (pentamer a dimer). Monomer Ig má prostorové uspořádání ve tvaru písmene Y. 23

22 Jak L, tak H řetězec mají konstantní oblast na karboxy- konci a variabilní oblast na amino- konci. Dva těžké řetězce jsou v jedné molekule vždy stejné, tak jako lehké řetězce. Imunoglobulinové třídy IgA a IgG se dále dělí na podtřídy podle rozdílů v H řetězcích. Idiotyp je segment imunoglobulinu, který určuje jeho specificitu pro antigen a je dán mnohočetnými kombinacemi V, D a J exonů. IgG, jediný imunoglobulin schopný prostupovat placentou, je hlavní lidský imunoglobulin. Je hlavní protilátkou anamnestické odpovědi. Sekreční IgA se nachází v tělních sekretech, jako je slina, střevní a bronchiální sekrety, slzy. Může se objevovat jako dimer, trimer i multimer. V sekretech zajišťuje lokální imunitu. IgD a monomerní IgM se vyskytují jako membránově vázané imunoglobuliny na B buňkách, kde váží Ag a aktivují B buňky. Monomery IgM jsou v pentametru kromě disulfidových můstků spojeny J řetězcem. Teoreticky má pentamer deset vazebných míst. Je částečně účinný v imunitní odpovědi vůči polysacharidovým antigenům na povrchu patogenních mikroorganismů. Nachází se především intravaskulárně (Havrdová a kol., 2001). IgE je mediátorem anafylaxe a v séru se vyskytuje ze všech imunoglobulinů nejméně. Protilátky mají různou aviditu a afinitu. Avidita je síla vazby mezi protilátkou a specifickým antigenem (vazebná kapacita) a odvozuje se od počtu vazebných míst. Afinita je síla vazby jednoho antigenního epitopu s odpovídajícím protějškem (paratopem) Ig molekuly T lymfocyty Vývoj T lymfocytů Prekurzory T lymfocytů přicházejí z kostní dřeně do thymu jako tzv. pro-thymocyty. Začnou nejprve přeskupovat geny pro TCRβ resp. TCRδ. Proběhne-li úspěšně přeskupení TCRβ, objeví se na povrchu časných thymocytů nejprve pre-tcr složený z β řetězce, tzv. pre- TCRβ, a z CD3 komplexu. Poté následuje přeskupování genů pro TCRα a vznik definitivního TCR složeného z řetězců α a β a CD3. Thymocyty v tomto stadiu vývoje tvoří většinu buněk v thymu (kortikální thymocyty). Na jejich povrchu se kromě mnoha jiných molekul nacházejí i koreceptory CD8 a CD4. V této fázi dochází nejprve k pozitivní selekci. Při ní zahynou thymocyty, které nerozeznávají, resp. váží s podprahovou afinitou, vlastní MHC proteiny. Potom hynou tzv. negativní selekcí potenciálně autoreaktivní thymocyty, to znamená 24

23 thymocyty rozeznávající s vysokou afinitou komplexy MHC molekul s vlastními peptidy. Signál, který takový thymocyt dostane, vede totiž k rychlé apoptotické smrti. Thymocyty si pak zachovávají expresi buď CD8 nebo CD4. Tyto zralé T buňky (medulární thymocyty) opouštějí thymus a usídlují se v sekundárních lymfoidních orgánech. Zásadní rozdíl oproti B lymfocytům spočívá v tom, že TCR jsou přísně testovány na to, zda umějí rozeznávat komplexy MHC proteinů s peptidy. Zhruba 98 % pro-thymocytů v thymu během vývoje hyne (Hořejší & Bartůňková, 2002). Výběr je tedy velmi přísný. Ačkoli většina autoreaktivních T buněk je eliminována v thymu, některé mohou rozeznávat antigeny, které nejsou v thymu dostupné, ale jsou hojné v jiných tkáních. Takové T buňky jsou většinou inaktivovány tím, že se s antigenem setkají na povrchu buněk, které nejsou schopny poskytnout druhý, kostimulační signál. Samotný první signál zprostředkovaný TCR má totiž negativní účinek a uvede buňku do stavu útlumu anergie. K potlačování autoreaktivních buněk přispívají zřejmě také T S lymfocyty a další regulační mechanismy. Klasifikace T lymfocytů T lymfocyty exprimující TCR typu αβ se dají rozdělit na ty, které nesou molekuly CD8 a ty, které mají na povrchu CD4. Většina CD8 + T buněk jsou prekurzory cytotoxických T buněk (T C ) nebo paměťové buňky tohoto funkčního typu. Měly by sem patřit i stále kontroverzní supresorové buňky (T S ). CD8 + T buňky mají i důležité regulační funkce, protože produkují široké spektrum cytokinů. Většina CD4 + T buněk jsou prekurzory pomocných T buněk (T H ). Podle hlavních cytokinů, které produkují, je lze rozdělit na T H 1, produkující zejména IL-2 a IFN-γ, a T H 2, produkující hlavně IL-4, IL-5, IL-6 a IL-10. Tzv. T H 0 klony produkují směs cytokinů typu 1 a 2. Jako T H 3 se někdy označují lymfocyty, pro které je charakteristická intenzivní produkce TGF-β (Hořejší & Bartůňková, 2002). Dosud nejasný je vztah tzv. T r 1 buněk k ostatním subpopulacím CD4 + T buněk. Svými vlastnostmi (produkce cytokinů) jsou blízké T H 3 buňkám, potlačují aktivitu T H 1 buněk a v některých ohledech fungují jako výše zmíněné supresorové buňky. 25

24 Imunitní reakce typu T H 1 zánětlivá reakce Základní funkcí T H 1 buněk je spolupráce s makrofágy a jejich stimulace k přeměně v aktivované makrofágy. Naopak pro vznik a pomnožení zralých T H 1 buněk je nezbytný styk s aktivovanými makrofágy. Na povrchu makrofágu mohou být rozeznány fragmenty proteinů, asociované s MHC gp II, receptorem prekurzorů T H (CD4 + ). Adhezívní molekuly a ligandy kostimulačních receptorů na povrchu makrofágů umožňují dostatečně pevný kontakt obou buněk. Makrofágy produkují také IL-12, který je výrazným diferenciačním faktorem pro T H 1. Soubor signálů (přes TCR, CD28, receptor pro IL-12 a přes další povrchové adhezívní a signalizační molekuly) vede k pomnožení klonu s příslušnou specifičností a ke konečné diferenciaci na efektorové T H 1 buňky. Ty kontaktují prostřednictvím adhezívních molekul a TCR infikované makrofágy a sekretují na ně cytokin IFN-γ, který je stimuluje k přeměně v aktivovanou formu. Další hlavní cytokin T H 1 buněk, IL-2, je využíván samotnými těmito buňkami jako autokrinní růstový faktor nezbytný k jejich dělení a proliferaci. Aktivované makrofágy sekretují také řadu látek, které přispívají k další stimulaci T buněk a obecně stimulují lokální zánět. T H 1 buňky se proto někdy také nazývají zánětlivé T buňky (Hořejší & Bartůňková, 2002). Imunitní reakce typu T H 2 pomoc B lymfocytům Základní funkcí T H 2 buněk je spolupráce s B lymfocyty, které byly předem stimulovány antigenem. Pomoc B buňkám je založena na sekreci cytokinů (hlavně IL-4, IL-5, IL-6) a přímém mezibuněčném kontaktu zprostředkovaném několika páry adhezívních a signalizačních povrchových molekul. Ke vzniku zralé efektorové buňky T H 2 je potřeba, aby se prekurzorová buňka T H setkala s Ag na povrchu profesionální APC a za přítomnosti IL-4. Spolupůsobením signálů předaných do T buňky dojde k proliferaci a diferenciaci na klon zralých efektorových T H 2. Ty dodávají B buňkám potřebné pomocné signály prostřednictvím sekretovaných i membránově vázaných cytokinů (Hořejší & Bartůňková, 2002). Vzájemná regulace aktivit T H 1 a T H 2 Zda se budou prekurzorové CD4 + T H buňky vyvíjet směrem k T H 2 nebo k T H 1, rozhoduje poměr koncentrací dvou cytokinů IL-12 a IL-4. Začne-li celý proces u makrofágů, budou tyto produkovat IL-12, který bude stimulovat vznik T H 1. Budou-li první fáze aktivace 26

25 prekurzorů T H probíhat v přítomnosti IL-4 uvolněného ze stimulovaných bazofilů a mastocytů, budou vznikat hlavně T H 2. Podstatné je, že cytokiny produkované T H 1 buňkami (hlavně IFN-γ) dále podporují vývoj T H 1 a silně inhibují vývoj T H 2. Naopak IL-4 a IL-10, produkty T H 2, podporují vznik T H 2 a inhibují vývoj T H 1 (Hořejší & Bartůňková, 2002). 3. AUTOIMUNITNÍ IMUNOPATOLOGICKÉ STAVY 3.1 Mechanismy tolerance Za fyziologických okolností je tolerance udržována na úrovni centrální a periferní. Centrální tolerance se ustanovuje v thymu pro T lymfocyty (pozitivní a negativní selekce) a v kostní dřeni pro B lymfocyty (negativní selekce neboli klonální delece). V thymu jsou prezentovány tkáňově specifické autoantigeny, exprimované ve všech typech buněk. Mechanismy centrální tolerance se však eliminují pouze autoreaktivní T lymfocyty s vysokou afinitou k vlastním antigenním fragmentům. Nízce afinitní autoreaktivní klony T lymfocytů se běžně vyskytují v oběhu a jejich aktivita je tlumena mechanismy periferní tolerance. Operují buď přímo v tkáni, nebo v regionálních uzlinách. Při autoimunitním onemocnění se předpokládá zejména selhání mechanismů periferní tolerance. Tyto mechanismy jsou udržovány klonální delecí (eliminace autoreaktivních klonů), klonální anergií (interakce bez druhého signálu), klonální ignorancí (neschopnost lymfocytů rozpoznat autoantigen) a supresí (T r buňkami) (Hořejší & Bartůňková, 2002). 3.2 Vznik autoimunitních imunopatologických stavů Narušení principu tolerance vlastního s následným imunopatologickým zánětem, ve kterém dominují poškozující složky, je základem autoimunitní imunopatologické reaktivity. Potenciálně autodestruktivní charakter imunitních mechanismů rozpoznal již na počátku minulého století Paul Ehrlich, který své úvahy shrnul do termínu horror autotoxicus. Za průlomový objev lze považovat odhalení biologického významu HLA systému počátkem 27

26 sedmdesátých let. V současné době nahlížíme na autoimunitní imunopatologickou reaktivitu (AIR) jako na multifaktoriální, vícestupňový a dlouhodobý proces (Krejsek & Kopecký, 2004). Na indukci AIR se podílí řada faktorů. Vedle genetické dispozice jedince, určené především polymorfismem některých genetických systémů, hrají důležitou roli infekce, pohlavní dimorfismus, podněty vnějšího prostředí a nejnověji také podněty, které vznikají v průběhu buněčné apoptózy Vliv genetických faktorů Pro účast genetických faktorů svědčí poměrně vysoká konkordance výskytu chorob u jednovaječných dvojčat, která se pohybuje u různý autoimunitních onemocnění mezi % (Hořejší & Bartůňková, 2002). Je nepochybné, že nebude nalezen jediný gen, který by podmiňoval vznik konkrétní AIR. Půjde vždy o komplexní úlohu genetické dispozice, která zahrnuje mnoho genů. Význam mají jednotlivé alely, které v polymorfních genových systémech alterují na určitém genovém lokusu u jednotlivých lidí. Pro polymorfní geny však penetrace nemoci v přítomnosti alely, která podmiňuje rozvoj choroby, není 100%. Naopak je poměrně nízká (Krejsek & Kopecký, 2004). Polymorfními genetickými systémy jsou kódovány např. molekuly MHC, cytokiny, receptory pro cytokiny i chemokiny, ale i některé nitrobuněčné signální molekuly. Z chemického pohledu záleží na struktuře konkrétní aminokyseliny, tj. jejím tvaru, náboji a schopnostech vytvořit slabou vazebnou interakci s odpovídajícím aminokyselinovým zbytkem například antigenního fragmentu. Nejsilnější asociace mezi HLA alelou a výskytem autoimunitní choroby je vidět u ankylozující spondyloartritidy (Bechtěrevova choroba). Jedinci s alelou HLA-B27 mají 90krát větší pravděpodobnost rozvoje ankylozující spondyloartritidy než jedinci s jinou alelou HLA-B (Goldsby a kol., 2000). U ostatních autoimunitních nemocí je však relativní riziko pro asociaci jednotlivých alel HLA II. třídy s rozvojem autoimunitních imunopatologických nemocí méně než 10 %. Pro potřeby diferenciální diagnostiky je tedy hledání asociací s expresí určitých HLA molekul bezcenné, s výjimkou Bechtěrevovy choroby ((Krejsek & Kopecký, 2004). Také nedostatek nebo nadbytek určitého cytokinu může vyvolat AIR, a to zřejmě porušením regulace T H 1 vs. T H 2. Mutace v genech kódujících molekuly zúčastněné v procesu 28

27 apoptózy mohou zase zapříčinit poruchy procesu apoptózy aktivovaných lymfocytů. Nedochází tak k adekvátní regulaci a ukončení imunitní reakce Vliv pohlavního dimorfismu Z dlouholetých klinických zkušeností je známo, že většinou z více než 70ti známých autoimunitních imunopatologických nemocí ve zvýšené míře trpí ženy. Příčiny budou nepochybně multifaktoriální, v převážné míře se však uplatňuje vliv pohlavních hormonů. Pohlavní hormony, zvláště estrogen, progesteron a testosteron, přímo působí na IS. Zasahují do prezentace antigenů, aktivace lymfocytů, exprese genů kódujících cytokiny a do procesů cílené migrace buněk IS. Na buňkách IS jsou přítomny receptory pro estrogenní i androgenní hormony. Pohlavní hormony působí na IS i nepřímo modulací osy hypothalamushypofýza-nadledvinky. Nejvíce poznatků bylo shromážděno studiem experimentálního myšího modelu, případně in vitro studií. Estrogeny mají imunostimulační působení in vivo na rozdíl od převážně imunosupresivního účinku progesteronu či androgenů. Imunosupresivní účinek androgenů je synergistický se zvýšenou produkcí TGF-β (Klener a kol., 1997). V in vitro experimentech přítomnost estrogenu zvyšuje tvorbu IFN-γ, IL-1 a také IL-10. Přítomnost androgenů tlumí tvorbu IFN-γ, IL-4 a IL-5 (Krejsek & Kopecký, 2004). Možným mechanismem účinku estrogenu na buňky IS je ovlivnění funkce kalcineurinu. Kalcineurin je fosfatáza, jejíž účinky závisí na kalciu a kalmodulinu, a skládá se ze dvou podjednotek, katalytické podjednotky A, která obsahuje doménu vázající kalmodulin a regulační podjednotky B, která váže kalcium. Kalcineurin je klíčový enzym v signální kaskádě vedoucí k aktivaci T lymfocytů. Zahrnuje transkripci několika významných genů pro cytokiny, např. IL-2, IFN-γ a TNF-α. Jejich přepis je zesílen cestou transkripčního faktoru NFAT, který vytváří komplexy s bílkovinami Fos a Jun v jádrech aktivovaných T lymfocytů (Obr. 5). Podmínkou přechodu nukleárních faktorů NFAT z cytoplazmy do jádra vyžaduje odštěpení fosfátů působením kalcineurinu (Krejsek & Kopecký, 2004). 29

28 Obr. 5: Schéma aktivace transkripčního faktoru NFAT. Zvýšená hladina Ca 2+ aktivuje kalmodulin (CaM) dependentní enzym (kalcieneurin). Ten defosforyluje fosfoseriny na NFAT, což způsobí translokaci a aktivaci transkripčního faktoru NFAT. ( Vliv infekčních procesů na vznik AIR Z faktorů vnějšího prostředí je infekcím přisuzován největší podíl na indukci AIR, i když zatím není známa žádná přímá asociace infekčních agens s konkrétní autoimunitní chorobou. Infekce se na indukci autoimunity může podílet různými mechanismy, které se mohou kombinovat: - Infekce odkryje pro IS jinak dosud nedostupný autoantigen (kryptické antigeny). - Pod vlivem zánětlivých cytokinů dochází k expresi MHC molekul II. třídy, což napomáhá prezentaci peptidů, které jsou jinak imunitnímu systému nepřístupné. - Pod vlivem zánětlivých cytokinů může dojít k expresi kostimulačních molekul a k následné stimulaci anergických autoreaktivních lymfocytů. - Infekční agens může vyvolat tvorbu autoprotilátek mechanismem zvaným molekulární mimikry - podobnost některých mikrobiálních antigenů s určitými molekulami organismu vlastními. - Některé mikrobiální superantigeny mohou vyvolat polyklonální aktivaci velkého počtu T lymfocytů, včetně autoreaktivních (Hořejší & Bartůňková, 2002). 30

29 Jak bylo uvedeno, molekulovými mimikry rozumíme strukturní podobnost mikrobiálních antigenů a molekul těla. Díky této shodě či podobnosti se může imunitní reaktivita, namířená proti mikroorganismu, nasměrovat vůči vlastním strukturám a v důsledku je poškodit. Obecně lze rozlišit podobnost sekvenční, tj. shodu v aminokyselinovém složení nebo podobnost strukturní, kdy shoda je na úrovni prostorového uspořádání molekuly. Nepochybně značnou strukturní shodu lze očekávat u skupiny bílkovin, které jsou označovány jako stresové proteiny hsp. Produkcí stresových proteinů reagují buňky jak mikrobiální, tak lidského těla na nepříznivé životní podmínky. Stresové proteiny jsou evolučně mimořádně konzervované a strukturně se od sebe odlišují zanedbatelně. Mikrobiální stresové proteiny jsou prakticky shodné se stresovými proteiny člověka. To naznačuje možnost, že imunitní odpověď vůči mikrobiálním stresovým proteinům může být příčinou autoimunitní imunopatologické reakce. Protein Reziduum * Sekvence aminokyselin Spalničkový virus P3 31 E I S D N L G Q E MBP 61 E I S F K L G Q E Tab. 2: Molekulární mimikry mezi proteinem infekčního organismu a lidským proteinem (hostitelský organismus). * Číslo indikuje pozici N-terminální aminokyseliny uvedené sekvence v intaktním proteinu (Goldsby a kol., 2000). U myelinového basického protienu (MBP), pokládaného za nejdůležitější autoantigen v patogenezi sclerosis multiplex, jsou prokázány shody v aminokyselinových sekvencích na pozicích tohoto proteinu se sekvencemi hemaglutininu viru chřipky, dřeňovým protinem adenovirů, proteiny virů spalniček (Tab. 2), viru herpes simplex, viru Epsteina a Barrové a viru hepatitidy B. V experimentální autoimunitní encefalomyelitidě, která je modelem roztroušené sklerózy, byla zjištěna shoda mezi úsekem Thr-Gly-Ser-Leu-Pro-Gln proteinu MBP s polymerázou viru hepatitidy B. Je zajímavé, že k indukci onemocnění postačí shoda ve čtyřech aminokyselinách v proteinu MBP (Krejsek & Kopecký, 2004). 31

30 3.2.4 Lymfocyty a AIR Autoreaktivní B lymfocyty jsou součástí fyziologického repertoáru B lymfocyfů člověka. Za normálních okolností nepředstavují pro člověka riziko, protože B lymfocytární odpověď je zcela pod regulační kontrolou T lymfocytárního systému. Autoreaktivní T lymfocyty lze najít u mnoha normálních zdravých jedinců. Jejich množství se nijak výrazně neliší od nálezů u pacientů s autoimunitními chorobami. Proto je dále třeba rozlišit, zda autoreaktivní klony jsou normálně tolerantní a tato tolerance je prolomena, a tak navodí autoimunitu, nebo zda nejsou tolerantní a pouze nepotkaly svůj antigen. Z řad pokusů na zvířatech plynou zatím dva základní principy. Aby mohla vzniknout autoimunitní odpověď, antigen musí být vhodně prezentován. Druhým konceptem je kostimulace, resp. její absence, která rozhoduje o indukci periferní tolerance, což je důležitý způsob kontroly autoimunity (Havrdová a kol., 2001) Stres a indukce AIR Stresové faktory se uplatňují zejména aktivací neuroendokrinní osy a hormonální dysbalancí. Jestliže jsou zátěžové podněty nadměrné nebo dlouhodobé, vedou k intenzivní zátěži, stresu. Zátěžovými podněty (stresory) mohou být jak silná antigenní stimulace, bolest, traumatické poškození tkáně, tak nadměrná fyzická námaha i např. nepříznivé podmínky existence. Závisí na intenzitě poškozujícího podnětu a době, po kterou zátěž trvá, zda výsledkem bude aktivace adaptivních procesů, mobilizace tkáňových struktur, metabolických a funkčních projevů, nebo zda nadměrný a chronický stres povede k vyčerpání energetických zásob, uvolnění stresových mediátorů a funkční depresi. Obecně nadměrné stresové podněty vedou ke snížené reakci IS s následnou vyšší četností infekčních a nádorových onemocnění v důsledku snížené aktivity monocyto-makrofágového systému i snížené proliferační odpovědi T lymfocytů na mitogenní podněty. Hypofýzo-adrenokortikální odpověď na infekci (podání LPS nebo cytokinů) je zprostředkována cytokiny, především IL-1β, který vazbou na centra v CNS aktivuje stresovou osu. Část této reakce je zprostředkována indukcí syntézy corticotropin releasing hormonu (CRH) a jeho uvolněním v hypothalamu. Chronický stres v podobě autoimunitního onemocnění vede ke sníženému výdeji CRH. Jak plasmatická hladina ACTH (adrenokortikotropní hormon), tak hladiny adrenálních kortikosteroidů se zvyšují 32

31 během infekce a během vrcholu imunitní reakce. ACTH zvyšuje hladinu camp v lymfocytech, což má imunosupresivní efekt na T lymfocyty a monocyty (Havrdová a kol., 2001). Tvorba prostaglandinů v místě zánětu ovlivňuje lokální tvorbu cytokinů a jejich uvolnění do krve. Nastartovaná tvorba adrenálních kortikosteroidů pak působí jako negativní zpětná vazba na zánětlivou odpověď a snižuje tak další tvorbu prozánětlivých cytokinů buňkami a suprimuje další proliferaci imunitních buněk. U pacientů s roztroušenou sklerózou (RS) je snížena tato zpětnovazebná odpověď osy hypothalamus-hypofýza-nadledviny na steroidy, přestože klidová hladina kortizolu je vyšší a třikrát vyšší je i množství CRH pozitivních buněk. K inhibici zánětu u RS je tedy třeba daleko vyšších hladin steroidů než u zdravých osob. A tak ačkoli se zdá, že osa hypothalamus-hypofýza-nadledviny je u pacientů s RS hyperaktivní, produkovaný kortizol nestačí k prevenci relapsů nemoci (Havrdová a kol., 2001). Imunosupresivní mediátory se však tvoří i při stresech vyvolaných stresory, které nemají nic společného s aktivací imunity antigenním podnětem. To je podstata účinku psychosociálního stresu na IS. Sociální stres indukuje hypersekreci ACTH a kortizolu. Vysoké hladiny glukokortikoidů vedou k necitlivosti vůči CRH a k poruše zpětné vazby. Nedojde tedy k supresi tvorby CRH. Různé stresory mají odlišné kvalitativní i kvantitativní účinky na určité imunologické parametry. Krátkodobý stres vyvolává zřejmě zvýšení imunitní odpovědi, zatímco dlouhodobý stres vede k její supresi. Je však jednoznačné, že působení psychického i fyzického stresu může přispět k vyvolání defektu v normální odpovědi IS a snížit tak rezistenci organismu k infekčním i autoimunitním onemocněním (Havrdová a kol., 2001). 3.3 Přehled autoimunitních onemocnění Autoimunitní onemocnění se dají zhruba rozdělit na systémová a orgánově specifická. U systémových je autoimunitní reakce namířena proti konzervovaným strukturám jaderných a dalších orgánově nespecifických antigenů. Uplatňuje se zejména imunokomplexový typ poškození tkání. Řadíme sem například systémový lupus erythematodes, revmatoidní artritidu a další. Do skupiny orgánově specifických autoimunitních onemocnění patří například roztroušená skleróza, hemolytická anémie či Graves-Basedowova choroba. Tkáňové poškození vyvolávají autoreaktivní T lymfocyty (T H 1, T C ) nebo autoprotilátky, které mají cytotoxický účinek, nebo ovlivňují funkci cílové struktury. Crohnova nemoc či autoimunitní hepatitidy jsou 33

32 řazeny mezi autoimunitní choroby postihující převážně určitý orgán provázené postižením dalších orgánů. Na vzniku těchto chorob se podílejí imunopatologické mechanismy, které vedou k postižení převážně jednoho orgánu a jsou navíc provázeny řadou systémových příznaků a častým výskytem orgánově nespecifických autoprotilátek (Hořejší & Bartůňková, 2002). 4. ROZTROUŠENÁ SKLERÓZA MOZKOMÍŠNÍ Roztroušená skleróza mozkomíšní je chronické zánětlivé onemocnění CNS, které vede jak k demyelinizaci nervových vláken, tak k jejich přímé ztrátě. RS je nejčastější příčinou invalidity mladších věkových skupin z neurologické příčiny v naší zeměpisné šířce. Je řazena mezi autoimunitní onemocnění, přičemž cílovými antigeny pro autoimunitní útok jsou antigeny myelinové pochvy, obalující nervová vlákna CNS (Havrdová a kol., 2001). Jak dlouho onemocnění RS existuje, není přesně známo. Jako samostatnou nozologickou jednotku jej popsal pod názvem sclérose en plaques v roce 1868 Jean-Martin Charcot. Podal přesný histologický popis demyelinizace, pochopil její vztah ke klinickému obrazu a navrhl diagnostická kritéria zahrnující klasickou triádu nesoucí jeho jméno. Po mnoha pokusech o léčbu však došel k závěru, že nemoc je neléčitelná. Ani další generace neurologů nebyly v léčbě RS úspěšnější. K průlomu v terapii došlo až v 60. letech 20. století. Byly publikovány výsledky studie srovnávající délku relapsu po aplikaci ACTH proti placebu. Úspěch aplikace ACTH a kortikoidů tak zahájil éru farmakoterapie roztroušené sklerózy. V 80. letech byla zahájena terapie interferonem, která vycházela, stejně jako kortikoterapie, z pokroků v pochopení imunologické podstaty RS (Havrdová, 2005). 4.1 Epidemiologie Počátek onemocnění vídáme nejčastěji mezi 20. a 40. rokem věku, zřídka je diagnostikováno před 10. a po 60. roce věku. Jako u řady jiných autoimunit je vyšší výskyt u žen, v poměru přibližně 2:1. U případů s časným a pozdním začátkem nemoci je poměr žen vůči mužům ještě vyšší (3:1 a 2,4:1) (Havrdová, 2000). 34

33 Vnímavost bílé rasy vůči onemocnění je největší, u černé rasy je vnímavost poloviční a u orientální rasy ještě nižší. Onemocnění je nejčastější u indoevropské rasy, především u osob skandinávského původu, což vede až ke spekulaci o vikingských genech, a v oblasti mírného pásma především více zalidněné severní polokoule. U Afričanů v rovníkové Africe se nemoc téměř nevyskytuje, u Afroameričanů, vesměs smíšených s indoevropskou populací, je výskyt vyšší. Minimální výskyt je kolem rovníku a jeho nárůst se zeměpisnou šířkou se dává do souvislosti se slunečním svitem a vlivem vitaminu D na IS. Migrační studie naznačují, že pokud se člověk vystěhuje po 15. roce věku ze země s vysokým rizikem RS do země s nízkým rizikem RS, přináší si s sebou riziko země, kde vyrostl, a naopak. Jeho potomci však již mají stejnou prevalenci jako jejich nové okolí. Existuje řada pokusů, jak vysvětlit existenci geografického gradientu. Pravdě nejblíže bude asi představa, že v určitém klimatickém pásmu se daří určité skupině virů, které sice zřejmě nejsou vyvolavateli RS, ale které se mohou podílet na aktivaci IS, která k rozvoji choroby vede (Havrdová, 2000). V naší republice je prevalence kolem obyvatel na Incidence se zdá být, jako u jiných autoimunit, lehce vzrůstající, a to nejen na vrub zlepšené a časné diagnostiky nemoci (Havrdová, 2005). Do souvislosti s výskytem RS jsou dávány také sociální a kulturní faktory, které souvisí se způsobem života různých skupin obyvatel. Ovlivňují stravovací návyky a stav výživy (např. změna poměru omega-3 a omega-6 nenasycených mastných kyselin v potravě), hygienické a zdravotní podmínky, mají vztah k urbanizaci a industrializaci. Komplexnost a různorodost těchto souvislostí spolu s metodologickou nejednotností studií však nedovolují vyslovit žádné jednoznačné závěry o jejich vlivu na epidemiologii RS. Kromě zevních faktorů rozhoduje velkou měrou o vnímavosti vůči této chorobě genetické pozadí. RS se vyskytuje častěji u příbuzných pacientů. Nejčastěji jsou postiženi dva sourozenci, riziko postižení kteréhokoli z příbuzných je však vždy nižší než 10 %, což vylučuje možnost, že za vnímavost vůči RS je zodpovědný jen jeden gen. Zřejmě také všechny geny vnímavosti, kterých se dnes uvažuje kolem 20, se dědí recesivně. Studie na dvojčatech (porovnání monozygotických dvojčat s dizygotickými) ukázaly, že monozygotická dvojčata mají asi sedminásobnou pravděpodobnost, že onemocní, ve srovnání s dizygotickými dvojčaty či ostatními sourozenci (Havrdová, 2000). 35

34 Ze zvířecích modelů je patrné, že ve vnímavosti vůči RS jsou důležité genetické lokusy, které se uplatňují v regulaci IS. Nejlépe prozkoumané jsou geny pro molekuly MHC. Vnímavost severoevropské populace pacientů s RS je spojena s přítomností antigenů MHC I. třídy A3 a B7, silnější je však vazba s antigeny II. třídy, a to D2, DQW1 a DQB1 (Havrdová, 2000). Tyto vztahy nejsou univerzální, u jiných populací je častější výskyt jiných alel. Dalšími kandidáty vnímavosti pro RS jsou geny kódující velmi polymorfní řetězec α a β receptoru T buňky, dále geny pro MBP, který je jednou z hlavních součástí myelinu, geny pro variabilní část molekuly imunoglobulinů a geny pro prozánětlivé cytokiny. Stejně tak agresivita nemoci a typ průběhu jsou zřejmě určeny geneticky. Samo genetické pozadí však nestačí. Kromě zmiňovaných zevních faktoru k němu přistupuje ještě vliv infekce. Ty mnohdy spouštějí nejen ataku nemoci. Dalším faktorem je stres, především chronický. 4.2 Etiopatogeneze Onemocnění je charakterizováno mnohočetnými zánětlivými infiltráty v CNS, zejména v bílé hmotě. Histopatologicky v těchto infiltrátech nalézáme aktivované T lymfocyty, makrofágy, méně B lymfocyty. Dále nacházíme destrukci myelinu, edém s poruchou hematoencefalické bariéry (HEB) a přítomností prozánětlivých, vazodilatačních a toxických látek, plazmatické buňky s produkcí Ig a různé počty zpřetrhaných axonů. Vzorec histopatologického nálezu je zřejmě u stejného jedince po celou dobu choroby identický. Nejčastěji převažují zánětlivé složky s depozity imunoglobulinů a demyelinizací bez masivní destrukce oligodendrocytů. Méně často je přítomna selektivní ztráta některých myelinových proteinů. Kombinace zánětu, demyelinizace a axonální transsekce pak vysvětluje různé klinické formy nemoci i různou odpověď na terapeutické snahy (Havrdová, 2001). Aktivace autoreaktivních T lymfocytů Aktivace autoagresivních T lymfocytů specifických pro antigeny CNS se předpokládá na periferii. IS se může s antigeny CNS setkat především v hlubokých krčních uzlinách. První aktivace klonů, které by teoreticky neměly být schopny dostatečného pomnožení potřebného k zahájení imunitní reakce poškozující cílovou tkáň, probíhá zřejmě na základě antigenních 36

35 mimiker při banálních, nejspíše virových infekcích v předchorobí. Po pomnožení na druhý podnět jsou tyto specifické lymfocyty schopny v těle vyhledat cílový orgán nositele antigenů. Bylo zjištěno, že klony T buněk rozpoznávající MBP vykazují vysoký stupeň specifické migrační aktivity. Tyto buňky silně infiltrují bílou hmotu mozku a míchy, ale zcela ignorují periferní nervy, i když tyto nervy obsahují MBP ve svých myelinových obalových vrstvách (Hašek & Holáň, 1988). Dále dochází k proliferaci lymfocytů, přestupu přes HEB a iniciaci zánětlivého ložiska. Porušení bariéry v místě vstupu a produkce mediátorů zánětu vede k atrahování makrofágů a dalších již nespecifických zánětlivých buněk do místa léze. Migrace T lymfocytů přes hematoencefalickou bariéru Centrální nervový systém je od ostatního těla, a tedy od IS, oddělen hematoencefalickou bariérou, která brání průchodu buněk IS i některých jejich mediátorů. Proto se nabízí otázka, jak mohou imunokompetentní buňky touto bariérou prostupovat. T lymfocyty překračují HEB transendoteliální cestou, nejčastěji v parajunkčních oblastech endotelových buněk. V těchto oblastech je největší exprese adhezívních molekul, i když jejich celkové množství je daleko nižší než v jiných orgánech. Aktivovaný T lymfocyt, produkující prozánětlivé cytokiny, dovede snížit elektrické napětí endoteliální buňky, které je významnou složkou nepropustnosti bariéry. Pevná lamina basalis je pak v místě přestupu narušena hyaluronidázou, produkovanou aktivovanými T buňkami. Pro úspěšné proniknutí do tkáně musí lymfocyty překonat ještě bariéru vlastní tkáňové matrix. Matrixové proteiny jako kolagen, vitronektin a fibronektin jsou ligandy povrchových lymfocytárních molekul zvaných VLA (very late antigens). Vlastní matrix je pak narušena enzymy, matrixovými metaloproteinázami (MMP), které tak hrají důležitou roli v patogenezi zánětlivých onemocnění CNS. MMP, obsahující v aktivním místě své molekuly atom zinku, se podílejí i na degradaci myelinových proteinů. V zánětlivé lézi jsou MMP produkovány hlavně leukocyty a také mikroglií. Vzájemná rovnováha mezi MMP a jejich přirozenými inhibitory, která je regulovaná cytokiny, může být určující jak pro velikost tak pro výsledný stav destruktivního zánětlivého ložiska (Havrdová, 2001). Demyelinizace Plazmatické buňky tvořící protilátky se nacházejí ve většině zánětlivých ložisek, jejich vlastní úloha však není zcela jasná. Protilátky, které jsou namířené proti myelinovým 37

36 antigenům, se mohou účastnit destrukce myelinu mechanismem prosté opsonizace. Tento mechanismus je patrný u protilátek, které rozpoznávají povrchové struktury myelinu, např. protilátky proti myelinovému oligodendrocytárnímu glykoproteinu (MOG). MBP je na spodní straně lamely myelinového obalu. Protilátky proti němu se tedy mohou uplatňovat v patogenezi demyelinizace až po narušení povrchu myelinové pochvy (Havrdová, 2001). Obr. 6: Myelinizace v CNS. a) jeden oligodendrocyt obtáčí několik axonů schematicky znázorněno rozbalení membrány, která tvoří jedno internodium, dále naznačeny zbytky cytoplazmy (1), b) každý výběžek oligodendrocytu vytváří jedno internodium, c) průřez internodiem: axon (2), cytoplasma oligodendrocytu (3). (Havrdová, E. a kolektiv: Neuroimunologie, Maxdorf, Praha, 2001) Myelinové obaly nervových vláken v CNS jsou produkovány oligodendrocyty. Myelin je rozšířenou membránou oligodendrocytů, která mnohonásobně obaluje axon (Obr. 6). Jeden oligodendrocyt poskytne myelinizaci zhruba 50 segmentům určitého axonu. Prostory mezi vrstvami myelinu jsou extracelulární. Na extracelulární straně myelinové vrstvy nejblíže axonu je lokalizován glykoprotein asociovaný s myelinem (MAG). Na cytoplazmatické straně myelinové vrstvy se nachází MOG. Podobně je lokalizován i hlavní terč AIR, myelinový bazický protein. Poslední z terčů, proteolipid protein (PLP), je transmembránovým proteinem, který má negativně nabitý konec v extracelulárním prostoru a část kladně nabitou v cytoplazmě (Obr. 7). Především na molekule MBP se nacházejí imunodominantní epitopy, vůči kterým je autoreaktivita zaměřena (Krejsek & Kopecký, 2004). Vzorec produkovaných cytokinů v zánětlivém ložisku je nejspíše posunut ve prospěch prozánětlivých cytokinů. V place na počátku jejího vývoje lze prokázat IL-12 a IL-1, v další fázi IFN-γ a TNF. TNF je schopen prostým kontaktem poškozovat myelin. I jeho působení je 38

37 však navozeno IFN-γ. Úloha ostatních cytokinů není zcela jednoznačná, protože jejich výsledný účinek se uplatňuje v kombinaci s jinými cytokiny. Protizánětlivé cytokiny lze prokázat v ložiscích až ve fázi, kdy je zánětlivá reakce na ústupu. Jde především o IL-10 a TGF-β. Jejich nedostatečná tvorba, která je prokazatelná již na začátku nemoci, je možná důvodem, proč autoreaktivní lymfocyty mohou proliferovat. Přítomnost IL-10 a TGF-β v zánětlivém ložisku je podmíněna snížením produkce IFN-γ a TNF. K reparačním pochodům ve tkáni proto nemůže zřejmě dojít, pokud je hojná přítomnost zánětlivých působků, ačkoli právě ony dávají k potřebě reparace první signál (Havrdová, 2001). Obr. 7: Molekulární struktura myelinu v CNS a periferním nervovém systému. PLP molekuly spojují extracelulární povrchy membrány, MBP molekuly spojují intracelulární povrchy membrány. P 0 je v periferním nervovém systému molekula analogická PLP v centrálním nervovém systému. (Havrdová, E. a kolektiv: Neuroimunologie, Maxdorf, Praha, 2001) Také chemokiny se uplatňují ve vzniku a udržování zánětlivého ložiska. Zajišťují migraci monocytů/makrofágů přes cévní stěnu a jejich akumulaci v místě zánětu a lze je prokázat v lézi RS. Úloha makrofágů v lézi není dosud zcela jasná. V makrofázích je možno v časné fázi plaky prokázat MBP, který je postupně degradován. Největší množství makrofágů 39

38 nalezneme v akutní place, kde dochází k masivní demyelinizaci, a také v place na začátku remyelinizace (Havrdová, 2001). Myelin je zřejmě ničen jak makrofágy samými, tak jejich toxickými produkty (Obr. 8). Obr. 8: Schéma patogeneze RS. T lymfocyt je aktivován na periferii rozpoznáním antigenu předkládaného makrofágem. T lymfocyt se množí a přestupuje HEB. Ve tkáni rozpoznává specifický antigen a produkovanými prozánětlivými cytokiny aktivuje makrofágy a mikroglii. Do CNS jsou přitahovány i B lymfocyty a cytotoxické lymfocyty, které se podílejí na ničení myelinu i axonů. MØ makrofág, Th1 subpopulace pomocných T lymfocytů, AM adhezívní molekuly, IFN-γ, TNF, IL-1 zánětlivé cytokiny, B B lymfocyt, A astrocyt. (Havrdová, E.: Roztroušená skleróza, Maxdorf, 2005) Remyelinizace V zánětlivém ložisku, place, dochází k rozpadu myelinu a ztrátě axonů. V případě snížení zánětlivé aktivity může dojít k reparaci myelinu díky aktivitě zbylých oligodendrocytů, které obnoví svou integritu a tvorbu myelinu, a díky přítomnosti prekurzorů oligodendrocytů, které mohou z blízkého okolí do léze přicestovat, dozrát v dospělé oligodendrocyty a podílet se na opravě myelinu. Tvorba myelinu je však v dospělém organismu velmi omezená. I když je oligodendrocyt po zničení části svých výběžků schopen určité množství myelinu dotvořit, tento nový myelin je tenčí a Ranvierovy zářezy mezi internodii jsou blíže u sebe. Při opakování zánětu ve stejném ložisku se destruovaná tkáň hojí za účasti astrocytů gliovou jizvou. Remyelinizace je minimální, ztráta axonů významná a k návratu funkce již plně nedochází (Havrdová, 2000). Neúspěch remyelinizace u pacientů s RS může být způsoben re-expresí adhezívních molekul PSA-NCAM na axonech v zánětlivých lézích, což může mít za následek 40

39 další zesílení destruktivních pochodů. Tyto negativní regulátory myelinizace jsou běžně přítomny během vývoje, ale ne u dospělých lidí. Kromě toho může ke špatné remyelinizaci přispět tvorba gliové jizvy, která obalí axon, a tím zabrání přístupu prekurzoru oligodendrocytu k demyelinizovanému axonu (Keirstead, 2005). Ztráta axonů Ničení vlastních nervových vláken v lézi je nejzávažnějším dějem při RS a není zcela známo, kolika mechanismy probíhá. Studie jasně ukázaly, že axonální ztráta je u RS již časnou událostí, ne záležitostí chronicko-progresivního stadia choroby, jak se dříve předpokládalo. Obnažené akutně demyelinizované vlákno ztrácí schopnost vedení elektrického impulsu a začíná na svém povrchu exprimovat MHC molekuly I. třídy. Tím se stane viditelným pro CD8 + lymfocyty, které jsou vyplavením perforinů schopny vlákno přerušit. Na proximálním konci přetržených axonů se vytvářejí cibulovité útvary ovoidy. Jedním z mechanismů axonální ztráty v pozdějších stadiích choroby je energetická náročnost vedení vzruchu chronicky demyelinizovaným nervovým vláknem. Takové vlákno musí v demyelinizovaném úseku přestěhovat iontové kanály z Ranvierových zářezů podél obnaženého vlákna a exprimovat kromě toho kanály další (Obr. 9). Tento energeticky náročný proces vlákno vyčerpává. Obr. 9: Axonální transsekce. A) CD8 + lymfocyt rozpoznává na demyelinizovaném vláknu MHC gp I a produkuje perforiny, které zničí membránu axonu. B) Při demyelinizaci se snižuje exprese genů spojených se systémem GABA. Dochází ke zvýšené elektrické aktivitě neuronu, zvýšení exprese Na + kanálů a nadbytku Ca 2+ v neuronu, což v konečném důsledku vede k jeho smrti. (Havrdová, E.: Roztroušená skleróza, Maxdorf, 2005) 41

40 Dalším možným mechanismem je poškození vlákna nadbytkem glutamátu, který není v místě zánětu a poškození oligodendrocytů efektivně ze synapsí odklízen. Buňky IS, zvláště T lymfocyty, jsou v místě zánětu významným zdrojem glutamátu. Ten se váže na své receptory na povrchu oligodendrocytů a neuronů. Abnormální metabolismus glutamátu je považován za příčinu poškození, či přímo smrti buněčných elementů (Krejsek & Kopecký, 2004). Zvířecí model RS Základním zvířecím modelem RS je experimentální alergická encefalomyelitida, EAE. Díky výsledkům dosaženým v základním výzkumu EAE je roztroušená skleróza jednou z mála autoimunitních imunopatologických nemocí, pro které máme k dispozici léky modifikující průběh onemocnění. EAE lze vyvolat několika způsoby. Vnímavému zvířeti jsou aplikovány imunogenní složky myelinu (MBP, PLP, MOG, MAG) spolu s tzv. Freundovým adjuvans. Freundovo adjuvans je suspenze usmrcených mykobakterií kmene BCG v purifikovaném rostlinném oleji (Krejsek & Kopecký, 2004). Na podnět této antigenní stimulace se začnou v regionálních uzlinách množit T lymfocyty se specifickým TCR, který je schopen tento antigen rozpoznat. Po namnožení se specifické T buňky vydají hledat svůj cílový antigen, přestoupí HEB a způsobí perivaskulární zánět v CNS. Onemocnění je možno vyvolat také přímým přenesením specifických T buněk vnímavému zvířeti nebo je zprostředkovat protilátkami, které se proti myelinovým komponentám vytvoří jako projev spolupráce T a B buněk. Klinicky u zvířete proběhne stadium různě těžkých paréz. Onemocnění lze modelovat i jako chronické relabující, tedy připomínající i klinicky RS. Zásadní rozdíl oproti lidskému onemocnění je znalost doby, kdy je antigen aplikován, právě tak jako znalost antigenu či antigenní směsi použité k imunizaci. Terapeutické zásahy mohou být tedy dobře načasované a antigen specifické. Problém v aplikaci poznatků ze zvířecích studií u EAE na lidskou RS je především na počátku. Neznáme antigen, který onemocnění vyvolal, nevíme, kdy došlo ke stimulaci imunitních buněk. 4.3 Klinické příznaky Klinický projev ložisek RS je závislý na jejich lokalizaci v bílé hmotě mozku a míchy a z části na jejich velikosti (drobné ložisko v prodloužené míše způsobí výraznou klinickou 42

41 symptomatologii, zatímco větší ložisko v okolí postranních komor se klinicky nemusí projevit vůbec). Akutní rozvoj neurologických příznaků je dán blokem vedení demyelinizovaným nervovým vláknem. Během několika dnů dochází k redistribuci iontových kanálů, původně shromážděných pouze v Ranvierových zářezech, a vedení nervovým vláknem je obnoveno. Klinické příznaky se v této době mohou zmírňovat. Došlo-li však během vývoje ložiska k zpřetrhání příliš velkého množství vláken, funkce nemůže být již plně obnovena. Tyto děje lze dokumentovat elektrofyziologickými metodami, tzv. evokovanými potenciály různých modalit. Protože k demyelinizaci dochází opakovaně, je pro systém čím dál tím složitější funkci obnovovat. Trvalé příznaky jsou způsobeny úbytkem axonů. Jejich významná destrukce odpovídá již stadiu chronické progrese (Havrdová, 2001). Nejčastějšími příznaky na začátku nemoci bývají poruchy zraku a poruchy citlivosti. Optická neuritida, postihující jeden nebo oba zrakové nervy, se projevuje jednak různou mírou poruchy zraku, od zamlženého vidění, poruchy barvocitu, výpadků zorného pole až po úplnou ztrátu zraku, jednak bolestí za bulbem a při pohybech bulbu. Může se upravit zcela bez následků, výpadky zorného pole i porucha zraku však mohou být ojediněle ireverzibilní. Vzácně může optická neuritida zanechat až slepotu. Na okrajích sítnice nacházíme u 5-30 % pacientů proužkové perivenózní infiltráty z lymfocytů a plazmatických buněk, tzv. Ruckerovy proužky. Některým pacientům se zhorší visus po námaze nebo pobytu v horku (Havrdová, 2001). Ztráta citlivosti nebo její změny (brnění, píchání, pálivé parestezie) jsou velmi časté v celém průběhu nemoci, na jejím začátku bývají často podceněny, přehlédnuty a ignorovány nejen pacientem, ale i lékařem. Nejčastěji jde o poruchy citlivosti, méně často je postiženo vnímání tepla, chladu a bolest. Typické je, že porucha citlivosti nesleduje inervační oblast periferních nervů ani kořenů, ale jde o ostrůvkovité výpadky čití nebo postižení jedné končetiny či pásu na trupu. Zpočátku se většina těchto poruch upravuje po několika dnech až měsících, později mohou obtíže být trvalé. Výskyt optické neuritidy a parestézií na začátku onemocnění se považuje prognosticky za příznivé znamení, předznamenávající benignější průběh choroby. Poruchy hybnosti jsou závažnějším příznakem. Obrny jsou centrálního charakteru a jsou provázeny zvýšením svalového tonu spasticitou. Postihují častěji dolní končetiny a jejich reverzibilita je samozřejmě větší na počátku onemocnění. Deficit hybnosti pozvolna narůstající 43

42 od počátku nemoci je typický pro primárně progresivní RS. Někdy i po ústupu vlastní poruchy hybnosti zůstává těžká spasticita. Poruchy hybnosti vedou k závažné hybné invaliditě pacienta. Závažné jsou mozečkové poruchy, neboť i velmi malé léze v cerebelárních drahách mohou způsobit významný defekt. Vázne koordinace pohybu, jeho plynulost a objevuje se intenční třes (třes před cílem a na cíli), který pacientovi brání se najíst, napít, vykovávat jakékoliv jemnější pohyby i při plně zachované síle. Ataxie spinálního původu může být spojená s poruchou hlubokého čití, kdy pacient neví bez kontroly zraku o uložení končetiny v prostoru, protože vázne přívod informací z kloubních a šlachových tělísek k vyšším centrům pro řízení motoriky. Chůze má pak nejistý, opilecký ráz. Objevení se mozečkových příznaků je prognosticky nepříznivým znamením. Okohybné poruchy představují nejčastěji dvojité vidění (diplopie) a nystagmus. Diplopie je většinou přechodná. Z mozkových nervů může být dále postižen nervus trigeminus. U některých pacientů se může objevit periferní obrna lícního nervu. Stejně tak může dojít k přechodné ztrátě sluchu. Vertigo a poruchy rovnováhy postihují nejméně polovinu pacientů. Výrazně mění kvalitu hybnosti a soběstačnosti pacienta. Sfinkterovými poruchami trpí v průběhu nemoci 80 % pacientů. Především jde o poruchy močení. Korelace existuje s mírou poruchy hybnosti dolních končetin, protože jde také o postižení velmi dlouhých drah. Téměř polovina pacientů s RS trpí zácpou. V korelaci se sfinkterovými poruchami jsou také sexuální poruchy. Podílí se však na nich i deprese, chronicita nemoci, únava, vliv léku. Proto je obtížné jejich objektivní hodnocení. Prevalence se odhaduje na 80 % u mužů a 33 % u žen. U mužů jde především o erektilní dysfunkci, u žen jsou sexuální poruch méně zmapovány (Havrdová, 2001). Únava je nespecifickým, ale velmi častým a někdy invalidizujícím příznakem RS. Její příčiny jsou nejspíše multifaktoriální a někdy jde spíše o projev deprese. Na únavě se podílí jednak vyšší únavnost demyelinizovaných nervových vláken, jednak oslabení nerovových drah axonální ztrátou a nepochybně i přítomnost zánětlivých produktů v nervové tkáni, které mohou interferovat s vlastní neurotransmisí. Více než polovinu pacientů s RS provází v některé fázi choroby deprese. Bývá to často v době diagnostiky, v období relapsu, ale i zcela nezávisle. Předpokládá se vliv zánětu na serotonergní transmisi a vliv samotné přítomnosti zánětlivých cytokinů, především TNF-α. 44

43 Depresi a její detekci je třeba věnovat značnou pozornost, protože sebevražednost je u RS několikanásobně zvýšena (Havrdová, 2005). Kognitivní a afektivní poruchy se objevují u 5 % pacientů již v počátcích choroby, v pokročilých stadiích až v 70 % případů. Nejsou tak nápadné a snadno detegovatelné jako u Alzheimerovy demence. Mohou je odhalit jen vhodné neuropsychologické testy (Havrdová, 2001). 4.4 Typy nemoci, průběh a prognóza nemoci Průběh nemoci je ve svém výsledku benigní nebo maligní. Benigní, tedy většinou dlouhotrvající remitentní průběh nemoci u % pacientů je nepochybně dán schopností IS včas aktivovat supresorické mechanismy. Tento typ průběhu však nelze nikdy předpovědět, jde vždy o retrospektivní pozorování. Naopak maligní průběh s rychlým nárůstem neurologického deficitu je dán zřejmě selháním supresorických mechanismů a rozsáhlým poškozením axonů i oligodendrocytů v lézích (Havrdová, 2001). Ataka je definována vznikem nových nebo zhoršením již existujících neurologických příznaků, které trvají alespoň 24 hodin a nejsou spojeny s probíhající horečnatou infekcí. Ataky po infekci vznikají většinou na konci infekce nebo několik dnů po jejím skončení. Progrese je definována trvalým zhoršením objektivního neurologického nálezu, který trvá 3-6 měsíců. To ovšem nevylučuje možnost zlepšení po protrahované atace (Havrdová, 2005). Průběh relaps-remitentní (stadium atak a remisí) U 85 % pacientů začíná onemocnění vznikem ataky, která se v různém časovém období dnů až měsíců upravuje a je následována různě dlouhým obdobím remise bez nových klinických příznaků (ať již s reziduem po první atace nebo bez něj). Atakovité období trvá přibližně 5-15 let. Některé ataky mohou zanechat následky v podobě patologického neurologického nálezu nebo invalidity, některé se upraví zcela. Většinou však během postupu nemoci ubývá schopnosti reparovat následky. Zánětlivá aktivita na MRI (magnetic resonance imaging) bývá v relaps-remitentním období choroby nejvyšší. 45

44 Průběh chronicko-progresivní (sekundárně progresivní) Polovina pacientů přejde již během prvních 10 let průběhu nemoci do stadia sekundární chronické progrese. Zánětlivá aktivita se zmenšuje, převažují degenerativní pochody v CNS. Ataky proto nejsou většinou tak nápadné, dochází spíše k pozvolnému nárůstu invalidity. Tyto dva typy průběhu nelze přesně oddělit, přechod do chronicko-progresivního stadia je dán vyčerpáním rezerv CNS, kterých se předpokládá až 40 %. Každé další poškození zánětlivým dějem již vyvolá trvalé následky (Havrdová, 2001). Primárně progresivní průběh U tohoto průběhu nejsou přítomny ataky, ale invalidita se vyvíjí pozvolna, většinou v podobě spastické paraparézy dolních končetin. Patogeneticky jde o poněkud odlišný typ nemoci s menší přítomností zánětu a větší přítomností degenerativních změn na nervových strukturách i oligodendrocytech. Postihuje asi % pacientů, více mužů než žen, a vznik je častější v pozdějším věku. Průběh relabující-progredující Kromě neúplné úzdravy z atak je toto stadium charakterizováno progresí i mezi atakami. Zánětlivá i degenerativní aktivita nemoci je u tohoto typu choroby nejvyšší, často nemocné těžce invalidizuje během několika málo let. Spouštěcími mechanismy atak RS jsou především virové infekce. Nespecifickou aktivací IS, bojujícího s virovou nákazou mohou být aktivovány i autoagresivní lymfocyty. Podobným způsobem se může vzácně uplatnit i imunizace. Dalšími spouštěcími faktory může být porod a období po něm, především díky hormonální změnám, které mají vliv na IS. Psychický i fyzický stres může být další příčinou exacerbace RS, a to především v průběhu dvou let před onemocněním (Havrdová, 2001). Pro popisné hodnocení stavu pacienta je možno užívat různé škály. Nejvíce rozšířenou je tzv. Kurtzkeho škála, která směšuje neurologický nález a invaliditu. Skládá se z 8 funkčních systémů, které se hodnotí zvlášť, postižení v jednotlivých systémech pak dává výsledné číslo (Tab. 3). 46

45 0 Normální neurologický nález (všechny FS stupeň 0) 1 Žádná disabilita, minimální neurologický nález v 1 FS (stupeň 1) 1,5 Žádná disabilita, minimální neurologický nález ve více než 1 FS (stupeň 1) 2 Minimální disabilita v 1 FS (1 FS stupeň 2, ostatní 0 nebo 1) 2,5 Minimální disabilita ve 2 FS (2 FS stupeň 2, ostatní 0 nebo 1) 3 Lehká disabilita v 1 FS (1 FS stupeň 3, ostatní 0 nebo 2) nebo mírná disabilita ve 3-4 FS (3-4 FS stupeň 2, ostatní 0 nebo 1) a zároveň chůze bez omezení 3,5 Chodící, ale se střední disabilitou v 1 FS (1 FS stupeň 3) a 1-2 FS stupně 2 nebo 2 FS stupně 3 nebo 5 FS stupně 2 (ostatní FS stupně 0 nebo 1) 4 Schopnost chůze bez pomůcky a odpočinku na alespoň 500 m, činnost 12 h denně navzdory relativně těžké disabilitě sestávající z 1 FS stupně 4 (ostatní 0 nebo 1) nebo kombinace nižších stupňů přesahující limity předchozích stupňů 4,5 Schopnost chůze bez pomůcky a odpočinku na alespoň 300 m, činnost po většinu dne, těžká invalidita sestávající z 1 FS stupně 4 (ostatní 0 nebo 1) nebo kombinace nižších stupňů přesahující limity předchozích stupňů 5 Schopnost chůze bez pomůcky a odpočinku na alespoň 200 m (ekvivalentem FS je 1x stupeň 5 a ostatní 0 nebo 1 nebo kombinace nižších stupňů překračující definici pro stupeň 4,5) 5,5 Schopnost ujít bez pomoci a odpočinku 100 m 6 Nutná jednostranná opora (hůl, berle) k ujití alespoň 100 m bez přestávky nebo s přestávkou 6,5 Chůze s oboustrannou oporou (hole, berle) na alespoň 20 m bez přestávky 7 Pacient není schopen ujít ani 20 m s oporou, převážně odkázán na vozík, na kterém se přepravuje sám, tráví na vozíku bděle alespoň 12 h 7,5 Pacient není schopen ujít s pomocí více než několik kroků, omezen pouze na vozík, potřebuje pomoc při transportu na vozík a jízdě na něm 8 Pacient převážně odkázán na lůžko nebo vozík, ale většinu dne tráví mimo lůžko, jsou zachovány některé sebeobslužné schopnosti obecně možnost užitečného použití horních končetin 8,5 Pacient většinu dne upoutaný na lůžko, má určitou schopnost užívat horních končetin, zachovány některé sebeobslužné schopnosti 9 Bezmocnost, pacient upoutaný na lůžko, schopný jíst a komunikovat 9,5 Zcela bezmocný ležící pacient, neschopný efektivně komunikovat a jíst/polykat 10 Smrt v důsledku RS Tab. 3: Kurtzkeho rozšířená škála disability. Funkční systémy (FS): pyramidový, kmenový, mozečkový, senzitivní, sfinkterový, zrakový, mentální, ostatní. Hodnocení u většiny z nich stupni 1-5, event. 6 (Havrdová, 2005). 47

46 4.5 Pomocná vyšetření a diferenciální diagnóza Význam jednotlivých vyšetření se během času vyvíjel. V době, kdy neexistovala MRI, byly evokované potenciály nezastupitelné, v současné době je na MRI kladen důraz největší, někdy i na úkor jiných vyšetřovacích metod. MRI je metoda založená na magnetických vlastnostech protonů vodíkových jader. Metoda magnetické rezonance (MR) je výrazně senzitivní k odhalení i velmi malých ložisek, často jen o velikosti několika milimetrů. Její nevýhodou je však nízká specifičnost. V MR obraze tak nelze často rozlišit demyelinizační onemocnění od ischemického, zánětlivého, toxického či metabolického postižení (Feitová, 2002). Vyšetření mozkomíšního moku zůstává stále velmi důležitým pomocníkem jak ve stanovení diagnózy, tak při diferenciálně diagnostickém rozhodování. Neinformuje sice o diseminaci lézí v čase ani v prostoru, informuje však o zánětlivé povaze procesu. V kterékoli fázi nemoci nacházíme zvýšené hladiny IgG. IgG jeví omezenou heterogenitu, prokazatelnou metodou izoelektrické fokusace jako tzv. oligoklonální pruhy. U více než 95 % pacientů s RS jsou prokazatelné oligoklonální pruhy v alkalické oblasti, zatímco pro zánětlivá onemocnění jsou typické oligoklonální pruhy spíše v kyselé oblasti (Havrdová, 2001). Evokované potenciály v současné době v diagnostice RS ztrácejí díky MRI na významu. Vyšetřením zrakových, sluchových, somatosenzorických a motorických drah dokládají postižení dalšího systému, kromě klinicky jasně detegovatelného, a podporují tak diagnostický požadavek rozsevu ložisek v čase a prostoru. Oční vyšetření je nezbytné při podezření na optickou neuritidu. Důležité je vyšetření defektů zorného pole a jejich sledování v čase v souvislosti s léčebným zásahem. Imunologické vyšetření periferní krve nepřináší konzistentní výsledky, které by byly specifické pro RS. Je schopno odhalit drobné abnormity ve funkci IS, např. sníženou funkční schopnost T S lymfocytů, vyšší počty CD4 + buněk, nižší počty B lymfocytů atd. Využití nalézají tyto metody především při hodnocení vlivu léků na buňky IS (Havrdová, 2001). K potvrzení RS slouží kromě typického klinického nálezu typický MRI nález a pozitivní nález oligoklonálních pásů v likvoru. Vyšetření mozkomíšního moku je v regionu střední Evropy velmi důležité, a to především k vyloučení jiných zánětlivých onemocnění CNS, např. boreliózy. 48

47 Diferenciálně diagnosticky je třeba odlišit především všechny chirurgicky řešitelné choroby (nádory, výhřezy plotének, kompresivní fraktury obratlů), jiná autoimunitní postižení CNS (vaskulitidy, chronická zánětlivá onemocnění), genetická a metabolická onemocnění (např. spinocerebelární ataxie se vznikem v dospělém věku). 4.6 Terapie Léčba ataky onemocnění v kterémkoli stadiu Vhledem k tomu, že akutní ataka představuje náhlé vzplanutí zánětu, podle současných mezinárodních doporučení je nutno s léčbou akutní ataky začít co nejdříve. Bez ohledu na přítomnost dlouhodobé terapie a její typ se podávají vysoké dávky methylprednisolonu intravenózně. Během podávání těchto vysokých dávek je doplňováno kalium, chráněn zažívací trakt a pokud jde o aktivní chorobu s opakovaným podáváním steroidů, jsou zaváděna opatření proti osteoporóze. Pokud pacienta obtíže při akutní atace příliš neobtěžují, často se přistupuje jen k přeléčení perorálními steroidy. Mechanismus účinku kortikosteroidů je znázorněn na Obr. 10. Obr. 10: Mechanismus účinku kortokosteroidů. Kortikosteroidy volně překračují membránu, váží se na svůj receptor v cytoplazmě a s ním cestují do jádra, kde se váží na glucocorticoid responsive element, část genetické informace zodpovědné za odpověď na steroidy. Dochází jednak k přepisu informace pro lipokortiny, β2 adrenoreceptory, receptor pro IL-1, jednak k zabránění přepisu informace pro prozánětlivé cytokiny. (Havrdová, E.: Roztroušená skleróza, Maxdorf, 2005) 49

48 4.6.2 Dlouhodobá léčba v remitentním stadiu RS V remitentním stadiu nemoci se užívá řada léků s cílem snížit počet atak a zpomalit progresi onemocnění. Podle mezinárodního konsenzu je u choroby, která jeví aktivitu (přítomnost dvou atak během dvou let), indikovována léčba tzv. léky první volby (léky ovlivňujícími přirozený průběh onemocnění, disease modifying drugs). Zavedení této léčby by podle mezinárodních doporučení nemělo být odkládáno. Do této skupiny léků patří interferon beta a glatiramer acetát. V ČR je situace díky ekonomickým problémům odlišná. Pro zahájení léčby léky první volby byla stanovena přísnější pravidla, proto v ČR není dosud léčena těmito léky řada pacientů, kteří by z léčby mohli profitovat (Havrdová, 2005). Interferon beta má schopnost snížit aktivitu onemocnění klinicky i na MRI. Efekt na buněčné úrovni není dosud jednoznačně objasněn. Mechanismus předpokládaných účinků IFNβ u RS je znázorněn na Obr. 11. Bylo prokázáno, že kromě antiproliferativního účinku snižuje produkci a internalizaci IFN-γ, TNF, IL-1. Inhibuje migraci leukocytů přes HEB, snižuje expresi adhezívních molekul, MHC gp II, produkci NO. Naopak stimuluje tvorbu IL-10 a IL- 1RA, napomáhá tak k tlumení zánětlivé aktivity onemocnění a reparaci tkáně. Nejvyšší efekt má IFN-β, je-li zavedena léčba v co nejčasnější fázi choroby. S přibližující se chronickou progresí efektivita klesá. Aplikace IFN-β má zvláště na začátku nepříjemné vedlejší účinky. Bezprostředně po aplikaci se objevuje tzv. chřipkový syndrom. Je to dáno pyrogenním efektem IFN-β. Dalším vedlejším účinkem jsou časté lokální reakce v místě vpichu při subkutánní aplikaci (Havrdová, 2005). Kombinace interferonů s běžně užívanými imunosupresivy je možná a výhodná. Tímto způsobem lze docílit výsledků více než dvojnásobně lepších než v původních pokusech s monoterapií interferony (Havrdová, 2001). Glatiramer acetát (dříve kopolymer-1) je již také zařazován mezi léky první volby, které by měly být použity u pacientů s aktivní, remitentní RS. Glatiramer acetát (GA) má schopnost snížit počet relapsů i oddálit progresi neurologického deficitu. Mechanismus účinku GA se podstatně liší od mechanismu účinku interferonů. GA se váže přímo na molekulu MHC gp II a je nabízen naivním T lymfocytům. Reakce jejich TCR s GA vede k vývoji populace T H 2, eventuálně T H 3 lymfocytů, produkujících spektrum protizánětlivých cytokinů (IL-10, TGF-β). Tyto lymfocyty putují přes HEB do CNS, kde vykonávají protizánětlivý efekt (Havrdová, 2005). Nástup účinku je pomalejší klinicky i na MRI, neboť trvá relativně dlouhou dobu, než 50

49 dostatek buněk aktivovaných glatiramer acetátem překročí HEB a efektivně potlačí zánětlivé děje. Snášenlivost preparátu je velmi dobrá. Zavedení této terapie, podobně jako u IFN-β, by mělo být v co nejčasnější fázi choroby, aby se předešlo nevratnému poškození CNS zánětlivým procesem. Obr. 11: Mechanismus předpokládaných účinků IFN-β u RS. (Havrdová, E. a kolektiv: Neuroimunologie, Maxdorf, Praha, 2001) Intravenózní imunoglobuliny patří mezi léky druhé volby tam, kde se neosvědčilo nebo nepodařilo zavedení léčby preparáty prvé volby. Při podání vysokých dávek se předpokládá imunosupresivní účinek a restaurování idiotypové-antiidiotypové sítě. Léčbu intravenózními imunoglobuliny je velmi vhodné zavést u pacientů, kteří nesnášejí imunosupresi, nebo u nichž dochází k atakám v souvislosti se zvýšenou náchylností k infektům. Azathioprin je řazen mezi léky třetí volby, tedy měl by být zaveden tam, kde není možno zavést léky první ani druhé volby. Mechanismus účinku zahrnuje inhibici syntézy purinových 51