Úvod do strukturní analýzy farmaceutických látek

Transkript

1 Úvod do strukturní analýzy farmaceutických látek Garant předmětu: doc. Ing. Bohumil Dolenský, Ph.D. A28, linka 40, Nukleární Magnetická Rezonance I. Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.7/3..00/33253

2 Nukleární Magnetická Rezonance

3 Nukleární Magnetická Rezonance Nedestruktivní metoda vyžadující obvykle několik mg látky. Pro vysoce citlivé přístroje zlomky µg látky. Umožňuje měření v plynné, kapalné i pevné fázi. NMR je téměř nejsilnějším analytickým nástrojem k řešení struktury organických a bioorganických látek. Umožňuje stanovit kovalentní, sekundární, terciární i kvartérní strukturu. Umožňuje studovat interakce molekul i biomolekul. V následujícím textu je zahrnuta řada zjednodušení a aproximací.

4 Nukleární Magnetická Rezonance Nukleární ( jaderná ) Využívá vlastností jader majících nenulový jaderný spin, I 0. Isotopy mající nulový jaderný spin nelze měřit (tzv. NMR inaktivní jádra). Magnetická Vyžaduje silné magnetické pole ( v součastnosti -24 Tesla; magnetické pole Země je ca. 45 µt ) Resonance resonanční podmínka ( Larmorova frekvence ) Absorbce elektromagnetického záření o frekvenci 0 6 až 0 0 z odnota je přímo úměrná síle použitého magnetickém pole. ( 0 až nm, až kj/mol )

5 Nukleární ( jaderná ) Je-li spinové kvantovéčíslo jádra nenulové, I > 0, pak lze tyto jádra studovat pomocí NMR. Spinové kvantové číslo jádra ( I ) = jaderný spin = spin Spin je kvantově mechanická vlastnost mnoha fundamentálních částic. Spinem se nazývá neboť se jedná o typ momentu hybnosti a platí pro něj vztahy týkající se momentu hybnosti. Jádra s nenulovým jaderným spinem mají nenulový magnetický moment µ h = 6, (33) J.s Planckova konstanta γ = gyromagnetický poměr ( vlastnost jádra )

6 Rezonance PŘÍKLAD PRO PROTON I = ½ B o µ ω ω µ E β E α Přímá úměra síle magnetického pole i gyromagnetickému poměru. E = E β - E α = γћ B o [J] E = hν ћ = h / 2π ω = γ B o / 2π = ν ω - resonanční frekvence [ rad. s - ] LARMOROVA REKVENCE Při stejné orientaci vektorů magnetického pole a magnetického momentu je energie nižší. ν - resonanční frekvence [ s - = z ]

7 Měřitelná jádra ( isotopy ) omezíme se na základy NMR a 3 C NMR spekter

8 Měřitelná jádra ( isotopy ) Je-li hmotnostní i protonové číslo jádra sudé je jaderný spin nulový. 2 6C 6 8O 32 6 S Je-li hmotnostní číslo liché je Jaderný spin poločíselný C N 3 5P Je-li hmotnostní číslo sudé a protonové číslo liché je spin celočíselný N

9 Varian Mercury Plus 300 Mz 7,05 Tesla R2D2 type ;-)

10 Bod varu dusíku -95,795 C (77,355 K) Bod varu helia -268,928 C ( 4,222 K)

11 Varian Mercury Plus 300 Mz 7,05 Tesla

12 23,5 Tesla,76 Tesla JEOL 500 Mz ÚAC VŠCT Praha krát silnější pole než magnetické pole Země

13 Stolní NMR přístroje s permanentními magnety (Benchtop NMR) NMReady 60P,4 Tesla, Tesla,9 Tesla PicoSpin 80 Larmor frequency Nucleus 82 Mz (,9 T) Resolution 20 ppb Magnet type PERMANENT Capillary 40 µl Weight 9,5 kg Dimensions 43 x 35 x 25 cm

14 Varian A-60 vs. NMReady-60

15 Achievement of 020 Mz NMR (24.0 T) Journal of Magnetic Resonance, 205; 256: 30. DOI: 0.06/j.jmr Výška 5 m Váha 5 tun

16 Základní informace z NMR spektra Počet signálů Intenzita signálů Chemický posun signálů Multiplicita signálů Přímá souvislost s molekulovou strukturou studované látky

17 Základní informace z NMR spektra čisté látky Počet signálů odpovídá počtu chemicky neekvivalentních jader v molekule ( omezíme na spektra látek při vyšší teplotě ) Intenzita signálů vypovídá o množství daných jader v molekule ( omezíme na spektra měřená za obvyklých servisních podmínek ) Chemický posun signálů vypovídá o chemickém okolí jader daného signálu ( omezíme na běžná jádra a běžné organické látky ) Multiplicita signálů vypovídá o přítomnosti jader s nenulovým magnetickým spinem (v molekule) ( omezíme na jádra s I = ½, a na spektra prvního řádu )

18 Počet signálů v NMR spektru Počet signálů v NMR spektru čisté látky odpovídá počtu chemicky neekvivalentních jader, tedy jader s různým chemickým okolím. Cl O NMR C NMR NMR 3 2 Chemicky ekvivalentní (neboli omotopní) jádra jsou taková, která jsou v důsledku symetrie nerozlišitelná, mají stejné chemické okolí. Počet signálů vypovídá o symetrii molekuly studované látky

19 Počet signálů v NMR spektru Chemicky ekvivalentní ( neboli omotopní ) jádra jsou taková, která jsou v důsledku symetrie nerozlišitelná, mají stejné chemické okolí. Pro chemicky ekvivalentní jádra platí substituční test : Záměnou jednoho za X vzniká stejná látka jako záměnou druhého za X. X X 2 signály v NMR 4 signály v 3 C NMR X X

20 Počet signálů v NMR spektru Za chemicky ekvivalentní lze považovat i jádra, která jsou ekvivalentní v důsledku rychlé rotace skupiny nebo jiné rychlé chemické výměny. Cl Měření NMR spektra trvá ca. 0 - až 0 s Pro rychlé procesy je pozorována jejich průměrná hodnota. Methyl se otočí mnohotisíckrát za sekundu. Vodíky methylu jsou ekvivalentní. Cl Cl Byla-li by rotace velmi pomalá, vodíky by byly neekvivalentní. Obecně jsou rotace kolem jednoduché vazby rychlé a vedou k ekvivalenci jader rotujících skupin. Pokud nejsou neekvivaletní z jiného důvodu!!!

21 Počet signálů v NMR spektru Uvažujte volnou rychlou rotaci kolem jednoduchých vazeb. C 3 O O 3 C O C 2 C 3 O 3 C C 3 3 C C 3 : 3 C: C O N 3 C O S C 3 O O : 3 C:

22 Počet signálů v NMR spektru NMR není chiroptickou metodou!!!!! Standardním měřením nelze rozlišit enantiomery. Chiralita má však zásadní dopad na NMR spektra. substituční test Cl substituční test X X X X Cl Cl Enantiomery jsou nerozlišitelné vodíky jsou ekvivalentní jeden signál v NMR Enantiotopní jádra Diastereomery jsou rozlišitelné vodíky jsou neekvivalentní dva signály v NMR Diastereotopní jádra

23 Rezonanční frekvence signálů v NMR spektru (C 3 ) 3 Si Rezonanční frekvence tetramethylsilanu ( TMS, standard pro, 3 C i 29 Si NMR ) B 0 [ T ] Tesla jádra [ Mz ] 3 C jádra [ Mz ] 29 Si jádra [ Mz ],4 60,0 5,,9 7,05 300, 75,5 59,6 9,4 400, 00,6 79,5,75 500, 25,8 99,4 4, 600, 50,9 9,2 8,8 800, 20,2 59,0 23,5 000, 25,5 98,7 Silnější magnetické pole = vyšší rezonanční frekvence Na každém přístroji absorbují stejná jádra při jiné frekvenci Pro přenositelnost nutno využít referenční látky (standardu)

24 Chemický posun signálů v NMR spektru Chemický posun signálu δ je bezrozměrné číslo, tj. nezávislé na síle použitého magnetického pole. Vzhledem k jeho obvyklé velikosti 0-6 až 0-4 udáváme jeho hodnotu v ppm. chemický posun signálu x faktor pro přepočet na ppm resonanční frekvence signálu x resonanční frekvence signálu referenční látky (standardu) blízká s tzv. pracovní frekvencí přístroje

25 NMR,96 5,69 6,26 C 3 2,2 COO ppm 3 C NMR 27,9 7,9 C 3 36, COO 73,5 ppm

26 Chemický posun signálů v NMR spektru odnota chemického posunu odráží chemické okolí atomů (stínění). Z rozsáhlých tabulek těchto hodnot lze usuzovat na možné strukturní fragmenty neznámé látky, nebo odhadnout (predikce) chemické posuny pro známou strukturu. Spektrum NMR experimentální chemické posuny tabulky chemických posunů predikční program databáze chemické posuny známých látek očekávané hodnoty chemických posunů potvrzení možné správnosti navržené struktury návrh struktura pravděpodobná strukturní uskupení

27 Chemické posuny v NMR spektrech 5,69 6,26,96 C 3 2,2 COO

28 Chemické posuny v 3 C NMR spektrech 27,9 7,9 C 3 36, COO 73,5

29 Intenzita signálu Integrální intenzita signálu je úměrná počtu chemicky ekvivalentních jader daného izotopu. Při standardním měření lze integrálních intenzit využít při analýze i 9 NMR spekter, nikoli u 3 C NMR spekter. Poměr integrálních intenzit signálů odpovídá poměru počtu ekvivalentních jader v molekule.

30 NMR integrální vlna ( výška ) integrální normalizovaná hodnota ( plocha ) 5,69 6,26,96 C 3 2,2 COO 3 3 C NMR ppm 27,9 7,9 C 3 36, COO 73, ppm

31 Intenzita signálu v NMR spektru porovnání výšky integrální vlny 22 : 67 = ca. :3 porovnání integrálních hodnot,356 : 3,249 = ca. :3 integrální vlna integrální vlna 22 mm hodnoty numerické integrace 67 mm,356 3,249 integrální intenzita integrální intenzita 3

32 Počet a integrální intenzita signálů v NMR spektru Uvažujte volnou rychlou rotaci kolem jednoduchých vazeb. C 3 O O 3 C O C 2 C 3 O 3 C C 3 3 C C 3 3 C: : 2 2 3: 4 3 3:2: :2 3 C O N 3 C O S C 3 O O : 3 C: 4 3:2:2: :2:2:2:3 5

33 Počet signálů O 3 C O C 3 3 C C3 3 C O : 2 ( 3:2 ) 3 C: 2 : 4 ( 3:2:2:3 ) 3 C: 4 : 5 ( 3:2:2:2: ) 3 C: 4 C 3 C 3 O C3 C 3 C 3 O C 3 3 C O 3 C : 3 ( 6::3 ) 3 C: 3 : 4 ( 6::2: ) 3 C: 3 : 2 ( 9: ) 3 C: 2 Tyto konstituční isomery lze snadno rozlišit pomocí NMR nikoli ze spekter IČ, Raman či MS.