Refraktometrické detektory Detektory jsou tří typů: Deflekční Fresnelova typu Interferenční Obecně platí, že signál S je úměrný koncentraci analytu c

Transkript

1 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie - Detektory - II Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

2 Refraktometrické detektory Detektory jsou tří typů: Deflekční Fresnelova typu Interferenční Obecně platí, že signál S je úměrný koncentraci analytu c rozpuštěného v mobilní fázi a rozdílů indexů lomu solventu N 1 a analytu N 2 : S ~ c * (N 1 N 2 ) Deflekční (výchylkový) detektor Záření ze zdroje je kolimováno čočkou a dopadá na detekční celu, která je složena z referenční a měrné části jenž jsou odděleny diagonální skleněnou přepážkou Při změně složení kapaliny v měrné cele dojde ke změně úhlu vychýlení světelného paprsku, který detekční celou prochází Podle vychýlení paprsku dopadajícího na fotonásobič je produkován odpovídající elektrický signál

3

4 Fresnelův detektor Založen na Fresnelově zákonu, podle kterého je frakce odraženého světla na rozhraní sklo-kapalina úměrná úhlu dopadu světla a indexu lomu kapaliny Světlo zdroje je kolimováno čočkou a fokusováno na referenční a měrné rozhraní hranol-kapalina. Světlo se odráží na rozhraní skrz kapalinu do cely, a potom se odráží zpět od povrchu za celou. Nakonec projde přes rozhraní kapalinahranol do detekčního systému Pokud je v měrné i referentní cele stejná kapalina, je množství odraženého světla v obou celách stejné a na duální detektor dopadá stejné množství záření Jestliže je v měrné cele kapalina odlišného složení než v referenční cele, výsledná množství světla dopadajícího na duální detektor se různí

5

6 Interferometrický detektor Záření určité vlnové délky (často 546 nm) je rozděleno do dvou svazků stejné intenzity Svazky jsou fokusovány do referenční a měrné cely a pak fokusovány do druhého děliče svazku, kde dojde ke konstruktivní interferenci (záření jsou ve fázi) v případě stejných kapalin v obou celách nebo destruktivní interferenci (záření jsou fázově posunuta), pokud jsou kapaliny v celách různé Intereferometrický detektor je nejcitlivější ze všech RI detektorů

7

8 Výhody refraktometrických detektorů: Univerzálnost, široké aplikační možnosti Linearita 10 4 Nevýhody: Citlivost ~ 10 3 x nižší než fotometrické detektory, není vhodný pro stopovou analýzu Citlivost na stabilitu tlaku a průtoku Nekompatibilní s gradientovým uspořádáním

9 Evaporative light scattering detector (ELSD) (Odpařovací rozptylový detektor) Poměrně jednoduchá konstrukce, vlastnosti univerzálního detektoru Detekce analytů méně těkavých než mobilní fáze Vhodný pro látky nemající chromofor (nelze detekovat fotometricky): sacharidy, tuky, polymery, nederivatizované aminokyseliny a mastné kyseliny, detergenty apod. Detektor je vhodný i pro gradientovou separaci Odezva detektoru je jen málo ovlivňována změnou vnější teploty V praxi jsou používány dva typy ELSD: Typ A Vhodný pro detekci netěkavých látek dělených chromatografií na reverzních fázích s použitím nevodných, nejlépe těkavých organických rozpouštědel nebo na normálních fázích. Průtok mobilní fáze do 1,5 ml/min Typ B Ideální pro detekci středně těkavých solutů ve vodné mobilní fázi. Průtoky jsou akceptovatelné do 1.5 ml/min

10

11

12 Corona Charged Aerosol Detector (CAD) Mobilní fáze je za kolonou nebulizována dusíkem a za laboratorní teploty tak dochází k odpaření těkavé mobilní fáze, méně těkavý analyt tvoří aerosol Současně je sekundární proud dusíku podroben ioniozaci v blízkosti platinové jehly na vysokém potenciálu Analyt se v protiproudném uspořádání setkává s pozitivně nabitým proudem dusíku a náboj je přenášen na analyt Následně jsou v iontové pasti odstraněny zbývající ionty dusíku V posledním stupni detektoru je náboj nesený analytem předán na kolektor, kde je měřen elektrometrem, velikost výsledného signálu je závislá na množství analytu

13

14

15 Odezva detektoru je jen málo závislá na struktuře látek Platí, že odezva je zhruba závislá jen na absolutním množství analytu

16 Citlivost detektoru je většinou lepší než pro ELSD

17 Rozsah detektoru je poměrně široký, od jednotek nanogramů po desítky mikrogramů

18 Nelineární kvadratická odezva v rozsahu 4 řádů 4.E+06 4.E+06 3.E+06 Peak Height 3.E+06 2.E+06 2.E E E E Mass Injected (ng) 4-HPAC Chlorogenic acid Gallic acid Gentisic acid Protocatechuic acid

19

20 Přednosti CAD Univerzálnost Široká použitelnost Vysoká citlivost Velký dynamický rozsah (ale nelineární odezva) Dobrá reprodukovatelnost odezvy

21 Elektrochemické detektory Řada funkčních skupin separovaných látek podléhá za vhodných podmínek oxidaci nebo redukci Důležitou vlastností je půlvlnový potenciál látky Platí pravidlo, že látky obtížně oxidovatelné nebo redukovatelné chemicky jsou také obtížně oxidovatelné/redukovatelné elektrochemicky V HPLC se užívá jak elektrochemické oxidace tak redukce. Snadnější je využití oxidačních dějů, protože v případě redukce je detekce znesnadňována vysokým signálem (proudem) pozadí, který je vyvolán redukcí rozpuštěného kyslíku v mobilní fázi na vodu. Mobilní fáze musí být tedy velmi pečlivě odplyněna, pokud je detekce založena na redukčním ději na katodě (také nečistoty-kovové ionty, zvyšují pozadí) Princip detektoru je založen na aplikaci konstantního napětí mezi pracovní a referentní elektrodu. Pokud je napětí vyšší než půlvlnový potenciál dané látky, dojde k redoxnímu ději, který je doprovázen zvýšeným průchodem proudu, jenž je registrován Obvykle se používá tříelektrodové zapojení, kdy třetí - pomocná elektroda zabezpečuje konstantní stabilní napětí mezi pracovní a referentní elektrodou

22 Pro detekci se využívá selektivity dané příslušným půlvlnovým potenciálem registrované látky. Běžně se tedy pracuje při jenom vhodně zvoleném napětí Detekční limity bývají až o 4 řády lepší než s užitím spektrofotometrické detekce Selektivita detekce často umožňuje měření i ve složitých směsích a komplikovaných matricích Vybrané látky stanovitelné elektochemickým detektorem Oxidace Redukce Amidy Olefiny Aminy Estery Fenoly Ketony Chinoliny Aldehydy Katecholaminy Ethery Thioly Diazo- látky Peroxidy Nitro- látky

23 Detekce je pochopitelně omezena na vodivé mobilní fáze Pracovní elektroda je zhotovena z různých materiálů: skelný, porézní, pyrolytický uhlík, kovy: platina, zlato, stříbro, amalgám zlata, slitiny kovů apod. Volba materiálu elektrody je závislá na řadě faktorů, jako jsou: použitelný rozsah napětí, účast elektrody na redoxním ději, kinetika procesu přenosu elektronů atd. Uhlíkové elektrody jsou obyčejně jen inertním zdrojem elektronů, kovové elektrody se ovšem účastní redoxních dějů přímo a dochází tak k jejich přeměně. Elektroda je tak postupně znehodnocována, jedním z možných postupů omezujících uvedený negativní jev je aplikace pulzní amperometrické detekce (PAD) Uhlíkové elektrody jsou spíše pro obecné použití, kovové elektrody pro cílené vybrané analyty, kde většinou umožňují dosažení lepší meze detekce než obecně použitelné elektrody uhlíkové

24 Referentní elektroda byla v minulosti nejčastěji argentchloridová: stříbro/chlorid stříbrný nebo kalomelová: rtuť/chlorid rtuťný V současnosti se prosazuje palladiová referentní elektroda (na bázi poločlánku vodík/palladium) Posledně jmenovaná elektroda je velmi malá, umístitelná do těsné blízkosti pracovní elektrody, je tlakově odolná, nevyžaduje údržbu a její potenciál je za daných podmínek velmi stabilní. Potenciál elektrody ovšem závisí na ph. Protože řada látek má redoxní potenciály podobně závislé na ph, je tato vlastnost referentní elektrody výhodná Lze aplikovat gradient ph při chromatografické analýze

25 Elektrochemické detektory se často dělí do dvou skupin, na amperometrické a kulometrické Ampérometrické detektory Oxidují nebo redukují jen část (do ~10%) analytu, jsou tedy koncentračně závislé Povrch elektrod se poměrně snadno mění vlivem elektrolytických dějů, dochází ke změnám odezvy a je nutná častá kalibrace a pravidelné ošetřovaní elektrody Reprodukovatelnost odezvy je obecně špatná Pomocná elektroda je obyčejně z nerezové oceli Vnitřní objem detektoru je velmi malý ~ 1 µl

26

27

28 oxidation reduction

29 Kulometrické detektory Dochází k redoxnímu ději pro 100% analytu, všechna látka je kompletně přeměněna na elektrodě Pracovní elektroda je z porézního grafitu a efluent protéká skrze elektrodu, díky uvedenému uspořádání je účinnost elektrolytické reakce velmi vysoká Poměr signál/šum je příznivější (ve srovnání s ampérometrickými detektory) Detektor nevyžaduje údržbu, při kontaminaci 90% povrchu pracovní elektrody poskytuje stabilní signál, životnost je běžně 1-2 roky Systém je stabilní vzhledem k teplotním změnám Celá škála možných uspořádání, od duálního řazení elektrod po coulometric array, obdobu PDA

30 Dual electrodes

31 Srovnání elektrodové účinnosti ampérometrického a kulometrického detektoru na rychlosti průtoku mobilní fáze

32 Amperometric detector A B

33 Coulometric detector A B

34

35 Coulometric array Detekce více analytů při různých potenciálech Až 16 pracovních elektrod zapojených v sérii, s postupně měněným potenciálem s krokem 60 mv Možnost stanovení i dvou a více časově nerozdělených komponent pomocí voltametrického rozlišení Možnost odhalení případné kontaminace píku Lze získat hydrodynamický voltamogram Lze aplikovat gradient ph při analýze

36 Hydrodynamic voltammogram

37

38 Vodivostní detektory Měření vodivosti efluentu Zásadní význam v iontové chromatografii Hmotnostní detektory

39 A.Braithwaite and F.J.Smith; Chromatographic Methods, Fifth edition, Blackie Academic & Professional 1996 Colin F. Poole and Salwa K. Poole; Chromatography Today, Elsevier Amsterdam 1995

40 2.2. Derivatizace Cílem derivatizace je obvykle: Zlepšení chromatografických vlastností složek, slelektivity dělení Zlepšení meze stanovitelnosti a detekce nebo dokonce umožnění detekce Derivatizace se provádí: 1. Mimo chromatograf - pre-column derivatization off-line K reakci dochází před vstupem na kolonu mimo separační systém Např. pyrolytická plynová chromatografie 2. Před kolonou pre-column derivatization on-line Reakce probíhá na koloně nebo těsně před kolonou. Derivatizace v mikroreaktorech, eliminační technika atd. 3. Za kolonou, před detektorem post-column derivatization Řada možných typů reaktorů Nejběžnější provedení derivatizace je založeno na metodě 1. a 2.

41 2.2.1 Derivatizace v HPLC Ad 1 a 2) Výhody Nevyžaduje úpravu chromatografu Rychlost derivatizační reakce nemusí být tak velká jako s post-kolonovou derivatizací Nevýhody Produkty reakce musí být dostatečně stabilní a dobře definované Nadbytek derivatizačního činidla a vedlejší produkty mohou negativně ovlivnit separaci Separační podmínky po derivatizaci jsou odlišné vzhledem k podmínkám dělení nederivatizovaných složek

42 Ad 3) Výhody Derivatizační reakce nemusí proběhnou na 100%. Je ale třeba, aby proces byl reprodukovatelný Vedlejší produkty a nadbytek derivatizační látky nepřijde do kontaktu se stacionární fází Proces je plně automatizovaný, nevyžaduje zásahy analytika Podmíky pro optimální průběh derivatizace (úprava ph apod.) lze nastavit až po separačním kroku Nevýhody Reakce by měla probíhat velice rychle Objem reaktoru způsobuje snížení separační účinnosti Přebytek činidla a vedlejší produkty nesmí interferovat s detekovanými látkami

43 Pro HPLC jsou nejdůležitější reakce vedoucí k derivátům, které umožňují stopovou analýzu Nejčastěji jde o deriváty vykazující: Silnou fluorescenci Zvýšenou absorpci záření v UV/VIS oblasti Radioaktivitu

44 Vybrané derivatizační reakce v HPLC Pro fluorescenční detekci 1.Reakce s dansylchloridem (5-dimethylaminonaftalen-1- sulfochlorid) Vhodný pro aminy, aminokyseliny, peptidy, proteiny, vybrané fenoly Excitační maxima jsou v rozmezí nm a emisní maxima v rozmezí nm CH 3 CH 3 N CH 3 CH 3 N R 1 NH + + HCl R 2 SO 2 Cl SO 2 NR 2

45 2.Reakce s fluorescaminem (4-fenylspiro[furan-2(3H), 1 (3 H)- isobenzofuran]-3,3 -dion) S primárními aminy poskytuje intenzivně fluoreskující deriváty Stabilita derivátů je omezená, ale selektivita reakce vysoká Excitační maxima kolem 390 nm a emisní kolem 475 nm O R N O O O + RNH 2 OH COOH O

46 3. Reakce s o-ftalaldehydem (OPA) Vhodný pro aminy, biogenní aminy, aminokyseliny, peptidy Deriváty jsou relativně nestabilní, přesmyky O C C O H H S CH 2 CH 2 OH + H 2 NCHRCOOH + HSC 2 H 4 OH N CH COOH R + H 2 O 4. Reakce s 4-chlor-7-nitrobenz-2,1,3-oxadiazolem (NBD-chlorid) Snadno reaguje s primárními i sekundárními aminy Excitační maxima jsou na ~ 480 nm, emisní maxima kolem 530 nm R 1 Cl N R 2 R 1 R 2 NH N N + O O + N N HCl NO 2 NO 2

47 Pro UV detekci 1. Reakce s ninhydrinem (1,2,3-indantrion monohydrát) Reaguje s aminokyselinami, pro post-kolonovou detekci Absorbuje při ~ 570 nm O O O OH OH O COOH O + R CH NH 2 O - O N O O

48 2. Reakce s bromomethyl 2-naftylketonem Pro pre-kolonovou derivatizaci karboxylových kyselin O CCH 2 Br + RCOOH H+ O O CCH 2 OCR