CHEMIE POTRAVIN Praktická cvičení

Transkript

1 VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO FAKULTA VETERINÁRNÍ HYGIENY A EKOLOGIE Ústav hygieny a technologie mléka CHEMIE POTRAVIN Praktická cvičení Prof. MVDr. Lenka Vorlová, Ph.D. MVDr. Michaela Králová, Ph.D. RNDr. Ivana Borkovcová, Ph.D. Doc. MVDr. Bohumíra Janštová, Ph.D. MVDr. Pavlína Navrátilová, Ph.D. Ing. Klára Bartáková, Ph.D. BRNO 2012

2 OBSAH OBSAH ZÁSADY PRÁCE V LABORATOŘI BEZPEČNOST PRÁCE V CHEMICKÉ LABORATOŘI VEDENÍ LABORATORNÍCH ZÁZNAMŮ PROTOKOL STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH PARAMETRŮ MASA STANOVENÍ DUSÍKU V MASE - KLASICKÝ POSTUP PODLE KJELDAHLA (ROZHODČÍ METODA) STANOVENÍ HYDROXYPROLINU V MASE STANOVENÍ OBSAHU VOLNÉHO TUTKU V MASE A MASNÝCH VÝROBCÍCH (ČSN ISO 1444) ENZYMOVÉ STANOVENÍ GLYKOGENU A GLUKOSY V MASE STANOVENÍ POPELA V MASE A MASNÝCH VÝROBCÍCH STANOVENÍ AMONIAKU (CONWAYOVA METODA) STANOVENÍ AMONIAKU IONTOVĚ SELEKTIVNÍ ELEKTRODOU (ISE) STANOVENÍ AMONIAKU V MASE SPEKTROFOTOMETRICKY STANOVENÍ KONCENTRACE KYSELINY MLÉČNÉ V MASE FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ PARAMETRY POUŽÍVANÉ K ODLIŠENÍ JAKOSTNÍCH ODCHYLEK MASA Stanovení ph elektrometricky Měření ph ve výluhu masa Měření ph vpichem Stanovení volné vody Stanovení ztráty masné šťávy odkapáním Stanovení barvy masa remisní kolorimetrií STANOVENÍ HISTAMINU V RYBÁCH STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH PARAMETRŮ MASNÝCH VÝROBKŮ STANOVENÍ OBSAHU VOLNÉHO TUKU (ČSN ISO 1444) STANOVENÍ OBSAHU SUŠINY Stanovení vody v mase a masných výrobcích referenční metoda (ČSN ) Stanovení obsahu vody v mase a masných výrobcích zkrácená metoda (ČSN ) STANOVENÍ DUSITANŮ Stanovení dusitanů v mase a masných výrobcích - referenční metoda (ISO 2918) Stanovení dusitanů spektrofotometricky STANOVENÍ OBSAHU CHLORIDŮ Stanovení obsahu chloridů v mase a masných výrobcích Volhardova metoda (ČSN ISO ) Stanovení obsahu chloridů v mase a masných výrobcích Potenciometrická metoda (ČSN ISO ) Potenciometrické stanovení chloridů v masných výrobcích (z popela) PRŮKAZ POLYFOSFÁTŮ V MASE A MASNÝCH VÝROBCÍCH (ISO 5553) STANOVENÍ ŠKROBU V MASNÝCH VÝROBCÍCH ENZYMOVÁ METODA

3 5 STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH PARAMETRŮ MLÉKA STANOVENÍ BÍLKOVIN Stanovení obsahu celkového dusíku a bílkovin podle Kjeldahla rozhodčí metoda (ČSN EN ISO ) Stanovení bílkovin roztokem amidočerni 10 B (provozní metoda podle ČSN ) Stanovení bílkovin v mléce pomocí SDS PAGE (elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s přídavkem dodecyl sulfátu sodného) STANOVENÍ MLÉČNÉHO TUKU Stanovení tuku podle Röse-Gottlieba (rozhodčí metoda podle ČSN ) Stanovení tuku acidobutyrometrickou metodou (provozní metoda podle ČSN ) Stanovení látkového obsahu volných mastných kyselin (podle ČSN ) Stanovení mastných kyselin metodou plynové chromatografie STANOVENÍ CHOLESTEROLU V MLÉCE A MLÉČNÝCH VÝROBCÍCH METODOU HPLC STANOVENÍ SACHARIDŮ Stanovení mléčného cukru polarimetricky (rozhodčí metoda podle ČSN ) Stanovení laktulosy enzymovou metodu STANOVENÍ BODU MRZNUTÍ Sstanovení bodu mrznutí mléka pomocí mléčných kryoskopů (ČSN ) STANOVENÍ SUŠINY Stanovení obsahu celkové sušiny (rozhodčí metoda podle ČSN ISO 6731) Stanovení sušina vážkově s použitím písku (ČSN ) Stanovení sušiny mléka výpočtem z hustoty a obsahu tuku (provozní metoda podle ČSN ) STANOVENÍ MINERÁLNÍCH LÁTEK Stanovení vápníku v mléce titrační metoda (rozhodčí metoda podle ISO 12081) Stanovení vápníku komplexonem (provozní metoda podle ČSN ) Stanovení chloridových iontů (rozhodčí metoda podle ČSN ) STANOVENÍ CHEMICKÝCH PARAMETRŮ MLÉČNÝCH VÝROBKŮ STANOVENÍ MĚDI V MLÉČNÝCH VÝROBCÍCH (SUŠENÉ MLÉKO) STANOVENÍ OBSAHU SACHARÓZY VE SLAZENÉM ZAHUŠTĚNÉM MLÉCE POLARIMETRICKÁ METODA PODLE ČSN ISO STANOVENÍ OBSAHU VODY, SUŠINY TUKUPROSTÉ A TUKKU V MÁSLE Z JEDNOHO ZKUŠEBNÍHO VZORKU PODLE ČSN EN ISO STANOVENÍ CHLORIDU SODNÉHO V SÝRECH ROZHODČÍ METODA PODLE ČSN STANOVENÍ SUŠINY V MLÉČNÝCH VÝROBCÍCH ROZHODČÍ METODA STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH PARAMETRŮ VAJEC STANOVENÍ CHOLESTEROLU Stanovení cholesterolu ve vejcích metodou HPLC Stanovení cholesterolu ve vejcích enzymovou metodou STANOVENÍ KYSELINY MLÉČNÉ, JANTAROVÉ A D-3-HYDROXYMÁSELNÉ VE VEJCÍCH A VAJEČNÝCH VÝROBCÍCH Stanovení kyseliny mléčné Stanovení kyseliny jantarové Stanovení kyseliny D-3-hydroxymáselné STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH PARAMETRŮ MEDU STANOVENÍ OBSAHU VODY V MEDU REFRAKTOMETRICKY STANOVENÍ ELEKTRICKÉ VODIVOSTI MEDU

4 8.3 STANOVENÍ TITRAČNÍ KYSELOSTI MEDU DŮKAZ PORUŠENÍ MEDU ŠKROBOVÝM SIRUPEM, ŠKROBOVÝM CUKREM A SLADOVÝMI VÝTAŽKY (FIEHEHO REAKCE II) STANOVENÍ HYDROXYMETHYLFURFURALU PODLE WINKLERA STANOVENÍ HYDROXYMETHYLFURFURALU Stanovení hydroxymethylfurfuralu podle Whita Stanovení hydroxymethylfurfuralu metodou HPLC STANOVENÍ DIASTATICKÉ AKTIVITY PODLE SCHADEHO STANOVENÍ INVERTÁZOVÉ AKTIVITY STANOVENÍ REDUKUJÍCÍCH CUKRŮ PODLE LANA A EYNONA UPRAVENÉ SOXHLETEM - ROZHODČÍ METODA STANOVENÍ SACHAROSY DLE LANA A EYNONA - ROZHODČÍ METODA STANOVENÍ OBSAHU POPELA STANOVENÍ OBSAHU PEVNÝCH LÁTEK VE VODĚ NEROZPUSTNÝCH LITERATURA

5 1 ZÁSADY PRÁCE V LABORATOŘI Nezbytnou podmínkou úspěšné práce v laboratoři je dobrá teoretická příprava posluchače. Proto je nezbytné, aby posluchači při příchodu do praktických cvičení měli prostudovány kapitoly vztahující se k experimentální práci a to jak z návodů na cvičení, tak popřípadě i z další literatury. Jedině tak je možno zvládnout, v řadě případů náročné metodiky analýzy potravin. Vzhledem k bezpečné práci v chemické laboratoři, ale i podmínkou úspěchu je pořádek a čistota v laboratoři. Použité chemické sklo se po předběžném vypláchnutí ukládá do určených košů. Papírový a tuhý odpad, zrovna tak jako rozbité sklo je nutno třídit do předem označených nádob. Je třeba udržovat v čistotě výlevky (neodhazovat tuhý odpad), digestoře, váhové stoly a pracovní stoly. Zvláštní pozornost je třeba věnovat udržování čistoty analytických vah, torzních vah a předvážek. V čistotě je potřeba udržovat i přípravnu pro vzorky a další společné prostory. Po skončení práce si každý uklidí své pracovní místo a přesvědčí se, zda jsou vypnuta elektrická zařízení, případně přívod vody a plynu. Před odchodem z laboratoře si studenti umyjí pečlivě ruce. Ochranný oděv (plášť) odloží až po opuštění laboratoře. 1.1 BEZPEČNOST PRÁCE V CHEMICKÉ LABORATOŘI Bezpečná práce v chemické laboratoři předpokládá dodržování následujících zásad: Vstup do laboratoře je zakázán osobám, které v ní nepracují. Povolené je vykonávat jen přikázané práce a ty, ke kterým dal povolení odpovědný vedoucí laboratorního cvičení. V laboratoři je třeba používat ochranný plášť (je potřeba jej obléci před vstupem do laboratoře) a podle potřeby i jiné ochranné pomůcky (brýle, štíty, rukavice). V laboratoři se nesmí jíst, pít ani kouřit. Chemikálie a roztoky se nesmí zkoušet ochutnáváním. Při zkoušce čichem je třeba postupovat opatrně - přivanout si výpary rukou. Tuhé chemikálie se nabírají jen laboratorními lžičkami, nepoužité se nevracejí do původních obalů. 4

6 Označení nádob s chemikáliemi je třeba chránit před poškozením. Žíraviny (silné kyseliny, silné zásady a koncentrovaná kyselina octová) i zředěné mohou způsobit poškození kůže, sliznic a očí. Účinek se zvyšuje s teplotou. Pro práci s nimi platí: o přelévají se vždy pouze pomocí nálevky o při ředění kyselin se přilévá kyselina do vody o nikdy se nepipetují ústy (pipetují bezpečnostními pipetami, pomocí balónku nebo se odměřují dávkovačem) o s koncentrovanými pracujeme v digestoři Tuhé hydroxidy se při rozpouštění sypou do připravené vody. Rozlité kyseliny a zásady se nejprve spláchnou vodou a zředěné se neutralizují. Spalování, žíhání a jakákoliv manipulace s látkami dýmavými, dráždivými a zapáchajícími se provádí v digestoři s dobrým odtahem. Jedovaté kapaliny se pipetují bezpečnostními pipetami, pomocí balónku nebo se odměřují dávkovačem. Při zahřívání hořlavin používáme vodní lázeň a digestoř s dobrým odtahem. Při rozlití hořlaviny je třeba zhasnout kahany a vypnout elektrické spotřebiče (páry těžší než vzduch, držící se při zemi mohou vzplanout i na dálku). Odpadní chemikálie (hořlaviny, látky jedovaté, silné kyseliny a zásady) se nesmí vylévat do komunálního odpadu, ale do určených označených sběrných nádob. Tlakové nádoby s plyny musí být zajištěné proti pádu řemeny, řetězy nebo v pojízdných stojanech, jejich vzdálenost od hořícího plamene smí být nejméně 3 m. Při manipulaci se sklem a při jeho umývání je třeba dávat pozor na poškozené okraje. Je zakázáno svévolně zasahovat do elektrického rozvodu. Zjištěné poruchy je třeba okamžitě hlásit vedoucímu cvičení a elektrické zařízení okamžitě vypnout. Měřicí přístroje, destilační a jiné aparatury nesmí být zapnuté bez dozoru. O všech úrazech a nehodách je třeba okamžitě informovat vedoucího cvičení. 5

7 2 VEDENÍ LABORATORNÍCH ZÁZNAMŮ Dosažení spolehlivých výsledků vyžaduje nejen pečlivé dodržování všeobecných zásad analytické práce, ale i pečlivé vedení laboratorních záznamů. Naprosto není vhodné psát záznamy na volné listy nebo útržky papíru. Do laboratorních záznamů (nejlepší je sešit) je třeba poznačit zejména: název úkolu, datum provedení, navážky vzorků, všechny případné odchylky od popisu v návodu, hmotnost navážky, spotřebovaný objem titračního činidla, hodnoty veličin získaných pomocí instrumentální techniky (absorbance, potenciál, index lomu, úhel otočení atd.). Na základě laboratorních záznamů je pro každou úlohu vypracován protokol. 2.1 PROTOKOL Naměřené výsledky je nezbytné pečlivě zapisovat, vypočítat a zhodnotit v protokolech, které jsou vedeny na volných listech nebo v nelinkovaném sešitě A4. Pro každou úlohu je vypracován protokol, který musí obsahovat níže uvedené údaje. Protokol o laboratorním vyšetření Název úlohy: Jméno a příjmení: Datum: V této části je třeba uvést následující údaje: charakteristika vzorků navážky vzorků popis odchylek od postupu v návodu naměřené údaje (optimální je zpracování do tabulky): spotřebovaný objem titračního činidla, hodnoty naměřených veličin získaných pomocí instrumentální techniky, např. absorbance, potenciál, index lomu atd. Výpočty: (včetně grafů) Závěr: (stručné shrnutí a interpretace výsledků) 6

8 3 STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH PARAMETRŮ MASA 3.1 STANOVENÍ DUSÍKU V MASE - KLASICKÝ POSTUP PODLE KJELDAHLA (ROZHODČÍ METODA) Princip: Dusík organických látek masa je převeden pomocí kyseliny sírové na síran amonný. Při této mineralizaci (kjeldahlizaci) vzniká z vodíku a uhlíku voda a oxid uhličitý. Kyselina sírová se přitom redukuje na oxid siřičitý. Mineralizace se urychluje přídavkem síranu draselného (zvýší se teplota varu reakční směsi) a některých katalyzátorů (CuSO 4, HgO, Se, SeO 2 ). Dusík ve vzniklém síranu amonném se stanovuje destilační metodou, přídavkem nadbytku NaOH se uvolní amoniak podle reakce: (1) (NH 4 ) 2 SO NaOH = 2 NH H 2 O + Na 2 SO 4 Reakce při teplotách okolo bodu varu probíhá kvantitativně. Uvolněný amoniak se předestiluje s vodní parou do předlohy se známým nadbytečným množstvím standardního roztoku kyseliny, se kterou reaguje podle rovnice: (2) 2 NH 3 + H 2 SO 4 = (NH 4 ) 2 SO 4 Nespotřebované množství kyseliny v předloze se zjistí zpětnou titrací standartním roztokem NaOH. Chemikálie a roztoky: kyselina sírová, H 2 SO 4 p.a. konc. kyselina sírová, H 2 SO 4 c = 0,05 mol/l hydroxid sodný, NaOH 33% roztok hydroxid sodný, NaOH c = 0,1 mol/l 7

9 katalyzátor: 32 g síranu draselného K 2 SO 4 se rozetře s 5 g síranu měďnatého CuSO 4. H 2 O a 1 g selenu. kyselina sírová, H 2 SO 4 c = 0,1 mol/l kyselina boritá, H 3 BO 3 c = 40 g/l indikátor Tashiro 1g methylénové modři a 2 g methylčerveně se doplní 96 % roztokem ethanolu na 1000 ml. Přístroje a pomůcky: Kjeldahlova baňka destilační přístroj podle Parnas - Wagnera odměrné sklo, skleněné kuličky kahan nebo vařič Postup: Do Kjeldahlovy spalovací baňky (o objemu ml) se diferenčně naváží cca 1 g zhomogenizovaného vzorku masa, přidá se 25 ml koncentrované kyseliny sírové, na špičku nože katalyzátoru a zamíchá. Směs se nejprve zahřívá v digestoři nad mírným plamenem do odstranění základního množství vody a potom při teplotě 360 ± 20 C tak dlouho, až se roztok vyjasní a odbarví se do čistého tónu. Po vychladnutí na pokojovou teplotu se obsah baňky mírně zředí a kvantitativně převede do destilačního přístroje pro stanovení amoniaku. K zalkalizování se použije přídavek 40 ml roztoku hydroxidu sodného. Poté se provede destilace uvolněného amoniaku v Parnas - Wagnerově přístroji. Do kuželové baňky, v níž je ponořena spodní část chladiče se odpipetuje 25 ml kyseliny borité s 2 až 3 kapkami indikátoru Tashiro. Destilace je ukončena, po 15 minutách od objevení se první kapky v chladiči (od počátku varu). Několik minut (5 minut) před koncem destilace se destilační baňka sníží a konec chladiče se opláchne do předlohy destilovanou vodou. Obsah baňky se titruje odměrným roztokem kyseliny sírové c = 0,1 mol/l do zeleného zbarvení. Slepý pokus se provede stejným způsobem, avšak místo navážky vzorku se použije destilovaná voda. Provádějí se dvě souběžná stanovení. Výpočet: 8

10 Obsah dusíku v % se vypočítá: =.0,28 V V 1 m objem kyseliny sírové (nebo kyseliny chlorovodíkové) spotřebované při titraci [ml] objem kyseliny sírové (nebo kyseliny chlorovodíkové) spotřebované při titraci slepého pokusu [ml] hmotnost navážky [g] Obsah bílkovin % se vypočítá: h í % 6,25 obsah dusíku v % 6,25 obsah dusíku vypočítaný viz výše přepočítávací faktor 9

11 3.2 STANOVENÍ HYDROXYPROLINU V MASE Princip: Vzorek masa je rozložen varem s HCl. Hydrolýzou bílkovin uvolněný hydroxyprolin se zoxiduje Chloraminem T na kyselinu 3-hydroxy-4-amino-1,3 dienvalerovou, která dává s p-dimetylaminobenzaldehydem červené zbarvení. Absorbance je měřena při 558 nm. Chemikálie a roztoky: kyselina chlorovodíková, HCl koncentrovaná pufr ph 6,8: 26,0 g kys. citronové (monohydrátu), 14,0 g NaOH peciček a 78,0 g octanu sodného bezvodého se rozpustí v 500 ml destilované vody. Přidá se 100 mg Na-etylmercurythiosalycylátu a kvantitativně se převede do 1000ml odměrné baňky. Po přídavku 250 ml 1-propanolu se doplní vodou po rysku. Skladovat ve tmě při 4 C (stálý 2 měsíce). II. Oxidační roztok: 1,4 g Chloraminu T (trihydrát) je naředěn do pufru ph 6,8 do 100 ml. Při skladování v lednici je stálý 1 týden. III. Barvící roztok: 10,0 g dimethylaminobenzaldehydu bude rozpuštěn v 35 ml HClO 4 (w = 60 %). Nakonec se opatrně přidá 65 ml 2- Propanolu. Tento roztok musí být každý den čerstvý. IV. 1) Standard hydroxyprolinu: 600mg/l 120 ml L-hydroxyprolinu je naředěno vodou do 200 ml odměrné baňky 2) Standard hydroxyprolinu : 6mg/l 5 ml roztoku 1 se napipetuje do 500 ml odměrné baňky a doplní po rysku 3) Z roztoku 2) dávkujeme:10; 20; 30; 40 ml do 100 ml odměrných baňek a doplníme dest. vodou po rysku. Koncentrace těchto standartních roztoků jsou 60; 120; 180; 240 µg/100 ml. Přístroje a potřeby: analytické váhy mlýnek na maso vodní lázeň 10

12 varné hnízdo laboratorní sklo, filtrační papír Postup: Příprava hydrolyzátu: Vzorek masa se nakrájí na 1 cm kousky a pomele. 4 g dobře zhomogenizovaného vzorku masa naváží s přesností na 1 mg do 100 ml varné baňky. Přidá se 30 ml koncentrované HCl a varné kamínky. Pomocí topného zařízení je roztok při mírném varu zahříván 8 h pod zpětným chladičem. Hydrolyzát se kvantitativně převede do 500 ml odměrné baňky, přidá se 5 ml petroletheru a doplní se vodou po rysku. Po důkladném promíchání je odstraněna vrstva petroleteru s tukem (odsátím) a vodná fáze přefiltrována přes skládaný filtr do 500 ml odměrné baňky. Hydrolyzát je stálý 4 týdny při 4 C. Dále je hydrolyzát naředěn tak, aby se očekávaná hladina hydroxyprolinu pohybovala v rozmezí 0,6-2,4 µg/ml. Tak dostaneme ředěním odpovídající objem (V). V našem případě odměříme 30 a 40 ml do 250 ml odměrných baněk a destilovanou vodou doplníme po rysku. Vlastní stanovení - vzorku: K 4 ml naředěného roztoku hydrolyzátu ve zkumavce se přidá 2 ml oxidačního činidla, zamíchá a nechá stát 20 min při laboratorní teplotě. Potom se přidá 2 ml barvícího roztoku. Po důkladném promíchání je zkumavka rychle dána do vodní lázně na 60 C a ponechána 15 minut. Potom následuje ochlazení zkumavky pod tekoucí vodou 3 minuty a nechá se stát 1/2 h při laboratorní teplotě. Potom změříme absorbanci při 558 nm v 1 cm kyvetě. Vlastní stanovení - standardů: Zpracovávájí se stejně jako vzorky jen místo 4 ml hydrolyzátu se dají 4 ml standardu ad 3). Stejným postupem se zpracuje slepý vzorek: místo 4 ml hydrolyzátu (resp. standardů) se dají 4 ml destilované vody. Výpočet: Obsah hydroxyprolinu w (g/100g) vzorku se vypočítá: = 12,5.. 11

13 x konc. hydroxyprolinu v µg/ml v naředěném hydrolyzátu, vypočítáme z kalibrační přímky m navážka vzorku [g] V objem (V) hydrolyzátu v ml, vzatý k naředění do 250 ml Poznámka: Výsledek se přepočte na kolagen. 12

14 3.3 STANOVENÍ OBSAHU VOLNÉHO TUTKU V MASE A MASNÝCH VÝROBCÍCH (ČSN ISO 1444) Princip: Tuk se stanoví gravimetricky po extrakci ze vzorku pomocí nepolárních rozpouštědel. Chemikálie a roztoky: n-hexan p.a. (nebo extrakční benzin) Potřeby a chemikálie: mlýnek na maso extrakční přístroj (Soxhletův nebo Soxtec) písková nebo vodní lázeň sušárna exikátor analytické váhy Postup: Do extrakční patrony se kvantitativně převede vzorek po stanovení vody sušením. Chomáčkem vaty (ovlhčeným rozpouštědlem) se vytře důkladně miska a chomáček vaty se vloží do extrakční patrony. Do baňky extrakčního přístroje, která byla předtím s několika varnými kuličkami vysušena 1 h při 103 C a zvážena s přesností na 0,001 g (m 1 ) se nalije rozpouštědlo a to tak, aby jeho množství bylo 1,5 krát až dvakrát větší, než odpovídá velikosti střední části extraktoru. Po sestavení extrakčního přístroje se vzorek extrahuje nejméně 6 h na pískové nebo vodní lázni (u přístroje Soxtec musí být doba zahřívání nejméně 2 h). Poté se vyjme extrakční baňka a rozpouštědlo se oddestiluje na pískové nebo vodní lázni. Potom se extrakční baňka suší v sušárně 1h 103 C, nechá vychladnout v exikátoru a zváží s přesností na 0,001 g. Tento postup se opakuje do konstantní hmotnosti vzorku (m 2 ). 13

15 Výpočet: Obsah volného tuku v % se vypočítá: = ( ).100 m 0 m 1 m 2 hmotnost naváženého vzorku [g] hmotnost extrakční baňky s varnými kuličkami [g] hmotnost extrakční baňky s varnými kuličkami a tukem po vysušení [g] 14

16 3.4 ENZYMOVÉ STANOVENÍ GLYKOGENU A GLUKOSY V MASE Princip: Glykogen je štěpen enzymem amyloglukozidasa (AMG) na glukosu (1). V další reakci (2) se glukosa oxiduje kyslíkem za katalýzy enzymem glukosooxidasou (GOD) na peroxid vodíku a kyselinu glukonovou. V následující reakci (3) se hladina peroxidu vodíku stanoví pomocí oxidační kopulace se substituovaným fenolem a 4-aminofenazonem katalysovanou enzymem peroxidasou (POD). Intenzita červeného zbarvení reakčního produktu je ekvivalentní množství přítomné glukosy a je měřena při 490 nm. Reakce: AMG (1) GLYKOGEN + H 2 O D GLUKOSA GOD (2) D - GLUKOSA + O KYS. GLUKONOVÁ + H 2 O 2 POD (3) H 2 O 2 + bezbarvá forma činidla zkopulovaná barevná forma činidla Chemikálie a roztoky: kyselina chloristá, HClO 4 c= 0,6 mol/l hydroxid sodný, KOH c = 5,4 mol/l amyloglukosidasa, AMG (EC ) lyophilized 75 U/mg octan sodný CH 3 COONa, tavený acetátový pufr ph=4,8 standard glukosy glukosové činidlo (fosfátový pufr ph=8, glukosooxidasa (GOD) 166 kat/l, peroxidasa (POD) 16 kat/l, 3-methylfenol 10 mmol/l, 4-aminofenazon 1 mmol/l (test Oxochrom GLUKOSA) Lachema, č.k glykogen 15

17 Přístroje a pomůcky: spektrofotometr odstředivka ph metr analytické váhy skleněná elektroda. Postup: Svalovina neznečištěná krví se zbaví tukové a vazivové tkáně a naváží se 900 mg vzorku s přesností 0,0001 g. Kvantitativně se přenese do třecí misky a přidají se 2,5 ml vychlazené HClO 4 c = 0,6 mol/l. Dobře se zhomogenizuje a přepraví do kalibrované zkumavky. Miska se vypláchne 1,5 ml HClO 4 a přidá se k prvnímu podílu homogenátu. Ve zkumavce se doplní pomocí HClO 4 o stejné koncentraci na objem homogenátu 5 ml. Poté následuje enzymová reakce. Do suchých zkumavek se pipetuje dle tabulky. Schema pipetování do zkumavek: Vzorek Slepý vzorek AMG Homogenát 0,2 ml - KOH (c = 5,4 mol/l) 0,02 ml 0,02 ml AMG (100 U/ml v pufru ph=4,8) 2,0 ml 2,0 ml Destilovaná voda - 0,2 ml Zkumavky se řádně promíchájí, uzavřou a nechají se inkubovat 1 h při 45 C za občasného promíchání. Po inkubaci se přidá: Vzorek Slepý vzorek AMG HClO 4 (c = 0,6 mol/l) 1,0 ml 1,0 ml KOH (c = 5,4 mol/l) 0,13 ml 0,13 ml 16

18 Přeleje se do odstředivkovych zkumavek a odstřeďuje 10 minut při ot./min. Potom se odpipetuje do čistých označených zkumavek dle schématu: Vzorek Slepý vzorek Standard Slepý vzorek AMG glukosy Supernatant vzorku 0,3 ml Supernatant AMG - 0,3 ml - - Standard glukosy - - 0,3 ml - Destilovaná voda ,3 ml Glukosové činidlo 3,0 ml 3,0 ml 3,0 ml 3,0 ml Zkumavky se zamíchají a při laboratorní teplotě se nechají 30 minut stát tak, aby byly zkumavky v zástinu. Poté se změří absorbance na spektrofotometru při 490 nm. Zároveň ve stejném vzorku stanovuje množství přítomné volné glukosy. Princip: Používá se stejná enzymatická reakce na stanovení glukozy jako při stanovení glykogenu. Ke stanovení glukosy byl použit Bio-la test fy Lachema Oxochrom GLUKOSA. Postup: Homogenát (viz stanovení glykogenu) z kalibrovaných zkumavek se přeleje do odstředivkových zkumavek a odstředí 10 min při ot./min. Potom se odpipetuje do suchých označených zkumavek 0,3 ml supernatantu a přidají se 3 ml glukosového činidla. Slepý vzorek se provede identicky, ale místo supernatantu se použije destilovaná voda. Zkumavky se zamíchají a inkubují 30 min při laboratorní teplotě v zástinu. Poté se červené zbarvení proměří na spektrofotometru při 490 nm. Analýza na spektrofotometru: Analýza vzorků a standardů a slepých vzorků se provádí na spektrofotometru. Měření se provádí v kyvetách s dráhou paprsku 10 mm, při vlnové délce 490 nm. 17

19 Výpočet: Kvantifikace se provádí pomocí matematického vztahu. Pro získání skutečné absorbance se odečítá od vzorků jak absorbance slepého vzorku, tak absorbance slepého vzorku AMG (AMG obsahuje glukosu). Výpočet koncentrace (c) glykogenu:! = " #$ " %&'() " %* " %&! %* [,/,] /,0 123 c=c 0.18 ř6ě8í (!6,ý :6/8áž) =ř6=čí3!í?31 [g/kg] glykogenu ředění přepočítávací faktor 93x 0,9 Výpočet koncentrace (c) glukosy:! = " #$ " %& " %* " %&! %* /,0 123 [,/,]! =! 0,18 ř6ě8í (!6,ý :6/8áž) glukosy [g/kg] A VZ A SL A SLAMG A ST absorbance vzorku absorbance slepého zkoušky absorbance slepého zkoušky AMG absorbance vzorku 18

20 3.5 STANOVENÍ POPELA V MASE A MASNÝCH VÝROBCÍCH Princip: Popel masa a masných výrobků představuje zbytek po spálení za podmínek definovaných metodou. Obsah popela se vyjadřuje v g/100 g vzorku. Potřeby a pomůcky: mlýnek muflova pec exikátor sušárna analytické váhy sklo, filtrační papír, porcelánové nebo křemenné kelímky Postup: 10 g dobře zhomogenizovaného vzorku se naváží s přesností na 1 mg do předem vyžíhaného a zváženého porcelánového kelímku (nebo spalovací miska) a následně se vysuší v sušárně při 103 ± 2 C. Poté se obsah v kelímku pomalu zuhelnatí nad kahanem nebo vařiči. Popel se nechá vychladnout a do misky se přidá asi 10 ml horké vody, rozpustný podíl se odfiltruje přes bezpopelný filtr a promyje se malým množstvím horké vody. Filtrát obsahující zejména chloridy se uchová. Filtr se vloží do spalovací misky, vysuší a vyžíhá se v muflové peci při 600 C. Po vychladnutí se do misky převede kvantitativně filtrát, který se pak odpaří při 130 C a miska krátce přežíhá. Po vychladnutí v exikátoru se miska zváží. Výpočet: Obsah popelovin v % se vypočte: = (! ) 100 a b hmotnost navážky [g] hmotnost prázdné misky [g] c hmotnost misky s vyžíhaným popelem [g] Poznámka:Výsledky se vyjadřují s přesností na jedno desetinné místo. 19

21 3.6 STANOVENÍ AMONIAKU (CONWAYOVA METODA) Princip: Ze vzorku se vytěsní amoniak nasyceným roztokem uhličitanu draselného, absorbuje se do roztoku kyseliny borité a stanoví se titračně roztokem kyseliny sírové. Chemikálie a roztoky: kyselina boritá, H 3 BO 3 roztok 10 g/l (10 g kyseliny borité se rozpustí v 1000 ml odměrné baňce, přidá se 200 ml ethanolu a 700 ml destilované vody. Po rozpuštění se přidá 10 ml indikátoru. Poté se roztok doplní na 1000 ml destilovanou vodou. indikátor (0,033 g bromkresolové zeleně a 0,066 g methylčerveně se rozpustí ve 100 ml ethanolu. uhličitan draselný, K 2 CO 3 nasycený roztok (52,8 g bezvodého uhličitanu draselného se rozpustí v 47,2 ml destilované vody). kyselina sírová, H 2 SO 4 odměrný roztok c = 0,05 mol/l Přístroje a pomůcky: Conwayova nádobka odměrné sklo vazelína Postup: Cca 1 g vzorku se zhomogenizuje s vodou v poměru 1:3. Do centrálního prostoru nádobky se napipetuje 1 ml roztoku kyseliny borité. Na jednu stranu vnějšího prostoru nádobky se napipetuje 1 ml vzorku a na protější stranu 1 ml nasyceného uhličitanu draselného. Po přikrytí nádobky se vzorek se promíchá s roztokem uhličitanu draselného mírným kruhovým pohybem. Potom se nádobka nechá 3 h při laboratorní teplotě. Po proběhnutí reakce se nádobka odkryje a k rortoku kyseliny borité se přidá 1 kapka indikátoru a obsah centrální části se dobře promíchá. Poté se titruje kyselinou sírovou do slabě červeného zbarvení. 20

22 Výpočet: Volný amoniak v mg/kg se vypočte: = 17,3 10? 8 a n f spotřeba odměrného roztoku kyseliny sírové [ml] hmotnost podílu vzorku v g/ml filtrátu faktor kyseliny sírové 21

23 3.7 STANOVENÍ AMONIAKU IONTOVĚ SELEKTIVNÍ ELEKTRODOU (ISE) Princip: Amoniak je vytěsňován z výluhu vzorku silnou zásadou, difunduje skrz pory membrány elektrody, rozpustí se v roztoku na povrchu skleněné elektrody - tam se vytvoří jeho rovnovážná koncentrace. Z hodnot potenciálů, změřených skleněnou elektrodou pak vypočteme koncentraci plynu. Chemikálie a roztoky: kyselina chloristá, HClO 4 c = 0,1 mol/l hydroxid sodný, NaOH c = 10 mol/l zásobní standardní roztok chloridu amonného, NH 4 Cl c = 0,1 mo/l Přístroje a pomůcky: mlýnek na maso mixér váhy digitální ph metr amoniaková ISE sklo; filtrační papír Postup: 4,0 g pomletého vzorku masa vložíme do mixéru a po přidání 100 ml HClO 4 c=0,1 mol/l homogenizujeme 1 minutu. Potom přelejeme obsah mixéru do 200 ml odměrné baňky a mixér promýváme HClO 4 až baňku doplníme po rysku. Necháme 5 minut stát a potom zfiltrujeme přes vatu, popř. řídkým filtrem. Vlastní stanovení: K měření vezmeme 100 ml filtrátu, ponoříme elektrodu (viz níže) vložíme míchadlo a zapneme míchačku. Přidáme 3 ml NaOH c=10 mol/l. Během 1 až 2 minut se ustálí potenciál na elektrodě a tento odečteme. Pokud se potenciál začne vracet do původní hodnoty, znamená to, že měření už trvá moc dlouho a amoniak se uvolňuje z pufru. Pozor: Zásadně se nedotýkat prsty membrány elektrody! 22

24 Práce s elektrodou: Elektrodu rozšroubujeme, vyjmeme z teflonového obalu skleněnou elektrodu a opláchneme destilovanou vodou. Do teflonového obalu napipetujeme ve svislé poloze 2 ml žlutého pufru a zašroubujeme elektrodu. Poté je elektroda připravena k měření. Elektrodu ponoříme maximálně po první bílé těsnění a kontrolujeme, jestli není na membráně bublinka. Mezi jednotlivými měřeními elektrodu opláchneme a ponoříme na chvíli do destilované vody. Zhotovení kalibrační křivky: Ze zásobního standardního roztoku NH 4 Cl c=0,1 mol/l naředíme pomocí HClO 4 6 pracovních standardních roztoků tak, aby pokryly rozmezí koncentrací mol/l až mol/l. Při měření postupujeme stejně, jako u vzorku. Výpočet: Z výsledků sestrojíme kalibrační křivku závislosti potenciálu E [mv] na logaritmu koncenrace [log c] stanovované látky. Z kalibrační křivky stanovíme množství amoniaku ve filtrátu vzorku a pomocí přípravy vzorku a navážky přepočítáme na množství anoniaku v původním vzorku. Poznámka: Po skončení měření elektrodu rozšroubujeme, vnitřní roztok vylejeme a teflonové pouzdro i skleněnou elektrodu opláchneme destilovanou vodou. Poté elektrodu opět zkompletujeme. 23

25 3.8 STANOVENÍ AMONIAKU V MASE SPEKTROFOTOMETRICKY Princip: Amoniak tvoří s Nesslerovým činidlem intenzivně zbarvený komplex, který se stanoví spektrofotometricky. Chemikálie a roztoky: kyselina trichloroctová, CCl 3 COOH 20% Nesslerovo činidlo (alkalický roztok HgI 2-4 ) standardní roztok chloridu amonného, NH 4 Cl c = 3,1411 g/l Přístroje a pomůcky: mlýnek na maso mixér váhy spektrofotometr sklo; filtrační papír Postup: Maso pomeleme a navážíme 10, 0 g. Zhomogenizujeme v mixeru s 80 ml destilované vody. Přelejeme do kádinky, mixer vypláchneme 20 ml destilované vody a přidáme k ostatnímu. Potom homogenát vyčeříme 60 ml 20% kyseliny trichloroctové. Zamícháme a necháme 10 min stát. Poté roztok zfiltrujeme nejprve přes vatu a podle potřeby přes střední filtrační papír do 200 ml odměrné baňky. Za promývání filtru destilovano vodou doplníme baňku po rysku. Ke stanovení napipetujeme 2 ml filtrátu do 50ml odměrné baňky, přidáme 10 ml destilované vody, 5 ml Nesslerova činidla, promícháme a doplním destilovanou vodu po rysku. Měření se provede na Spekolu při vlnové délce 400 nm, proti kompenzačnímu roztoku, připravenému z 5 ml Nesslerova činidla a 45 ml destilované vody. Zhotovení kalibrační křivky: Zásobní standardní roztok NH 4 Cl se naředí 100 krát, tzn., že v 1 ml tohoto naředěného standardu je obsažen 0,01 mg NH 3. Kalibrační křivku zhotovíme z 5 roztoků získaných 24

26 ředěním od 0,5 7 ml tohoto pracovního standardu do 50 ml odměrných baněk. Po přidání 10 ml destilované vody vybarvíme roztoky stejným množstvím Nesslerova činidla jako u vzorku. Doplníme destilovanou vodou opět po rysku. Výpočet: Vyhodnocení se provede pomocí kalibrační křivky a přepočítá se na (mg/kg) amoniaku v mase. 25

27 3.9 STANOVENÍ KONCENTRACE KYSELINY MLÉČNÉ V MASE Princip: Kyselina mléčná je oxidována koenzymem NAD + za katalýzy laktátdehydrogenázy na pyruvát a NADH. Při reakci vzniklé množství NADH je ekvivalentní množství kyseliny mléčné. Hladina NADH je měřena při 340 nm Reakce: L-LDH (1) L-LAKTÁT + NAD + PYRUVÁT + NADH + H + GPT (2) PYRUVÁT + L-GLUTAMÁT L-ALANIN + α-ketoglutarát Poznámka: Za účelem posunutí chem. rovnováhy na stranu pyruvátu a NADH je pyruvát v další reakci pomocí GPT (glutamát-pyruvát transaminázy) a kys. glutamové převáděn na alanin a kys. α-ketoglutarovou. Chemikálie a roztoky: ROZTOK 1: glycyl-glycinový pufr- ph 10 c = 0,5 mol/l, D-glutamová kyselina c = 0,5 mol/l, azid sodný 0,05% ROZTOK 2: NAD + - lyofilizát, 210 mg ROZTOK 3: Glutamát-pyruvát-transaminasa (GPT), c = 1,100 U/ml ROZTOK 4: L-laktátdehydrogenasa (LDH), c = 2,000 U/ml kyselina chloristá, HClO 4 70% hydroxid sodný, KOH c = 2 mol/l pufry ph 7 a 10 Přístroje a pomůcky: homogenizátor ph-metr a kombinovaná skleněná elektroda spektrofotometr UV/VIS laboratorní sklo, filtrační papír 26

28 Postup: Svalovinu zbavenou povázek, šlach a tukové tkáně naškrábeme (zmražené maso nebo maso v rigoru mortis nakrájíme na malé kousky) a navážíme 10,00 g. Přeneseme do čistého mixeru a zhomogenizujeme s 60 ml vychlazené HClO 4 c = 1 mol/l 5 minut při ot./min. Potom homogenát přelejeme do kádinky na 250 ml. Do mixeru odměříme 100 ml destilované vody a zapnutím důkladně propláchneme a přidáme k homogenátu. Dalšími 20 ml dest. vody vypláchneme naposled mixér a přidáme k předcházejícímu. Pomocí ph-metru, kombinované skleněné elektrody, za stálého míchání a KOH c= 2,0 mol/l homogenát zneutralizujeme a nastavíme ph na Poté homogenát přepravíme kvantitativně do odměrné baňky na 250 ml, doplníme destilovanou vodou po rysku a promícháme. Pro odloučení tuku necháme 15 minut stát v chladu (lednička, ledová tříšť). Potom zfiltrujeme přes hustý skládaný filtr do čisté, suché zkumavky. První ml filtrátu vylijeme a z dalších bereme ke stanovení: Schema pipetování do zkumavek: Slepá zkouška Vzorek Destilovaná voda 1,6 ml 1,5 ml Filtrát vzorku - 0,1 ml ROZTOK 1 0,5 ml 0,5 ml ROZTOK 2 0,1 ml 0,1 ml ROZTOK 3 0,02 ml 0,02 ml Zkumavky promícháme a po 5 min změříme absorbanci (A 1 ). Při měření roztoky naléváme zpátky do zkumavek. Potom přidáme: Slepá zkouška Vzorek ROZTOK 4 0,02 ml 0,02 ml Promícháme a po 10 minutách změřímě extinkci (A 2 ). 27

29 Výpočet: U slepé zkoušky i u vzorku vypočítáme rozdíl absorbancí: B"= (" " ) #$ (" " ) %& Přepočet pro stanovení koncentrace laktátu v roztoku:! = CD E 1000 B" [//,] V v MG d ε konečný objem roztoku v kyvetě [ml] objem použitého filtrátu vzorku [ml] molekulová hmotnost stanovovaného substrátu [g] šířka kyvety [cm] extinkční molární koeficient NADH při 340 nm [6,3 l/mmol/cm] Poznámka: Přepočítáním výsledku ředěním vzorku se stanoví koncentrace kyeliny mléčné v původním vzorku (g/kg a µmol/g). 28

30 3.10 FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ PARAMETRY POUŽÍVANÉ K ODLIŠENÍ JAKOSTNÍCH ODCHYLEK MASA Stanovení ph elektrometricky Princip: Stanovení ph spočívá v měření potenciálu vznikajícího na rozhraní dvou fází (elektrolytu) oddělených membránou měřící skleněné elektrody, ponořené do vyšetřovaného extraktu nebo vzorku. Tento potenciál se snímá v porovnání s konstantním potenciálem druhé - referentní elektrody. Jako referentní se nejčastěji používá elektroda kalomelová nebo argentochloridová. Chemikálie a roztoky: pufry Ph = 7 a 4 (komerční roztoky) ethanol 95% Přístroje a pomůcky: ph metr kombinovaná vpichová elektroda Postup: Na cvičeních budeme používat vpichovou kombinovanou skleněnou elektrodu. Nejprve se provede kalibrace ph metru s elektrodou pomocí pufrů (ph 7 a 4). Pokud není k dispozici ph-metr s korekcí teploty, je třeba, aby teplota měřených pufrů i vzorků byla 20 ± 2 C. Před ponořením do pufru se elektrody několikrát opláchnou destilovanou vodou a lehce se osuší buničitou vatou. Při vlastním stanovení se elektroda ponoří do vzorku a odečte se ph na displeji. 29

31 Měření ph ve výluhu masa Postup: Při stanovení ph se obvykle používá vodního 10% výluhu. Ze vzorku odpreparujeme tukové vazivo a šlachy. Z g svaloviny se rozemletím připraví masová měl. Odváží se 10 g rozmělněného masa do kádinky o objemu 250 ml, zalije se 100 ml destilované vody (zbavené oxidu uhličitého převařením) a nechá se 15 minut stát za občasného míchání. Získaný výluh se zfiltruje. Měření ph se provede u každého výluhu jedenkrát Měření ph vpichem Vpichovou kombinovanou elektrodou je možno měřit ph přímo ve svalové tkáni. Měříme-li vzorek tuhé konzistence, je třeba nejprve do něj udělat přiměřený vpich (teflonovým bodcem), do kterého pak elektrodu zasuneme. Přímé měření ph vzorku bez přípravy extraktu vpichovou kombinovanou elektrodou opakujte 10krát, přičemž elektrodu zapíchneme vždy do jiného místa (vyhodnoťte pomocí základní statistiky). Čištění a uchovávání elektrody: Po ukončení měření se elektroda opláchne ethanolem a poté destilovanou vodou. Elektroda se uchovává v úchovném roztoku dle doporučení výrobce, většinou v pufru ph 7,0. Upozornění: S elektrodou je nutno pracovat velmi opatrně a citlivě, protože hrot elektrody je velmi náchylný k mechanickému poškození. Zvláště při měření ph masa v období rigoru mortis je nebezpečí poškození elektrody díky tuhosti tkáně, a proto je použití teflonového bodce nezbytné. 30

32 Stanovení volné vody Princip: Za definovaných podmínek je rozdíl hmotností vzorku masa před a po kompresi kousku svaloviny, úměrný množství volné vody. Přístroje a pomůcky: váhy laboratorní potřeby exikátor s nasyceným roztokem KCl s chromatografickým papírem Whatman, skleněné desky závaží Postup: Ze středu části vzorku se vyřízne kousek masa o hmotnosti 300 mg, zváží se s přesností na 0,001 g a položí se na chromatografický papír konstantní vlhkosti, přechovávaný v exikátoru nad nasyceným roztokem KCl. Vzorek se vloží mezi dvě desky a zatíží závažím o hmotnosti 1 kg. Po pěti minutách se závaží odstraní, horní deska se opatrně odstraní a vzorek se znovu zváží. Výpočet: Úbytek hmotnosti se vyjádří v procentech jako volná voda. Poznámka: Vyhodnocení je možno provést i výpočtem koeficientu Q, což je poměr skvrny masa ku skvrně celkové po kompresi, odečtené pomocí šablony. Tento způsob vyhodnocení je však zatížen hrubou chybou, kromě jiného i vzhledem k používaným kruhovým otvorům v šabloně. 31

33 Stanovení ztráty masné šťávy odkapáním Princip: Za definovaných podmínak je určeno množství masové šťávy uvolněné vzorkem masa. Přístroje a pomůcky: váhy chladnička laboratorní potřeby Postup: Vzorek svaloviny cca 150 g bez viditelných povázek, šlach a tukové tkáně se odváží na dvě desetinná místa a vloží se do sáčku z plastu, zataví a uloží po dobu 24 hodin do chladničky při teplotě 4-6 C. Poté se sáček otevře, vzorek osuší válením po filtračním papíru a znovu zváží. Výpočet: Ztráta odkapáním se vyjadřuje jako procentuální podíl hmotnosti odkapané šťávy z celkové hmotnosti vzorku. 32

34 Stanovení barvy masa remisní kolorimetrií Princip: Je měřen barevný jas masa, na základě jeho odrazivosti R, tj. poměru intenzit odraženého záření a záření dopadajícího na povrch vzorku. Přístroje a pomůcky: spektrofotometr Spekol 11 remisní nástavec R 45/0 bílý standard BaO nebo BaSO 4 černý standard - černé duté těleso prkénko, nůž Postup: Spekol 11 zapneme do sítě a necháme 15 minut zahřát nastavíme vlnovou délku 546 nm levou dolní páčku (intenzita dopadajících paprsků) nastavíme na spodní polohu zmáčkneme tlačítko FL- bliká dioda Z-FL a FAKT přítlačný talíř na vzorky stlačíme dolů a umístíme na něj černé duté těleso (černý standard) a opatrně pomocí zpětné pružiny přitlačíme na měřící otvor zmáčkneme tlačítko Z-FL. Tím následuje vynulování přístroje na černý standard. Zhasne dioda Z-FL, bliká FAKT a R. černý standard odstraníme a na talíř položíme pomocný talíř s černým filcovým povrchem. Na něj položíme bílý standard a přitlačíme k měřícímu otvoru. stlačíme tlačítko FAKT, dioda R zhasne. Pomocí tlačítka POS (nastavovaná hodnota) a tlačítka INC (číselná hodnota) nastavíme hodnotu remise přiloženého normálu 100 %. znova zmáčkneme tlačítko FAKT, dioda FAKT zhasne; dioda R bliká. stlačíme tlačítko R, zhasne dioda R, na ukazateli se objeví příslušná hodnota remise. odděláme normál a na pomocný příložný talíř položíme mističku se vzorkem a přitlačíme na měřící otvor. Na ukazateli se objeví příslušná hodnota remise. 33

35 Příprava vzorku svaloviny k měření: Maso, zbavené vazivové tkáně, tukové tkáně a bez potřísnění krví, řežeme napříč svalových vláken. Tloušťka vzorku je dána výškou černé mističky, kterou nesmí přesahovat, tvar taktéž. Horní plocha vzorku musí být rovná a hladká. Pozor! S příložnými standardy pracujte opatrně, chraňte před znečištěním a poškrabáním. 34

36 3.11 STANOVENÍ HISTAMINU V RYBÁCH Princip: Po provedené extrakci vzorku se filtrát i standard vyvíjejí pomocí tenkovrstvé chromatografie a po následné detekci chromatogramu se semikvantitativně stanoví obsah histaminu, porovnáním intenzity barevných skvrn vzorku a standardu. Chemikálie a roztoky: kyselina chlorovodíková, HCl c = 6 mol/l vyvíjecí směs: aceton-hydroxid amonný (čerstvý) 95:5 ninhydrin, 0,2% roztok v ethanolu (stačí připravit 25 ml roztoku) methylalkohol standard: histamin dihydrochlorid, c = 10 mg/100ml a 20 mg/100ml Přístroje a pomůcky: mixér chromatografická deska Silufol nanášecí zařízení pro chromatografii chromatografická skleněná kyveta vysoušeč vlasů laboratorní sušárna fixírka Postup: Zpracování vzorku: A. Při stanovení histaminu u ryb s nižším obsahem tuku: K 10 g rybí svaloviny zbavené kůže a kostí se přidá 25 ml destilované vody a 5 ml HCl (c=6 mol/l) a vše se homogenizuje v mixeru po dobu 120 sec. Homogenát se přepraví do kádinky a zfiltruje. Poté se 30 µl filtrátu nanese na start chromatogramu. B. Při stanovení histaminu u ryb s vysokým obsahem tuku je lépe než kyselou extrakci zvolit extrakci do methylalkoholu podle následujícího postupu: 20 g rybí svaloviny zbavené kůže a kostí se homogenizuje v mixeru s 80 ml methylalkoholu po dobu 120 s. Homogenát se přepraví do kádinky a zfiltruje. Poté se 40 µl filtrátu nanese na start 35

37 chromatogramu. Start se vyznačí čarou 2 cm od spodního okraje chromatogramu, na kterou označíme místa nanášení. Nanášení se provádí postupně po malých dávkách pomocí chromatografické jehly s následným vysušením. Příprava standardu: pro vzorek zpracovaný kyselou extrakcí: Naváží se 20 mg standardu, kvantitativně se převede do 100 ml odměrné baňky a doplní destilovanou vodou po rysku. Do další baňky se z tohoto roztoku připraví roztok 10 mg/100ml. Poté se 10 µl standardů nanese na chromatogram vedle vzorku. pro vzorek zpracovaný extrakcí do methanolu: Příprava je stejná, jen doplnění na konečný objem v odměrné baňce se provede methylalkoholem. Nanášení, vyvíjení a detekce: Po nanesení vzorku i standardů a po vysušení skvrn, se deska vloží do chromatografické komory a nechá se vyvíjet tak dlouho, až čelo rozpouštědla vyvíjecí směsi dosáhne 1 cm pod horní okraj chromatogramu. Deska se po vyjmutí usuší a provede se postřik roztokem ninhydrinu. Zviditelnění skvrn se provede zahřátím v sušárně (60 C) po dobu 10 min. Posouzení: Skvrna histaminu je červenofialové barvy. Histidin zůstává na startu. Intenzita barevné skvrny vzorku se porovná se skvrnami standardů a provede se semikvantitativní vyhodnocení: Obsah histaminu méně než 100 mg/kg, případně méně než 200 mg/kg. 36

38 4 STANOVENÍ FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÝCH PARAMETRŮ MASNÝCH VÝROBKŮ 4.1 STANOVENÍ OBSAHU VOLNÉHO TUKU (ČSN ISO 1444) Princip: Metoda je založena na extrakci tuku ze vzorku pomocí nepolárních rozpouštědel, odstranění rozpouštědla odpařením, sušením a vážením (gravimetricky). Chemikálie a roztoky: extrakční rozpouštědlo (n-hexan nebo extrakční benzín) Přístroje a pomůcky: mlýnek na maso extrakční přístroj (Soxhletův nebo Soxtec) písková nebo vodní lázeň sušárna exsikátor analytické váhy extrakční patrona Postup: Vzorek po stanovení vody sušením se kvantitativně převede do extrakční patrony. Vatou navlhčenou rozpouštědlem se vytřou zbytky vzorku z misky a vata se vloží do extrakční patrony. Patrona se vloží do extrakčního přístroje. Do baňky extrakčního přístroje, která byla předtím s několika varnými kuličkami vysušena 1 h při 103 C, ochlazena v exsikátoru na teplotu místnosti a zvážena s přesností na 0,001 g (m 1 ), se naleje rozpouštědlo. Množství rozpouštědla musí mít nejméně 1,5 2násobnou kapacitu extrakční trubice přístroje. Baňka se upevní do extrakčního přístroje a zahřívá nejméně 6 hod na pískové nebo vodní lázni podle rychlosti extrakce a použitého přístroje (u přístroje Soxtec musí být doba zahřívání nejméně 2 hod). Po extrakci se vyjme extrakční baňka obsahující rozpouštědlo a rozpouštědlo 37

39 se oddestiluje na pískové nebo vodní lázni. Potom se extrakční baňka suší v sušárně 1 hod při 103 C, nechá se vychladnout v exsikátoru a zváží s přesností na 0,001 g. Tento postup se opakuje do konstantní hmotnosti vzorku (m 2 ). Výpočet: Obsah volného tuku (w) se vypočítá podle uvedeného vzorce: = ( ) 100 [%] m 0 m 1 m 2 hmotnost vzorku odebraného pro sušení [g] hmotnost extrakční baňky s varnými kuličkami [g] hmotnost extrakční baňky s varnými kuličkami a tukem po vysušení [g] Poznámka:Výsledek zaokrouhlíme na jedno desetinné místo. 38

40 4.2 STANOVENÍ OBSAHU SUŠINY Stanovení vody v mase a masných výrobcích referenční metoda (ČSN ) Princip: Obsah vody se zjistí z rozdílu hmotností vzorku před sušením a po sušení za podmínek metody. Chemikálie a roztoky: mořský písek ethanol Přístroje a pomůcky: mlýnek analytické váhy sušárna exsikátor hliníková miska Postup: Hliníková miska s g mořského písku a skleněnou tyčinkou se vysuší za občasného promíchání při teplotě 103 C ± 2 C do konstantní hmotnosti (1 2 hod). Miska se ochladí v exsikátoru, zváží s přesností na 0,001 g, naváží se do ní 5-10 g pomletého vzorku a zváží se podruhé se stejnou přesností. Vzorek se skropí několika kapkami ethanolu a promíchá. Poté se suší v pootevřené sušárně při teplotě 60 C ± 2 C po dobu 1 hod a pak se dosouší do konstantní hmotnosti při 103 ± 2 C. Za výsledek se považuje nejnižší zjištěná hmotnost, jež se od předchozí hmotnosti neliší více jak o 0,002 g. Poprvé se úbytek kontroluje po třech hodinách a poté každou hodinu. 39

41 Výpočet: Obsah vody ve vzorku (x) se vypočte: = ( F ) 100 [%] ( ) m 1 m 2 m 3 hmotnost misky s pískem a tyčinkou před sušením [g] hmotnost misky se vzorkem, pískem a tyčinkou před sušením [g] hmotnost misky se vzorkem, pískem a tyčinkou po sušení [g] Výsledek se uvádí jako průměr dvou souběžných stanovení, jež se nemají vzájemně lišit o více než 0,3 %. Vysušený obsah misky je možné použít ke stanovení tuku. Sušinu stanovíme výpočtem: h šh80[%]= 100 h 0 % 40

42 4.2.2 Stanovení obsahu vody v mase a masných výrobcích zkrácená metoda (ČSN ) Princip: Obsah vody se zjistí z rozdílu hmotnosti vzorku před sušením a po sušení za definovaných podmínek (170 C 40 minut). Chemikálie a roztoky: ethanol Přístroje a pomůcky: mlýnek analytické váhy sušárna exsikátor hliníková miska Postup: Do suché hliníkové misky se vloží skleněná tyčinka. Naváží se do ní 10 g homogenizovaného vzorku s přesností na 0,01 g. Vzorek se zvlhčí malým množstvím ethanolu a pomocí tyčinky rovnoměrně rozetře po dně misky. Ze začátku se misky suší s pootevřenými dveřmi sušárny. Po odpaření ethanolu se sušárna uzavře a misky se suší při 170 C po dobu 40 minut. Po vychladnutí v exsikátoru se miska zváží. 41

43 Výpočet: Obsah vody ve vzorku (x) se vypočte: = ( F ) 100 [%] ( ) m 1 m 2 m 3 hmotnost misky s pískem a tyčinkou před sušením [g] hmotnost misky se vzorkem, pískem a tyčinkou před sušením [g] hmotnost misky se vzorkem, pískem a tyčinkou po sušení [g] Výsledek se uvádí jako průměr dvou souběžných stanovení, jež se nemají vzájemně lišit o více než 0,3 %. Sušina se stanoví výpočtem: h šh80[%]= 100 h 0 % 42

44 4.3 STANOVENÍ DUSITANŮ Stanovení dusitanů v mase a masných výrobcích - referenční metoda (ISO 2918) Princip: Po předchozí úpravě vzorku (extrakci horkou vodou, precipitaci proteinů a filtraci) reagují přítomné dusitany se sulphanilamidem a N-1-naphtylethylendiamin dihydrochloridem za vzniku červeného zbarvení, vhodného ke spektrofotometrickému stanovení při 538 nm. Chemikálie a roztoky: činidlo I (106 g ferrokyanidu draselného K 4 [Fe (CN) 6 ].3H 2 O se doplní na objem 1000 ml) činidlo II (220 g octanu zinečnatého Zn (CH 3 COO) 2.2H 2 O a 30 ml ledové kyseliny octové se doplní na objem 1000 ml) borax (nasycený roztok) (50 g tetraboritanu disodného Na 2 B 4 O 7.10H 2 O se rozpustí ve vlažné vodě a doplní na 1000 ml) standardní roztok dusitanu sodného Základní standard je 1,000 g dusitanu sodného (NaNO 2 ) se naředí do 100 ml odměrné baňky Pracovní standardy: 0,05 g/l (ředí se každý den čerstvý) Kalibrační roztoky: 5 roztoků o koncentraci 2,5-10,0 µg/ml Barvicí roztoky Roztok I Ve vodní lázni se rozpustí 2 g sulphanilamidu NH 2 C 6 H 4 SO 2 NH 2 v 800 ml destilované vody. Ochladí se, jestliže je to nutné, filtruje se. Přidá se za stálého míchání 100 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové (ρ 1,19 g/ml) a doplní se na 1000 ml destilovanou vodou. 43

45 Roztok II Rozpustí se 0,25 g N-1-naphthylethylenediaminu C 10 H 7 NHCH 2 CH 2 NH 2.2HCl ve vodě. Naředí se na objem 250 ml. Roztok se skladuje v dobře uzavřené hnědé lahvi, v lednici, ne déle než jeden týden. Roztok III Naředí se 445 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové (ρ 1,19 g/ml) na objem 1000 ml. Přístroje a pomůcky: mlýnek vodní lázeň analytické váhy spektrofotometr laboratorní sklo a filtrační papír Postup: Vzorek se zhomogenizuje pomletím a naváží se 10 g vzorku s přesností na 0,001g. Přepraví se do Erlenmayerovy baňky, přidá se 5 ml nasyceného roztoku boraxu a 100 ml destilované vody o teplotě alespoň 70 C. Baňka se nechá ve vroucí vodní lázni 15 minut za opakovaného promíchání. Poté se baňka ochladí na teplotu místnosti a pomalu se přidají 2 ml činidla I a 2 ml činidla II (po každém přídavku se obsah dobře promíchá). Obsah se přepraví do 200 ml odměrné baňky, doplní po rysku a nechá stát 30 minut při pokojové teplotě. Tekutý supernatant se opatrně přefiltruje přes filtrační papír. Barevná reakce: 1. Napipetuje se alikvotní díl filtrátu (ml), ale ne více než 25 ml do 100 ml odměrné baňky a přidá se voda na objem asi 60 ml. 2. Přidá se 10 ml roztoku I a následně 6 ml roztoku III, zamíchá se a nechá 5 minut stát v temnu při pokojové teplotě. 3. Pak se přidají 2 ml roztoku II, roztok se zamíchá a nechá stát 3-10 minut v temnu při pokojové teplotě. Poté se naředí po značku destilovanou vodou. 4. Změří se absorbance při 538 nm. 44

46 Kalibrační křivka: Do 100 ml odměrných baněk se napipetuje 10 ml destilované vody a 10 ml od každého kalibračního roztoku. Objem v odměrných baňkách se upraví asi na 60 ml. Potom se postupuje stejně jako u vzorku a to od bodu 2. Výpočet: Na základě vyhodnocení kalibrační křivky se stanoví obsah dusitanu sodného ve vzorku. IIJ =! 2000 [mg/kg] c m V koncentrace dusitanu sodného odečtená z kalibrační přímky [µg/ml] hmotnost vzorku [g] objem filtrátu, vzatý do práce [ml] 45

47 4.3.2 Stanovení dusitanů spektrofotometricky Princip: Dusitany obsažené ve filtrátu vzorku po vysrážení bílkovin se stanovují diazotační reakcí s kyselinou sulfanilovou a následnou kopulací s alfa-naftolem za vzniku oranžového azobarviva vhodného ke spektrofotometrickému stanovení. Chemikálie a roztoky: DIAZO-1 25 mg alfa-naftolu se rozpustí 20 ml kyseliny octové a doplní se destilovanou vodou na celkový objem 100 ml. DIAZO mg kyseliny sulfanilové se rozpustí za horka zhruba v 50 ml destilované vody a po přidání 20 ml kyseliny octové se v odměrné baňce doplní destilovanou vodou na celkový objem 100 ml. síran zinečnatý, ZnSO 4 roztok 30% standardní roztok dusičnanu sodného, NaNO 2 c = 1 g/l borax, Na 2 B 4 O 7 nasycený roztok Přístroje a pomůcky: mlýnek na maso vodní lázeň analytické váhy spektrofotometr, kyveta 1 cm třepačka na zkumavky stojánek na zkumavky stojan + kruhy na filtraci laboratorní sklo a pomůcky, obvazová vata Postup: Naváží se 10,0 g 3 krát pomletého vzorku, přidá se 150 ml destilované vody a nechá se vařit ve vodní lázni 45 minut. Potom se přidá 10 ml nasyceného roztoku Na 2 B 4 O 7 a nechá se vařit ještě 15 minut. Pomalu po kapkách za stálého míchání se přidává ZnSO 4 do celkového objemu 4 ml. Nechá se 15 minut stát, zfiltruje přes vatu a poté přes filtr do 200 ml odměrné 46