BIOLOGICKÉ A MOLEKULÁRNÍ EFEKTY INHIBICE AKTIVITY CYKLIN DEPENDENTNÍCH KINÁZ U LIDSKÝCH EMBRYONÁLNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK

Transkript

1 BAKALÁŘSKÁ PÍSEMNÁ PRÁCE MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie BIOLOGICKÉ A MOLEKULÁRNÍ EFEKTY INHIBICE AKTIVITY CYKLIN DEPENDENTNÍCH KINÁZ U LIDSKÝCH EMBRYONÁLNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK BRNO, 2006 Tomáš Bárta

2 Poděkování Rád bych poděkoval svému školiteli Doc. MVDr. Aleši Hamplovi Csc. a odbornému konzultantovi Doc. Ing. Petru Dvořákovi Csc. za pomoc při vypracování bakalářské práce. Tato práce byla vypracována na pracovišti Biologického ústavu LF MU a Ústavu experimentální biologie AVČR.

3 Obsah Úvod Embryonální kmenové buňky Výskyt kmenových buněk v dospělém organismu Izolace a kultivace ES buněk Kultivace myších ES buněk Kultivace lidských ES buněk Diferenciace ES buněk Diferenciace do embryoidních tělísek Diferenciace v monovrstvě Problematika terapeutického využití embryonálních kmenových buněk Buněčný cyklus Systém řízení buněčného cyklu Cyklin dependentní kinázy (CDK) CDK inhibiční proteiny (CKI) Buněčný cyklus v somatických savčích buňkách Kontrolní bod G1/S S fáze Kontrolní bod G2/M Buněčný cyklus v ES buňkách G1 fáze v ES buňkách G1/S kontrolní bod v ES buňkách G2/M přechod u ES buněk Inhibice CDK umělými inhibitory Působení CDK inhibitorů na živý organismus Indukce apoptózy inhibicí cyklin dependentních kináz Indukce diferenciace inhibicí cyklin dependentních kináz Interakce mezi CDK a inhibitorem Analogy purinů ,6,9-trisubstituované puriny Benzylaminopuriny Ostatní inhibitory...37 Závěr...38 Literatura...39

4 Úvod Izolace lidských embryonálních zárodečných buněk v roce 1998 Johnem Geartem z John Hopkins Hospital a embryonálních kmenových buněk Jamesem Thomsonem z University of Wisconsin dala světu naději, že snad někdy v budoucnu bude možné některé dnes neléčitelné nemoci úspěšně vyléčit. Embryonální kmenové buňky (ESC Embryonic Stem Cells) lze snadno množit a cíleně diferencovat. Proto poskytují velké možnosti využití v buněčných terapiích. Díky unikátnímu obsahu a konfigurací molekul, které buněčný cyklus regulují, dokážou rychle tímto buněčným cyklem procházet, čímž poskytují také vhodný model pro testování nových farmaceutických preparátů. Pro použití kmenových buněk v terapii je třeba dostatečně poznat mechanizmy diferenciace. Nové preparáty zkoumané na ES buňkách jsou látky, které indukují diferenciaci a přispívají tak i k poznání buněčných mechanizmů, které ji řídí. Dalším problémem, který brání použití ES buněk v terapii, je dosavadní nevhodná kultivace. Kultivace probíhá v přítomnosti zvířecích buněk, které mohou obsahovat patogeny a v přítomnosti zvířecích proteinů v kultivačním médiu. Kultivační metoda, která by eliminovala přítomnost těchto komponent, nebyla doposud vyvinuta. V této bakalářské práci prezentuji úvod do problematiky embryonálních kmenových buněk, jejich kultivaci, diferenciaci a potencionální využití v buněčné terapii. Současně se základní problematikou ES buněk se také zabývám studiem buněčného cyklu a molekul, které buněčný cyklus v ES buňkách regulují. Ve své práci se také zaměřuji na inhibici cyklin dependentních kináz (CDK) pomocí synteticky připravených inhibitorů. Působení inhibitorů CDK je nyní intenzivně zkoumáno na mnoha buněčných typech, avšak testování na lidských embryonálních kmenových buňkách nebylo doposud uskutečněno. 4

5 1. Embryonální kmenové buňky Během embryonálního vývoje savce ve fázi blastocysty je embryo tvořeno dvěma typy buněk: pluripotentní vnitřní buněčná masa (ICM - Inner Cell Mass), která dává vznik všem třem zárodečným vrstvám a trofoblast, který podporuje růst embrya (obrázky 1, 2 a 4). Embryonální kmenové buňky (ES buňky) jsou pluripotentní buňky izolované právě z této vnitřní buněčné masy. ES buňky jsou v plně nediferenciovaném stavu, které mají schopnost neomezené proliferace a samy se mohou neustále obnovovat. Obrázek 1: Blastocysta šipka ukazuje ICM. Převzato z (Kim et al., 2005). ES buňky vykazují vysokou úroveň exprese telomerázy, ribonukleoproteinu zodpovědného za udržování délek telomer (Thomson et. al., 1998). Díky aktivitě telomerázy získávají ES buňky určitou nesmrtelnost, protože zde nedochází během jednotlivých dělení ke zkracování telomer mohou se dělit prakticky neomezeně. Oproti normálním somatickým buňkám, které nemají telomerázu, se mohou somatické buňky v důsledku zkracování telomer dělit jen 50-80krát. Během vývoje jsou ES buňky směrovány k jednotlivým vývojovým drahám a jejich diferenciační potenciál se tak snižuje. Pak buňka ztrácí svou pluripotenci, ale stále se ještě může vyvinout do značného počtu buněčných typů. Takovéto buňky se nacházejí ve stavu multipotence. Například buňka diferencující do ektodermu dá vznik jen té tkáni, která je ektodermálního původu (obrázek 8). Kmenové buňky se mohou vyskytovat také v unipotentním stavu. Tento stav zapříčiňuje proliferaci kmenové buňky pouze do jednoho buněčného typu. Obrovský význam ES buněk spočívá v možnosti diferencovat se na všechny typy buněk, ze kterých se skládá živý organismus. Díky snadnému množení, cílené diferenciaci a genetické modifikaci se v posledních letech ES buňky staly středem pozornosti a předmětem mnohých studií na celém světě. 5

6 1.1. Výskyt kmenových buněk v dospělém organismu Kmenové buňky se nemusejí vyskytovat jen v embryu, ale také na mnoha místech už dospělého organismu. Většina orgánů obsahuje kromě specializovaných buněk, plnící danou funkci orgánu také buňky, které dokážou tkáň regenerovat. Takovéto buňky mají v porovnání s ES buňkami svůj diferenciační potenciál snížený a většinou se mohou diferencovat jen do určitých buněčných typů. Dlouho se myslelo, že kmenové buňky v dospělém organismu jsou jen ve tkáních, které potřebují neustále obnovovat své buňky (kůže), nebo produkovat nové buňky i mimo tkáň (kostní dřeň). Nový pohled na tuto skutečnost přinesl nález kmenových buněk ve stěnách komor savčího mozku. Zde se vyskytuje jedna vrstva ependymálních buněk. Ukazuje se, že tyto ependymální buňky vykazují jistou multipotenci a také se dokáží samy obnovovat in vitro (Johanson et al., 1999). In vivo dokáží generovat neurony olfaktorického bulbu (čichový lalok). Dále se vyskytují běžné unipotentní buňky ve tkáních. Například ve svalové tkáni jsou tyto unipotentní buňky, ze kterých vznikají již diferencované svalové buňky. Nedávné studie také ukázaly, že dospělé kmenové buňky se mohou přizpůsobovat prostředí, do kterého byly umístěny. Také bylo dokázáno, že působením růstových faktorů můžeme přimět kmenové buňky diferencovat se do úplně jiných buněčných typů, než byly původně směřovány. Pokud aplikujeme na multipotentní buňky hematopoetické linie určité růstové faktory in vitro mohou z nich vzniknout osteoblasty, chondrocyty a adipocyty (Vats et al., 2005). Protože kmenové buňky mohou mít stejného dárce i příjemce, mohou se v budoucnu stát cílem buněčných terapií, bez hrozby odmítnutí buněk imunitním systémem Izolace a kultivace ES buněk Historie izolace ES buněk sahá do roku 1981, kdy se podařilo nezávisle dvěma vědeckým týmům izolovat myší ES buňky (mesc; mes buňky) (Martin, 1981; Evans a Kaufman, 1981). Buňky byly izolovány z vnitřní buněčné masy (ICM) blastocysty. Následovaly izolace ES buněk z křečka (Doetschman et al., 1988), králíka (Graves a Moreadith, 1993), norka (Sukoyan et al., 1993), krávy (First et al., 1994), potkana (Iannaccone et al., 1994), prasete (Wheeler, 1994) a kuřete (Pain et al., 1996). Izolace lidských ES buněk (hesc; hes buňky) byla provedena dvěma na sobě nezávislými týmy 6

7 (Reubinoff et al., 2000; Thomson et al., 1998). ES buňky z různých organismů se liší svými kultivačními nároky a expresí molekulárních markerů (tabulka 1 a obrázek 3). Marker Myši Opice Člověk SSEA SSEA SSEA TRA TRA Alkalická fosfatáza Oct Tabulka 1: Porovnání molekulárních markerů pluripotence mezi ES buňkami myši, opice a člověka. Převzato z (Kirschstein a Skirboll, 2001). Upraveno. Blastocysta (obrázky 1, 2 a 4a) se skládá ze dvou typů skupin buněk. První je vnitřní buněčná masa ICM, která dává vznik všem typům tkání embrya, druhá je trofektoderm, ze kterého se vyvíjí placenta. Z toho vyplývá, že ES buňky se nemohou diferencovat do trofektodermu. Proto jsou ES buňky pluripotentní a nikoliv totipotentní. Při izolaci ES buněk se nejprve odstraní vrstva trofektodermu a ICM je následně umístěna na vrstvu podpůrných buněk (obrázek 2 a 4). Tyto podpůrné buňky jsou myší embryonální fibroblasty (mef), které jsou izolované z 11 až 13 denních myších zárodků. Tato vrstva podpůrných buněk se nazývá feeder. Po několika dnech kultivace se začínají formovat kolonie ES buněk (Reubinoff et al., 2000; Thomson et al., 1998). Jednotlivé kolonie ES buněk jsou poté přeneseny na čerstvé mef buňky. Abychom zabránili diferenciaci ES buněk, musí se médium každý den měnit a také se musí ES buňky každých 4-6 dní přenést do nového média obsahující nové mef buňky. V minulých letech bylo izolováno mnoho buněčných linií hes buněk, jejich registr je uveden na: 7 Obrázek 2: Schéma izolace ES buňek z blastocysty a následná kultivace na myších embryonálních fibroblastech. Převzato z (Kirschstein a Skirboll, 2001). Upraveno.

8 Obrázek 3: Některé markery u hes buněk: A) alkalická fosfatáza B) OCT-4 C) SSEA-3 D)SSEA-4 E) TRA-1-60 F) TRA Měřítko je 100µm. Převzato z (Klimanskaya et al., 2005). Upraveno. Obrázek 4: Postup izolace hes buněk. Převzato z (Stojkovic et al., 2004). Upraveno. 8

9 Kultivace ES buněk sebou přináší značné komplikace v podobě velkých nároků na kultivační médium. Cílem je vyvinout takové médium, ve kterém si buňky udrží svůj nediferencovaný stav, snadno v něm proliferují a které neobsahuje cizorodé nebo jinak toxické látky. Musí být rovněž levné a snadno připravitelné. Médium, splňující všechna uvedená kritéria, nebylo zatím vyvinuto Kultivace myších ES buněk Vzhledem k tomu, že kultivace hes buněk vychází z modelu kultivace mes buněk a mnoho diferenciačních modelů je založeno na diferenciaci právě mes buněk, je nutné zmínit se o základech kultivace a diferenciace mes buněk. Myší ES buňky se kultivují na mitoticky inaktivovaných embryonálních myších fibroblastech (mef). Tyto fibroblasty produkují do média různé, stále zatím neidentifikované faktory, které podporují proliferaci a udržují nediferencovaný stav mes buněk. Jedním z již identifikovaných faktorů, které feeder produkuje, je LIF (Leukemia Inhibitory Factor). Tento cytokin, patřící do rodiny IL-6, se váže na receptor LIFR a gp130. Heterodimerní komplex těchto dvou receptorů aktivuje Obrázek 5: Aktivace STAT3 a ERK pomocí dimeru receptoru LIFR/gp130. LIF stabilizuje spojení LIFR a gp130. Použitím estrandiolu může být STAT3 aktivován bez přídavku LIF. (Burdon et al., 2002). Obrázek byl převzat z (Kirschstein a Skirboll, 2001). Upraveno. Janus tyrozin proteinkinázy (JAK), které fosforylují intracelulární domény receptorů. Na 9

10 fosforylované tyroziny receptoru se SH2 doménami navážou proteiny STAT3 a fosforylují se. Molekuly STAT3 se poté z receptoru uvolní a dimerizují (obrázek 5). Jednotlivé dimery putují do jádra, kde řídí expresi genů zodpovědných za proliferaci a potlačení diferenciace (Burdon et al., 2002; Ying et al., 2003). Avšak v laboratorních podmínkách kultivace mes buněk může úspěšně probíhat i bez přítomnosti LIF, ale za předpokladu, že médium bude obsahovat hyper IL-6, kombinaci interleukinu-6 (IL-6) a rozpustného IL-6 receptoru. Tento komplex rozpustného receptoru a jeho ligandu dokáže aktivovat monomerní receptor gp130 a následnou aktivaci transkripčního faktoru STAT3, který udržuje pluripotenci buňky (Humphrey et al., 2004). Paradoxně, signálem z gp130 se aktivuje Ras-ERK1/2 cesta, která způsobuje ztrátu pluripotence a počátek diferenciace buňky (Burdon et al., 1999; Burdon et al., 2002). LIF nestačí úplně k udržení pluripotence, navíc buňky mají tendenci diferencovat směrem k neuronům. Proto se používá kombinace LIF a BMP (Bone Morfogenetic Protein). LIF a BMP úspěšně udržují proliferaci i pluripotenci buněk. Myší ES buňky tak mohou růst bez potřeby feedru nebo séra (Ying et al., 2003). BMP působí na buňku transkripčními faktory rodiny Smad, které indukují expresi genu Id (Inhibitor of Differentiation). Tento gen zapříčiňuje blokování neurální diferenciace tím, že inhibuje neurogenetické transkripční faktory (Ying et al., 2003) Kultivace lidských ES buněk Kultivace hes buněk sebou přináší značné komplikace v podobě velkých nároků na kultivační médium. Je velmi důležité vyvinout jednoduché a levné systémy kultivace nediferencovaných hes buněk. Buňky v médiu nesmí spontánně diferencovat, musí se samy obnovovat. Pokud předpokládáme použití hes buněk k terapeutickým účelům, nesmí médium osahovat nežádoucí složky, které mohou obsahovat patogeny. Podobně jako mes buňky, jsou i hes buňky typicky kultivovány v médiu obsahujícím mef a sérum (komplex proteinů neznámého původu většinou zvířecího původu). Dalším způsobem je kultivace na matrigelu (směs lamininu, kolagenu IV, heparan sulfátu, proteoglykanů (HSPGs) a entaktinu) s mef kondiciovaným médiem (mef-cm) (Rao a Zandstra, 2005). Vzhledem k předpokládanému terapeutickému využití lidských ES buněk je použití séra, které obsahuje proteiny zvířecího původu, ke kultivaci nebezpečné. mef nebo mef- CM mohou být zdrojem pro člověka velmi nebezpečných patogenů - převážně virů. Při 10

11 přenosu hes buněk do organismu by tak mohlo dojít k infekci příjemce patogeny. Proto vědci stále hledají nejvhodnější metody kultivace, které by eliminovaly nežádoucí elementy přítomné v médiu. Zkoumání látek, které jsou produkovány mef a hrají úlohu při uchovávání pluripotence při kultivaci hes buněk, by mohlo přispět k vývoji média s lépe definovaným složením. LIF ani IL-6, produkovaný mef, není zodpovědný za udržení pluripotence, protože oba ligandy nejsou schopny se na receptory hes buněk navázat. Navíc lidský LIF není schopen udržet hes buňky v nediferencovaném stavu (Thomson et al., 1998). Zvláštní je, že i když hes buňky exprimují LIF, IL-6 a gp130 receptory, přesto signální dráhy asociované s těmito receptory nestačí k udržení pluripotence. Toto bylo dokázáno stimulací mes i hes buněk růstovými faktory LIF, IL-6 nebo hyper IL-6. U obou typů došlo k fosforylaci ERK1, ERK2 i Akt kináz a také k aktivaci STAT3. Avšak ke ztrátě pluripotenčních markerů Nanog, Oct-4 a TRA-1-60 došlo jen u hes buněk (Humphrey et al., 2004). Navíc běžně pěstované hes buňky na mef feedrech nebo v mef kondiciovaných médiích nevykazují žádnou aktivaci STAT3. Z toho vyplývá, že samotná aktivace transkripčního faktoru STAT3 není dostatečná k udržení pluripotence u hes buněk (Humphrey et al., 2004). Tohle jasně dokazuje nejen rozdíly mezi lidskými a myšími ES buňkami, ale také přítomnost stále nedefinované složky v médiu obsahujícím myší fibroblasty. Jedním způsobem, jak se vyhnout použití zvířecích buněk při kultivaci, je kultivační metoda neobsahující mef. Avšak v tomto případě je třeba do média přidávat směs různých růstových faktorů ve vyšších koncentracích. Aby byla dosažena eliminace zvířecích látek, musí být sérum nahrazeno jinou látkou. V současné době se používá serum replacement (SR). SR je opět směs proteinů, ale již známého složení. Avšak SR obsahuje hovězí albumin, takže eliminace všech zvířecích látek z média nebyla doposud uskutečněna (shrnuto v Rao a Zandstra, 2005). Buňky hes potřebují ke kultivaci za těchto podmínek odlišné látky než mes buňky, kterým stačí pouze LIF a BMP. Aby bylo vůbec možné takovéto médium vyvinout, bylo třeba identifikovat látky obsažené v médiích obsahujících mef. V roce 2002 bylo v médiu, obsahujícím mef, identifikováno 136 neznámých druhů proteinů (Lim a Bodnar, 2002). Přestože bylo v posledních letech provedeno velké množství pokusů, všechny látky produkované mef, které hrají hlavní roli v udržení pluripotence, jsou stále neidentifikované. Studie o signálních dráhách, které působí na sebeobnovu hes buněk, mohou poskytnout důležité informace pro identifikaci externích faktorů k udržení nediferencovanosti v kultuře. 11

12 K uchování nediferencovaného stavu hes buněk je nutná přítomnost tří transkripčních faktorů Oct4 (původní označení Pou5f1), Nanog (Chambers a Smith, 2004) a Rex-1 (Sato et al., 2004). Tyto faktory jsou aktivovány různými signály, které spolu kooperují nebo působí proti sobě. Mezi tyto signály patří složité signální dráhy a faktory, které tyto signální dráhy regulují. Všechny signální dráhy a faktory, které jsou zapojeny do sebeobnovy ES buněk, stále nejsou známy. Je známo pouze několik signálů, které se zdají být hlavními aktéry při udržení pluripotence hes buněk. Důležitým faktorem, který udržuje hes buňky v nediferencovaném stavu a udržuje sebeobnovu hes buněk, je fibroblastový růstový faktor FGF (Fibroblast Growth Factor). Do FGF spadá celá rodina růstových faktorů, čítající 22 různých ligandů, které se vážou na 4 typy povrchových FGF receptorů, označovaných FGFR1-4. Receptory FGF jsou také charakterizovány velkým množstvím izoforem, které jsou způsobeny alternativním sestřihem, takže každý FGFR může vázat mnoho FGF ligandů. FGF vázající se na FGFR tvoří formaci FGF-FGFR, která je stabilizována proteinem HSPG, vazba FGF indukuje dimerizaci receptoru a prostřednictvím tyrozin kinázové aktivity dochází k aktivaci Rasmitogen asociované proteinkinázy (MAPK), fosfatidylinositol-3 kináze (PI3) a fosfolipázy C (obrázek 6). Obrázek 6: Schéma signální dráhy aktivované FGF. Převzato z (Böttcher a Niehrs, 2005). 12

13 Analýza genové exprese prokázala, že signální dráha FGF je aktivní pouze v nediferencovaných buňkách. Pokud v médiu chybí FGF, buňky se mohou uchovávat v nediferencovaném stavu přidáváním jiných faktorů (TGF-β1 nebo aktivinu), ale jejich proliferace je velmi slabá (Dvořák et al., 2005; shrnuto v Rao a Zandstra, 2005). TGF-β (Transforming Growth Factor) je opět skupina asi 40 faktorů, které hrají významnou roli v udržení pluripotence hes buněk. Signál se spouští navázáním ligandu na receptory typu I a typu II, které mají serin/threonin kinázovou aktivitu. Signál z receptorů je dále veden dvěmi větvemi: SMAD1/5, která je aktivována receptorem typu I (ALK1, ALK2, ALK3 a ALK6); druhá TGF- β/aktivin/nodal větev ovlivňuje aktivaci SMAD2/3 receptory ALK4, ALK5 a ALK7. Aktivované transkripční faktory SMAD pak putují do jádra, kde řídí expresi genů (obrázek 7). Jak již bylo zmíněno, tento transkripční faktor udržuje buňky v nediferencovaném stavu a zvyšuje jejich proliferaci (James et al., 2005). BMP při kultivaci mes buněk zabraňuje jejich diferenciaci, kdežto při kultivaci hes buněk způsobuje jejich diferenciaci. Proto Obrázek 7: Schéma TGFβ/aktivin/nodal signální dráhy. Převzato z (Elliott a Blobe, 2005). se při kultivaci hes buněk do kultivačního média přidává noggin, který působí jako antagonista BMP a potlačuje tak jejich diferenciaci. V kultuře mes buněk způsobuje noggin jejich diferenciaci (Wang et al., 2005). Wnt signální dráha také ovlivňuje udržení pluripotence u hes i mes buněk. Wnt dráha je v nediferencovaných ES buňkách aktivována a při diferenciaci se aktivita této dráhy snižuje. Wnt je zodpovědná za indukci exprese transkripčního faktoru Rex-1 a udržuje expresi transkripčního faktoru Oct4 (Sato et al., 2004). Tato signální dráha se aktivuje navázáním Wnt proteinu na povrchový receptor. Signálem z receptoru se inaktivuje GSK-3 (glykogen syntázy kináza-3), čímž dojde k nahromadění β-kateninu v jádře. Tento β-katenin aktivuje transkripci Wnt genů (Sato et al., 2004). Bylo prokázáno, že mef sekretují při kultivaci ES buněk do kultivačního média Wnt protein a tím mohou podporovat růst nediferencovaných ES buněk. 13

14 Signální dráha, která je regulována faktory Nodal a Aktivin, je označována jako Nodal/Aktivin. Tento signál indukuje diferenciaci mesodermu, endodermu a determinuje pravou a levou asymetrii u obratlovců. Nodal a Aktivin se vážou na aktivinový receptor a aktivují tak transkripční faktor Smad2. Smad2 se pak váže na Smad4 a putuje do jádra, kde řídí expresi genů (Chambers a Smith, 2004). Dalším způsobem, jak se vyhnout použití zvířecích složek v médiu, je použití lidských fibroblastů jako feeder. Protože médium neobsahuje zvířecí složky, odpadá zde nebezpečí infekce zvířecími patogeny (Richards et al., 2003) Diferenciace ES buněk Diferenciací ES buněk rozumíme snižování diferenciačního potenciálu pluripotentní ES buňky za účelem získání skupiny buněk jednoho konkrétního buněčného typu (obrázek 8). Abychom však mohli plně využít léčebný potenciál ES buněk, je nutné vyvinout systémy cílené diferenciace k získání buněčných linií, které by byly aplikovatelné nejen pro buněčné terapie, ale také například pro vývoj nových léčiv a genovou terapii. embryonální kmenové buňky mezoderm ektoderm endoderm zárodečné buňky kosterní svaly, kosti, chrupavky atd. krev, srdce, endotel cév atd. nervová soustava, pokožka atd. trávicí trubice, játra, plíce atd. Obrázek 8: Schéma diferenciace ES buněk Diferenciace do embryoidních tělísek Pokud se mes buňky kultivují v médiu bez mef buněk, bez antidiferenciačních látek a za neadhezivních podmínek (v suspenzní kultuře nebo metodou visících kapek), pak se spontánně diferencují do trojrozměrných kulovitých útvarů nazývaných embryoidní tělíska EB (Embryoid Bodies) (obrázek 9) (Desbaillets et al., 2000). Uvnitř EB se vyvíjejí buňky diferencující se do entodermu, mezodermu a ektodermu (obrázek 8). U mnohých EB dochází také ke vzniku určité rytmické pulzace a to díky přítomnosti 14

15 kardiomyocytárních struktur (Kehat et al., 2001). Tím, že EB obsahují buňky všech zárodečných listů, jsou vhodným modelem ke studování časného embryonálního vývoje. Vzniklé EB je pro další diferenciaci buněk nutné převést na adhezivní povrch. Poté buňky začnou z EB vyrůstat do periferie a diferencovat se. Pokud ale chceme ES buňky diferencovat do konkrétního buněčného typu, je nutné změnit kultivační podmínky pro požadovaný Obrázek 9: Tvorba embryoidních tělísek (EB) změnou kultivačních podmínek in vitro. Převzato z (Kirschstein a Skirboll, 2001). Upraveno. buněčný typ. Nejefektivnější změnou kultivačních podmínek je přidání nebo odebrání růstových faktorů a úprava kultivačního povrchu bílkovinnými substráty. Pokud bychom nezměnili kultivační podmínky, vznikne heterogenní populace buněk všech možných typů. Technika diferenciace do EB je často počátečním krokem pro pozdější diferenciace v monovrstvě. EB se rozruší trypsinem a buňky jsou poté kultivovány v přítomnosti diferenciačního činidla Diferenciace v monovrstvě Diferenciace buněk v monovrstvě spočívá v působení látek indukujících diferenciaci na monovrstvu ES buněk. Lidské neurální prekurzory se získávají izolací po 3-4 týdenní kultivaci hes buněk bez výměny mef. Během této doby se hes buňky spontánně diferencují a začnou exprimovat neuroektodermální marker N-CAM. Oblasti, které tento marker obsahují, jsou pak izolovány a umístěny do média, které neobsahuje sérum (přítomnost bfgf a EGF je nutná) (Reubinoff et al., 2000). Během kultivace v těchto podmínkách buňky exprimovaly markery: N-CAM, nestin, A2B5, vimentin a transkripční faktor PAX-6. Když byly tyto prekurzory vpraveny do myši, objevila se tvorba jen nervových buněk. Tvorba teratomů nebo jiných buněk nebyla zaznamenána (shrnuto v Conley et al., 2004 včetně uvedených citací v publikaci). Hematopoetické kolonie tvořící buňky byly získány kultivací lidských ES buněk spolu s myšími buňkami kostní dřeně. Pouze 1-2% buněk byly CD34 + CD38 - a měly fenotyp hematopoetické buňky (Kaufman et al., 2001). 15

16 Myší ES buňky vzácně diferencují do trofektodermu. Naproti tomu lidské ES buňky diferencují do trofoblastu v přítomnosti rekombinantního lidského BMP4. Tyto buňky pak produkují gonadotropin, estradiol a progesteron (shrnuto v Conley et al., 2004 včetně uvedených citací v publikaci). Diferenciace ES buněk v monovrstvě poskytuje vhodný model pro získávání diferencovaných buněčných linií. Avšak při použití této metody nediferencují všechny buňky, ale pouze několik málo procent buněčné populace. Proto je třeba najít látky, které budou indukovat diferenciaci v mnohem větším počtu buněk Problematika terapeutického využití embryonálních kmenových buněk Potenciální terapeutické využití kmenových buněk je obrovské. Se svou schopností diferencovat do všech typů buněk se stávají vhodným nástrojem pro léčbu tkáňovými náhradami. Hlavním problémem při použití tkání diferencovaných z ES buněk je možnost odmítnutí tkáňového štěpu imunitním systémem. To je zprostředkováno molekulami MHCI (Major Histocompatibility Complex), které jsou exprimovány na povrchu buněk a jsou specifické pro každého jedince. Samotné ES buňky exprimují velmi málo MHCI, takže odmítnutí nehrozí. Pokud se ale buňky diferencují, začínají se exprimovat i molekuly MHCI, což může mít za následek již zmíněné odmítnutí nové tkáně. Existuje několik způsobů, jak se vyhnout tomuto odmítnutí. Jednou z možností je podávání imunosupresiv. Tyto imunosupresiva ovšem mají vedlejší účinky na organismus příjemce. Tento problém by mohlo vyřešit založení banky, která by obsahovala kompletní sbírku MHC molekul v populaci. Avšak, vzhledem k vysokým nákladům, je tento projekt v nedohlednu. Jedno z dalších řešení je terapeutické klonování (obrázek 11). Základním principem této metody je přenos jádra ze somatické buňky do enukleovaného (jádra zbaveného) oocytu. Následně se buňka kultivuje až do vzniku blastocysty. Z blastocysty se izolují hes buňky a kultivují se do patřičného počtu. Poté se u hes buněk indukuje diferenciace do požadované tkáně. Diferencované buňky již pak budou mít MHCI molekuly příjemce a mohou být vpraveny do pacientova těla (shrnuto v Stojkovic et al., 2004 včetně citací uvedených v publikaci). 16

17 Obrázek 10: Schéma změny nebo odstranění MHC pomocí genové manipulace (Kirschstein a Skirboll, 2001). Upraveno. Obrázek 11: Schématické zobrazení procesu přenosu jádra do enukleovaného oocytu (Kirschstein a Skirboll, 2001). Upraveno. ES buňky se jeví jako vhodný buněčný typ ke genetické manipulaci. Genetické manipulace se dá také využít i v ochraně před odmítnutím tkáňového štěpu příjemcem. Tato metoda spočívá v odstranění genu, který determinuje MHC nebo v přidání genu, který vyjadřuje MHC molekuly příjemce (obrázek 10). Toho může být dosaženo homologní rekombinací (Shrnuto v Kirschstein a Skirboll, 2001 včetně citací uvedených v publikaci). 2. Buněčný cyklus Buňka se rozmnožuje prostřednictvím uspořádaného sledu akcí, ve kterých zdvojí většinu svých komponent a následně se rozdělí na dvě buňky. Tento cyklus duplikace a dělení nazýváme buněčný cyklus. Buněčný cyklus dělíme do 4 fází: G1, S, G2 a M (obrázek 12). 17

18 Obrázek 12: Obecné schéma buněčného cyklu. Převzato z (Kirschstein a Skirboll, 2001). První fáze se nazývá předsyntetická a označuje se jako G1 fáze. Její součástí je kontrolní bod, který rozhoduje o dalším průběhu buněčného cyklu. Tento bod se nazývá G1/S kontrolní bod a rozhoduje, zda buňka přejde do S fáze buněčného cyklu. Na G1 fázi tedy navazuje syntetická fáze - S fáze. Probíhá zde replikace DNA a zdvojení chromozómů, které zůstávají stále spolu spojeny v místě centromery. V postsyntetické fázi, označované jako G2 fáze, buňka dále roste. Dochází zde k vytváření dalších nových buněčných struktur. G2 fáze obsahuje kontrolní bod G2/M, který rozhoduje, zda buňka vstoupí, či nevstoupí do M fáze. Mitotická fáze M fáze v buňce se vytváří mitotický aparát, mizí jaderná membrána a začíná mitóza. Samotná mitóza se skládá ze 4 fází: profáze, metafáze, anafáze a telofáze. Kontrolní body G1/S a G2/M jsou strategicky umístěny pro sledování integrity DNA tak, aby mohly zamezit dělení mutované nebo jinak poškozené buňky. Pokud se buňka nachází mimo buněčný cyklus ve fázi klidu, tento stav označujeme jako G0 fázi. Pokud je buňka v G0 fázi stimulována mitogeny nebo růstovými faktory, může z G0 fáze přejít do G1 fáze a pokračovat v buněčném cyklu. Kontrolní body G1/S a G2/M však nejsou jediná místa, kde může dojít k pozastavení buněčného cyklu. Existují ještě další 2 kontrolní body. První je v S fázi a může pozastavit buněčný cyklus dokud není DNA úplně replikovaná. Další se nachází v M fázi a dokáže pozastavit dělení buňky, pokud není správně vytvořeno dělící vřeténko (shrnuto v Garrett, 2001). 18

19 Každý kontrolní bod se skládá ze 3 částí. První částí je senzorový mechanismus, který zjišťuje, zdali je vše splněno pro přechod do další fáze, nebo jestli nedošlo k poškození DNA. Druhou částí je signální dráha, která zajišťuje přenos signálu od senzorové části ke třetí, efektorové části. Tato třetí část může navodit zastavení buněčného cyklu, dokud se problém nevyřeší (např. oprava DNA) (Garrett, 2001) Systém řízení buněčného cyklu Řízení buněčného cyklu je dosti komplikovaný a rozsáhlý proces, který musí být dokonale řízen. Proteiny, které se podílejí na řízení buněčného cyklu, nazýváme cykliny. Během života buňky hladina většiny cyklinů osciluje v závislosti na fázi, ve které se buňka právě nachází. Jakmile hladina určitého cyklinu překročí konkrétní kritickou hranici, spouštějí se procesy, které nezvratně směrují buňku do určité fáze buněčného cyklu. Jakmile je proces u konce, hladina cyklinu se rychle snižuje a tím připravuje buňku na nový proces. Cykliny přímo neaktivují tyto procesy, ale vážou se na cyklin dependentní kinázy (CDK), které již mohou přímo aktivovat proteiny zodpovědné za řízení těchto procesů. Cykliny, na rozdíl od CDK, jsou tedy syntetizovány jen během určité fáze buněčného cyklu, kdežto CKD jsou syntetizovány neustále. Cykliny aktivují CDK navázáním na jejich molekulu. Po uskutečnění této vazby dojde k odkrytí katalyticky aktivního místa. Takto aktivované kinázy mohou fosforylovat proteiny, které uvádějí do chodu procesy spojené s průchodem buněčným cyklem - syntéza DNA, segregace chromozomů nebo přímo proces, který je specifický pro daný cyklin. Řízení buněčného cyklu ale není tak jednoduché, jak by se mohlo zdát. Aby došlo k dokonalému vyladění všech procesů, buňka musí disponovat mnoha dalšími proteiny. Některé z nich blokují cykliny, jiné mohou přijímat růstové signály od okolních buněk a zvyšovat účinek cyklinů tak, aby se buňka mohla dělit, pokud jí to okolní podmínky umožní. Nádorové buňky se často vyznačují mutací právě v těchto mechanizmech řízení. Blokují kontrolní body buněčného cyklu, zvyšují četnost dělení buněk, vedou buňky k abnormálním proliferacím. Vědci se pokoušejí najít vhodnou terapii, která by zamezila nekontrolovatelnému dělení nádorových buněk na úrovni cyklinů. Bylo již vyvinuto mnoho inhibitorů cyklin dependentních kináz. Tyto syntetické inhibitory se vážou na molekulu CDK v místě, kam se váže ATP (ATP binding pocket), a tím brání fosforylaci dalších proteinů. Působením inhibitoru na nádorovou buňku dojde k zastavení dělení, nebo k indukci apoptózy (shrnuto v Goodsell, 2004). 19

20 Cyklin dependentní kinázy (CDK) CDK jsou serin/threonin dependentní protein kinázy, které se výrazně podílejí na regulaci buněčného cyklu. Buněčný cyklus regulují tím, že dokáží fosforylovat určité proteiny resp. skupiny proteinů. Tyto proteiny pak pozitivně regulují transkripci genů zodpovědných za vstup buňky do určité fáze buněčného cyklu. Částečná aktivace kinázy spočívá v navázání cyklinu na CDK podjednotku (pro přehled nejdůležitějších CDK a jejich cyklinů viz tabulka 2). Úplná aktivace pak závisí na fosforylaci CDK komplexu enzymem CAK (CDK-aktivační kináza). CDK fosforylují četné proteiny, které řídí expresi genů odpovědných za průběh buněčného cyklu. Pokud dojde k expresi určitého genu (resp. skupiny genů), přejde buňka do určité fáze buněčného cyklu. Lidský genom kóduje asi 2000 proteinkináz. Z tohoto počtu je 9 cyklindependentních kináz (CDK1-9), které jsou aktivovány cykliny (A-K a T) (Meijer et al., 1999). Inhibice nebo aktivace CDK může vést nejen k regulaci proliferace, ale také k indukci diferenciace. CDK tak hrají významnou roli v udržování rovnováhy mezi buněčnou proliferací a diferenciací, i když funkce některých CDK se liší v závislosti na buněčném typu (Malgrange et al., 2003) CDK inhibiční proteiny (CKI) Aktivace CDK však může být také inhibována navázáním CDK-inhibičního proteinu (CKI) na molekulu CDK. CKI dělíme do 2 rodin: a) Cip/Kip (CDK Interacting Protein/Kinase Inhibitory Protein) rodina, do které řadíme inhibitory p21 CIP1, p27 KIP1 a p57 KIP2. Tyto proteiny inhibují CDK4, CDK6, CDK2 a CDK1 (tabulka 2) (shrnuto např. v Garrett, 2001 včetně citací uvedených v publikaci). b) INK4 rodina inhibuje kinázu CDK4. Do této rodiny patří p15 INK4B, p16 INK4A, p18 INK4C a p19 ARF. p16 INK4a inhibuje CDK4 a CDK6, kdežto p19 ARF se váže na MDM2 a blokuje destrukci p53 (viz kapitola ). p15 INK4B, p18 INK4C a p19 ARF inhibují komplex CDK4/cyklin D a CDK6/cyklin D (tabulka 2) (shrnuto např. v Garrett, 2001 včetně citací uvedených v publikaci). Přehled všech cyklinů a jejich kináz je uveden v tabulce 2. 20

21 cyklin-dependentní kináza aktivující cyklin CKI inhibitor CDK2 cyklin A (A1 nebo A2) Cip/Kip cyklin E (E1 nebo E2) Cip/Kip CDK4 cyklin D1 cyklin D2 Cip/Kip, INK4 cyklin D3 CDK6 cyklin D1 cyklin D2 Cip/Kip, INK4 cyklin D3 Tabulka 2: Cykliny, CDK a jejich inhibitory Buněčný cyklus v somatických savčích buňkách Buněčný cyklus v buňce začíná ve fázi G1, kdy dochází ke zvýšené expresi cyklinu D (D1, D2, D3). D cykliny se vážou na CDK4 a CDK6 (viz obrázek 5). Ve formaci CDK/cyklin je následně CDK fosforylována a aktivována. Aktivované CDK poté fosforylují retinoblastový protein RB (Garrett, 2001; Israels a Israels, 2001). Fosforylací RB začíná G1/S kontrolní bod Kontrolní bod G1/S Proliferace diferencovaných savčích buněk je kontrolována regulací kontrolního bodu G1/S (obrázek 13). Tento kontrolní bod zjišťuje, zda buňka přijala nezbytné růstové signály (většinou extracelulárního původu), aby pak mohla přejít do S fáze. Pokud jsou růstové signály dostatečné, buňka přejde přes tento kontrolní bod a po zbytek buněčného cyklu již tyto signály nepotřebuje. Pokud jsou růstové signály nedostatečné, Obrázek 13: Schéma kontrolního bodu G1/S. Převzato z (Israels a Israels, 2001). Upraveno buňka přejde do G0 fáze. Tento kontrolní bod také kontroluje, jestli není DNA poškozená. Pokud je DNA poškozená, buněčný cyklus se v tomto bodě zastaví, dokud není DNA 21

22 opravená. Pokud je ovšem poškození DNA natolik velké, že není možné DNA opravit, buňka apoptuje. Nejdůležitější proteiny, které jsou zodpovědné za úspěšný průchod tímto bodem, jsou RB proteiny. Do rodiny RB proteinů patří proteiny p107, p130 a prb. Aktivita RB proteinů je řízena fosforylací. Hypofosforylovaný RB tedy inhibuje expresi genů, které jsou potřebné pro vstup do S fáze buněčného cyklu tím, že váže E2F transkripční faktor a ten je pak neúčinný. Jak již bylo zmíněno, fosforylace RB probíhá v G1 fázi a RB je zde fosforylován komplexy cyklinů a jejich cyklin dependentních kináz (CDK4/cyklin D a CDK6/cyklin D). Fosforylace komplexu CDK4/cyklin D nebo CDK6/cyklin D indukuje pouze částečné uvolnění E2F tím, že ruší vazbu RB s E2F. Toto množství E2F je však dostatečné k aktivaci transkripce genu pro cyklin E a Cdc25A. Cdc25A je enzym fosfatáza, která odstraňuje z CDK2 fosfáty. Po odstranění fosfátů se na CDK2 naváže cyklin E a vznikne komplex CDK2/cyklin E. Avšak neustálá přítomnost CIP/KIP inhibitorů může komplex CDK2/cyklin E inhibovat. Proto se zde patrně uplatňuje druhá funkce cyklin D dependentních kináz. Tyto kinázy totiž mohou odvádět CIP/KIP inhibitory od CDK2/cyklin E. Komplex pak dokončí úplnou fosforylaci RB proteinů, které pak vedou k úplnému uvolnění E2F a buňka se nezvratně blíží do S fáze (obrázek 13) (shrnuto např. v Izraels a Izraels, 2001; Garrett, 2001). Pro regulaci buněčného cyklu existuje i druhá cesta. Tato cesta je spojena s protoonkogenem c-myc. Tento protoonkogen přímo stimuluje transkripci genů, které kódují cyklin E a cdc25a (shrnuto v Burdon et al., 2002). Obě dráhy, Myc i RB/E2F, jsou paralelní a navzájem spolu kooperují. Mutace v těchto signálních drahách se často vyskytuje v nádorových buňkách a tyto buňky se pak dokážou nekontrolovatelně množit (Burdon et al., 2002). Pokud buňka v tomto kontrolním bodě zaznamená poškození DNA, buněčný cyklus se může zastavit. Pokud je však poškození natolik veliké, že buňka nemůže DNA opravit, buňka apoptuje. Integrita buněčného genomu je monitorována transkripčním faktorem p53. Pokud je DNA poškozena, p53 se váže na specifické místo na DNA, a tím zvyšuje syntézu dalších p53. Následná fosforylace jej aktivuje. Aktivní p53 dokáže přerušit buněčný cyklus, aby buňka mohla poškozenou DNA opravit. Protein p53 zastavuje buněčný cyklus tak, že inhibuje fosforylaci RB proteinů. Negativní regulaci p53 zajišťuje MDM2 protein a MDM2 je sám regulován prostřednictvím p53. MDM2 snižuje expresi p53 a sám se může na p53 navázat a 22

23 inaktivovat jej. Inaktivace spočívá v odvádění p53 z jádra, jeho ubikvitinací s následným proteolytickým štěpením (Israels a Israels, 2001). Působení p53 je uskutečněno CDK inhibičním proteinem (CKI) p21 CIP1. Tento protein je schopen inhibovat CDK4, CDK6 a CDK2. Tato inhibice cyklin dependentních kináz zamezuje fosforylaci RB proteinů, a tím buňka může setrvat v G1 fázi a poškozenou DNA opravit. Pokud je poškození DNA natolik velké, že jej buňka nedokáže opravit, p53 způsobí její apoptózu indukcí proteinu Bax (Israels a Israels, 2001). Obrázek 14: Schéma zapojení kináz a jejich inhibitorů do řízení kontrolních bodů v buněčném cyklu v závislosti na poškození DNA. Převzato z (Garrett, 2001). Upraveno. V důsledku působení p53 roste i hladina inhibitoru p21 CIP1, který následně inhibuje CDK4 a CDK6. Výsledkem toho, že CDK4 a CDK6 nejsou fosforylovány, nefosforylujou se ani RB proteiny a buňka tak může zůstat v G1 fázi (obrázek 13 a 14) (Israels a Israels, 2001). Zastavení buněčného cyklu v kontrolním bodě G1/S začíná postupnou degradací cyklinu D1. Tato degradace vede k uvolnění p21 CIP1 z CDK4. Uvolněný p21 CIP1 poté může inhibovat CDK2. Mimo inhibici CDK2 dochází také k degradaci Cdc25A fosfatázy. Tato degradace Cdc25A je indukována serin/threonin kinázou Chk1 (serin/threonin checkpoint kinase 1) (obrázek 14). K udržení tohoto stavu přispívá produkt tumor supresorového genu TP53, protein p53. p53 spouští expresi genů zodpovědných za zastavení buněčného cyklu nebo apoptózu. Jedním z produktů těchto genů je p21 CIP1, který se váže na CDK2/cyklin E, čímž dojde k zastavení buněčného cyklu. Aktivace p53 je závislá na ATM proteinkináze. Pokud je DNA poškozená, ATM fosforyluje Chk2 (serin/threonin checkpoint kinase 2) a Chk2 následně fosforyluje p53 (shrnuto v Garrett, 2001) S fáze Komplex E/CDK2 je potřebný pro přechod buňky z G1 do S fáze. Ovšem během tohoto přechodu se také zvyšuje hladina cyklinu A a přetrvává během celé S fáze. Cyklin 23

24 A se pak váže na CDK2. Díky změně cyklinu se mění také substrátová specifita CDK2 a CDK2/cyklin A nyní fosforyluje protein Cdc6, který spouští replikaci DNA. V pozdější části S fázi dochází k navázání cyklinu A na CDK1 (dříve označovaný jako Cdc2 nebo p34 Cdc2 ) (shrnuto v Israels a Israels, 2001; Garrett, 2001). Poškození DNA v S fázi nevyvolává zastavení buněčného cyklu, ale pouze jeho zpomalení (Rowley et al., 1999; Rhind a Russel., 2000). Byly nalezeny 4 proteiny, které se podílejí na zpomalení této fáze: ATM, Nibrin (dříve NBS1), Mre11, Rad50. V S fázi jsou Nibrin, Mre11 a Rad50 vázány spolu v komplexu. Nibrin je aktivován ATM kinázou a hraje úlohu při opravě dvojitého zlomu DNA. Zpomalení buněčného cyklu v S fázi může být také způsobeno p21 CIP1, který zpomaluje replikaci DNA tím, že inhibuje aktivitu CDK. Ukázalo se však, že přítomnost p21 CIP1 není nutná ke zpomalení S fáze (shrnuto v Garrett, 2001 včetně citací uvedených v publikaci) Kontrolní bod G2/M Tento kontrolní bod má za úkol nevpustit buňku do M fáze, pokud je syntéza DNA ještě nedokončena nebo je DNA poškozena. Vstup do M fáze je tak zpožděn až do kompletní syntézy DNA nebo do té doby, než se DNA opraví. Přechod buňky z G2 fáze do M fáze vyžaduje přítomnost CDK1. Zvýšené hladiny cyklinu A a B, které se vážou na CDK1, jsou důležité pro průchod M fází buněčného cyklu. Zastavení buněčného cyklu v tomto kontrolním bodě se děje pomocí stejných proteinů jako v G1/S. Jediným rozdílem je, že cílem není komplex CDK2/cyklin E, ale CDK1/cyklin B, který je potřebný pro přechod z G2 do M fáze. Hlavním úkolem G2/M je udržovat CDK1/cyklin B v inaktivním stavu. To se opět děje za účasti ATM, která signalizuje poškození DNA. ATM fosforyluje Chk1 a Chk2, které blokují činnost Cdc25C fosfatázy. Tato fosfatáza pak nemůže odstranit fosfáty z CDK1, protože je odváděna z jádra do cytoplazmy. Inhibice buněčného cyklu může být v tomto kontrolním bodě zprostředkována pomocí p53. p53 indukuje expresi p21 CIP1, který se váže na CDK1/cyklin B a tento komplex tak inhibuje (shrnuto v Garrett, 2001). Zjednodušené schéma buněčného cyklu a jeho regulátorů je uvedeno na obrázku

25 Obrázek 15: Schéma buněčného cyklu a působení přirozených buněčných regulátorů na buněčný cyklus. Převzato z (Meijer, 2000) Buněčný cyklus v ES buňkách Buněčný cyklus u ES buněk byl zatím zkoumán jen u zvířecích ES buněk. Původně se předpokládalo, že konfigurace molekul, které řídí buněčný cyklus bude u všech druhů stejná. Avšak nové studie ukázaly rozdíly mezi myšími a opičími ES buňkami (Fluckinger et al., 2006). ES buňky se vyznačují extrémně rychlým průchodem buněčným cyklem. Průměrná doba trvání buněčného cykluje 8-11 hodin. (Savatier et al.,1994; Stead et al., 2001). Toto je dáno unikátním seskupením a konfigurací molekul, které jej regulují. Komplexy CDK2/cyklin E a CDK2/cyklin A jsou aktivní během celého cyklu (Stead et al., 2002), oproti somatickým buňkám, ve kterých hladina cyklinů osciluje v závislosti na fázi buněčného cyklu. Pokud však dojde k diferenciaci buněk, dochází také ke snížení hladiny cyklinu A a E. (Fluckiger et al., 2006). Navíc, RB proteiny se v ES buňkách vyskytují převážně v hyperfosforylované formě (Savatier et al., 1994). Tyto skutečnosti vedou k tomu, že ES buňky mohou téměř ihned po mitóze vstoupit do S fáze a začít replikovat DNA. 25

26 G1 fáze v ES buňkách Embryonální kmenové buňky jsou charakteristické rychlým průchodem přes G1 fázi. Tato fáze zaujímá 15% buněčného cyklu (G1 trvá v ES buňkách cca 1,5 h) (Fluckiger et al., 2006; Savatier et al., 1994). Hypofosforylované RB proteiny jsou během G1 fáze nedetekovatelné. Narozdíl od diferencovaných buněk, jsou RB u ES refosforylovány ihned po mitóze. Proteiny RB (v ES buňkách se jedná o p107 a prb) jsou neustále fosforylovány komplexy CDK2/cyklin E a CDK2/cyklin A, které jsou v ES buňkách trvale aktivní. V důsledku toho hyperfosforylované RB neváží proteiny E2F. Tím je zřejmě umožněn rychlý průchod G1 fází. Otázkou zůstává, zda regulace G1 fáze u ES buněk je řízena přímo prb proteinem nebo některým ze členů rodiny RB proteinů, eventuelně jestli je prb inaktivován postupnou hyperfosforylací. Vzhledem k tomu, že ES buňky neexprimují p130, ale exprimují p107, ukazuje se, že RB dráha nejspíše vůbec nereguluje buněčný cyklus u ES buněk (Burdon et al., 2002). Cykliny A a E jsou v ES buňkách syntetizovány neustále, avšak cykliny D1 a D3 jsou přítomny jen v malých množstvích, zatímco cyklin D2 není přítomen vůbec (Burdon et al., 2002; Fluckiger et al., 2006), takže aktivita CDK4 je malá. Pokud je indukována diferenciace, dochází k mohutné syntéze cyklinu D a k aktivaci CDK4/cyklin D (Savatier et al., 1996). S tím související malá aktivita CDK4/cyklin D může přispívat k hyperfosforylaci prb a zároveň může odvádět p27 KIP1 od CDK2/cyklin E a tím zamezit inhibici CDK2/cyklin E (shrnuto v Burdon et al., 2002). ES buňky vykazují určitou rezistenci k inhibitoru p16 INK4A. Tato rezistence je typická pro nádorové buňky, které se vymkly kontrole. Pokud je u ES buněk indukována diferenciace, dochází ke zvýšení vnímavosti ES buněk k účinku p16 INK4A (Savatier et al., 1996). Další zajímavostí ES buněk je, že cyklin E je exprimován během celého cyklu, zatímco u somatických buněk je exprimován pouze při přechodu z G1 do S fáze (Fluckiger et al., 2006). Během G1 fáze může buňka přijímat růstové signály a začít tak diferencovat. Krátká G1 fáze tak může působit jako určitá ochrana pluripotentních buněk před indukcí diferenciace (Fluckiger et al., 2006). 26

27 G1/S kontrolní bod v ES buňkách Kontrolní bod G1/S v ES buňkách není přítomen (Fluckiger et al., 2006); respektive není závislý na klasické cestě CDK4/6/cyklin D-pRb:E2F (Burdon et al., 2002; White et al., 2005), protože ES buňky obsahují velmi nízké hladiny cyklinů D. Hladina cyklinů D stoupá až po indukci diferenciace (Savatier et al., 1996). Z toho vyplývá, že vstup do S fáze je řízen pouze CDK2 (Burdon et al., 2002). Rychlý průchod cyklem tedy zajišťují neustále aktivní komplexy CDK2/cyklin E (obrázek 16) a CDK2/cyklin A (Stead et al., 2002). Toto však platí pouze u myších ES buněk. U opičích ES buněk nebyla přítomnost cyklinu A ve všech fázích buněčného cyklu dokázána (Fluckinger et al., 2006). Pokud dojde k poškození DNA, ES buňky sice syntetizují dostatečné množství p53, ale k zastavení buněčného cyklu nedojde (Aladjem et al., 1998; Fluckiger et al., 2006). Nabízí se otázka, jak se dokážou ES buňky vyrovnat s poškozením genomu, když postrádají G1/S kontrolní bod. Jedním z vysvětlení je, že p53 způsobuje u ES buněk apoptózu (Aladjem et al., 1998; Fluckiger et al., 2006) a takto se tedy mohou eliminovat buňky s poškozeným genomem. Nedávné studie ukázaly, že p53 může inhibovat aktivitu transkripčního faktoru nanog, způsobit diferenciaci, a tím eliminovat poškozenou buňku ze skupiny pluripotentních buněk (Lin et al., 2005). Obrázek 16: Model kontroly buněčného cyklu v ES buňkách. Přerušovaná čára mezi CDK4/6 a RB znamená, že CDK4 a CDK6 není důležitá ve fosforylaci RB. Převzato z (Burdon et al., 2002). Upraveno G2/M přechod u ES buněk ES buňky nemohou zastavit buněčný cyklus v G1 fázi v důsledku přítomnosti hyperfosforylovaných RB, mohou ale zastavit v G2/M kontrolním bodu, protože tento bod není závislý na RB (Aladjem et al., 1998). 27

28 3. Inhibice CDK umělými inhibitory V uplynulých letech bylo publikováno mnoho studií o úloze cyklin dependentních kináz během buněčného dělení. Objevení funkce CDK vedlo vědce k úvaze, že inhibice CDK může vést k zastavení buněčného dělení nebo způsobit diferenciaci. Pokud by se podařilo vyvinout látku, která dokáže specificky inhibovat aktivitu CDK, mohla by se použít při léčbě rakoviny a jiných nemocí způsobených špatnou proliferací buněk. Syntetické inhibitory jsou látky, které se navážou na CDK do místa, kam se váže ATP (ATP binding pocket), a tím kompetitivně inhibují její aktivitu (Havlíček et al., 1997). Tyto preparáty jsou syntetické analogy rostlinných cytokininů (Vermeulen et al., 2002a). Jejich chemická stavba je 2,6,9-trisubstituovaný purin (chemické vzorce preparátů viz tabulka 3), kde jednotlivé substituenty jsou zodpovědné za afinitu k CDK nebo zvyšují účinnost inhibitoru (Kryštof et al., 2002; Vermeulen et al., 2002b). Objevují se i preparáty odlišné chemické struktury (pyrimidiny, oxindoly, flavonoidy aj.). Veškerý přehled CDK inhibitorů obsahuje databáze s názvem KID na adrese (Collin a Meijer, 1999). V době psaní této práce je však tato databáze pozastavena. Prvním inhibitorem byl Olomoucin (Veselý et al., 1994). Tento preparát selektivně inhibuje CDK1, CDK2 a CDK5. (Veselý et al., 1994; Kryštof et al., 2002). Po objevu Olomoucinu nastalo hledání nových preparátů, které by inhibovaly CDK při ještě nižších koncentracích. Strukturální modifikace Olomoucinu vedly k vývoji Roskovitinu (Havlíček et al., 1997; Meijer et al., 1997). Tento preparát je účinný při mnohem menších koncentracích (tabulky 3 a 4) a nyní je v IIb klinickém testování jako perorální cytostatikum (osobní komunikace s prof. Strnadem, 2006). Podrobná analýza krystalické struktury CDK2-Roskovitin (De Azevedo et al., 1997) motivovala další vědecké týmy k syntéze nových a ještě účinnějších preparátů, založených na 2,6,9-trisubstituovaném purinu. Výzkum těchto látek přinesl nový preparát s názvem Purvalanol A. Tento preparát je 100krát účinnější než Roskovitin Působení CDK inhibitorů na živý organismus Pokud by v budoucnu měly být umělé CDK inhibitory nasazené v terapii, musí se nejprve dokonale prozkoumat jejich metabolismus in vivo. Metabolismus těchto látek v savčím těle byl zatím zkoumán jen u myší a krys. 28

29 Tyto látky jsou lipofilního charakteru, takže dobře procházejí cytoplazmatickou membránou (osobní komunikace s prof. Strnadem, 2006), avšak, pokud má buňka špatně propustnou membránu (u embryí Drosophila m. a kvasinek), nedochází k proniknutí preparátu do buňky (Abraham et al., 1995). Chmela a kolektiv zkoumal metabolismus Boheminu u myši. Po intravenózní aplikaci látky se Bohemin do 60 minut kompletně metabolizoval (Chmela et al., 2001). K této rychlé metabolické dráze přispívá hydroxylová skupina umístěna na C2, která je častým cílem glykosidace, či oxidativní reakce. Metabolity byly z organismu odstraněny převážně játry s pomocí renální exkrece. V ostatních tkáních nebyly metabolity Boheminu nalezeny (Chmela et al., 2001). Podobné výsledky byly dosaženy při testování Purvalanolu u krys. Metabolity Purvalanolu byly nalezeny jen v jaterních extraktech (Knockaert et al., 2000). Předtím, než Bohemin a ostatní inhibitory CDK budou plně nasazeny v terapeutickém využití, musí být vykonáno mnoho studií o působení v živém organismu Indukce apoptózy inhibicí cyklin dependentních kináz Inhibitory působí antimitoticky tím, že zastavují buněčný cyklus v G1/S nebo v G2/M kontrolním bodu (Abraham et al., 1995; Veselý et al., 1994). V proliferujících buňkách dokážou spustit apoptózu. Pokud inhibitor CDK působí v nervových buňkách, dokáže je před apoptózou uchránit (Meijer et al., 1999). Indukce apoptózy v nádorových buňkách je závislá na aktivaci kaspáz enzymů spouštějících apoptózu. Na aktivaci kaspáz se podílejí 2 cesty: 1) je spouštěna Fas (CD95/APO-1) receptorem, který aktivuje kaspázu-8 a ta pak aktivuje kaspázu-3; 2) mitochondrie může uvolnit apoptogenní faktory jako cytochrom C a APAF-1, které vedou k depolarizaci mitochondriální membrány a následné aktivaci kaspázy-9, která aktivuje kaspázu-3 (Vermeulen et al., 2002a). Avšak v nádorových buňkách, které jsou vystaveny účinku CDK inhibitorů, je apoptóza indukována pouze druhou dráhou, tj. depolarizací mitochondriální membrány. To je pravděpodobně způsobeno porušením integrity mitochondriální membrány syntetickým inhibitorem (Vermeulen et al., 2002a). Apoptóza indukovaná depolarizací membrány je také charakterizována zvýšeným množstvím fosfatidylserinu v membráně s následnou aktivací kaspáz a kondenzací DNA (Vermeulen et al., 2002a). Apoptóza není závislá na zastavení buněčného cyklu v některém z kontrolních bodů (Mihara et al., 2002). 29

30 Indukce apoptózy je částečně intracelulárně indukována geny Bcl-2. Tato rodina Bcl-2 genů produkuje Bcl-2, Bax a Bcl-x S/L. Bcl-2 a Bcl-x L inhibují apoptózu, zatímco Bax a Bcl-x S ji indukují. V buňkách, na které bylo působeno inhibitorem, byla zaznamenána indukce proapoptického proteinu Bcl-x S. To znamená, že apoptóza může být způsobena také zvýšenou expresí tohoto proteinu (Mihara et al., 2002). Apoptóza je u buněk léčených inhibitorem CDK na p53 nezávislá. To bylo dokázáno působením Roskovitinu na nádorové buňky, které exprimují mutovaný, a tudíž nefunkční p53 (Mihara et al., 2002). Potenciální využití CDK inhibitorů se nyní testuje ve výzkumu léčby rakoviny. Další možné uplatnění v léčbě jiných nemocí se teprve zkoumá. CDK inhibitory by mohly najít uplatnění v léčbě kardiovaskulárních, nefrologických a dermatologických nemocnění, ale také u bakteriálních a virových onemocnění (Gray et al., 1998; Hung et al., 1996; Imbach et al., 1999; Meijer et al., 1999; Schow et al., 1997; Sielecki et al., 2000). Nové studie ukazují, že CDK5 je důležitá v neurodegenerativních onemocněních jako je Alzheimerova a Parkinsonova choroba. Látky, které inhibují CDK5, tak mohou být vhodnými preparáty k léčbě těchto nemocí (Knockaert et al., 2000) Indukce diferenciace inhibicí cyklin dependentních kináz Diferenciace buněk je proces, při kterém se z nespecializovaných buněk vyvíjejí buňky se specializovanou strukturou i funkcí. K diferenciaci v organismu dochází v průběhu ontogeneze nebo při náhradách určitých buněčných typů u dospělců. Terminálně diferencované buňky se nacházejí ve fázi G0. Lze předpokládat, že z regulátorů buněčného cyklu budou obsahovat převážně CKI a nikoliv CDK. Je překvapivé, že toto tvrzení není pravdivé. Mnoho diferencovaných buněk obsahuje jak cykliny, tak CKI v různých koncentracích. Navíc obsah CDK i CKI se liší i podle typu buňky (shrnuto v Burdon et al., 2002). Dá se tedy předpokládat, že inhibicí nebo aktivací některých regulátorů buněčného cyklu může být diferenciace indukována. Působením Roskovitinu na Cortiho orgány, izolované z 19 denních krysích embryí, byla indukována diferenciace vláskových buněk a pomocných buněk (Malgrange et al., 2003). Protože Roskovitin inhibuje právě cyklin dependentní kinázy, diferenciace se tedy může spustit inhibicí CDK. Malgrangeová a kolektiv dokázala, že úspěšnost indukce diferenciace je závislá na síle inhibitoru. Nejlépe spouštěl diferenciaci aminopurvalanol, nejhůře Olomoucin. Tedy 30

31 síla použitých inhibitorů klesá v řadě: aminopurvalanol > Roskovitin > Olomoucin. Testování jiných inhibitorů, např. inhibitor MAP kinázy, neprokázalo spuštění diferenciace. Indukce apoptózy ani jakýkoliv jiný vliv na buněčnou proliferaci nebyl působením Roskovitinu při diferenciaci zaznamenán (Malgrange et al., 2003). Tím, že inhibitory dokážou zastavit buněčný cyklus v G1 fázi, mohou tak indukovat diferenciaci do nervové tkáně (Ohnuma a Harris, 2003). Působení inhibitorů regulujících buněčný cyklus je dnes intenzivně zkoumáno na velkém počtu buněčných typů. Působení na pluripotentní buňky a na buňky, které ještě nejsou terminálně diferencované, však ještě nebylo zkoumáno Interakce mezi CDK a inhibitorem Aby mohla být dokonale prozkoumána interakce inhibitoru s CDK, musela být provedena krystalizace CDK. Byly nalezené 3 aminokyseliny, které jsou důležité pro interakci mezi inhibitorem a danou CDK. Všechny krystalizace byly prováděné s CDK2 a nalezené 3 aminokyseliny jsou zodpovědné za 40% všech interakcí mezi CDK2 a inhibitorem: Ile10, Leu83 a Leu 134 (Meijer et al., 1999). Za interakci jsou zodpovědné i vodíkové můstky mezi inhibitorem a Glu81a Leu83 (obrázek 17). Tyto vodíkové interakce jsou přítomny u interakcí všech typů inhibitorů. Zvláštní je, že všechny inhibitory se vážou do stejného místa na molekulu CDK (ATP binding pocket), ale s opačnou orientací molekuly než ATP (De Azevedo et al., 1997). Přehled jednotlivých substituentů, umístěných na 2,6,9-trisubstituovaných purinech, je uveden v tabulce 3. preparát substituce C-2 C-6 N-9 Olomoucin 2-hydroxyethylamino benzylamino methyl 7 Olomoucin II [1-(hydroxymethyl)propyl]amino 2-hydoxybenzylamino izopropyl 0,02 Roskovitin [1-(hydroxymethyl)propyl]amino benzylamino izopropyl 0,1 Purvalanol A [1-(hydroxymethyl)-2- methylpopyl]amino IC 50 (µm) 3-chloroanilino izopropyl 0,05 Bohemin 3-hydroxypropylamino benzylamino izopropyl 1,1 Tabulka 3: Chemická struktura jednotlivých preparátů. Hodnoty IC 50 jsou inhibiční koncentrace CDK1/cyklin B testované in vitro (Kryštof et al., 2002). 31

32 Obrázek 17: Interakce Roskovitinu s CDK2. Převzato z (Meijer a Raymond, 2003). Schopnost inhibovat CDK1 úzce koreluje s antiproliferační schopností inhibitoru. To znamená, že čím snadněji preparát inhibuje CDK1, tím více působí antiproliferačně na nádorovou linii (tabulka 3 a 4) (Kryštof et al., 2002). Experimenty ukázaly, že hydroxy skupina navázaná na benzylu zvyšuje afinitu purinu k CDK1, a tím zvyšuje inhibiční schopnosti purinu k CDK1/cyklin B (Veselý et al.,1994; Kryštof et al., 2002). Různé skupiny hydroxylovaných benzylaminů na pozici C6 zvyšují až 10krát antimitotickou aktivitu preparátu. Nejúčinnější zvýšení inhibice CDK1 nastává u preparátů s hydroxylovou skupinou navázanou na 2. a 3. pozici benzylu (Kryštof et al., 2002) Analogy purinů ,6,9-trisubstituované puriny 2,6,9-trisubstituované puriny byly původně vyvinuty k inhibici komplexu CDK1/cyklin B (Kryštof et al., 2002; Veselý et al., 1994). Následné studie potvrdily inhibici i dalších kináz CDK2, CDK4, CDK5 (Kryštof et al., 2002). Jednotlivé substituenty jsou zodpovědné za afinitu k dané CDK a zvyšují účinnost inhibitoru. Substituenty jsou umístěné v 2,6,9 pozicích na purinu (obrázek 18). 32