MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Ústav biochemie Stanovení GMO v potravinách pomocí metody PCR: sója a sójové výrobky Student: Dana Vargová Obor: Biochemie Vedoucí práce: doc. RNDr. Omar Šerý, Ph.D. Brno 2009

2 Prohlášení: Prohlašuji, že svou bakalářskou práci na téma Stanovení GMO v potravinách pomocí metody PCR: sója a sójové výrobky jsem vypracovala samostatně pod dohledem vedoucího bakalářské práce a s použitím odborné literatury a jiných informačních zdrojů, které jsou uvedeny na konci práce. Brno: Dana Vargová

3 Poděkování: Chtěla bych poděkovat svému školiteli doc. RNDr. Omarovi Šerému, Ph.D. za odborné vedení a cenné připomínky při zpracování práce. Děkuji také Mgr. Lukášovi Častulíkovi za ochotu a odborný dohled při vykonávání praktické části.

4 OBSAH SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK... 5 SEZNAM OBRÁZKŮ ÚVOD TEORETICKÝ ZÁKLAD Historie Legislativa GMO Definice GMO Nakládání s GMO Značení potravin vyrobených z GMO Testování a bezpečnost Stav GM zemědělských plodin Genetická modifikace Tvorba geneticky modifikovaných rostlin Praktické využití GMO v zemědělství Genetické modifikace sóji Roundup Ready sója Jiné možnosti genetické úpravy sóji Metody detekce GMO Multiplex PCR Nested PCR Real-time PCR MATERIÁL A METODIKA Vzorky Izolace Nested PCR Gelová elektroforéza VÝSLEDKY Vyhodnocení agarózového gelu DISKUSE ZÁVĚR ABSTRAKT SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY INTERNETOVÉ ZDROJE... 46

5 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK: A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens Bt Bacillus thuringiensis CaMV Cauliflower Mosaic Virus cdna komplementární DNA CTP chloroplast transit peptide dntp deoxynukleotidtrifosfát dsdna double-strand DNA E. coli Escherichia coli ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay EPSPS 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfát syntáza FRET fluorescence resonance energy transfer GM geneticky modifikovaná (plodina) GMO geneticky modifikovaný organismus mrna mediátorová RNA NOS nopaline synthase PCR polymerase chain reaction QC-PCR quantitative competitive PCR RR Roundup Ready ssdna single-strand DNA T-DNA transformační DNA 5

6 SEZNAM OBRÁZKŮ: Obr. 1 Odlišná struktura rostlinného a bakteriálního enzymu. 19 Obr. 2 Transkripční jednotka (konstrukt) 19 Obr. 3 Nested PCR 23 Obr. 4 SYBR green I 25 Obr. 5 FRET 26 Obr. 6 TaqMan próba 27 Obr. 7 Molecular beacon 28 Obr. 8 Výsledek elektroforézy na agarózovém gelu z nested PCR 35 6

7 1 ÚVOD GMO neboli geneticky modifikované organismy jsou organismy, které mají cíleně pozměněnou genetickou informaci. Této změny ale nebylo dosaženo přirozenou cestou, nýbrž cestou nepřirozenou, a to vnesením nebo eliminací určitého genu. Právě nepřirozený postup této změny vyvolává u většiny lidí nedůvěru a spekulace o tom, zda geneticky modifikované organismy nepředstavují určitou hrozbu pro společnost. Zda jsou bezpečné pro využívání v zemědělství, zda jejich pěstování nemá negativní vliv na životní prostředí a v neposlední řadě, zda konzumace geneticky upravených plodin je bezpečná a nevyvolává alergie a jiné vedlejší účinky. Vznik geneticky modifikovaných organismů předcházely intenzivní studia v oblasti mikrobiologie a genetiky spojené s nejrůznějšími objevy. Johan Gregor Mendel svým odhalením základních zákonitostí dědičnosti přispěl k rozvoji biologických věd. V roce 1953 vědci Francis Crick a James Watson objasnili prostorovou strukturu deoxyribonukleové kyseliny jako základní molekuly dědičnosti. Tyto zásadní objevy spolu s významným rozvojem biotechnologií pomohly pochopit vzájemné vztahy bílkovin a nukleových kyselin s životními funkcemi jednotlivých organismů a daly vzniknout nové moderní disciplíně, kterou nazýváme genové inženýrství. Dnes se ve světě již využívají geneticky upravené plodiny tolerantní k herbicidům a odolné vůči škůdcům. Je to především sója, kukuřice, bavlník a řepka olejka. V České republice se komerčně pěstuje jedna GM plodina kukuřice MON810, odolná vůči škůdci zavíječi kukuřičnému. Genetické modifikace jsou v podstatě logickým pokračováním procesu, kdy zemědělci v dávných dobách vybírali k dalšímu pěstování ty rostliny, které jim vyhovovaly více, a tak postupně vytvořili z planých rostlin kulturní plodiny. Také při domestikaci zvířat se vybírala ta zvířata, která měla výhodnější vlastnosti pro chovatele. Dnes je to podobné. Jako příklad poslouží geneticky modifikovaná kukuřice, do které je vkládán gen bakterie Bacillus thuringiensis. Tento gen produkuje bílkovinu, která je toxická pro housenky motýlů zavíječe kukuřičného. Geneticky modifikovaná kukuřice (Bt-kukuřice) je tedy proti tomuto škůdci odolná. Proč tedy zavrhovat zušlechťování zvířat a rostlin jen proto, že se k tomu začala využívat metoda genového inženýrství. 7

8 Práce bude věnována jak legislativní stránce používání geneticky modifikovaných organismů v zemědělství, tak i jejich praktickému současnému využití. Dále budou popsány podstaty genetických modifikací u základních geneticky upravených plodin, zejména u geneticky modifikované sóji. Hlavní náplní práce bude popsat techniky detekce GMO v potravinách. V rámci praktické části bakalářské práce bude provedena analýza potravinářských výrobků ze sóji. Pro stanovení geneticky modifikované složky v produktu bude využita metoda nested PCR. Cílem práce pak bude zpracování tabulky, ve které budou srovnány skutečnosti uvedené na obchodním obalu výrobku s výsledky DNA analýz ohledně přítomnosti GMO. 8

9 2 TEORETICKÝ ZÁKLAD 2.1 Historie Po tisíce let člověk žije jako zemědělec. Pro svou zemědělskou činnost vybírá živočichy a rostliny, které nejlépe splňují požadavky na produkci surovin používaných k výrobě potravin, ale i technických produktů. Přesto, že tento umělý výběr zůstává i na dále základní šlechtitelskou metodou, pro šlechtění je to nedostačující. V průběhu 20. století se začalo více využívat záměrného křížení. Od 70. let minulého století posunul člověk hranice svého poznání v oblasti šlechtění organismů tak daleko, že dokáže modifikovat genetickou informaci v buňkách způsobem, který dává organismům zcela jiné užitečné vlastnosti. Jde o vnesení nebo naopak odstranění jednotlivého genu nebo skupiny genů do dědičného základu organismu s využitím metod genového inženýrství. Tomuto typu změn se začalo říkat transgenoze nebo také genetická modifikace (GM) a takto vzniklým organismům geneticky modifikované organismy (GMO). První pokusy byly prováděny v roce 1973 v Kalifornii, kdy byl metodou plazmidů vnesen gen žáby do běžné bakterie, a ta začala produkovat žabí bílkovinu. V 80. letech transgenoze začala pronikat i do šlechtění rostlin a začaly se pěstovat první komerční geneticky modifikované rostliny. První transgenní rostlina byla vytvořena v roce 1983, kdy do tabáku, jako modelového organismu, byl vnesen gen nesoucí rezistenci vůči kanamicinu a v roce 1986 se uskutečnily první polní pokusy s geneticky upravenými plodinami. Čína pak byla první zemí, kde se v roce 1992 začaly pěstovat transgenní rostliny pro komerční použití. V roce 1994 byla pro trh USA schválena první GM odrůda rostlin bylo to rajče s prodlouženou životaschopností. Další GM plodiny, zejména sója, kukuřice, bavlník a řepka, rezistentní ke škůdcům a tolerantní k herbicidům se objevily na trhu v roce V roce 2006 je již plocha zemědělské půdy s GM rostlinami téměř 102 milionů hektarů (Shimizu et al., 2008). Prakticky 99 % z této výměry se nachází pouze v několika zemích: USA (63 %), Argentina (21 %), Kanada (6 %), Brazílie (4 %), Čína (4 %). Nejvíce zastoupené GM rostliny jsou v pořadí sója, kukuřice, bavlna a řepka. Další GM plodiny reprezentují pouhých asi 5 % celkové výměry. Podle předpokladů, se plochy pěstovaných transgenních plodin budou zvyšovat a rozšíří se i do jiných zemí. 9

10 2.2 Legislativa GMO Definice GMO Geneticky modifikovaný organismus je podle zákona č. 346/2005 Sb. definován jako takový organismus (kromě člověka), jehož dědičný materiál byl změněn genetickou modifikací, tj. cílenou změnou dědičného materiálu způsobem, kterého se nedosáhne přirozeně např. křížením, šlechtěním. Tato definice se vztahuje na organismy schopné rozmnožování nebo přenosu dědičného materiálu, tj. mikroorganismy, rostliny, živočichy a buněčné kultury; nevztahuje se na člověka Nakládání s GMO V České republice je nakládání s geneticky modifikovanými organismy upraveno zákonem Ministerstva životního prostředí č. 346/2005 Sb. o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a produkty a prováděcí vyhláškou č. 209/2004 Sb. o bližších podmínkách nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty. Datum účinnosti tohoto zákona je od a nahrazuje zákon 78/2004 Sb. Tímto zákonem a vyhláškou byly do české legislativy převedeny evropské směrnice 2001/18/EC a 98/81/EC. Zákon se týká nakládání s geneticky modifikovanými organismy, které si zachovaly schopnost reprodukce a nakládání s produkty, které tyto životaschopné organismy obsahují (nevztahuje se tedy na potraviny vyrobené ze sójové mouky nebo řepkového oleje, krmiva obsahující kukuřičný šrot a jiné výrobky, které životaschopné organismy neobsahují). Cílem je stanovit povinnosti fyzických a právnických osob tak, aby byla zajištěna ochrana zdraví člověka a zvířat, životního prostředí a biologické rozmanitosti. Dále zákon stanoví postup udělování oprávnění k nakládání s geneticky modifikovanými organismy a produkty, systém kontroly nad dodržováním zákona a systém evidence uživatelů i geneticky modifikovaných organismů a produktů. Vzhledem k tomu, že oblast genetických modifikací se rozvíjí velmi rychlým tempem a dosud nejsou známy všechny potenciální dlouhodobé účinky geneticky modifikovaných organismů, vychází zákon z principu předběžné opatrnosti a obsahuje ustanovení umožňující v případě 10

11 potřeby rozhodnutím správního úřadu pozastavit nebo ukončit nakládání s geneticky modifikovaným organismem. Vydávání správních rozhodnutí v oblasti nakládání s geneticky modifikovanými organismy je podle zákona v působnosti Ministerstva životního prostředí, které při rozhodování přihlíží ke stanoviskům Ministerstva zdravotnictví, Ministerstva zemědělství a České komise pro nakládání s geneticky modifikovanými organismy a produkty. V České republice platí kromě našich zákonů i další přímo aplikovatelné předpisy EU týkající se GMO. Jedná se o tři nařízení Evropského parlamentu a Rady: nařízení č. 1829/2003 o geneticky modifikovaných potravinách a krmivech nařízení Evropského parlamentu a Rady č. 1830/2003 o sledovatelnosti a označování GMO a sledovatelnosti potravin a krmiv vyrobených z GMO a o změně směrnice 2001/18/ES nařízení Evropského parlamentu a Rady č. 1946/2003 o pohybech geneticky modifikovaných organismů přes hranice, které přejímá Cartagenský protokol o biologické bezpečnosti Podle právních předpisů se rozlišují 3 způsoby nakládání s GMO: uzavřené nakládání s GMO uvádění GMO do životního prostředí uvádění GMO a produktů do oběhu (úplné informace o výše uvedených způsobech nakládání s GMO jsou uvedeny v zákonu č.78/2004) Značení potravin vyrobených z GMO Česká republika Značení potravin připravených z geneticky modifikovaných organismů je dáno zákonem č.110/1997 Sb. o potravinách a tabákových výrobcích, který byl novelizován 11

12 zákonem č. 306/2000 Sb. a je platný od roku Podle zákona se povinně označují všechny potraviny obsahující GMO nebo z nich vyrobené, pokud u nich lze vysledovat obsah materiálu pocházejícího z GMO vyšší než 0,9 %. Povinnost označování se týká i výrobků jako je olej, kde není přítomna DNA, a tudíž nelze prokázat genetickou modifikaci. Proto současně platí i pravidla o dohledatelnosti původu zboží. Na obalu výrobku musí být uvedeno označení: geneticky modifikováno nebo obsahuje geneticky modifikovaný organismus. Tato informace musí být uvedena i u nebalených výrobků např. u chleba a pečiva. Živočišné produkty pocházející od zvířat krmených GM krmivy (maso, mléko, vejce, ) být označeny nemusí. Ve světě V některých státech světa se označování výrobků připravených z GMO nevyžaduje, je pouze dobrovolné. Patří mezi ně hlavně státy USA a Kanada, které jsou největšími producenty geneticky modifikovaných plodin v zemědělství. Ve státech Korea a Japonsko je označování povinné, a to v případě, že plodina nebo potravina obsahuje více jak 3 % (Korea) a 5 % (Japonsko) geneticky modifikovaného materiálu (Zhang et al., 2008). V zemích Evropské Unie (EU) se GMO a výrobky z GMO musí označovat podle evropského nařízení od roku Toto nařízení stanovuje povinnost označování produktů, které obsahují více než 0,9 % geneticky upraveného materiálu. Příslušné správní předpisy jsou velice přísné a vyžadují možnost dohledání původu potraviny nebo krmiva od zemědělce až ke spotřebiteli Testování a bezpečnost Všechny geneticky modifikované organismy, které se pěstují v zemědělství i ty, které se uvádí do oběhu, musí být schváleny složitým a velmi náročným systémem schvalování shodným v celé EU. Jsou podrobovány důkladné kontrole rizika zdraví lidí a zvířat, rizika pro zemědělskou výrobu a také rizika týkajícího se životního prostředí. Protože se do organismu vkládá nový gen, testuje se např. stabilita tohoto genu, toxicita proteinu, který vznikl jeho expresí nebo také alergenicita a jiné vlastnosti. V současné době je síť laboratoří, zkoumající geneticky modifikované organismy, tvořena více jak 45 kontrolními laboratořemi členských států EU, z toho pět laboratoří zabývajících se GMO je v ČR. 12

13 Podle zákonů všech členských zemí EU je předpokladem pro schválení GM potraviny stejná bezpečnost, výživová hodnota a zdravotní nezávadnost jako je u srovnatelného konvenčního výrobku. Dále musí být GM odrůda shodná s příslušnou konvenční odrůdou ve všech podstatných znacích s výjimkou dané genetické modifikace (Ondřej a Drobník, 2002). Testování je velice důkladné a často daleko podrobnější než u konvenčních odrůd, a proto se dá říci, že GMO jsou nejvíce kontrolované organismy používané v zemědělství, a jejich schválení lze považovat za zcela důvěryhodné Stav GM zemědělských plodin Česká republika V České republice se většina GMO smí používat pouze pro laboratorní účely nebo při pokusném pěstování. V současné době jsou pro polní pokusy povoleny dvě modifikace kukuřice, řepka olejka, brambory, len a slivoň. Komerčně se nyní v ČR pěstuje pouze jedna GM plodina kukuřice MON810 (v roce 2007 činila plocha osetá touto kukuřicí v ČR ha). Pro použití v potravinách a krmivech je povolen pouze jeden GMO, a to je geneticky modifikovaná sója (tzv. Roundup Ready sója firmy Monsanto). Ta se však v České republice nesmí pěstovat a dováží se proto jako surovina nebo ve formě polotovarů z jiných zemí (Doubková, 2003 a 2008). Ve světě Ve světě je pěstování GM plodin povoleno. Plocha, na které jsou tyto plodiny pěstovány, celosvětově vzrůstá. V roce 2006 byla sečtena na 102 milionů hektarů v 16 zemích (Shimizu et al., 2008). V největší míře se pěstuje sója, odolná vůči herbicidu. Plocha (k roku 2007) dosahuje až 58,6 milionů hektarů a představuje tak 51 % z celkové výměry plochy pro pěstování sóji (Zhang et al., 2008), (její pěstování v Evropě není povoleno). Dalšími povolenými plodinami jsou kukuřice, bavlna a řepka (Demerová a Ovesná, 2008). V zemích Evropské Unie je pro komerční pěstování povolena jediná GM plodina a tou je kukuřice MON 810 (Bt-kukuřice), odolná proti hmyzím škůdcům zavíječe kukuřičného. Další povolené GM plodiny pro pokusné pěstování, dovoz a zpracování jsou řepka olejka, tolerantní k herbicidu a dvě modifikace kukuřice s tolerancí vůči herbicidu a s odolností proti škůdci zavíječe kukuřičného (tyto plodiny se do ČR nedovážejí), (Demerová a Ovesná, 2008). 13

14 Další informace, znění uvedených zákonů a jiné věci týkající se legislativní stránky používání GMO v zemědělství lze najít na oficiálních internetových stránkách Ministerstva životního prostředí, Genetická modifikace Genetickou modifikací se rozumí cílená změna genetické informace organismu tak, aby došlo ke změně fenotypového projevu. Získání nových vlastností je uskutečňováno vnesením jednoho, nebo více genů, s využitím metod genového inženýrství. Základem těchto metod je příprava rekombinantní DNA a její přenos do organismu. Aby se mohla upravovat genetická informace in vitro, jsou k tomu zapotřebí nástroje na izolaci DNA, její stříhání na specifické sekvence a také spojování jednotlivých úseků navzájem. Takovými nástroji jsou zejména restrikční endonukleázy, potřebné ke specifickému štěpení a DNA ligázy na spojování. Jako přenašeč genů slouží DNA vektor. Vznik transgenního organismu, tedy organismu, do kterého byl vnesen cizorodý gen, se skládá z několika kroků. Nejdříve se musí požadovaný gen izolovat z dárcovského organismu, dále se připraví rekombinantní molekula DNA, která se následně přenese do genomu organismu. Kromě organismů, které ve svém genomu obsahují cizí gen, se mezi geneticky modifikované organismy řadí i ty organismy, u kterých byl určitý gen eliminován. Nežádoucí vlastnost může být zcela odstraněna vyřazením genu z funkce ( knock-out ) nebo pouze omezena ( knock-down ) Tvorba geneticky modifikovaných rostlin Za vznikem transgenní rostliny, stejně jako u ostatních geneticky modifikovaných organismů stojí biotechnologické úpravy, jejichž postup je následující: izolace genu (sekvence DNA) z organismu příprava rekombinantní DNA klonování rekombinantní DNA v buňce bakterie přenos cizorodého genu do genomu rostliny 14

15 Izolace genu Gen s požadovanou vlastností se získává z nukleových kyselin (DNA, RNA) restrikčním štěpením, zpětnou syntézou cdna podle předlohy mrna anebo programovanou chemickou syntézou DNA. Při enzymatickém štěpení se využívá restrikčních enzymů třídy III, které štěpí DNA v místě rozpoznání určitého pořadí nukleotidů. Příprava rekombinované DNA Izolovaný gen je malá část makromolekuly a vkládá se proto do DNA vektoru. DNA vektor slouží jako nosič při přenosu cizorodých genů do organismu nebo k vytváření kopií genů. K těmto účelům se většinou využívají plazmidy bakterií. Jsou to zejména Ti-plazmid (plazmid infekce) a R-plazmid (plazmid rezistence). Rekombinantní DNA vzniká enzymatickým spojením genu a DNA vektoru. Spojení je uskutečněno pomocí DNA linkerů nebo homopolymerních konců DNA. Přenos cizorodého genu do genomu rostliny Přenos cizorodého genu do genomu rostliny je uskutečňován dvěma základními mechanismy. Jde o mechanismus biologický, který je zprostředkován agrobaktériemi a způsob mechanický, kdy se jedná o přímou genetickou transformaci, a bakterie využívány nejsou. Biologický způsob přenosu Mnoho transgenních rostlin přijímá cizí DNA přirozenou cestou prostřednictvím Agrobacterium tumefaciens. Je to půdní bakterie, která napadá poraněné rostliny a včleňuje do nich svoji genetickou informaci. Tato schopnost je dána transformační deoxyribonukleovou kyselinou (T-DNA). T-DNA je malý úsek Ti-plazmidu (tumor indukující plazmid) a nese geny pro syntézu hormonů a opinů. Při vstupu bakterie do místa poranění se T-DNA integruje do genomu rostlinné buňky. Rostlina začne syntetizovat hormony, které způsobí vznik nádoru a neobvyklé aminokyseliny opiny, které slouží jako zdroj dusíku a uhlíku pro výživu bakterií. Tato skutečnost, že T-DNA má schopnost včleňovat se do cizího genomu a v jeho rámci se replikovat a exprimovat, se využívá ke konstrukci vektorů, které se pak využívají na 15

16 přenos žádoucích genů při T-DNA transformaci. Původní geny T-DNA zodpovědné za tvorbu nádoru jsou nahrazeny novými geny s požadovanou vlastností. Společně s těmito geny jsou ke kódujícím oblastem připojovány i regulační části na jejich expresi. Regulační části musí být ekvivalentní k recipientní rostlinné buňce. Genetická transformace pomocí T-DNA se převážně používá na tvorbu transgenních dvouděložných, v menším rozsahu pak u jednoděložných rostlin. Přenos požadovaného genu se může uskutečňovat ve formě integrovaného nebo dvojitého (binárního) vektoru. Oba typy vektorů jsou odvozené od Ti-plazmidu. K infekci rostlin agrobakteriemi dochází přirozeně buď ponořováním kvetoucí rostliny do suspenze bakterií, nebo infekcí rostlinných explantátů na umělých živných médiích. Integrovaný vektor vzniká rekombinací dvou plazmidů. První plazmid pochází z Escherichia coli a obsahuje vložený úsek T-DNA s požadovaným genem. Druhým plazmidem je Ti-plazmid, který již neobsahuje geny pro hormony způsobující nádor. Plazmid z E.coli je konjugací přenesen do kmene Agrobacterium tumefaciens, kde se T-DNA začlení homologickou rekombinací do Ti-plazmidu. Vznikne tak vektor Ti-plazmidu, který obsahuje jak vir geny tak T-DNA. Po infekci rostliny se pak T-DNA s cizorodým genem inkorporuje do genomu rostliny. Protože bylo zjištěno, že vir geny a T-DNA nemusí být společně na jednom plazmidu, používá se i systém binárního vektoru, kdy jeden plazmid obsahuje geny virulence a druhý má v sobě začleněnu sekvenci T-DNA s cizím genem. Upravený plazmid E.coli je konjugací vložen do bakterie A. tumefaciens, která obsahuje plazmid s vir genem. Po infekci rostliny agrobakterií je T-DNA s cizorodým genem včleněna do jejího chromozómu pomocí virulence Ti-plazmidu. Mechanický způsob přenosu Mezi nejvíce účinný a relativně jednoduchý způsob mechanického (fyzikálního) přenosu DNA patří biolistická metoda. Ostatní metody jako jsou elektroporace, mikroinjekce (přímý přenos DNA do protoplastů) a lipozomální zprostředkovaná transformace se používají méně často. Biolistická metoda je nejvýznamnější u jednoděložných rostlin. Požadovaná DNA sekvence se nejprve vysráží na povrchu mikroskopických částeček kovu (nejčastěji se 16

17 používá zlato a wolfram). Tyto tzv. mikroprojektily jsou pak vstřelovány do rostlinné tkáně prostřednictvím různých vysokotlakých zařízení. V určitém procentu případů je zasaženo jádro a ve zlomku těchto zásahů se během oprav poškození, které bylo způsobeno kovovým mikroprojektilem, cizorodá DNA spojí s rostlinným genomem (Wilm, 2008, Ondřej a Drobník, 2002, URL 3). 2.4 Praktické využití GMO v zemědělství Důvodů, proč se organismy geneticky upravují je mnoho. Jeden z nich je praktické využití GM plodin v zemědělství. GM rostliny se dají rozdělit do tří základních skupin (generací). Do první generace se řadí odrůdy výhodné z hlediska jejich zemědělské produkce. Patří k nim odrůdy odolné vůči virovým chorobám, škůdcům a některým herbicidům. Nejznámější GM rostliny odolné k hmyzím škůdcům jsou tzv. Bt-plodiny. Bt-plodiny obsahují gen pro syntézu cry-proteinu z bakterie Bacillus thuringiensis. Cry-protein je toxický pro některé skupiny hmyzu. Protože se mění v toxickou látku pouze v trávicím traktu hmyzu, který má zásaditý charakter, pro člověka a jiné živočichy je neškodný. K herbicid tolerantním rostlinám patří plodiny třídy Roundup Ready, kdy k nejrozšířenějším patří sója, bavlník kukuřice a řepka (podstata bude vysvětlena níže viz Roundup Ready sója). První generace GM plodin je užitečná především pro pěstitele. Snižuje nároky na používání chemického ošetření, což prospívá životnímu prostředí a lepší vlastnosti modifikovaných plodin umožňují jejich lepší skladování a delší životnost. Transgenní rostliny s lepší nutriční hodnotou (více vitamínů, jiné složení proteinů) patří do generace druhé. Tyto plodiny přináší výhody hlavně pro konzumenty a jsou nadějí pro rozvojové země. Příkladem je zlatá rýže, která obsahuje gen pro beta-karoten, který je prekurzorem vitamínu A. Tato odrůda rýže se pěstuje především v oblastech Jihovýchodní Asie, kde lidé trpí nedostatkem tohoto vitamínu. Upravovány jsou také další plodiny, jako je řepka olejná s výsledným vyšším obsahem vitamínů A a E, nebo rýže se zvýšeným zastoupením železa, které pomáhají zlepšovat kvalitu výživy. Třetí generace má uplatnění ve farmacii a zdravotnictví. GM rostlina v těchto odvětvích slouží jako bioreaktor k produkci jedlých vakcín, protilátek, léčiv, enzymů a jiných využívaných látek. 17

18 Další užitečnou vlastností může být odolnost vůči nepříznivému klimatu, což umožňuje rozšíření polního hospodářství do všech klimatických pásem (Doubková a Ovesná, 2005). 2.5 Genetické modifikace sóji Genetických modifikací sóji se využívá především k získání tolerance k totálním (nespecifickým) herbicidům. Nejznámější z takto upravených sójí je Roundup Ready sója. Dále je sója modifikována za účelem vyššího obsahu kyseliny olejové, což vede ke zlepšení kvality sojového oleje. Genetickou modifikací se také získává lepší nutriční hodnota, nebo rezistence k hmyzím škůdcům a háďátkům (Bečka a Jozefyová, 2005) Roundup Ready sója Roundup Ready sója (RR sója) je geneticky upravená odrůda sóji (konkrétně jde o sóju linie GTS ), která je odolná vůči stejnojmennému herbicidu Roundup (Rott et al., 2004). Tento totální herbicid od firmy Monsato obsahuje účinnou složku glyfosát (N-fosfonometylglycin), který působí jako inhibitor vlastního rostlinného enzymu 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfát syntázy (EPSPS). Tento enzym katalyzuje předposlední krok syntézy šikimátu a je tudíž zodpovědný za biosyntézu aromatických aminokyselin (tryptofan, fenylalanin a tyrozin). Jeho blokace vede k narušení syntézy těchto aminokyselin a v důsledku jejich nedostatku dochází k redukci růstu rostliny, která následně umírá. Enzym EPSPS obsahují pouze rostliny, bakterie a některé houby, nikoliv živočichové. Ti si aromatické aminokyseliny syntetizovat nedokážou a přijímají je z potravy (Ondřej a Drobník, 2002, URL 2). Podstata tolerance je následující. RR sója má ve svém genomu vložen cizí gen z bakterie Agrobacterium tumefaciens rodu CP-4. V důsledku dlouhodobého systematického vystavení herbicidu Roundup je bakterie vůči tomuto herbicidu odolná. Gen, který se včleňuje do genetické informace sóji, produkuje enzym CP4-EPSPS, který je velice podobný rostlinnému enzymu EPSPS. Enzym z bakterie má však odlišnou strukturu, která způsobuje, že glyfosátem blokován není. Vnesený gen je bakteriální obdobou vlastního rostlinného genu. 18

19 Obr. 1 Odlišná struktura rostlinného a bakteriálního enzymu. a) běžně fungující rostlinný enzym EPSPS (syntéza aminokyselin probíhá), b) blokace enzymu EPSPS glyfosátem G (syntéza aminokyselin je zastavena), c) bakteriální enzym CP4-EPSPS (mutantní varianta EPSPS), funkce enzymu je zachovaná a probíhá syntéza aminokyselin Společně s genem se do genetické informace vkládají také regulační sekvence, které jsou nezbytné pro správnou expresi genu v sóji (Aarts et al, 2002). Do genomu rostliny se tedy včleňuje celá transkripční jednotka (konstrukt), která je znázorněna na obrázku č. 2. Jako promotor slouží CaMV (35S promoter) a transkripci ukončuje NOS terminátor. Další částí konstruktu je gen CTP izolovaný z petúnie (Petunia hybrida), (Hoef et al., 1998). Tento gen tvoří tranzitní peptid (chloroplast transit peptide), (Brod and Arisi, 2008) který má za úkol přenést enzym CP4-EPSPS z cytoplazmy, kde je lokalizován, do chloroplastu, kde probíhá biosyntéza šikimátu. Je tedy zodpovědný za správné fungování enzymu v buňce (Ondřej a Drobník, 2002). 5' 3' rostlinná DNA CaMV CTP CP4-EPSPS NOS rostlinná DNA Obr. 2 Transkripční jednotka (konstrukt) Kód, pomocí něhož je v genu zapsané složení bílkoviny je univerzální, přečtou ho tedy všechny organismy. Regulační sekvence jsou však pro každou skupinu organismů jiné (Drobník, J., 2007 [1] ). Sekvence CaMV a NOS (z půdní bakterie Agrobacterium tumefaciens) patří mezi standardně používané regulační sekvence při transgenozi rostlinných organismů. Gen CTP z petúnie a gen pro enzym CP4-EPSPS jsou charakteristické právě pro tento typ genetické modifikace. Podle primerů, které jsou komplementární k regulačním sekvencím, nebo k vnitřním částem transgenu, se 19

20 zjišťuje, zda je rostlina geneticky modifikovaná a popřípadě o jaký transgen se jedná. Umístění primerů tedy ovlivňuje typ informace, která je pomocí PCR získána (Zdeňková, 2002) Jiné možnosti genetické úpravy sóji Geneticky modifikovaná sója se změněným obsahem mastných kyselin prozatím není tolik rozšířená. Takto upravená sója má až o 60 % vyšší obsah kyseliny olejové a olej z ní vyrobený se vyznačuje delší trvanlivostí. Patří do druhé generace GM rostlin, které mají hlavní využití u spotřebitelů, naopak RR sóju řadíme do první generace a má hlavní význam pro pěstitele. Ve fázi výzkumu je zatím GM sója s transgenem pro methionin, který je prekurzorem pro biosyntézu lysinu a threoninu. Zvýšený obsah těchto zásobních proteinů je však nepatrný. Další studie GM sóji se týkají odolnosti vůči hmyzím škůdcům nebo rezistence k háďátkům (Bečka a Jozefyová, 2005). 2.6 Metody detekce GMO Od roku 1997 platí v EU nařízení, podle kterého se musí označovat produkty vyrobené z geneticky modifikovaných organismů. Pro kontrolu tohoto ustanovení bylo nezbytné zavedení spolehlivých, účinných a přesných metod pro identifikaci a zejména kvantifikaci GMO v potravinářských produktech (Rott et al., 2004). Pro stanovení GM složky v produktu je dnes známá řada postupů. Jsou to především metody založené na stanovení nukleových kyselin s využitím polymerázové řetězové reakce (PCR) a metody stanovující proteiny pomocí imunoenzymatické techniky ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Dalšími využívanými metodami jsou hmotnostní spektrometrie, infračervená spektrometrie, chromatografie nebo DNA čipy (Huang and Pan, 2005). PCR (polymerázová řetězová reakce) Polymerázová řetězová reakce je známá od roku Za objev, dnes už nejpoužívanější techniky v oboru mikrobiologické diagnostiky, dostal v roce 1993 Nobelovu cenu Kary Mullis. Jedná se o cyklickou amplifikaci definované DNA sekvence v podmínkách in vitro. Každý cyklus se skládá ze tří základních kroků: 20

21 1) Oddělení vláken dsdna zahřátím nad teplotu 92 C (denaturace). 2) Hybridizace primerů při teplotě kolem C (annealing). 3) Syntéza komplementárního řetězce DNA polymerázou probíhá při teplotě kolem C (elongace/extenze). Počet cyklů se obvykle pohybuje v rozmezí (tento počet je ovlivněn koncentračními poměry v reakční směsi, životností enzymů a požadovaným výtěžkem). Používané primery jsou syntetické oligonukleotidy (17 30 nukleotidů dlouhé) komplementární ke 3 a 5 koncům cílové DNA sekvence. Reakce je katalyzována termostabilními enzymy (např. Taq polymeráza z bakterie Thermus aquaticus a Pfu polymeráza izolovaná z Pyrococcus furiosus) pro jejichž správnou funkci se do reakční směsi přidává pufr s Mg 2+ ionty. Aby mohla probíhat syntéza cílové sekvence, reakční směs musí obsahovat směs dntp (deoxynukleotidtrifosfát), které slouží jako stavební jednotky. Amplifikace se provádí v tzv. termocykléru, který je schopen velmi rychle měnit teplotu reakčního prostředí (cyklické střídání teplot pro denaturaci, annealing a elongaci). Každá reakce s testovaným vzorkem by měla mít pozitivní, negativní a interní kontrolu probíhající amplifikace. Metody detekce GMO založené na PCR reakci lze obecně rozdělit do čtyř kategorií, z nichž každá má jinou výpovědní hodnotu: Monitorovací (screening) metody jsou zaměřeny na detekci elementů, běžně se vyskytujících u GMO. Mezi tyto elementy patří originální regulační sekvence CaMV (35 S promotor) a NOS. Pomocí této metody lze tedy získat informaci o přítomnosti transgenní DNA v testovaném vzorku. Konstrukt specifické (construct-specific) metody pomocí primerů komplementárních k regulační sekvenci a vnitřnímu genu poskytují informace o typu genetické modifikace, určují tedy vloženou transkripční jednotku. Druhově specifické (event-specific) metody se zaměřují na amplifikaci úseku mezi vloženým konstruktem a vlastní genomovou DNA. Pomocí této metody lze rozlišit druhy transgenních organismů, které obsahují stejný genetický konstrukt. 21

22 Kvantitativní metody slouží k zjištění přesného množství GMO v produktu (viz níže Kvantifikace GMO pomocí PCR), (Aarts et al., 2002). Kromě konvenční PCR má tato metoda různé obměny. Pro stanovení DNA jsou to například multiplex PCR, nested PCR, kvantitativní kompetitivní PCR (QC-PCR) nebo Real-time PCR Multiplex PCR Multiplex PCR umožňuje současně amplifikovat více cílových sekvencí najednou v rámci jedné reakce s použitím většího počtu páru primerů. Jeden pár primerů je většinou komplementární k internímu genu a druhý k transgenu. Pomocí této metody lze kvantitativně detekovat transgenní DNA, kdy se porovnává množství PCR produktu z obou cílových sekvencí (Aarts et al, 2002, Zděňková, 2002) Nested PCR Nested PCR je velice citlivá a přesná metoda umožňující vysokou výtěžnost a rozlišení specifických a nespecifických amplifikačních produktů (Brod et al., 2007). Amplifikace probíhá ve dvou fázích (obrázek č. 3), kdy každá z nich se skládá z reakčních cyklů. V první fázi se amplifikuje izolovaná DNA ze vzorku pomocí vnějších primerů (koncentrace vnějších primerů musí být nízká, aby se v první fázi reakce vyčerpaly a nevznikaly tak v druhé fázi namnožené sekvence o jiné délce). V druhé fázi jako DNA templát slouží amplikon z první fáze a využívá se vnitřních primerů, které jsou specifické k vnitřnímu úseku amplikonu. Amplifikuje se tedy kratší úsek DNA sekvence než ve fázi první. Po skončení reakce se detekce provádí pomocí gelové elektroforézy, kdy se porovnává délka fragmentu PCR produktu se standardním vzorkem (marker molekulové hmotnosti). Protože se druhá fáze reakce uskutečňuje v jiné amplifikační zkumavce, musí se amplikon z první fáze přenášet. Při otevírání zkumavek však hrozí kontaminace vzorku, a proto má nested PCR jinou modifikaci, tzv. Single-tube nested PCR. K této reakci, jak již název napovídá, je využívána pouze jedna amplifikační zkumavka, kdy oddělení druhé dvojce primerů od první fáze reakce je docíleno silnou vrstvou minerálního oleje (Feray et al., 1992). Pro oddělení dvojic primerů se také používá diferenciální annealing, kdy se upraví složení konců vnitřních primerů (převaha G a C nukleotidů), a tím se zvýší teplotní optimum pro annealing ve druhé fázi amplifikace (Erlich et al., 22

23 1991, Yourno 1992). Nested PCR se také využívána v klinické praxi při detekci virů, bakterií a jiných mikroorganismů. Obr. 3 Nested PCR Pomocí PCR lze dokázat přítomnost transgenu v produktu, ale už obtížnější je určit přesnou koncentraci dané DNA sekvence. Nepřesná kvantifikace je způsobena tím, že účinnost amplifikace v jednotlivých amplifikačních cyklech není konstantní. Proto se pro kvantifikaci DNA používají jiné varianty PCR metody (Zděňková, 2002). Kvantifikace GMO pomocí PCR Pro stanovení procentuálního množství GMO v potravinářských produktech jsou k dispozici dvě techniky. Je to kvantitativní kompetitivní PCR (QC-PCR) a PCR v reálném čase (Real-time PCR). QC-PCR je založená na současné amplifikaci cílové molekuly vzorku a vnitřního standardu o známé koncentraci. Množství cílové sekvence je odhadováno srovnáváním intenzit signálu PCR produktu a vnitřního standardu o známé koncentraci na agarózovém gelu. Metoda QC-PCR je poněkud zdlouhavá a není příliš přesná. Real-time PCR je velice přesná, citlivá a specifická metoda, a i přes její vysoké náklady je velice vhodnou a využívanou metodou pro kvantifikaci GMO v potravinách (Aarts et al., 2002). 23

24 2.6.3 Real-time PCR Real-time PCR je metoda, která umožňuje rychlé monitorování namnožené cílové sekvence DNA během celého amplifikačního procesu s použitím fluorescenčních barviv (fluoroforů). K detekci vznikajícího produktu jsou nejčastěji využívány dva systémy (LightCycler System od společnosti Roche a ABI od společnosti Applied Biosystems), založené na stanovení změny intenzity fluorescenčního záření v průběhu amplifikace. LightCycler systém funguje prostřednictvím interkalačního barviva SYBR Green I nebo pomocí hybridizačních prób (TaqMan, Molecular beacon, Scorpion primer) (Aarts et al., 2002). 24

25 SYBR Green I SYBR Green I je fluorescenční kyanidové barvivo, které má schopnost vázat se do malého žlábku dvouřetězcové DNA (dsdna) a emitovat záření. Průběh reakce je patrný na obrázku č. 4. Na počátku amplifikačního cyklu se za vysoké teploty denaturuje dsdna na jednotlivá vlákna. Na jednořetězcovou DNA (ssdna) se barvivo není schopno vázat, a proto je jeho intenzita emitovaného záření velice nízká. Při poklesu teploty se na jednotlivé vlákno připojí primer a dojde k vytvoření krátkého úseku dvouřetězcové DNA. Barvivo se na tento úsek nespecificky naváže a jeho intenzita fluorescence vzroste. V důsledku prodlužování dsdna pomocí DNA polymerázy se na dvouřetězcové vlákno váže větší počet barviva a fluorescenční signál stoupá. Nárůst fluorescence je tedy úměrný množství naamplifikované dsdna. Protože se interkalační barvivo váže na veškerou dsdna ve vzorku, zvýšená fluorescence může pocházet jak ze specificky tak i nespecificky namnožené DNA. Proto na rozlišení specifického PCR produktu slouží disociační analýza. Tato analýza podle disociační křivky (křivka tání) je založena na rozdílné disociační teplotě (teplota tání) specifického a nespecifického PCR produktu. Disociační teplota je teplota, kdy polovina PCR produktu je tvořena dsdna a druhá polovina je již denaturována. Její hodnota závisí na distribuci GC/AT a na délce produktu PCR reakce (Anderson et al., 2006). Obr. 4 SYBR green I (URL 5) 25

26 FRET (fluorescenční rezonanční přenos energie) U Real-time PCR se uplatňuje fluorescenční rezonanční přenos energie (FRET). Tento jev je založen na přenosu energie mezi fluorescenčními barvivy. Fluorescenční barviva jsou navázány na dvě specifické sekvence oligonukleotidu, sloužící jako hybridizační próby. Jedna z nich je označena fluorescenčním barvivem na 3 konci a po excitaci vnějším zdrojem slouží jako donor světla. Druhá je barvivem označena na 5 konci, má funkci akceptoru emitovaného světla a přijaté světlo pak vyzařuje o vyšší vlnové délce. Próby jsou navrženy tak, aby se při nasednutí (hybridizaci) na cílové sekvence dostaly do těsné blízkosti a umožnily tak FRET. Výsledkem je pak nárůst fluorescence. Schéma reakce je znázorněno na obrázku č. 5 (Zdeňková, 2002). Obr. 5 FRET (URL 6) 26

27 TaqMan próba Na principu FRET funguje i hybridizační próba TaqMan. Je to krátký úsek oligonukleotidu, který je komplementární k vnitřní části cílové DNA sekvence. Na nukleovou kyselinu se tedy váže specificky. TagMan próba obsahuje na 5 konci fluorofor-zářič (reporter) a na 3 konci má zhášeč (quencher). V důsledku jejich bezprostřední blízkosti je záření emitované zářičem potlačováno zhášečem. Po denaturaci nukleové kyseliny dochází k navázání primeru a TagMan próby na jednořetězcové vlákno DNA. Během elongace, kdy pomocí Taq DNA polymerázy dochází k syntéze komplementárního řetězce, je próba rozštěpena (hydrolyzována). Hydrolýza próby je uskutečněna na základě silné 5 3 exonukleázové aktivitě, kterou Taq DNA polymeráza vykazuje. Zářič se z próby uvolní a vzdálí se od zhášeče. Výsledkem oddělení těchto molekul se zamezí efektu zhášení a dochází k nárůstu fluorescenčního signálu. Průběh reakce je patrný na obrázku č. 6. TaqMan próba může být využívána jak ABI systémem, tak i v LightCycler sytému (Vaïtilingom et al., 1999, Aarts et al., 2002, Singh). Obr. 6 TaqMan próba (URL 7) 27

28 Molekulární maják (molecular beacon) Další hybridizační próbou využívanou při Real-time PCR je molekulární maják s vlásenkovou strukturou. Tato próba se od ostatních liší v tom, že obsahuje obrácené koncové repetice, které jsou zodpovědné za její charakteristickou sekundární strukturu. Na jednom konci (5 konec), stejně jako TaqMan próba, je označena fluoroforem a na druhém konci (3 konec) má quencher. Vnitřní sekvence smyčky je komplementární k cílové oblasti DNA. Jestliže je próba volně v roztoku, udržuje si tvar vlásenky se smyčkou, a v důsledku těsné blízkosti fluoroforu a quencheru nevykazuje fluorescenci. Jakmile se próba naváže na cílovou sekvenci DNA, dojde ke změně konformace molekuly a na základě oddálení fluoroforu a quencheru vzroste její fluorescence (princip FRET). Reakce je znázorněna na obrázku č. 7. Podobnou strukturu a funkci jako molekulární maják má škorpion primer (scorpion primer) (Andersen et al., 2006, Aarts et al., 2002). Obr. 7 Molecular beacon (URL 8) 28

29 3 MATERIÁL A METODIKA 3.1 Vzorky Obsah geneticky modifikované složky byl stanovován v potravinářských výrobcích na bázi sóji. Konkrétně byla analyzována sójová masa nebo výrobky ze sojové mouky od různých výrobců (dodavatelů). Vzorky potravin byly vyšetřovány se zaměřením na specifický druh GMO, Roundup Ready sóju (RR sója). 3.2 Izolace Prvním krokem analýzy potravinářských výrobků ze sóje byla izolace DNA. Pro izolaci DNA byl použit komerční kit UltraClean TM Plant DNA Isolation Kit (MO BIO), (kat. č ). Kit obsahuje roztoky P1-P5, mikrozkumavky (2 ml), kolonky v 2 ml mikrozkumavkách, mikrozkumavky s rozbíjecími částicemi (2 ml). K izolaci byla potřeba mikrocentrifuga (10,000 x g), vortex, pipety se sterilními špičkami a třecí miska. Postup izolace DNA: 1. Třecí misku vypláchneme v kyselině chlorovodíkové (HCl), důkladně opláchneme vodou, vysušíme a sójové kostky (2 3) na jemno rozdrtíme. 2. Do mikrozkumavky s rozbíjecími částicemi dáme 250 mg rozdrceného sójového masa a přidáme 1 ml pufru TD1. 3. Přidáme 100 µl roztoku P1 (jestliže je roztok P1 sražený, zahřejeme jej, aby se rozpustil) a vortexujeme asi 15 sekund. Roztok P1 obsahuje SDS. 4. Inkubujeme při 65 C 30 min. 5. Uzavřené mikrozkumavky vortexujeme (v horizontální poloze) na maximální rychlost 10 min (použijeme MO BIO Vortex Adapter Tube Holder). 6. Centrifugujeme 30 sekund při 10,000 x g, aby se odstranily nechtěné drobky. 7. Přeneseme supernatant do čisté mikrozkumavky. 8. Přidáme 300 µl roztoku P2 a vortexujeme asi 5 sekund. Roztok P2 umožňuje srážení proteinů. 9. Inkubujeme v ledové lázni (4 C) 5 min. 29

30 10. Centrifugujeme 1 min při 10,000 x g a poté přeneseme 500 µl supernatantu do čisté mikrozkumavky (dáme pozor, abychom nenabrali sraženou bílkovinu na dně mikrozkumavky, mohla by inhibovat reakci). 11. K odebranému supernatantu přidáme 1 ml roztoku P3 a vortexujeme 5 sekund. Roztok P3 je vysoce koncentrovaný solný roztok a zajišťuje podmínky nutné pro zachycení DNA na filtru v kolonce. 12. Přibližně 650 µl obsahu mikrozkumavky (zbytek nevyhazujeme, bude potřeba!) přeneseme do kolonky a centrifugujeme 30 sekund při 10,000 x g. 13. Přendáme kolonku do nové mikrozkumavky a přidáme zbylý obsah mikrozkumavky. Vortexujeme 30 sekund při 10,000 x g. 14. Přidáme 300 µl roztoku P4 a centrifugujeme 30 sekund při 10,000 x g. Roztok P4 je promývací roztok s obsahem ethanolu, který vyčistí navázanou DNA. 15. Přendáme kolonku do nové mikrozkumavky a znovu centrifugujeme 1 min (k odstranění zbytku roztoku P4). 16. Opatrně vyjmeme kolonku a přeneseme jí do nové mikrozkumavky, aniž bychom se dotkli roztoku P4 na dně původní mikrozkumavky. 17. Přímo do středu membrány uvnitř kolonky přidáme 50 µl roztoku P5 a centrifugujeme 30 sekund. Roztok P5 je eluční pufr. 18. Odstraníme kolonku a DNA v mikrozkumavce je připravena na PCR reakci. Vyizolovaná DNA byla uskladňována ve zmrzlém stavu při -20 C. (V případě použití vzorku následující dny po izolaci, stačí vzorky DNA uschovat v lednici při 4 C.) 3.3 Nested PCR Princip metody Pro detekci geneticky modifikované složky v potravinářském produktu ze sóje byla použita metoda nested PCR. Princip metody je založen na použití dvou párů primerů, které jsou navrženy tak, aby byly komplementární k cílové sekvenci genu z petúnie (CTP). Tento gen se nachází pouze v geneticky upravené sóji Roundup Ready, a proto se k její detekci používají takto navržené primery. V prvním kroku reakce je použit vnější pár primerů, kdy je amplifikován delší fragment DNA a v druhém kroku se amplifikuje kratší fragment DNA pomocí vnitřního páru primerů. Dvoufázové 30

31 provedení reakce zvyšuje její selektivitu a specificitu (Hoef et al., 2002). Pro potvrzení přítomnosti sójové DNA a její schopnosti amplifikace se používá další dvojce primerů. Tyto primery detekují gen pro lektin a slouží jako specifická kontrola čistoty a množství izolované DNA pro uskutečnění PCR (Brod and Arisi, 2007). V rámci metody nested PCR se proto detekuje jednak specifická sekvence konstruktu RR sóji (CTP), ale i přítomnost genu pro lektin. Použité primery: primery pro gen lektin vnější (E001 a E002), vnitřní (E003 a E004) primery pro gen z petúnie vnější (E005 a E006), vnitřní (E007 a E008) E001 GCC GTA GCA ACC AAT CAT C E002 GAA GGA TAT GAT AGA ATT GAC E003 CTC TAC TCC ACC CCC ATC E004 CAT CTG CAG GCC TTT TTG TG E005 TGA TGT GCT ATC TCC ACT GAC G E006 TGT GCT GTT GCC AGA GAT GC E007 CTG ACG TAA GGG TTG ACG CT E008 TAT ATC CCT TGA GGG ATG TTG A Pro obě PCR reakce byl použit následující program chodu termocykléru Touchgene Gradient: 1 cyklus 3 min 94 C 30 cyklů 30 s 94 C 1 cyklus 30 s 94 C 30 s 58 C 30 s 58 C 30 s 58 C 30 s 72 C 30 s 72 C 5 min 72 C Složky reakčních směsí (mastermixů): - voda - 10 Taq Buffer (50 mm KCl, 10 mm Tris-HCl (ph 8,4), 5 mm MgCl 2 ) - 1 µm primery - 0,5 mm dntp - 1U Taq-Purple DNA polymeráza (Top-Bio) 31

32 Pracovní postup: 1. Připravíme reakční směsi pro 1. PCR reakci (pufr, primery a dntp je třeba rozmrazit, polymeráza se přidává poslední, je nejcitlivější). mastermix (sója) lektin mastermix petúnie voda 36 µl voda 36 µl pufr 5 µl pufr 5 µl primer E001 1 µl primer E005 1 µl primer E002 1 µl primer E006 1 µl dntp 1 µl dntp 1 µl polymeráza 1 µl polymeráza 1 µl 2. Do amplifikační zkumavky s mastermixem pro sóju a do amplifikační zkumavky s mastermixem pro petúnii přidáme 5 µl vyizolované DNA. (pro pět vzorků připravíme pětkrát mastermix pro sóju a pětkrát mastermix pro petúnii.) 3. Amplifikační zkumavky krátce vortexujeme a vložíme do předem vyhřátého termocykléru a spustíme program. 4. Po skončení programu termocykléru připravíme reakční směsi pro 2. PCR reakci (pufr, primery a dntp je třeba rozmrazit, polymeráza se přidává poslední). mastermix (sója) lektin mastermix petúnie voda 40 µl voda 40 µl pufr 5 µl pufr 5 µl primer E003 1 µl primer E007 1 µl primer E004 1 µl primer E008 1 µl dntp 1 µl dntp 1 µl polymeráza 1 µl polymeráza 1 µl 5. Do amplifikační zkumavky s mastermixem pro sóju a do amplifikační zkumavky s mastermixem pro petúnii přidáme 1 µl produktu z 1. PCR reakce. 6. Amplifikační zkumavky krátce vortexujeme, vložíme do termocykléru a spustíme program. 32

33 3.4 Gelová elektroforéza Princip metody Analýza PCR produktu z nested PCR reakce se provádí pomocí gelové elektroforézy. Gelová elektroforéza umožňuje separaci nukleových kyselin v elektrickém poli na základě jejich elektrického náboje. Pohyblivost nukleových kyselin v agarózovém gelu je ovlivněna řadou parametrů, z nichž nejdůležitější je tvar (konformace) a velikost molekuly, přičemž větší molekula (více párů bází) se pohybuje pomaleji než molekula o menším počtu párů bází. Pro určení velikostí fragmentů se používají markery molekulové hmotnosti, kdy se srovnává poloha fragmentu DNA s polohami markeru. Výsledný produkt z 2. PCR reakce byl analyzován na 2% agarózovém gelu EliPhore. K vizualizaci DNA fragmentů bylo použito fluorescenční barvivo ethidium bromid. Po skončení elektroforézy byl výsledný obraz nasvícen pod UV transiluminátorem a snímán fotoaparátem. Pracovní postup: 1. Nejdříve připravíme 2% agarózový gel. Do Erlenmeyerovy baňky ze 150 ml TBE pufru (10 ředěný) nasypeme (za stálého míchání) 3 g agarózy. 2. Roztok necháme za občasného míchání rozvařit v mikrovlnné troubě (roztok musí být čirý a bez bublinek). 3. Rozvařenou agarózu necháme zchladnout (cca na 60 C) a přidáme 8 µl ethidium bromidu, zamícháme. (ethidium bromid je silný mutagen a potencionální karcinogen, proto se veškerá práce s touto látkou provádí s rukavicemi v digestoři.) 4. Roztok nalijeme do předem připravené formy, vložíme hřebínek a necháme ztuhnout přibližně 15 min. 5. Ze ztuhnutého gelu opatrně vyjmeme hřebínek a gel vložíme do elektroforetické vany, kterou po rysku doplníme TBE pufrem (10 ředěný). 6. Pomocí hydrofóbního papírku smícháme 20 µl PCR produktu s malou kapkou nanášecího pufru a vzorky naneseme do jamek. Do první jamky naneseme 20 µl molekulového markeru (nanášecí pufr je obarvený roztok sacharózy, který zabrání vylití vzorku z jamky a umožňuje sledovat průběh elektroforézy). 33

34 7. Elektroforetickou vanu zapojíme do zdroje napětí (80 V) a necháme probíhat elektroforézu po dobu 1 hod. 8. Gel nasvítíme pod UV transiluminátorem a vyfotografujeme. 34

35 4 VÝSLEDKY 4.1 Vyhodnocení agarózového gelu Výsledek gelové elektroforézy je znázorněn na obrázku č. 8. Agarózový gel obsahuje celkem 11 drah se vzorky. Každý z pěti vyšetřovaných vzorků byl testován na přítomnost genu pro lektin (dráhy S1 až S5) a na přítomnost genu z petúnie (dráhy P1 až P5). Na první dráze z leva je nanesen referenční vzorek M (marker molekulové hmotnosti). Viditelné proužky v drahách S1 až S5 dokazují přítomnost genu pro lektin. Gen z petúnie je zřejmý pouze u jednoho vzorku, a to v dráze P2. Pozitivní výsledek z reakce specifické pro gen, jehož expresí vzniká lektin, na dráze S2 a zároveň pozitivní výsledek z reakce specifické pro gen z petúnie na dráze P2 prokazují přítomnost GMO v testovaném vzorku č. 2. Obr. 8 Výsledek elektroforézy na agarózovém gelu z nested PCR M: referenční vzorek (marker molekulové hmotnosti, bp), S: PCR produkt reakce specifické pro gen lektinu, P: PCR produkt reakce specifické pro gen z petúnie, 1 5: čísla vzorků. Na přítomnost RR sóji bylo vyšetřeno dohromady pět vzorků. Z pěti analyzovaných vzorků, nebyla přítomnost GMO prokázána ve čtyřech z nich, a to ve vzorcích č. 1, 3, 4 a 5. Jako vzorek č. 2, který reprezentuje jediný pozitivní vzorek, byla testována potravina (sójové kostky) od výrobce Nový věk, s. r. o. 35

36 Informace z DNA analýzy a další informace týkající se testovaných vzorků jsou uvedeny v tabulce výsledků. Číslo vzorku Název výrobku Výrobce/dodavatel/ prodávající Země původu Gen pro lektin Gen z petúnie GMO Značení na obalu BonaVita Big steak 1 PRAGOSOJA, spol. s r. o. CZ neuvedeno Sójové kostky 2 Nový věk, s. r. o. NL GMO free Sójové kostky 3 EKOPRODUKT, spol. s r. o. NL GMO free Sójový granulát 4 Alfabio Slovakia, s. r. o. SK GMO free Sójová mouka hrubá 5 Natural CZ neuvedeno Tabulka výsledků DNA analýzy a údajů uvedených na obalu CZ: Česká republika, SK: Slovensko, NL: Nizozemsko 36