ÚVOD PRAVIDLA PRÁCE V MIKROBIOLOGICKÉ LABORATOŘI :

Transkript

1 ÚVOD Rutinní práce v mikrobiologické laboratoři je často podceňována. Nejenže nejsou respektovány specifické nároky při vybavování mikrobiologického pracoviště, ale dochází i k tomu, že vedoucí pracovníci nejsou dostatečně vyškoleni a nejsou dodržovány předepsané zásady bezpečnosti práce. Tato fakta pak vedou k celé řadě nedostatků, které mohou snižovat serioznost výsledků. Při práci s patogenními mikroorganismy může dojít i k potencionálnímu zdravotnímu riziku. Z těchto důvodů je nutné klást vysoké požadavky na dodržování pracovní kázně a pracovního řádu a řídit se následujícími pravidly bezpečnosti práce. PRAVIDLA PRÁCE V MIKROBIOLOGICKÉ LABORATOŘI : 1. Vstup do mikrobiologické laboratoře je dovolen pouze osobám, které tam pracují. Svrchní oděv je nutné před vstupem do laboratoře odložit do skříněk na chodbě a převléknout se do čistého laboratorního pláště. Pracovní plášť je určen výhradně k práci v mikrobiologické laboratoři a není dovoleno ho používat mimo předem určené prostory. 2. V laboratoři není dovoleno jíst, pít a kouřit. 3. Je nutné zvýšenou měrou dodržovat bezpečnost práce a hygienu, neboť se pracuje s podmíněně pathogenními a pathogenními mikroorganismy. Po ukončení práce se musí ruce důkladně umýt mýdlem, popř. vydezinfikovat 0,1% roztokem Ajatinu. 4. Pracovní stůl se musí před i po práci vydezinfikovat 0,1% roztokem Ajatinu nebo jiným účinným dezinfekčním prostředkem (70% ethanol). Během práce nesmí být na pracovním stole nesterilní předměty a je nutné udržovat maximální pořádek. Prostory a ovzduší v laboratoři je třeba desinfikovat UV zářením. Provádí se v nočních hodinách po odchodu pracovníků z pracoviště a po důkladném mechanickém ošetření, omytí a chemické desinfekci. 5. Každý úraz a zranění je nutno ihned hlásit asistentovi. I nejmenší oděrky musí být pečlivě vydezinfikovány a ošetřeny, neboť hrozí infekce rány. Strana1

2 6. Dostane-li se při práci infekční materiál do úst, je nutno ústa důkladně vypláchnout a vykloktat 1% roztokem KMnO4 nebo zředěným Lugolovým roztokem. 7. Dostane-li se infekční materiál do oka, musí se oko ihned vypláchnout borovou vodou. 8. Kontaminovanou pokožku nebo předmět (pracovní stůl, oděv) je nutné ihned otřít 0,1% roztokem Ajatinu. 9. Po ukončení pokusů před likvidací a mytím nádobí musí být mikrobiální kultury ve zkumavkách, Petriho miskách a ostatních kultivačních nádobách usmrceny autoklávováním nejméně 30. minut při 121 o C. V žádném případě se nesmí kultury bez předešlého usmrcení vylévat do vodovodní výlevky nebo jiného odpadu. 10. Rozbité sklo se odkládá pouze do určené nádoby. Je-li znečištěno mikrobiální kulturou musí se nejdříve vydezinfikovat ponořením do dezinfekčního prostředku za použití pinzety nebo kleští. Střepy se nikdy nesmějí sbírat rukou. 11. Před odchodem z laboratoře je nutno uklidit pracovní stůl i pomocné prostory, uložit potřebné kultury do chladničky, očistit objektivy mikroskopu a uschovat jej na příslušné místo, zkontrolovat, zda jsou uzavřeny plynové a vodovodní kohoutky a vypnuty všechny elektrické spotřebiče kromě nepřetržitě pracujících termostatů, třepaček a chladniček. Strana2

3 1. PRINCIPY MIKROBIOLOGICKÉ PRÁCE Práce v mikrobiologické laboratoři se musí stejně tak jako v laboratoři chemické řídit pravidly Správné laboratorní praxe (SLP). Tato skutečnost je obzvláště důležitá v dnešní době zavedením mezinárodních norem ISO a norem platných v EU. Mikrobiologická práce musí vždy vycházet z vědomí, že: a) v prostředí kolem nás se vyskytuje velké množství mikroorganismů, které mohou znečistit a tím úplně znehodnotit používané mikrobiální kultury nebo živné půdy nebo úplně zkreslit výsledky mikrobiologických analýz, b) že některé z používaných kultur nebo kolonií, jež vyrostly při rozboru potravinářských surovin jsou podmíněně patogenní nebo dokonce patogenní, takže bychom neopatrnou prací s nimi mohli ohrozit své zdraví i zdraví svých spolupracovníků. Základním požadavkem při všech mikrobiologických postupech je to tzv. aseptická práce, spočívající v tom, že zabraňuje rozptýlení buněk z kultur do prostředí a vniknutí mikroorganismů z prostředí do kultur do prostředí a vniknutí mikroorganismů z prostředí do kultur nebo živných půd, což by vedlo k rychlému pomnožení těchto cizích mikroorganismů. Proto je nutno pracovat se sterilními pomůckami a pokud možno ve sterilním tj. vydezinfikovaném prostředí, a to co nejrychleji, třeba i na úkor objemové nebo hmotností přesnosti. Je třeba mít na paměti, že pracujeme s živými objekty, které potřebují určitou dobu k pomnožení, avšak velmi rychle stárnou a poměrně snadno podléhají genetickým změnám. Všechny tyto skutečnosti kladou velké nároky na plánování pokusů a organizaci práce, udržování kultur v živém stavu, jejich kontrolu z hlediska čistoty a stability genetických i fyziologických vlastností. Většina používaných postupů vyžaduje určitou zručnost a zkušenost, a proto je třeba je opakovat několikrát než se dosáhne žádaného výsledku. Ovšem i při uspokojivém výsledku je vhodné pokus opakovat, aby se zjistilo, že původní výsledek nebyl dosažen náhodně. Strana3

4 V každém výzkumu jsou velmi důležité kontrolní pokusy, a to jak pozitivní kontrola, která nám ukazuje, jak má příslušná reakce probíhat a zda použité živné půdy, činidla i pracovní postup jsou správné, tak i negativní kontrola, která je mezí, podle níž hodnotíme pozitivní reakci. Někdy lze pro negativní kontrolu použít nezaočkovanou živnou půdu, avšak přesnější a v některých případech nezbytné je provést celý postup s mikroorganismem, který poskytuje negativní reakci. Jelikož pracujeme s živým materiálem, který poměrně snadno podléhá změnám, ať už v důsledku stárnutí, genetických změn a jejich selekce nebo znečištění cizími mikroorganismy, musíme při neuspokojivém výsledku pozitivní kontroly hledat příčinu nejen v chybně připravených půdách nebo činidlech, v chybné kultivaci nebo pracovním postupu, ale také ve vlastnostech použitého kmene. Z těchto důvodů také kontrolujeme identitu a čistotu všech používaných kultur, a to jak makroskopicky, tak i mikroskopicky a pomocí biochemických testů. O čistotě a současně i homogenitě kultury se přesvědčujeme použitím některé z isolačních metod a testováním jednotlivých kolonií. Přitom je nutné, aby každý student prováděl všechny pokusy sám a získal jistotu, že příslušnou metodiku dobře zvládl, nikoliv tedy aby si preparáty a jiné částečné výsledky vyměňoval s kolegy. 1.1 Plánování mikrobiologické práce, její organizace, vedení protokolů Mikrobiologická práce je časově velmi náročná, vzhledem k tomu, že již v přípravě pokusů je nutné vysterilovat všechny potřebné pomůcky včetně živných půd a fermentačních medií, časově zdlouhavé může být i oživování a testování použitých mikroorganismů spojené s jejich kultivací. Jelikož mikrobiální buňky používané v pokusu musí být většinou určitého stáří (8h, 24h, 48h), je třeba věnovat velkou pozornost přesnému naplánování průběhu celé práce včetně přípravných prací, nasazení pokusu a jeho další zpracování. Během laboratoří plánují pracovní program a přípravu pomůcek vyučující, takže studenti včas dostávají vhodný materiál a pomůcky. Při plánování pokusu si experimentátor musí dobře uvědomit účel a cíl pokusu a všechna úskalí, která by mohla zkreslit vyhodnocení. Musí se seznámit se současným stavem problematiky prostudováním literatury, získat a otestovat biologický materiál, vyzkoušet si vhodnost a přesnost potřebných analytických metod. Teprve poté může přistoupit k podrobnému rozpisu pokusu včetně přípravných prací a naplánovat vše Strana4

5 podle jednotlivých dnů. Při plánování práce je vždy nutné počítat s určitou rezervou živných půd a sterilních pomůcek, aby rozbití nebo rozlití jediné nádoby nezabránilo v úspěšném pokračování práce. Jestliže začínáme pracovat na nové problematice, plánujeme první pokus poměrně jednoduchý, neboť při něm bychom měli především zjistit, zda celý pokus lze našimi prostředky úspěšně zvládnout. Teprve poté, když metodika pokusu je dobře propracována, lze plánovat komplikovaný pokus, sledující různé varianty a sledující seriovou práci, jež je vždy ekonomičtější než individuální stanovení. Při všech pokusech nesmíme zapomínat na vhodné kontroly a na dostatečné opakování pokusů, pokud je to možné, také na jejich statistické vyhodnocení. O pokusu a všech analysách, které jsou prováděny vedeme stručný, ale přehledný protokol, kde vedle účelu a cíle práce je uveden rozpis pokusu, použitý materiál a jeho původ (u mikroorganismů se vedle názvu druhu uvádí také označení kmene a jeho zdroj), stáří kultury, medium na němž byl mikroorganismus pěstován, způsob kultivace (povrchový, submerzní, za třepání, nebo staticky atd.), složení a postup přípravy roztoků, činidel, a půd, údaje o kultivačních podmínkách (teplota, ph, doba) i průběh pokusů včetně případných drobných závad, abnormalit a jiných podrobností. U každého protokolu musí být uvedeno datum, je-li to nutné i hodina provedení daného měření. Každý pokus je vyhodnocen graficky nebo tabulkou, u mikroskopických prací i obrázkem. Na závěr je ukončen diskusí výsledků a závěrem, který hodnotí dosažené výsledky i použité metody a případně uvádí náměty pro ověřovací a rozšiřující pokusy. Celý protokol musí být veden tak, že popsaný pokus může být kdykoli kýmkoli přesně zopakován. Současně dobře zapsaný pokus by měl experimentátorovi umožnit zjistit, kde eventuelně došlo k chybě při realizaci plánu (např. chybná navážka, chyba v přípravě půdy apod.). Z tohoto důvodu jsou pro experimentátora důležité protokoly z nezdařených nebo nedokončených pokusů. 1.2 Získávání mikrobiálních kultur Každé mikrobiologické pracoviště, ať už jde o pracoviště pedagogické, výzkumné, analytické nebo technologické, má obyčejně menší pracovní sbírku mikroorganismů, v níž udržuje používané případně i srovnávací kmeny. Kromě toho existují větší sbírky mikroorganismů, které jsou organizovány z hlediska průmyslových, zemědělských, zdravotnických nebo vědeckých potřeb, mikroorganismů a zasílají je na objednávku žadatelů. Protože udržování a kontrola Strana5

6 čistoty eventuelně stabilita vlastností mikrobiálních kultur jsou poměrně nákladné, účtují sbírky za každý dodaný kmen určitý poplatek. Největší sbírkou mikroorganismů v České republice je sbírka mikroorganismů v Brně (zkratka CCM Czech Collection of Microorganisms), která řádově obsahuje několik tisíc kmenů bakterií a stovek kmenů plísní. Ročně rozesílá řadu z nich do tuzemska i zahraničí. Tímto způsobem sbírka získává i určité prostředky pro objednávání kmenů ze zahraničních sbírek. Z potravinářského hlediska je důležitá sbírka mléčných kultur mlékárenského průmyslu, umístěná ve výzkumném a vývojovém závodě v Praze 6, která udržuje kolem 800 mikrobiálních kmenů, většinou bakterií. 1.3 Zařízení, přístrojové vybavení a pracovní pomůcky na mikrobiologickém pracovišti Jak již bylo uvedeno, práce v mikrobiologické laboratoři se v mnoha aspektech značně liší od práce v běžné chemické laboratoři. Tyto rozdíly vyplývají hlavně z toho, že mikrobiolog pracuje s živými organismy a jejich požadavkům musí podřídit nejen metodiku, ale i vybavení laboratoře. V mikrobiologické laboratoři proto používáme některé méně běžné pomůcky. Laboratorní nábytek musí vyhovovat charakteru práce v mikrobiologické laboratoři a požadavkům časté desinfekce. Přístroje určené pro mikrobiologické pracoviště slouží výhradně pro provádění mikrobiologických rozborů : Mikroskop Patří do základního vybavení každé mokrobiologické laboratoře. Tím, že umožňuje studovat předměty pouhým okem neviditelné, stává se nezbytnou pomůckou při studiu morfologie mikroorganismů. Podrobně viz mikrobiologické metody. Chladnička Slouží k uchovávání vzorků určených k rozboru, sterilních kultivačních medií v kultivačních nádobách, nebo kultur mikroorganismů. Chladnička by měla spolehlivě udržovat teplotu v rozmezí 1-4 o C a neměla by být užívána k jiným než výše uvedenmým účelům. Je též výhodné pokud kultury mikroorganismů a čistá kultivační media jsou uchovávány oděleně, ve dvou odělených chladničkách. Mrazící box - Přístroj se používá k uchovávání lyofilizovaných kultur mikroorganismů (-20 o C), skladování některých antibiotik (složky speciálních medií), Strana6

7 enzymů (restrikční enzymy), mikrobiálních, zásobních kultur v glycerolu (-80 o C) a některých chemikálií. Očkovací box - Očkování provádíme v očkovacích boxech (tzv. laminární box nebo flow-box). Tato zařízení jsou vybavena filtry, které umožňují sterilaci vzduchu, jež laminárně proudí uvnitř zařízení, a tím je zajištěno sterilní prostředí uvnitř očkovacího boxu. Pracovník může do vnitřního prostoru vsunovat pouze ruce, jinak je od vnitřní, sterilní části zařízení oddělen sklem. Toto sklo nejen zabraňuje kontaminaci jež by mohla přijít zvenčí, současně však chrání pracovníka např. před případným vdechnutím mikroorganismů s nimiž pracuje. Laminární box je vybaven přívodem plynu, vody, elektřiny měl by být vybaven i germicidní zářivkou. Inkubátory - Tato zařízení se používají pro kultivaci mikroorganismů při konkrétních teplotách odpovídajících optimální teplotě růstu, v případě rozborů při teplotách daných příslušnou normou. Tato zařízení jsou vybavena termostaty, u nichž je možné teplotu regulovat. Nejvýhodnější jsou inkubátory vodní, méně pak inkubátoey teplovzdušné, které neudrží nastavenou teplotu při krátkodobých výpadcích elektrické energie. Vodní lázeň Především slouží k provádění pasterizace vzorků pro stanovení sporulujících mikroorganismů, ve zvláštních případech k rozvařování ztuhlých kultivačních medií nebo nových medií, které obsahují složky, jež není možno sterilovat v autoklávu. Homogenizátor- Toto zařízení se používá při přípravě vzorků s jinou než tekutou konzistencí, pro rozmělnění vzorků tuhé konzistence před jejich očkováním případně zřeďováním. V zásadě existují dva typy homogenizátorů, rotační a peristaltický. Rotační homogenizátor musí být vybaven skleněnými nebo kovovými uzavíratelnými nádobkami, které snesou sterilaci. Součástí poeristaltického homogenizátoru jsou sterilní sáčky, v nichž je vzorek homogenizován ve zřeďovacím roztoku. Obecně platí, že velikost sáčku by měla být dvojnásobná oproti objemu vzorku. Použití homogenizátoru je upraveno ČSN ISO 6887 ( ). Vývěva Používá se pro membránovou filtraci. Nejvýhodnější je olejová, pokud ta není k dispozici, lze použít i vodní. UV lampa Toto zařízení se obecně používá k různým účelům. K vyhodnocování fluorescence se užívají UV lampy o vlnové délce 360 nm. Při mutačních pokusech, kdy jsou suspenze mikroorganismů ozařovány po určitou dobu Strana7

8 UV světlem z určité vzdálenosti. Výsledkem je získání čistých kmenů s odlišným genotypem a fenotypem. UV (germicidní) lampa se používá ke sterilaci kontaminovaného prostředí, nebo obecně prostor a ploch mikrobiologického pracoviště, kde se pracuje s mikroorganismy, a k likvidaci aerosolů. Tento způsob sterilace prostředí se užívá v noci, v případě nepřítomnosti pracovníků. Nejvyšší účinnosti je dosaženo při nm, optimum je 260 nm. Komerčně vyráběné germicidní lampy emitují UV záření o vlnové délce 253,7 nm a nelze je zaměňovat s UV lampami užívanými k vyhodnocování fluorescence (360nm). Váhy Pro větší navážky se používají váhy s přesností minimálně 0,1 g a možností navážky do 200 g. Na navážky nižší než 2 g se používají analytické váhy s citlivostí 0,1 mg a navážkou do 10 g. p H metr slouží ke stanovení p H kultivačních medií a roztoků. Vhodné jsou p H metry schopné měřit s přesností 0,1 p H jednotky. Odstředivka je přístroj, který patří k základnímu vybavení mikrobiologické laboratoře, přestože většina metod mikrobiologického rozboru toto zařízení nevyžaduje. Je určena k separaci suspendovaných částic hmoty v kapalině, nebo oddělení mikrobiálních buněk od kultivačního media. Odstředivka je v současnosti též hodně využívána u metod molekulární biologie (isolace plasmidové, chromosomální DNA). Třepačka je přístroj používaný pro kultivaci mikroorganismů, při inkubaci některých roztoků a suspenzí, přípravě vzorků určených k rozboru. Pohyb je horizontální, krouživý, a u většiny třepaček lze regulovat rychlost i poloměr otáček. V současné době se vyrábí i termostatované modely (vodní i se vzdušnou atmosferou) s možností regulace teploty. Některé uzavřené přístroje jsou vybaveny i umělým osvětlením. Laboratorní sklo Mikrobiologické sklo se liší od chemického nejen tvarem nádob, ale i jakostí. Základním požadavkem je odolnost vůči vysokým teplotám, kterých se používá při horkovzdušné sterilaci. Sklo sloužící k déle trvajícímu uskladňování živných půd má být I. hydrolytické třídy, tzn. vodě dokonale odolné sklo, u kterého nedochází k vyluhování chemikálií do media během skladování. Kultivační nádoby Mikrobiologické zkumavky - mají na rozdíl od chemických silnější stěny a rovné okraje. Užívají se pro tekuté, ztužené i tuhé půdy při kultivaci, udržování kultur a Strana8

9 biochemických testech. Zkumavky uzavíráme zátkami z obyčejné nebo buničité vaty, druhá je mnohem levnější, a proto jí dáváme přednost. Zátky musí zasahovat dvěma třetinami své délky dovnitř zkumavky a musí být dostatečně pevné, aby zabránily přístupu kontaminující mikroflory. Příliš tvrdé zátky jsou však během sterilace nebo vývoje plynu vytlačovány. Postup výroby zátek je znázorněn na obr. 1. Místo vatových zátek se též používají hliníkové uzávěry, nebo patentní kovové zátky. Vedle skleněných zkumavek se používají i umělohmotné zkumavky na jedno použití, které výrobce dodává již sterilní v zatavených polyethylenových sáčcích. Tyto zkumavky však nejsou odolné vůči vysokým teplotám. Jejich použití je výhodné, protože šetří čas a energii obzvláště v servisních mikrobiologických laboratořích, kde se provádí velké množství rozborů denně. Baňky používají se většinou kónické (Erlenmayerovy) nebo obyčejné varné. Zátkujeme je podobně jako zkumavky. Používají se hlavně k přípravě živných půd a kultivace v tekutých půdách. Dříve se často používaly speciální kultivační baňky se zabroušenou skleněnou čepičkou na ochranu vatové zátky před zvlhnutím (obr. xxx) a popřípadě ještě s očko-vacím tubusem (obr. xxx). Pro získání většího povrchu substrátu se používaly Fernbachovy baňky (s tubusem a bez tubusu) a Houleovy baňky apod. (obr. xxx). Misky používají se pro ztužené půdy nebo sklíčkové kultury. Nejběžnější jsou Petriho misky o průměru 50 mm, 90 mm, 100 mm. Misky s děleným dnem jsou vhodné pro současné použití různých substrátů a pro společné pěstování aerobů a anaerobů. Vedle skleněných misek se stejně jako v případě zkumavek používají misky z umělé hmoty na jedno použití, které výrobce dodává již sterilní v zatavených polyethylenových sáčcích. Plynovky Pro sledování vývoje plynu (např. zkvašování cukru kvasinkami) se používají Durhamovy plynovky (obr. xxx), což jsou malé zkumavky vkládané dnem vzhůru do bakteriologických zkumavek. Mikroskopická sklíčka K přípravě preparátů používáme podložní sklíčka velikosti cca 76 mm x 26 mm a krycí sklíčka velikosti 20 x 20 mm o tloušťce 0,16 nebo 0,17 mm. Čistá sklíčka uchováváme v Petriho miskách, použitá je nutné vkládat ihned do kyselého alkoholu (ethanol + 3% HCl) nebo do 95% ethanolu, aby nezaschla a neslepila se. Nová podložní a krycí sklíčka dáváme na několik hodin do alkoholu s 3%HCl, oplachujeme nejdříve vodovodní, poté destilovanou vodou, osušíme filtračním papírem a vyleštíme suchým hadříkem. Strana9

10 Použitá sklíčka shromažďujeme v kyselém alkoholu, tuk odstraňujeme xylenem nebo chromsírovou kyselinou. Po několikerém opláchnutí je vkládáme na několik hodin do 50% alkoholu. Další postup je stejný jako u nových. Čistotu sklíček zkoušíme kapkou destilované vody, která musí tvořit souvislý film. Podložní sklíčka K přípravě visutých kapek a vlhkých komůrek používáme podložní sklíčka s kruhovou prohloubeninou uprostřed. Vlhké komůrky jsou vhodné k přímému pozorování vzniku pseudomycelia u kvasinkových mikroorganismů. Thomova nebo Bürkerova komůrka Slouží k počítání mikroorganismů. Pipety - Pro pipetování roztoků nebo sterilních kultivačních medií používáme stejně jako v chemické laboratoři dělené pipety. Nové skleněné pipety vkládáme do oxidační směsi (chromsírová kyselin), aby se zbavily mastnoty. Po vyjmutí ze směsi je pipety nutné řádně omýt vodou. Pro odměřování medií obsahujících mikroorganismy se podle SLP (správná laboratorní praxe), jejíž pravidla jsou zavedena do nových norem pro práci v mikrobiologické laboratoři, se nesmí používat pipetování ústy. Z tohoto důvodu se pro dávkování a odměřování různých objemů používají sterilní odměrné válce, nebo v případě malých objemů mikropipety s vyměňovatelnými sterilními špičkami na jedno použití, které jsou vyrobeny z umělé hmoty. Tyto špičky jsou buď výrobcem dodávány nesterilní nebo ve speciálních krabičkách již sterilní. Nesterilní špičky lze sterilovat autoklávováním, nikoli suchým teplem v hor-kovzdušném sterilátoru. Nádobky na barviva a jiné kapaliny Jde o běžné indikátorové lahvičky s kapátky. Pro alkoholické vzorky se doporučuje kapátka uzavřít gumičkou, aby barviva neměnila vysycháním koncentraci. Pro imerzní olej a xylen používáme lahvičky se zátkami s tyčinkou. Použité skleněné nádobí (i s kulturou) je nutné nejdříve autoklávovat (1/2 hodiny při přetlaku 0,1 Mpa), potom ještě za horka obsah nádob vylít a mýt obvyklým způsobem. Polyethylenové nádobí na jedno použití se i s obsahem vkládá do speciálních pytlů z umělé hmoty, které jsou odolné vůči vysokým teplotám v autoklávu. Celý pytel i s obsahem se po zautoklávování odnáší do předem vyhrazeného odpadu. Preparační a očkovací pomůcky Pro očkování a přípravu preparátů používáme očkovací jehly chromniklové, zřídka platinové (obr. xxx), o průměru očka cca 2 mm. Pro čárkování je vhodné očko odchýlit asi o 30o od přímého směru. Dále se používají tvrdé ocelové preparační jehly (obr. xx), tyčinky, pinzety, lancety (obr.x), Strana10

11 skalpely. Pasteurova pipeta (obr. xx) je do kapiláry vytažená trubička, uzavřená na širším konci vatou. Sterilizační zařízení Autokláv Jedná se o speciální zařízení, v němž při zahřívání dochází ke vzniku zvýšeného tlaku páry, a tak k přehřátí vnitřního prostoru na vyšší teplotu než 100oC. Většinou se užívá tlak 0,1 Mpa, kterému odpovídá teplota 121oC. Autokláv musí být vybaven regulačním zařízením pro regulaci teploty i doby sterilace. Běžně slouží pro mikrobiologické účely, k bezpečné sterilaci většiny kultivačních medií a roztoků, některých umělohmotných pomůcek (kyvety, špičky, mikrozkumavky atd.) a k likvidaci jakéhokoli infikovaného nebo kontaminovaného materiálu. Pro sterilaci čistých medií a pomůcek by měl být určen jiný autokláv než je užíván pro likvidaci. Autoklávy se nepoužívají ke sterilaci skleněného nádobí. Použití Papinova hrnce je nevhodné, vzhledem k tomu, že v tlakovém hrnci lze dosáhnout přetlaku pouze 0,05 MPa, což odpovídá teplotě 112oC. V dnešní době jsou autoklávy vybaveny tak, že lze nastavit i režim sterilace v proudící páře při teplotě maximálně 100oC. Tento způsob se používá pro frakcionovanou sterilaci látek choulostivých na teplotu a medií, které tyto látky obsahují. Toto vybavení nahrazuje tzv. Kochův parní hrnec. Horkovzdušný sterilizátor Existuje mnoho typů horkovzdušných sterilizátorů, které udržují teplotu oC po dobu 1 až 3 hodin (počínaje dobou, kdy teplota dosáhla 160oC). Kromě teploty lze regulovat většinou i dobu sterilace a registrovat teplotu. Horkovzdušné sterilizátory se výhradně používají ke sterilaci laboratorního skla a některých pomůcek. Sterilizační filtry Používají se pro sterilaci čirých kapalin, které nesnášejí zahřívání. Je to buď asbestocelulosový filtr (tzv.seitzův filtr), nebo nyní častěji membránový filtr, který má velikost pórů 0,1-0,2 μ, případně 0,3-0,5 μm. Pro laboratorní mikrobiální filtraci se také používají skleněné sintrové kelímky nebo nuče (např. kelímek G5). 1.4 Popis mikroskopu Mikroskop se skládá z mechanické a optické části : Mechanická část mikroskopu Strana11

12 Mechanickou část tvoří stativ (noha mikroskopu), tubus a stolek. Noha mikroskopu je spojena s nosičem kloubem, který umožňuje tubus naklánět. Na nosiči jsou dále umístěny 2 šrouby makrometrický a mikrometrický. Tyto šrouby umožňují hrubý a jemný posuv tubusu ve směru optické osy mikroskopu, a tím plynulé zaostřování pozorovaného objektu. Tubus udržuje optické systémy mikroskopu (okulár, objektiv) v konstantní vzdálenosti. Na spodním konci tubusu je umístěn objektiv a shora je zasunut okulár. Vzdálenost mezi horním a dolním okrajem tubusu je mechanická délka tubusu. Tato délka bývá obvykle 160 mm nebo 170 mm. Optická délka tubusu, což je vzdálenost ohnisek okuláru a objektivu, se mění podle použitých okulárů a objektivů. Okuláry se vyměňují prostým vyjmutím a zasunutím, bez dalšího upevňování. Pro rychlou výměnu objektivů slouží tzv. revolverový měnič, umístěný na tubusu. Výměna se provádí otáčením nosného kotouče, ve kterém jsou jednotlivé objektivy našroubovány. Preparát, který se pokládá na stolek mikroskopu se přichycuje pérovými svorkami nebo křížovým vodičem preparátu. Stolky bez křížového vodiče jsou obyčejně otáčivé a kromě toho posuvné Optická část mikroskopu Optická část se skládá ze dvou soustav čoček, jež vytváří obraz předmětu (objektiv, okulár) a z osvětlovacího zařízení. Objektiv vytváří obraz objektu reálný, převrácený a zvětšený. Tento obraz je zvětšen okulárem tak, aby detaily zobrazené objektivem bylo možno pozorovat okem. To jaké detaily je objektiv schopen rozlišit, je dáno hodnotou jeho tzv. numerické apertury A : Kde A = n. sin α n = index lomu prostředí mezi čelní čočkou objektivu a preparátu sin α = polovina otvorového úhlu objektivu (tj. úhlu mezi optickou osou a krajními paprsky vcházejícími do objektivu). Na numerické apertuře A a vlnové délce použitého světla λ závisí rozlišovací schopnost objektivu a : a = λ/a a = nejmenší rozměr struktury, který lze rozlišit (rozlišovací schopnost mikroskopu) λ= vlnová délka použitého světla Při konstantní vlnové délce pro bílé světlo ( nm) lze dosáhnout maximální rozlišovací schopnost tím, že použijeme objektiv s vysokou numerickou aperturou. Toto čísloje na na objektivu vyraženo pod číslem udávajícím lineární zvětšení. Protože otvorový úhel může mít pouze hodnoty nižší než 180 o, maximální dosažitelná hodnota sin α je kolem 0,95. Index lomu vzduchu je přibližně roven 1. Strana12

13 V tomto případě může numerická apertura nabývat pouze hodnot od 0 1. Vyšších hodnot lze dosáhnout změnou prostředí mezi preparátem a objektivem. Mluvíme o tzv. imerzních objektivech, z nichž nejpoužívanější jsou olejové imerze, kde mezi preparát a čelní čočku objektivu kápneme cedrový olej, který má index lomu přibližně stejný jako sklo (n=1,33). Znamená to, že paprsky procházejí opticky homogenním prostředím, nelámou se a vstupuje jich do objektivu více než u ostatních tzv. suchých objektivů. Nejlepší imerzní objektivy mají n = 1,3 1,4. Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu dosahuje hodnot kolem m. Celkové zvětšení mikroskopu vypočteme, násobímeli zvětšení objektivu zvětšením okuláru. Toto celkové zvětšení je nutné stanovit předem, aby nedošlo k překročení užitečného zvětšení. To je omezeno numerickou aperturou tak, že dosahuje jejího násobku. Z toho vyplývá, že že u objektivu s A 0,65 může být celkové zvětšení mikroskopu 325 až 650 násobné. Větší zvětšení je bezvýznmané, a proto je nazýváme prázdným. Nedává žádné další detaily. Osvětlovací zařízení se skládá ze zrcátka a kondenzoru, jenž je na spodu opatřen irisovou clonnkou. Zrcátko má jednu stranu plochou a druhou vypouklou. Ploché zrcátko se nastavuje při použití objektivů s malým zvětšením (do 45 ), u všech ostatních je nutno pracovat s vydutým zrcátkem. Kondenzor je optická soustava čoček s velkou aperturou A= 1,2-1,4, jejímž úkolem je soustředit širší svazek světelných paprsků odražených zrcátkem na pozorovaný preparát. Irisovou clonkou kondenzoru je možné regulovat míru osvětlení preparátu a tím současně měnit numerickou aperturu kondenzoru. Kondenzor je umístěn pod mikroskopickým stolkem a je posunovatelný ve svislém směru. Jako zdroje světla používáme elektrické lampy pro mikroskopování, u novějších mikroskopů je světlo umístěné přímo v noze stativu Základní postup při mikroskopování 1. Mikroskop se drží vždy za stativ. 2. Do revolverového měniče se našroubuje objektiv od nejslabšího do nejsilnějšího po směru hodinových ručiček. Do tubusu se vsune okulár střední síly (10 ). Zrcátko se nastaví tak, aby celé zorné pole bylo osvětleno. 3. Preparát se umístí na mikroskopický stolek tak, aby ležel v optické ose mikroskopu. 4. Otáčením makrometrického šroubu se pomalu snižuje objektiv ke krycímu sklíčku a ze strany se pozuruje vzdálenost, aby objektiv nenarazil do sklíčka a nepoškodila se Strana13

14 čelní čočka. Osvětlení se upraví pomocí zrcátka, clony a svislého posuvu kondenzoru. 5. Makrošroubem se tubus pomalu zdvihá tak dlouho, dokud se hledaný obraz neobjeví v zorném poli. Doostří se mikrometrickým šroubem a preparát se nastaví do středu zorného pole. U monookulárního typu mikroskopu se preparát pozoruje levým okem a pravé se nechá otevřené. 6. Po prohlédnutí preparátu malým zvětšením se objektiv vymění za silnější pomocí revolverového měniče. Barevné preparáty se pozorují při otevřené clonce. 7. Při mikroskopování s imerzním objektivem se kápne kapka cedrového oleje na čelní stranu čočky kondensoru, který se předem sniží. 8. Na stolek se vloží preparát a kondensor se pomalu zdvihá až olej spojí čočku s podložním sklíčkem. Stáhne se clonka kondenzoru, poté se kápne kapka cedrového oleje na fixovaný preparát nebo krycí sklíčko a objektiv se pomalu snižuje, až se čelní čočka ponoří do oleje. 9. Tubus se dále pomalu zvedá, aby nedošlo k přerušení spojení čočky s olejem a pozuruje se, kdy se v zorném poli kmitne obraz objektu. Poté se tubus opatrně snižuje, až se obraz znovu objeví. Mikrometrickým šroubem se obraz zaostří a upraví se osvětlení Péče o mikroskop 1. Mikroskop má být uložen tak, aby byl chráněn před prachem, výpary kyselin a přímým slunečním světlem. 2. Horní konec tubusu nesmí zůstat otevřen, aby prach nevnikl do mikroskopu a neusadil se na vnitřní straně mikroskopu a zadní čočce. Do tubusu se proto vkládá okulár nebo speciální krycí destička. 3. Čocky se nejlépe čistí lněným pláténkem ovlhčeným xylenem nebo benzenem a ihned se osuší. U moderních mikroskopů výrobce dodává speciální roztoky pro čištění čoček. Objektivy se nikdy nesmí rozšroubovávat, jelikož by se porušilo přesné nastavení a centrace čoček. U okuláru můžeme naopak obě čočky rozšroubovat. 4. Mechanické části se nejlépe čistí kůží. 5. Po delší době používání je nutné předat mikroskop odborné kontrole Fázová kontrastní mikroskopie Strana14

15 Tento způsob mikroskopování je zvláště vhodný pro studium struktury živých buněk. Je založen na rozdílném chování světla při průchodu zbarveným, čili částečně absorbujícím objektem, nebo nezbarveným, zcela transparentním objektem. V prvém případě dochází k částečnému absorbování určité vlnové délky procházejícího světla. Dochází přitom ke změně amplitudy světelného vlnění, které naše oko zachytí jako změnu barvy (Obr. XXX). Výsledná vlna vzniká interferencí původní vlny a vlny po difrakci, která je posunuta oproti původní o 180 o. V případě zcela transparentního objektu se amplituda nemění, ale vzhledem k různým refraktivním vlastnostem objektu bude procházející vlna buď zpožděna nebo v předstihu proti původní vlně, tzn. bude mezi nimi fázový posun (Obr. XXZ). U transparentních objektů je difrakcí vzniklá vlna posunuta oproti původní o různý úhel. Pro slabě lámavé objekty, často sledované v mikroskopu, je fázový posun 90 o, tj. 1/4 délky vlny. Použitím optického zařízení je rozdíl ve fázi mezi původní světelnou vlnou a vlnou po difrakci zvýšen z asi 90 o na 180 o, takže se obě vlny při interferenci co nejvíce ruší. Nastane obdobná situace jako na obr. XXX, tzn. jako by světelná vlna prošla barevným objektem. Lidské oko a fotografický materiál bude tento zcela transparentní materiál vnímat jako by částečně absorboval světlo. Většina živých buněk je ve světelném mikroskopu téměř transparentní. Různé části buněk a organely se liší indexem lomu a tloušťkou. Tyto rozdíly jsou fázovým kontrastem převedeny na změny intenzity světla, přičemž neklesá rozlišovací schopnost ani kvalita obrazu. Živé bakterie se při fázové kontrastní mikroskopii jeví jako zbarvené. U kvasinek a plísní jsou patrné jednotlivé části buněk. Praktické provedení : 1. Vyměň normální objektivy za fázové a kondenzor za kondenzor s fázovými clonami. 2. Fázový kondenzor nastav na normální osvětlení ve světelném poli, tj. bez fázové destičky (označeno na okraji měniče fázových destiček jako 0). 3. Zaostři preparát při značně zúžené cloně kondenzoru a nulové poloze měniče destiček. 4. Otevři úplně irisovou clonku kondenzoru a měničem nastav příslušnou fázovou destičku (např. pro 10x zvětšující objektiv destičku č. 10, apod.). Vyměň okulár za pomocný mikroskop a zaostři na fázovou destičku, která je v zorném poli zobrazena Strana15

16 jako prstenec. Mimo to je v zorném poli vidět prstenčitá clona kondenzátoru, která jasně září. 5. Centračním zařízením pod kondenzátorem, tj. dvěma klíči zasunutými do příslušných otvorů měniče pohybuj tak, aby obrazy obou prstenců byly koncentrické. Světlo procházející prstenčitou clonou kondenzoru nesmí prosvítat na okraji fázové destičky objektivu. 6. Nasaď okulár a pozoruj fázově kontrastní objekt. Poznámka: Objekt pozorujeme ve žlutozeleném světle, které dostaneme použitím filtru, jenž je součástí vybavení fázového kontrastu. Strana16

17 2. KULTIVACE MIKROORGANISMŮ Abychom udrželi mikroorganismy v životném stavu, musíme je pravidelně pomnožovat, tj. kultivovat za optimálních podmínek s následujícím uchováním za takových podmínek, kdy stárnou a tudíž i odumírají co nejpomaleji (viz kap. ).Pomnožování mikroorganismů je nutné také pro získání většího množství jejich buněčné hmoty potřebné k biotechnologickým účelům (pak hovoříme o propagaci mikroorganismů) nebo pro mikrobiologické, biochemické či genetické studie. Pro kultivaci potřebujeme vhodné sterilní živné půdy v kultivačních nádobách, očkovací pomůcky, inkubátor (tj. termostat) nebo temperovaný box a někdy ještě zařízení pro regulaci přístupu vzduchu ke kulturám. 2.1 Živné půdy Živné půdy neboli media, používané pro kultivaci mikroorganismů musí vyhovovat všem nárokům příslušného mikroorganismu na výživu, na p H, osmotický tlak a další fyzikálně chemické podmínky. Základní vlastnosti všech živých půd jsou: 1. Dostatek vody, neboť životní pochody probíhají jen ve vodném prostředí. 2. Přítomnost potřebných živin ve vhodných koncentracích,a to : a) zdroje energie (u fototrofních je nahražen světlem, u heterotrofních organismů je stejný se zdrojem uhlíku), b) zdroje uhlíku (cukry, bílkoviny, organické kyseleny nebo alkoholy, pro autotrofní bakterie CO 2 ), c) zdroje dusíku (NH + 4, NO - 3, aminokyseliny, bílkoviny a jejich částečné hydrolyzáty, jako jsou proteosy a peptony; jen poměrně malým skupinám mikroorganismů stačí jako zdroj dusíku plynný N 2 ), d) ostatní biogenní prvky a prvky oligogenní,nejčastěji ve formě anorganických solí. Některé živné půdy obsahují ještě specifické faktory, např. nadbytek SO - 4 pro bakterie redukující sírany, růstové faktory (vitamíny, aminokyseliny) nutné pro auxotrofní mikroorganismy aj. Strana17

18 Jako živné půdy slouží některé přírodní látky (např. mléko, plátky mrkve nebo brambor). U tzv. umělých půd, kam patří i sladina a bujon, jsou zdrojem vitamínů a aminokyselin výtažky přírodních látek. Jako zdroj vitamínů slouží hlavně sladový výtažek, výluh ze sladových klíčků, kvasniční autolyzát, zahuštěné máčecí vody z výroby kukuřičného škrobu, masový výtažek apod. Zdrojem aminokyselin je hlavně hydrolyzát kaseinu. U tzv. syntetických půd je přesně udáno chemické složení, takže používá čistých vitamínů, aminokyselin a stopových prvků atd. K rozpouštění všech složek syntetických půd se používá destilovaná voda. Podle konzistence rozdělujeme půdy na tekuté (mléko,masopeptonový bujon, sladina), ztužené agarem nebo želatinou a tuhé (mrkev,brambor). Podle účelu rozlišujeme půdy všeobecné, na nichž se rozmnožují velké skupiny mikroorganismů (masopeptonový bujon pro bakterie, sladina pro kvasinky a plísně), selektivní, zvýhodňující růst určité skupiny mikroorganismů, nebo diagnostické půdy, na nichž roste jen velmi uzká skupina mikroorganismů Příprava živných půd K přípravě živných půd z přírodního materiálu se používá většinou vodovodní voda, která však nesmí být tvrdá a nesmí obsahovat větší množství železa a chloridů. Také silné chlorování je na závadu. K přípravě syntetických a speciálních živných půd používáme destilovanou vodu, pro analytické stanovení vitamínů a aminokyselin pomocí mikroorganismů nutno použít redestilovanou nebo deionizovanou vodu. Živná půda se připravuje rozpuštěním jejich součástí ve vodě za případného zahřátí a neustálého míchání. Pak se upraví p H, půda se zfiltruje, rozplní do vhodných nádob (baněk nebo zkumavek) a ihned steriluje. Pro ztužení půd se před sterilací přidává příslušné množství agaru. Komerčně dodávané tzv.sušené živné půdy (např. od firmy Oxoid) mají již upravené ph a jsou z hlediska přípravy velmi jednoduché. P H živných půd se upravuje pomocí 1n NaOH nebo 1n H 2 SO 4. Půdy připravené z pří-rodních materiálů mají reakci obyčejně kyselou. Pro bakterie je nutno upravit ph 7,0 7,3, kdežto kvasinky a plísně vyžadují kyselou reakci (ph 4,5 6,0). Sterilací půd klesne jejich p H o 0,1 0,3. Filtrace půd se provádí skládaným filtrem, u silně vyvločkovaných půd se místo filtračního papíru použije vrstva obyčejné vaty. První podíl filtrátu se vrátí na filtr. Strana18

19 Ztužování živných půd se nejčastěji provádí pomocí agaru v množství 1,5-3,0%. Agar je polysacharid, získaný z mořských řas. Rozvaření agaru v půdě se provádí na vodní lázni nebo v autoklávu. Bod tání agarových půd je 96 C, bod tuhnutí C. Příprava jednotlivých půd je uvedena v seznamu živných půd na konci tohoto skripta Rozlévání půd a jejich uchovávání Tekuté nebo ztekucené živné půdy plníme ihned po přípravě do sterilních baněk nebo zkumavek, opatřených vatovými zátkami nebo patentními uzávěry. Pro plnění zkumavek používáme nálevek uzavřených tlačkou na napojené hadičce (obr. ), u neztužených půd můžeme použít také byrety. Při rozlévání se nesmí půdou potřísnit okraje nádob ani zátky, neboť by zde došlo k pomnožení mikroorganismů ze vzduchu a k jejich prorůstání zátkou do nádoby. Půdy musí být sterilovány ihned po jejich rozlití. Šikmé agary se přepravují tak, že se zkumavky naplní roztavenou půdou asi do 1/3 objemu, vysterilizují a pak nechají ztuhnout v šikmé poloze (nejlépe opřenyo ležící tyčinku nebo pipetu). Horní okraj šikmého agaru se nesmí dotýkat zátky zkumavky (obr. ).Sešikmení se provádí krátce před použitím, neboť šikmý agar rychle vysychá. Lití desek (ploten) do Petriho misek se provádí asepticky až po sterilaci půd. Agarovou půdu v baňce nebo ve zkumavce roztavíme na vroucí vodní lázni nebo v autoklávu, okraj nádoby ožehneme a nádobku otevřeme tak, že zátku uchopíme dlaní a malíkem levé ruky nebo mezi malíkem prsteníkem levé ruky, jež je obrácena dlaní vzhůru, pak znovu ožehneme hrdlo nádoby, palcem a ukazováčkem levé ruky poněkud nadzdvihneme víčko sterilní Petriho misky, vlijeme takové množství půdy, aby vznikla vrstva 3 4 mm vysoká (tj ml půdy na Petriho misku o průměru 10 cm), víčko ihned přiklopíme a naléváme další desky. Zátku nádobky během lití desek nepokládáme. Okraje a víčka misek nesmí být potřísněny rozlévanou půdou. Po ukončení rozlévání hrdlo nádobky i vnitřní část zátky, kterou držíme stále v ruce, ožehneme a nádobu uzavřeme. Rozlévání provádíme na vydezinfikovaném stole blízko plamene. Bubliny na povrchu půdy odstraníme ještě v tekutém stavu přímým plamenem kahanu. Desky necháme ztuhnout ve vodorovné poloze. Po utuhnutí je obyčejně inkubujeme 2 3 dny v obrácené poloze (zavěšený agar) při teplotě, jež bude používána Strana19

20 pro kultivaci mikroorganismů. Tím dojde k vhodnému předsušení půdy, jež je nutné pro povrchové očkování. Kromě toho se během této inkubace také projeví případná kontaminace desek tvorbou zřetelných kolonií, takže tyto nevhodné desky mohou být vyřazeny a neznehodnotí další práci. Pro rychlé předsušení desek používáme sušárnu o teplotě C; doba sušení otevřených misek, položených dnem vzhůru, je pak 5 30 minut, tj. do vytvoření nepravidelných hran na povrchu desky. Při používání misek z umělé hmoty nesmí teplota při sušení přesáhnout 60 C, neboť by došlo k měknutí misek a jejich deformaci. 1) Sterilace půd Živné půdy se sterilují nejčastěji autoklávováním při přetlaku 0,1 0,15 MPa. Sterilační doba je závislá na objemu a viskozitě půdy (20 min. pro zkumavky, 30 min. až 1 hod pro objemy 3 litrů). 2) Uchovávání živných půd Živné půda se uchovávají na temném, bezprašném, suchém a pokud možno chladném místě. Pro dlouhodobé uchovávání se doporučuje chladnička o 5-6 C. 2.2 Sterilace nádobí, živných půd a ostatních pomůcek Každá mikrobiologická práce vyžaduje sterilní pomůcky, tj. pomůcky prosté všech živých mikroorganismů. Výkon, kterým materiál nebo předměty zbavujeme živých mikroorganismů, nazýváme sterilací. Sterilace spočívá buď v usmrcení přítomných mikroorganismů nebo v jejich odstranění Fyzikální prostředky sterilace Z fyzikálních prostředků se v mikrobiologické laboratoři nejčastěji používá tepelná sterilace, jež se provádí několika způsoby. Volba způsobu závisí na materiálu, který sterilizujeme. 1) Sterilace ožeháváním Se používá pro hrdla zkumavek baněk, pro očkování tubusu nádob a skleněné tyčinky k jejich uzavírání, pro očkovací a preparační jehly, pinzety, podložní skla a jiné kovové nebo skleněné předměty. Strana20

21 Očkovací jehly ožehujeme v oxidačním plameni kahanu (viz obr.v kap. ), a to po celé délce jehly až do žhnutí drátku a krátce ožehneme i tu část držáku, která bude při očkování zasahovat do kultivační nádoby. Ožehujeme těsně před očkováním a jehlu pak zchlazujeme na nezaočkované půdě, ve sterilní vodě nebo na okraji kultury. Po použití nutno jehlu ihned znovu ožehnout, abychom mikroorganismy z kultury neznečistily prostředí laboratoře. U chromniklové jehly vypalujeme zbytky kultury v redukční části plamene, aby se nerozptýlily po o-kolí (důležité hlavně při rozočkování kultur pod parafínovým olejem!) a pak teprve jehlu ožehujeme v oxidačním plameni. Redukční plamen nemůžeme použít pro platinové jehly (vznik křehkého karbidu platiny!). 2) Sterilace suchým teplem v horkovzdušném sterilizátoru Tato sterilace se používá pro prázdné kultivační nádoby (tj. zkumavky nebo baňky uzavřené vatovými zátkami nebo patentními uzávěry, skleněné Petriho misky zabalené do papírů nebo v kovových pouzdrech), pipety, vatové filtry, papírové, skleněné nebo kovové pomůcky, jež vesměs sterilizujeme zabalené do papíru. Suché teplo má nižší sterilační účinky než teplo vlhké, a proto je nutno použít poměrně vysokých teplot, tj.160 o C 180 C po dobu dvou hodin (počítá se od dosažení sterilačních teploty). Tato vysoká teplota by již poškodila živné půdy, gumové rukavice, tkaniny apod. Sterilované předměty vkládáme do chladného sterilizátoru, přičemž sterilátor nesmí být předměty přeplněn, aby se nebránilo cirkulaci vzduchu a pronikání tepla. Papírové obaly nebo vatové zátky se nesmějí dotýkat stěn sterilizátoru, aby nedošlo k zuhelnění. Po ukončení sterilace necháme zavřený sterilizátor pomalu vychladnout a teprve chladné sterilní předměty z něj vyjímáme. Parafín a parafínový olej sterilujeme suchým teplem při 150 C po dobu 1 hodiny ve sterilních baňkách uzavřených vatovými zátkami. 3) Sterilace vlhkým teplem Sterilace vlhkým teplem se používá pro živné půdy, vodu a roztoky přidávané do kultur mikroorganismů, dále pro tkaniny, gumové hadice, pro likvidaci nepotřebných kultur apod. Nejpoužívanější je sterilace tlakovou parou. Používá se přetlaku 0,1 0,15 Strana21

22 MPa, což odpovídá teplotě C (viz tab. ). K této sterilaci se používají tlakové nádoby, tzv. autoklávy, které jsou vytápěny plynem, elektřinou nebo tlakovou parou. Každý autokláv musí být opatřen manometrem, pojistným ventilem, výpustným kohoutem pro páru a vodoznak. Podle bezpečnostních předpisů musí být autoklávy v pravidelných intervalech podrobeny tlakové zkoušce. Rozlišujeme autoklávy jednoplášťové (obr. ), u nichž je vyvíječ páry spojen otvory se sterilačním prostorem, a dvouplášťové (obr. ), kde páru z vyvíječe přepouštíme pomocí ventilu do sterilačního prostoru. Dnes se většinou vyrábějí elektrické autoklávy s automatickou regulací, u nichž se pouze nastaví zvolený sterilační program. 4) Frakcionovaná (přerušovaná) sterilace Sterilace proudící parou používá teploty 99 o 100 C, která však nemůže usmrtit bakteriální spory. Proto je možno používat tuto sterilaci pouze u živných půd, v nichž bakteriální spory po 24 h uchovávání při laboratorní teplotě vyklíčí a přemění se v rozmnožující se vegetativní buňky, jež se dalším zahřátím proudící parou usmrtí. Pro jistotu postup opakujeme ještě třetí den, u některých půd ještě i čtvrtý den. Jednotlivé záhřevy trvají min a celý postup se pro to nazývá frakcionovaná (přerušovaná) sterilace. Pro časovou náročnost a ne vždy 100%ní účinnost se používá této sterilace pouze u půd, které by byly tlakovou sterilací poškozeny. 5) Tyndalizace Pro živné půdy a roztoky, které nesnášejí zahřívání na 100 C, používáme tzv. tyndalizaci, což je zahřívání na teplotu 57 C po dobu 1 h, opakované osmkrát v 24 hodinových intervalech, během nichž jsou roztoky uchovávány při laboratorní teplotě. Tento postup není příliš účinný, neboť neusmrcuje termofilní bakterie, a proto je v poslední době u čirých roztoků nahrazován filtrací. 6) Sterilace ultrafialovým zářením Sterilace UV světlem se používá k usmrcení mikroorganismů ve vzduchu a na povrchu pracovních ploch (v očkovacích boxech a laboratořích). Používáme tzv. germicidní lampy, které vydávají záření o vlnové délce nm. Lampy jsou zapnuty přes noc nebo před započetím práce. Při obsluze UV světla je nutné si chránit zrak. 7) Sterilace filtrací Strana22

23 Tento způsob sterilace se používá pro plyny a dále pro čiré kapaliny, které by byly zahříváním poškozeny. Pro sterilaci vzduchu používáme vatové filtry (skleněné nebo kovové trubice naplněné vzdušným filtrem nebo skelnou vatou a sterilované suchým teplem). Nejjednodušším vzdušným filtrem je vatová zátka kultivačních nádob. Pro sterilaci čirých kapalin, které nesnášejí zahřívání, se používá filtrace přes asbesto-celulosové vrstvy (tzv. Seitzův filtr viz. obr. ) nebo přes membránové fitltry. Tyto filtry se sterilují v autoklávu Sterilace chemickými prostředky Chemické prostředky se používají v mikrobiologické laboratoři nejčastěji pro sterilaci (případně dezinfekci) povrchu předmětů a pracovních ploch, dále do nádob pro ukládání použitých pipet a k rychlé likvidaci zbytků kultur, např. náhodně rozlitých na pracovní ploše. Vzácněji se používají ke sterilaci roztoků barviv a jiných látek, jež nemohou být sterilovány tepelně ani filtrací, a pro konzervaci kultur před jejich chemickým zpracováním. Nejpoužívanější prostředky pro povrchovou sterilaci jsou:povrchově aktivní prostředky, jako např. Ajatin (10%ní roztok dimethyllaurylbenzylamoniumchloridu nebo bromidu), používaný ve zředění 1 : 100 až 1 : 200. Jsou to bezbarvé. nejedovaté, nekorozivní sloučeniny povahy kationtových povrchově aktivních látek, a proto se její účinnost snižuje v přítomnosti aniontových povrchově aktivních látek, tj.mýdel a pracích prostředků.další povrchově aktivní látkou je Persteril (cca 40%ní roztok peroctové kyseliny). Používá se ve zředění 1 : 80.Je vel-mi účinný i na kvasinky a plísně, ale i poměrně zředěný je silně korozivní. Ethanol má poměrně malý dezinfekční účinek. Nejúčinnější je v koncentraci 50-70%. Formaldehyd se používá pro usmrcení mikrobiálních kultur před jejich dalším zpracováním. Pro zastavení rozmnožování se přidává 0,1 ml 40%ního formaldehydu do 10 ml kultury. Chemické prostředky se používají k zastavení růstu rychle se rozrůstajících kolonií na Petriho misce. Dosahuje se toho vložením krystalku KmnO 4 do středu kolonie. Podobného účinku se dosáhne kapkou 10%ního roztoku AgNO 3, který je však účinný hlavně pro bakterie. Pro zastavení činnosti kvasinek a plísní v kulturách před jejich chemickou analýzou se používá allylisothiokyanatan v množství 1 2 kapky/10 ml kultury. Strana23

24 2.3 Očkování mikroorganismů Při pěstování nebo-li kultivaci mikroorganismů je zapotřebí přenést do sterilní živné půdy živé buňky žádaného druhu, což se označuje jako očkování (inokulace) a přenesené buňky se nazývají inokulum. Je samozřejmé, že při kultivaci mikroorganismů musíme postupovat přísně asepticky, tzn. že do kultury ani do používané půdy nesmí vniknout žádné cizí mikroorganismy ze vzduchu nebo z pracovních pomůcek. Aseptická práce vyžaduje řadu zvláštních opatření i značnou zručnost. Hlavní zásady aseptické práce jsou : 1. Pracovat v co nejčistším prostředí,tj.v místnosti,kde se nevíří prach,není průvan a je dokonalá čistota. 2. Ruce si omýt před prací mýdlem a otřít dezinfekčním prostředkem. 3. Povrch pracovní plochy před prací vydezinfikovat, pracovat blízko plamene a plamen ještě před prací několikrát protáhnout pracovním prostorem. 4. Pracovat sice opatrně, ale co nejrychleji. 5. Hrdla nádob i zátky před a po práci ožehnout plamenem. 6. Zátky nikdy nepokládat, ale držet je během celé práce dlaní a malíkem, malíkem a prostředníkem ap. pravé ruky. Při pipetování je vhodné držet zátky mezi ukazovákem a prostředníkem (dlaň je obrácená vzhůru) nebo malíkem a dlaní levé ruky. Nikdy se nedotýkat rukou nebo jiným nesterilním předmětem té části zátky, jež se zasunuje do kultivační nádoby. 7. Nádoby s kulturou nebo sterilní roztoky nechávat otevřené jen po skutečně nezbytnou dobu a otevřené držet hrdlem blízko plamene v silně nakloněné (téměř vodorovné)poloze Očkování kultury ve zkumavce na šikmý agar Uchop zkumavku s kulturou a zkumavku s nezaočkovaným šikmým agarem paralelně do levé ruky obrácené dlaní vzhůru tak, abys měl nezakrytý povrch šikmého agaru a aby zkumavky byly téměř vodorovně. Do pravé ruky vezmi očkovací kličku a ožehni ji pomalým protahováním oxidační částí plamene (viz obr.22). Pak ožehni okraje zkumavky, sejmi pomocí dlaně a malíku, malíku a prsteníku pravé ruky zátky ze zkumavek (obr.14), znovu ožehni okraje zkumavek, ochlaď kličku na nezaočkované půdě, naber malé množství kultury a lehkým klikatým pohybem, vycházejícím ze Strana24