MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE FUNKČNÍ CHARAKTERIZACE PROMETASTATICKÝCH PROTEINŮ U KARCINOMŮ PRSU Diplomová práce Josef Maryáš Vedoucí práce: Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D. Brno 2014

2 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Bc. Josef Maryáš Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie Funkční charakterizace prometastatických proteinů u karcinomů prsu Biochemie Analytická Biochemie Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D. Akademický rok: 2013/2014 Počet stran: 133 Klíčová slova: karcinom prsu; metastáza; EMT; STMN1; TRAF3IP2; RNF25; PDLIM2; SDS-PAGE; western blotting; pull down assay; SILAC

3 Bibliographic Entry Author Title of Thesis: Bc. Josef Maryáš Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry Functional characterization of pro-metastatic proteins in breast carcinomas Degree programme: Biochemistry Field of Study: Supervisor: Analytical Biochemistry Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D. Academic Year: 2013/20014 Number of Pages: 133 Keyword: breast cancer; metastasis; EMT; STMN1; TRAF3IP2; RNF25; PDLIM2; SDS-PAGE; western blotting; pull down assay; SILAC

4 Abstrakt Tato diplomová práce se zabývá proteinem stathmin 1 (STMN1), TRAF3 interakčním proteinem 2 (TRAF3IP2), ring finger proteinem 25 (RNF25) a PDZ a LIM domény obsahujícím proteinem 2 (PDLIM2). Zmíněné proteiny byly na základě předchozí proteomicko-transkriptomické studie, provedené na klinicko-patologicky reprezentativní soustavě karcinomů prsu, vyhodnoceny jako proteiny potenciálně pro-metastatické. Teoretická část této práce představuje literární rešerši popisující obecný proces vzniku metastáz a také jednotlivé proteiny a jejich buněčné funkce, dále dráhy, do kterých jsou tyto proteiny zapojeny (NF-κB, MAPK/ERK, Wnt a další) a v neposlední řadě jejich vztah k migraci a invazivitě buněk a popis jejich známých interakčních partnerů. Experimentální část práce představují funkční experimenty snažící se objasnit vztah zmíněných proteinů k migraci a invazivitě, dále jejich vztah k epiteliálně mezenchymální transici a proteomické experimenty zaměřené na detekci jejich interakčních partnerů. Všechny tyto experimenty přispěly k lepšímu pochopení a určení přesnějšího vztahu těchto proteinů k metastazování nádorů. Abstract This diploma thesis is focused on stathmin like protein 1 (STMN1), TRAF3 interacting protein 2 (TRAF3IP2), ring finger protein 25 (RNF25) and PDZ and LIM domain containing protein 2 (PDLIM2). Based on previous proteomics-transcriptomics study on clinicopathological representative set of breast carcinomas, these proteins were recognized as potentially pro-metastatic. Theoretical part of the thesis summarizes the process of metastasis formation, reviews the functions of mentioned proteins and their involvement in signalling pathways (e.g., NF-κB, MAPK/ERK and Wnt), as well as their known interacting partners. In the experimental part, functional experiments revealing the relationships between these proteins and cell migration, invasiveness and epithelial to mesenchymal transition are described, together with a proteomics-based detection of their interacting partners. All these experiments have contributed to better understanding the potential role of studied proteins in breast cancer metastasis.

5

6

7 Poděkování Na tomto místě bych rád poděkoval Mgr. Pavlu Bouchalovi, Ph.D. za jeho čas, odborné vedení a za poskytnutí materiálů a cenných rad při řešení mé diplomové práce. Dále bych rád poděkoval Mgr. Monice Dvořákové a Mgr. Ivě Struhárové za jejich trpělivost a cenné rady, Mgr. Jakubu Faktorovi a Mgr. Vendule Perníkářové za pomoc s přípravou vzorků pro MS a celému kolektivu RECAMO za jejich pomoc a vstřícnost při provádění a vyhodnocování experimentů. V neposlední řadě bych chtěl poděkovat mým přátelům a rodině za jejich trpělivost a projevenou podporu. Práce byla řešena v rámci grantového projektu Grantové agentury České republiky č S a s podporou Evropského fondu pro regionální rozvoj a státního rozpočtu České republiky (RECAMO; CZ 1.05/2.1.00/ ). Prohlášení Prohlašuji, že jsem svou diplomovou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 30. dubna 2014 Josef Maryáš

8 OBSAH 1 SEZNAM ZKRATEK ÚVOD TEORETICKÁ ČÁST Obecná charakterizace nádorových onemocnění Nádory prsu Kancerogeneze a modely progrese u nádorů prsu Klasifikace nádorů prsu Metastazování nádorů Metastatická kaskáda Lokální invaze Intravazace Přežití v cirkulaci a záchyt ve vzdálených orgánech či tkáních Extravazace Přežití v distantním místě Metastatická kolonizace Migrační mechanismy nádorových buněk Metastatické markery spojované s nádory prsu Studované proteiny STMN TRAF3IP RNF PDLIM Potenciálně pro-metastatické dráhy související se studovanými proteiny NF-κB dráha Kanonická Wnt/β-catenin dráha MAPK/ERK dráha JAK-STAT dráha CÍLE PRÁCE ~ 8 ~

9 5 MATERIÁL A METODY Biologický materiál a chemikálie Použité buněčné linie a bakteriální kmeny Použité protilátky Použité sirna a komerční plazmidy Použité chemikálie Použité přístroje Práce s buněčnými liniemi Kultivace buněčných linií Příprava buněčných lyzátů Stanovení koncentrace bílkoviny v buněčných lyzátech Transfekce buněk elektroporací Transfekce buněk pomocí PEI metody Počítání buněk Měření buněčné migrace a invaze Fluorescenční mikroskopie buněk Separace a detekce proteinů v buněčných lyzátech SDS-PAGE Western blotting Příprava expresních vektorů One Step RT PCR PCR s Herculase II Izolace RNA Agarózová elektroforéza BP reakce a transformace chem. kompetentních bakterií Amplifikace a izolace entry vektoru LR reakce a transformace chem. kompetentních bakterií Amplifikace a izolace destinačního vektoru Připravené plazmidy Identifikace interakčních partnerů vybraných proteinů Detekce SBP tagu u rekombinantních proteinů Pull down assay s LC-MS/MS identifikací a SILAC-MS kvantifikací interakčních partnerů ~ 9 ~

10 6 VÝSLEDKY Studium úlohy vybraných proteinů v EMT, migraci a invazivitě u buněčných linií odvozených od karcinomů prsu STMN TRAF3IP RNF PDLIM Pull down assay s LC-MS/MS identifikací a SILAC-MS kvantifikací interakčních partnerů studovaných proteinů DISKUZE Identifikace vlivu hladin studovaných proteinů na buněčnou migraci, invazivitu a EMT Vliv studovaných proteinů na buněčnou migraci a invazi Vztah studovaných proteinů k EMT Identifikace interakčních partnerů studovaných proteinů SOUHRN SUMMARY SEZNAM CITOVANÉ LITERATURY ~ 10 ~

11 1 SEZNAM ZKRATEK ACN acetonitril AFM mikroskopie atomárních sil Akt protein kináza B AK aminokyselina AP-1 aktivační protein 1 Apaf1 - faktor aktivující apoptotické proteázy 1 APC - adenomatózní polypóza coli protein APS peroxodisíran amonný BAFF B buněčný aktivační faktor Bax Bcl-2 asociovaný protein X Bcl-2 B buněčný lymfatický protein 2 Bcl-XL B buněčný lymfatický extral large protein BSA bovinní sérový albumin CCL5 chemokin (C-C motiv) ligand 5 CK1 kasein kináza 1 COX-2 cyklooxygenáza 2 CXCL1 chemokin (C-X-C motiv) ligand 1 CXCL12 chemokin (C-X-C motiv) ligand 12 CXCR4 C-X-C chemokinový receptor typ 4 ECL enhanced chemiluminiscence EGF epidermální růstový faktor EGFR receptor epiteliálního růstového faktoru EGTA ethylen-glykol tetraoctová kyselina EPR epiregulin ERK extracelulární signál regulující kinázy ~ 11 ~

12 ERK1/2 extracelulární signál regulující kináza 1/2 FA kyselina mravenčí GSK3 glykogen syntáza kinazá 3 HGF hepatocytární růstový faktor Her2/neu receptor 2 pro lidský epidermální růstový faktor HMG-CoA 3-hyroxy-3-methylglutaryl koenzym A hsc70 70 kda protein teplotního šoku HTLV-1 lidský T-buněčný leukemický virus typ 1 HEPES hydroxyethyl-piperazinethansulfonová kyselina IAPs inhibitory apoptotických proteinů IGF-I inzulinu podobný růstový faktor I (somatomedin C) IκB inhibiční proteiny kappab IKK IκB kinázový komplex IL-6 interleukin 6 IL-17 interleukin 17 JAK Janus kinázy JNK c-jun N-terminální kináza LC kapalinová chromatografie MAPK mitogen aktivované protein kinázy MAPKK mitogen aktivované protein kinázy kinázy MAPKKK mitogen aktivované protein kinázy kinázy kinázy Mcl1 protein indukující diferenciaci myeloidních leukemických buněk MiR pre-mirna mirna mikrorna MOPS 3-(N-morpholino)-1-propansulfonová kyselina mrna mediátorová (massenger) RNA MS hmotnostní spektrometrie ~ 12 ~

13 MW relativní molekulová hmotnost NF-κB - nukleární faktor kappa B NK buňky přirození zabíječi NS1 nestrukturovaný protein 1 PDEF od prostaty odvození transkripční faktory Ets PI3K fosfatydilinositol 3 kináza PKC protein kináza C RAMPx králičí polyklonální protilátky proti myším značené peroxidázou RhoC homolog genové rodiny Ras SAPK stresem aktivované proteinkinázy SBP streptavidin vazebný peptid STAT přenašeče signálu a aktivátory transkripce SDS dodecyl sulfát sodný SWARPx prasečí polyklonální protilátky proti králičím značené peroxidázou TAK1 transformujícím růstovým faktorem b aktivovaná kináza 1 TFA trifluoroctová kyselina TGFβ transformující růstový faktor beta TEMED tetramethylethylendiamin TNF tumor nekrotizující faktor TNFα tumor nekrotizující faktor alfa TNFR TNF receptor TRAF6 TNF receptor asociovaný faktor 6 tsg101 (CC2) - gen nádorové citlivosti 101 protein VEGF vaskulární endoteliální růstový faktor WB western blotting Wnt Wingless/Int-1 ~ 13 ~

14 2 ÚVOD Lze směle říci, že pojem nádorové onemocnění je jedním z největších strašáků naší doby. Není se co divit, neboť tato onemocnění jsou celosvětově druhou nejčastější příčinou úmrtí, hned po chorobách srdce a cév. Hlavní příčinou úmrtí u pacientů se solidními nádory není ovšem primární nádor jako takový, ale jeho metastázy, tedy nádory sekundární. Bohužel, i když byla identifikována řada potenciálních prognostických a terapeutických nádorových biomarkerů, z nichž některé byly validovány a vstoupily do klinické praxe, žádný z nich není výslovně spjat s metastazováním. Identifikace biomarkerů asociovaných s metastazováním je tedy z klinického hlediska velmi žádoucí. Výrazným příslibem v této oblasti je značný rozvoj a pokrok molekulárně biologických, genomických a proteomických metod. Právě na základě proteomickotranskriptomického experimentu provedeného na klinicko-patologicky reprezentativní soustavě karcinomů prsu (1), byly vybrány potenciálně pro-metastatické proteiny, jimž se tato práce zabývá, konkrétně stathmin like protein 1 (STMN1), TRAF3 interakční protein 2 (TRAF3IP2), ring finger protein 25 (RNF25) a PDZ a LIM domény obsahující protein 2 (PDLIM2). S výjimkou proteinu STMN1 nejsou tyto proteiny příliš prostudovány, avšak dosud publikované informace o jejich buněčných funkcích, především vztahu k drahám prokazatelně zapojeným do vzniku a vývoje metastáz (NF-κB, MAPK/ERK a další), naše korelace s metastazováním u low-grade karcinomů prsu potvrzují. Podrobnějšímu popisu těchto proteinů, jejich funkcí a jejich vztahu k obecnému mechanismu vzniku a vývoje metastáz jsou postupně věnovány další části tohoto textu. ~ 14 ~

15 3 TEORETICKÁ ČÁST 3.1 Obecná charakterizace nádorových onemocnění Existuje několik definic pojmu nádor (jinak také tumor, neoplazma, novotvar či nádorové onemocnění). Jedna z nich říká, že nádor je abnormální přírůstek tkáňové hmoty, jenž nemá fyziologickou funkci a není v souladu s rovnovážným stavem organismu (2). V současné době je popsáno více než 100 různých typů nádorových onemocnění, přičemž všechny vykazují společný znak, kterým je právě vznik v důsledku abnormálního a nekontrolovatelného buněčného růstu (3). Obecný proces vzniku a vývoje nádorů se nazývá kancerogeneze nebo také onkogeneze (4). Jde o proces mnohastupňový, charakterizovaný akumulací genetických a epigenetických změn v buňkách příslušné tkáně, které vedou k tzv. neoplastické transformaci, tedy k přeměně normálních buněk na buňky nádorové (5). Nádorová onemocnění jsou velmi heterogenní skupinou onemocnění, kterou lze dále klasifikovat a dělit podle nejrůznějších kritérií. Jedno z nejobecnějších dělení nádorů je dělení dle jejich zhoubnosti a to na nádory benigní, tedy nezhoubné, pomalu rostoucí, bez schopnosti infiltrovat krevní či lymfatické řečiště a vytvářet metastázy a nádory maligní (invazivní), zhoubné a rychle rostoucí, schopné generalizovat, tedy šířit se krevní či lymfatickou cestou z místa tzv. primárního nádoru a vytvářet metastázy, tedy tzv. nádory sekundární (6). Jiným způsobem klasifikace je klasifikace nádorů podle jejich anatomické lokalizace, tedy podle orgánu, v němž se nádory nachází (nádory konečníku, ledvin atd.) (7). Další způsob dělení tzv. typing je založen na typu tkáně, ze které nádor vzniknul např. karcinomy, což jsou nejčastěji se vyskytující nádory vzniklé z epiteliálních tkání, sarkomy, nádory pojivových tkání, či leukémie, lymfomy a další. V klinické praxi je pro klasifikaci maligních (invazivních) nádorů používána tzv. histopatologická klasifikace, založená na morfologických faktorech nádoru. Zahrnuje určení rozsahu nádoru tzv. staging, kde se nejčastěji užívá tzv. TNM systému, v něm T (tumor) označuje velikost primárního nádoru, N (nodus = uzlina) označuje přítomnost či nepřítomnost a také stupeň zasažení blízkých lymfatických uzlin a M (metastáza) značí přítomnost či nepřítomnost vzdálených metastáz (7). Součástí této klasifikace je také určení histopatologického stupně diferenciace nádoru, tedy tzv. grade (G), jenž udává stupeň malignity nádorů, obecně platí, že čím je nádor malignější, tím má vyšší grade a tím méně je diferenciován. Do histopatologické charakterizace spadá také již zmiňovaný typing nádoru, tedy určení typu tkáně ze které nádor vzniknul (7). U jednotlivých anatomických typů nádorů je tato klasifikace rozličně modifikována, existují například různé ~ 15 ~

16 systémy pro určení grade apod. S rozvojem molekulárně biologických proteomických a genomických metod, je tato klasifikace u jednotlivých anatomických typů nádorů postupně doplňována i o rozličné molekulární markery (7). Tato diplomová práce se z heterogenní skupiny nádorových onemocnění věnuje pouze jedné skupině a to nádorům prsu. Zabývá se funkční charakterizací proteinů, u kterých předchozí proteomicko-transkriptomická studie (1) odhalila korelaci mezi jejich hladinami a mezi metastazováním nádorů prsu. 3.2 Nádory prsu Nádory prsu jsou celosvětově nejčastěji diagnostikovaným nádorovým onemocněním (8). Předpokládá se, že každý rok se toto onemocnění vyvine nejméně u jednoho milionu žen na celém světě (9), v České republice pak ročně onemocní přes 6000 žen (10). Jedná se též o celosvětově nejčastější příčinu úmrtí spojenou s nádorovým onemocněním (11) a obecně druhou nejčastější příčinu úmrtí u žen (8). Samotná nádorová onemocnění prsu tvoří značně heterogenní skupinu onemocnění zahrnující řadu morfologicky i klinicky odlišných entit (12), jejichž jediným společným znakem je lokalizace v prsu (10). Z této heterogenity vyplývá i odlišná prognóza a také terapeutický přístup k jednotlivým subtypům těchto nádorů (10) Kancerogeneze a modely progrese u nádorů prsu V současnosti jsou uznávány dva modely vzniku a vývoje (kancerogeneze) nádorů prsu a to sporadický klonální evoluční model a model zárodečných nádorových buněk neboli cancer stem cells (CSCs) model (13). Obecný vývoj normálních prsních buněk probíhá ze zárodečné prsní buňky, jež má schopnost sebeobnovy a diferenciace. Z této prsní buňky se diferenciuje progenitorová buňka, která dále diferenciuje a dává vznik luminálním a myoepiteliálním progenitorovým buňkám, ze kterých se nakonec tvoří luminální a myoepiteliální buňky (13), tvořící tubulo-lobulární stavbu prsní tkáně (14). Sporadický klonální evoluční model kancerogeneze nádorů prsu předpokládá, že jakýkoli typ výše zmíněných normálních buněk prsní tkáně může být předmětem genetických a epigenetických alterací a tedy zárodkem budoucího nádoru. Normální buňky prsní tkáně jsou totiž dlouho žijící, což z nich činí velmi vhodné kandidáty pro vznik a akumulaci těchto alterací (8). Buňky s výhodnými genetickými a epigenetickými alteracemi jsou postupem času selektovány a přispívají k iniciaci a progresi nádoru, přičemž z různých buněčných typů se tvoří různé subtypy nádorů prsu, které budou podrobněji ~ 16 ~

17 popisovány v dalších částech textu. CSCs model oproti tomu předpokládá, že pouze zárodečné nádorové buňky, které představují jen malou část populace nádorových buněk, mohou iniciovat vznik a progresi nádoru (14). Předpokládá se, že CSCs vznikají ze zárodečných prsních buněk v důsledku genetických a epigenetických změn, které vedou k poruše sebeobnovy těchto buněk. Také se předpokládá, že část CSCs, podobně jako zárodečné prsní buňky, diferencuje a dává tak vznik jednotlivým subtypům nádorů prsu (14) Klasifikace nádorů prsu Již celá desetiletí je u nádorů prsu vyvíjen klasifikační systém, jenž by usnadnil stanovení prognózy onemocnění a predikci vhodné terapie. V úvodu této práce byla zmíněna histopatologická charakterizace maligních nádorů založená na jejich morfologických faktorech, která je obecně užívána v klinické praxi. Tato klasifikace je používána i u maligních nádorů prsu. Rozsah (staging) nádorů prsu se klasifikuje pomocí již zmiňovaného TNM systému (viz úvod) (15), na jeho základě se nádory prsu následně rozdělují do 4 klinických stádií (I-IV), kdy stádium I vykazuje nejlepší a stádium IV nejhorší prognózu. Součástí TNM systému je u nádorů prsu i určení tzv. statutu lymfatických uzlin, jež hodnotí počet postižených uzlin a procento, které v uzlině zaujímá nádorová tkáň (15). Dalším morfologickým faktorem stanovovaným u nádorů prsu je jejich histologický typ, podle kterého je lze obecně klasifikovat na in situ (na místě) a invazivní (infiltrující) nádory, které se vzájemně liší cytologickými a růstovými znaky. In situ karcinomy jsou heterogenní skupinou, která se dále dělí na karcinomy duktální a lobulární, jenž tvoří až 70% všech diagnostikovaných případů. Duktální karcinomy se oproti lobulárním vyskytují mnohem častěji, ale jsou také mnohem více různorodé a lze je na základě strukturních znaků dále dělit na několik dalších subtypů. Invazivní (infiltrující) karcinomy jsou podobně jako karcinomy in situ také velmi heterogenní skupinou nádorů. Jejich nejběžnějším typem je infiltrující duktální karcinom, dalšími již méně často se vyskytujícími typy jsou poté invazivní lobulární či duktální/lobulární karcinom (13). Histopatologická charakterizace nádorů prsu zahrnuje také stanovení grade. U nádorů prsu se využívá tzv. Nottinghamského grading systému, který rozlišuje nádory prsu podle jejich malignity na nádory s nízkým (1), středním (2) a vysokým (3) gradem, tedy na nádory málo, středně a vysoce maligní (16). Současný systém stratifikace pacientů s invazivními nádory prsu užívaný k určení prognózy a vhodné terapie není ovšem založen pouze na výše zmíněných morfologických faktorech nádoru, tedy na jeho malignitě (grade), histologickém typu ( typing ) a rozsahu ( staging ), nýbrž také na stanovení molekulárních markerů, tedy na tzv. molekulární ~ 17 ~

18 klasifikaci, konkrétně na stanovení statutu hormonálních receptorů (estrogenový a progesteronový) a statutu tyrosin kinázového HER2/neu receptoru (17). Pokroky ve výzkumu nádorových onemocnění prsu, především analýzy genové exprese, vedly k lepšímu pochopení molekulární podstaty vzniku těchto onemocnění a odkryly, že nádory prsu nejsou pouze morfologicky, ale také molekulárně heterogenní (18). DNA mikroarray odhalily, že existuje několik molekulárních subtypů invazivních nádorů prsu, jež spolu s morfologickými faktory přispívají k ucelenější a klinicky relevantnější klasifikaci těchto nádorů (13). Těchto molekulárních subtypů nádorů prsu je pět - viz obrázek 1, jsou to LUMINAL A, LUMINAL B (HER2 negativní), LUMINAL B (HER2 pozitivní), HER2 pozitivní a tzv. basal like subtyp nebo také triple negativní subtyp (19). První z těchto subtypů tzv. LUMIAL A nádory, se v populaci vyskytují nejčastěji. Jde o nádory estrogen (ER), progesteron (PgR) pozitivní HER2 negativní, vyznačující se vysokou diferenciací, nízkou proliferační aktivitou a příznivou prognózou, reagující na hormonální léčbu. LUMINAL B (HER2 negativní) nádory jsou stejně jako LUMINAL A estrogen, progesteron pozitivní, avšak jejich proliferativní index (schopnost buněk dělit se) je vysoký a jsou tedy spojeny s horší prognózou. LUMINAL B (HER2 pozitivní) nádory navíc vykazují i zvýšené hladiny HER2 receptoru, pacienti s tímto typem nádorů reagují na hormonální terapii v kombinaci s transtuzumabem (monoklonální protilátka proti HER2/neu). U pacientů s LUMINAL B (HER2 negativním) typem nádoru se doporučuje pouze hormonální terapie nebo chemoterapie. HER2 pozitivní nádory tvořící další molekulární subtyp představují až 15% všech nádorů prsu a jsou charakteristické nízkým stupněm diferenciace, přítomností metastáz v lymfatických uzlinách a velmi špatnou prognózou. U pacientů s těmito nádory je obvykle indikována léčba transtuzumabem, jejíž zavedení významně zvýšilo přežití pacientek s tímto typem nádoru, a anthracyklinová chemoterapie (19). Poslední molekulární subtyp tzv. triple negativní nádory, jsou značně heterogenní skupinou nádorů, kterou lze dále členit na základě rozdílné genové exprese či mutace genů (např. BRCA1), ale také rozdílné histologie (12). Tento typ nádorů tvoří až 20% všech nádorů prsu, vyznačuje se nepřítomností HER2, estrogenových a progesteronových receptorů, odtud název triple negativní, dále vysokou proliferací a schopností šířit se krevním řečištěm a vytvářet metastázy, nejčastěji v mozku či plicích, méně často pak v kostech. V důsledku vysokého procenta relapsů má tento typ nádorů nejhorší prognózu ze všech 5 molekulárních subtypů. Triple negativní nádory jsou, na rozdíl od nádorů luminálních, citlivé vůči chemoterapii (19). Kombinace morfologických a molekulárních faktorů při klasifikaci nádorů prsu vede k výraznému zvýšení účinnosti léčby a zvýšení pravděpodobnosti pětileté doby přežití (20). ~ 18 ~

19 Molekulární subtypy u nádorů prsu Basal like (triple negative) ( ER-, PgR-, HER2-) ~15-20% LUMINAL A (ER+, PgR+, HER2-, nízký prolif. index) ~40% Nádory prsu LUMINAL B HER2 + ( ER+, PgR+, HER2+, vysoký prolif. index) ~10-15% HER2 + ( ER-, PgR-, HER2+) ~10-15% LUMINAL B HER2 - ( ER+, PgR+, HER2- vysoký prolif. index) ~10% Obrázek 1 Molekulární subtypy nádorů prsu: Rozdělení nádorů prsu na jednotlivé molekulární subtypy a jejich stručná charakterizace zaměřená především na přítomnost či nepřítomnost HER2 a steroidních receptorů a četnost jejich výskytu. 3.3 Metastazování nádorů Jak již bylo zmíněno, náplní této diplomové práce je funkční charakterizace proteinů, korelujících s metastazováním nádorů prsu. Je-li nádorové onemocnění diagnostikováno v rané fázi, tedy bez přítomnosti metastáz, je jeho léčba často úspěšná, je-li ovšem u pacienta diagnostikováno metastatické (invazivní) nádorové onemocnění, účinnost léčby je podstatně nižší (20). Jsou to totiž právě metastázy a nikoli primární nádory, které jsou hlavní příčinou úmrtí pacientů s nádorovým onemocněním (21) - bylo zjištěno, že zodpovídají za více než 90% případů úmrtí těchto pacientů (22). Odhalení mechanismů vedoucích k tvorbě metastáz, ke kterým přispívá i funkční charakterizace pro-metastatických proteinů, je tedy, co se týká prognózy i terapie velice důležité. K pochopení těchto mechanismů významně napomáhá znalost obecného mechanismu vzniku metastáz, tzv. metastatické (22) nebo také invazivně metastatické kaskády (23) Metastatická kaskáda Tvorba metastáz zahrnuje diseminaci nádorových buněk z místa primárního nádoru (21) do distantních orgánů a tkání a jejich přizpůsobení neznámému mikroprostředí v tomto distantním místě (22). Metastatická kaskáda je multifaktoriální a vícestupňový děj zahrnující následující kroky (22): I) lokální invazi buněk z místa primárního nádoru přes extracelulární matrix (ECM) a vrstvu stromálních buněk; II) jejich intravazaci do krevního či lymfatického řečiště; III) přežití a záchyt v krevním řečišti; IV) zachycení v distantních tkáních a orgánech; ~ 19 ~

20 V) extravazaci do parenchymu těchto tkání a orgánů a konečně VI) neoplastický růst metastatických nádorů (22) - viz obrázek Lokální invaze První krok vedoucí k tvorbě metastáz, tzv. lokální invaze, je charakterizován únikem nádorových buněk z mikroprostředí primárního nádoru (24), viz obrázek 2. Nádorové mikroprostředí, tvořené sítí cév, stromálními buňkami a extracelulární matrix, hraje významnou roli v progresi nádorů (23). Nádorové buňky a buňky nádorového mikroprostředí jsou velmi těsně spjaty a navzájem se ovlivňují. Aberantní metabolismus nádorových buněk, jako např. vysoká produkce prozánětlivých molekul, vysoká produkce laktátu a s tím související nízké extracelulární ph či hypoxie, ovlivňují buňky nádorového mikroprostředí, což přispívá k progresi invaze a metastazování (25). V tomto ohledu jsou nádory značně podobné poraněné tkáni a často jsou tedy srovnávány s ránami, které se nehojí. Vztah mezi nádorovými buňkami a mikroprostředím funguje i v opačném gardu: neboť stromální buňky mohou zvyšovat agresivní chování nádorových buněk, jak je popsáno dále (25). Aby nádorové buňky úspěšně opustily mikroprostředí primárního nádoru, musí nejprve dojít k přerušení buněčných spojů a k porušení bazální membrány (BM) (26), specializovaného typu ECM, jež hraje zásadní roli v organizaci epiteliálních tkání a přenosu signálů mezi nádorovými buňkami (22). Nádorové buňky společně s buňkami nádorového mikroprostředí nadměrně exprimují různé proteázy jako např. matrix metaloproteázy (MMPs), tkáňový urokinázový aktivátor plazminogenu (upa), sekretované či membránově vázané proteázy a další, které vedou k rozpadu bazální membrány a umožňují nádorovým buňkám vstup do stromatu nádoru (22). Stromální buňky, jak již bylo zmíněno, jsou poté v důsledku nádorově stromálních interakcí schopny zvýšit agresivní chování nádorových buněk (25) produkcí různých cytokinů a růstových faktorů (např. EGF, HGF, VEGF, TGFβ) viz obrázek 2. Tyto faktory často spouští proces epiteliálně mezenchymální transice (EMT), což následně zvyšuje migrační a invazivní schopnosti buněk primárního nádoru a umožňuje těmto buňkám invadovat do okolních tkání (22). EMT hraje velmi významnou roli v progresi nádorů a metastazování, nicméně je také esenciálním dějem v průběhu embryonálního vývoje a při regeneraci tkání. Obecně lze na základě biologického kontextu EMT rozdělit do tří subtypů, jež ačkoli jsou značně rozdílnými biologickými procesy, mají některé genetické elementy a mechanismy velmi podobné a značně konzervované (27). První typ EMT je zodpovědný za přeměnu epiteliálních buněk na ~ 20 ~

21 mnohem pohyblivější buňky mezenchymální v průběhu vývoje embrya, gastrulace a také migrace buněk podél neurální lišty. Druhý typ EMT je spojován s hojivými procesy, reparací tkání a orgánovou fibrózou a zahrnuje přeměnu epiteliálních či endoteliálních buněk během poranění či chronického zánětu na tkáňové fibroblasty (27). Třetím typem je tzv. nádorové EMT, které se vyskytuje u nádorových epiteliálních buněk. Tento typ EMT zodpovídá za fenotypickou konverzi epiteliálních nádorových buněk na buňky mezenchymální, což přispívá k lokální invazi a také metastazování a osídlování vzdálených orgánů a tkání a v konečném důsledku vede k tvorbě metastatických lézí v těchto tkáních a orgánech. Tvorba těchto lézí je spojena i s tzv. mezenchymálně epiteliální transicí (MET), tedy dějem protikladným k EMT, během něhož nádorové buňky získávají zpět svůj původní (epiteliální) fenotyp, umožňující jim tyto léze vytvářet. EMT je tedy proces zásadní pro osídlení vzdálených tkání a orgánu nádorovými buňkami, kdežto MET zodpovídá za tvorbu metastatických lézí v těchto orgánech a tkáních (27). Fenotypická konverze epiteliálních nádorových buněk během nádorové EMT je provázena ztrátou buněčné adheze a buněčných spojů, remodelací buněčného cytoskeletu, ztrátou epiteliálních markerů např. kateninů, E-cadherinu a dalších a produkci markerů mezenchymálních jako jsou např. vimentin či N-cadherin, což v konečném důsledku vede ke zvýšení invazivity a motility nádorových buněk a umožňuje již výše zmíněnou invadaci a metastazování (28). Již bylo zmíněno, že nádorové mikroprostředí je v důsledku produkce různých cytokinů a růstových faktorů schopno spouštět nádorovou EMT. Za aktivaci nádorové EMT však nejsou zodpovědné pouze cytokiny či růstové faktory, ale také zánětlivé buňky či hypoxie a s ní související oxidační stres, k němuž běžně dochází v nádorovém mikroprostředí. Do aktivace a průběhu nádorového EMT je také zapojena celá řada dalších mechanismů a drah, např. Notch, MAPK-ERK, Wnt, NF-κB, JNK či TGFβ dráha a další (28). Některé z těchto drah a mechanismů, především ty mající vztah ke studovaným proteinům (např. NFκB), jsou podrobněji rozebírány v dalších částech této práce Intravazace V dalším kroku metastatické kaskády probíhá tzv. intravazace, během níž lokálně invazivní nádorové buňky vstupují do lymfatického či krevního řečiště (24), viz obrázek 2. Šíření nádorových buněk lymfatickým řečištěm představuje důležitý prognostický faktor progrese nádorové choroby, touto cestou se šíří především měně invazivní nádorové buňky. Šíření krevním řečištěm je naproti tomu typické pro buňky vysoce invazivní a představuje hlavní způsob šíření nádorových buněk (22). Překonání vrstvy pericytů a endoteliální buněčné ~ 21 ~

22 bariéry, jež tvoří stěny mikrokapilár a následný vstup nádorových buněk do cirkulace, je usnadněn rozličnými molekulárními změnami v nádorových buňkách (např. zvýšené hladiny TGFβ), ale také v buňkách nádorového mikroprostředí. Mechanismus intravazace je také značně ovlivněn strukturními vlastnostmi nádorových kapilár (22). Nádorové buňky spolu s buňkami nádorového mikroprostředí jako jsou např. s nádorem asociované makrofágy (TAMs), produkují angiogenní růstové faktory (např. VEGF), chemokiny (např. IL-6, TNF), proteázy a další látky (např. EGFR, RhoC). Produkce těchto látek přispívá k remodelaci extracelulární matrix (ECM), která vede k tvorbě nových kapilár, tedy tzv. neoangiogenezi (23). Tyto nádorové kapiláry jsou oproti kapilárám v normální tkáni mnohem více prostupné, což proces intravazace usnadňuje (22) Přežití v cirkulaci a záchyt ve vzdálených orgánech či tkáních Po proniknutí do cirkulace jsou tzv. cirkulující nádorové buňky (CTCs) vystaveny značně nepřátelskému prostředí a musí překonat celou řadu stresů, než dojde k jejich záchytu ve vzdálených orgánech a tkáních (22). CTCs se například musí vyhnout specifickému typu apoptózy, tzv. anoikis, která je spouštěna, dojde-li k porušení integriny zprostředkované adheze buněk ke komponentám ECM (22). CTCs využívají několik mechanismů, jež jim umožňují vyhnout se tomuto typu apoptózy. Jedním z těchto mechanismů je změna hladin povrchových integrinů, přesněji nadměrné zvýšení hladin integrinů αvβ3, které je zprostředkováno Src dráhou. Jiným mechanismem je nadměrné zvýšení hladin neurotropických receptorových tyrosin-kináz, jež vedou k aktivaci drah inhibujících apoptózu (např. PI3K/Akt) (26). CTCs také vykazují nadprodukci antiapoptotických mitochondriálních efektorů jako jsou Bcl-XL, Bcl-2, Mcl1 a naopak sníženou produkci pro-apoptotických efektorů např. Bax, Apaf1 či různých kaspáz (23). Kromě anoikis se CTCs musí také umět vyhnout vrozené imunitní odpovědí organismu, především tedy NK buňkám (22). Cirkulující nádorové buňky vytváří spolu s bílými krvinkami sraženiny, tzv. metastatické tromby, jež oklamou buňky imunitního systému a umožňují CTCs přežít. Hlavními molekulami zodpovědnými za vznik těchto trombů jsou L a P-selektiny na povrchu CTCs (29). Cirkulující nádorové buňky, kterým se podaří překonat nepříznivé podmínky krevního řečiště, jsou následně zachyceny ve vzdálených orgánech a tkáních. Dosud neobjasněnou otázkou ovšem zůstává, zda je proces záchytu CTCs procesem aktivním či pasivním, viz obrázek 2 (24). Pasivní záchyt CTCs je založen na jejich velikosti a průměru kapilár. Průměr CTCs činí 20 μm, kdežto průměr kapilár pouhých 8 μm, pasivní záchyt tedy předpokládá ~ 22 ~

23 zachycení CTCs v kapilárách prvního orgánu či tkáně, do které se dostanou (22). Celistvost této teorie ovšem narušují nádory, jež vytvářejí orgánově specifické metastázy, jako např. nádory prsu, jež metastazují především do plic, mozku, jater či kostí nebo nádory kolorekta, přednostně metastazující do jater (21). Předpokládá se, že u těchto nádorů dochází k tzv. aktivnímu záchytu. Podstata této hypotézy tkví v tom, že k záchytu CTCs v důsledku jejich značné plasticity nedochází na základě velikosti, ale na základě specifických interakcí receptorů (např. CXCR4) a ligandů (např. CXCL12) na povrchu CTCs a kapilár příslušného orgánu. Tato hypotéza vychází z tzv. seed and soil hypotézy, formulované roku 1889 anglickým chirurgem Stephenem Pagetem, jež si jako první všiml, že některé nádory vytváří metastázy pouze v určitých tkáních či orgánech (21) Extravazace V dalším kroku CTCs zachycené v kapilárách vzdálených orgánů a tkání mají snahu do těchto tkání a orgánů penetrovat (prostupovat). Penetrace může probíhat tak, že zachycené CTCs iniciují intraluminární růst a vytvářejí mikrokolonie, což vede k ruptuře stěn kapilár a umožňuje kontakt nádorových buněk s tkáňovým parenchymem (22). Jiným způsobem, který také vede ke kontaktu CTCs s tkáňovým parenchymem, je penetrace nádorových buněk skrz endoteliální buněčnou bariéru a vrstvu pericitů v procesu nazývaném extravazace, viz obrázek 2, jež je na první pohled procesem opačným k intravazaci, mechanisticky se však tyto procesy poněkud liší: Zatímco intravazaci usnadňuje vysoká penetrabilita nádorových kapilár a také buňky nádorového mikroprostředí, např. už zmiňované TAMs, při extravazaci musí nádorové buňky často překonávat velmi odolné bariéry jako je např. hemato-encefalitická bariéra mozku (22). K překonání těchto fyzikálních bariér během extravazace nádorové buňky produkují faktory navozující vaskulární hyper-permeabilitu jako např. angiopoietin-like-4 (Angptl4), EPR, COX-2, MMP-1 a MMP-2 (22), důležitou roli hrají také E selektiny, které aktivují MAPK (29). Všechny tyto faktory významně usnadňují extravazaci nádorových buněk do tkáňového mikroprostředí. Nutno ovšem podotknout, že ne všechny nádorové buňky, jež unikly z místa primárního nádoru, přežily v krevním řečišti a byly zachyceny v kapilárách distantních orgánů a tkání, jsou schopny produkovat faktory navozující permeabilitu kapilár a tedy extravazovat (diseminovat) (22) Přežití v distantním místě Úspěšnost přežití buněk, kterým se podaří extravazovat do parenchymu vzdálených orgánů a tkání, je poměrně nízká. Mikroprostředí v místě vzniku sekundárního nádoru (metastázy) se totiž obvykle značně liší od mikroprostředí v místě nádoru primárního (26). ~ 23 ~

24 Dále je zde rozdílná dostupnost růstových faktorů a cytokinů, rozdílné zastoupení složek ECM či typů stromálních buněk (22). Předpokládá se, že nádorové buňky řeší problém rozdílného mikroprostředí tvorbou tzv. pre-metastatických míst. Podle tohoto modelu buňky primárního nádoru systematicky uvolňují signály, např. lysyloxidasu (LOX), jež indukuje orgánově specifické uvolňování fibronektinu z tkáňových fibroblastů, což vede k mobilizaci VEGF receptor 1 pozitivních hematopoetických progenitorových buněk z kostní dřeně do budoucího místa vzniku metastázy. Tyto hematopoetické buňky modifikují mikroprostředí sekrecí MMP-9, což vede k uvolnění různých integrinů a dalších molekul jako jsou např. chemoatraktanty nádorových buněk a k usnadnění přežití diseminovaných (extravazovaných) buněk (22). Kromě tvorby pre-metastatických míst dochází také k aktivaci různých drah v diseminovaných nádorových buňkách, jež jim umožňují přizpůsobit se rozdílnému mikroprostředí a přežít (26) Metastatická kolonizace Dokonce ani v případě, že diseminované nádorové buňky přežijí v sekundárním místě, není ještě garantováno, že budou toto místo metastaticky kolonizovat, tedy proliferovat a vytvářet makroskopické metastázy, viz obrázek 2. Drtivá většina diseminovaných buněk zůstává ve stadiu dlouhodobé dormance ve formě tzv. mikrokolonií, pouze malé množství je schopné tvořit makroskopické metastázy (26).Obecně uznávané důvody, proč diseminované buňky setrvávají ve formě mikrokolonií, jsou ve své podstatě dva. První předpokládá, že diseminované buňky v daném mikroprostředí nejsou schopny aktivovat dráhy vedoucí k aktivaci jejich proliferace, např. Src dráhu. Druhý důvod předpokládá, že buňky sice proliferace schopné jsou, ale v důsledku nadměrné apoptózy se celkový počet těchto buněk nemění, nebo mění pouze velmi pomalu (22). Z výše uvedených poznatků plyne, že metastatická kaskáda, jež je zodpovědná za vznik nádorových metastáz, je značně různorodý, složitý, ale také neefektivní proces (22). Obzvláště poslední fáze metastatické kaskády (metastatická kolonizace, proliferace v sekundárním místě a extravazace) jsou značně neefektivní, což dokazují i četné in vivo a in vitro studie. Skutečnost, že hlavní příčinou úmrtí u pacientů s nádorovým onemocněním jsou metastázy, nicméně indikuje, že mechanismy, dráhy a proteiny zapojené do procesu vzniku metastáz jsou slibnými prognostickými a terapeutickými cíli pro další studie (26). ~ 24 ~

25 Céva a) Primární nádor b) Lokální invaze Bazální membrána (BM) Stromální bu ňky Nádorové bu ňky Nádorové buňky produkcí MMPs, upa a dalších proteáz naruší BM a vstupují do stromatu. V důsledku i n t e r a k c í n á d o r o v ý c h a stromálních buněk dochází k zesílení agresivity buněk nádorů a aktivaci EMT, jež je zásadním m e c h a n i s m e m p r o tv o r b u metastáz. c) Intravazace Intravazace je ovlivňována produkcí angiogenních faktorů (VEGF s, EGF), c y tok i nů (TGFß), MMPs a dalšchi molekul (EGFR, RhoC ), jež jsou produkovány nádorovými b u ň k a m i a s n á d o r e m asociovanými makrofágy, a k t e r é v e d o u k t v o r b ě nádor ov ý c h k api l ár tz v. neoangiogenezi a k usnadnění vstupu nádorových buněk do cirkulace. f) Metastatická kolonizace Po extravazaci musí nádorové buňky přežít v mikroprostředí sekundárního místa, jež se liší od mís ta primárního nádoru. Z přeživších buněk také celá řada zůstává ve formě mikrokolonií a pouze malá část je schopná aktivovat dráhy vedoucí k proliferaci a tv o r b ě m a k r o s k o p i c k ý c h metastáz. e) Extravazace P o z á c h y t u C T C s produkují faktory jako např. angiopoietin-like-4, EREG, COX-2 nebo MMP- 2,jenž usnadňují jejich penetraci do parenchymu vzdálených orgánů a tkání, d) Záchyt v distantním místě V současnosti jsou uznávány dva mechanismy záchytu CTCs. První tz v. pas iv ní, je z alož en na fy z i k ál ním z ác hy tu C T C s v k apilárác h na z ák ladě jejic h velikosti. Druhý,aktivní, je založen na specifické interakci receptorů a ligandů na povrchu CTCs a kapilár. Obrázek 2 Metastatická kaskáda (obrázek převzat z (24) a volně přeložen do češtiny): Jednotlivé kroky metastatické kaskády, vedoucí k tvorbě vzdálených metastáz, zahrnující a-b) lokální invazi nádorových buněk z místa primárního nádoru a jejich vstup do stromatu; c) intravazaci nádorových buněk do krevního a lymfatického řečiště v důsledku produkce MMPs, cytokinů a angiogenních faktorů; d) záchyt cirkulujících nádorových buněk v kapilárách vzdálených orgánů a tkání; e) jejich extravazaci a vstup do parenchymu vzdálených orgánů a tkání; f) osídlení sekundárního místa a neoplastický růst metastatických nádorů Migrační mechanismy nádorových buněk Metastatická kaskáda představuje obecný popis dějů vedoucích k tvorbě vzdálených metastáz. V následující části textu budou stručně zmíněny migračně invazivní mechanismy, jež nádorovým buňkám umožňují měnit jejich pozici uvnitř orgánu či tkáně. Tyto buněčné mechanismy jsou ve své podstatě fenotypickým projevem molekulárních dějů, probíhajících během metastatické kaskády (30). ~ 25 ~

26 Nádorové buňky vykazují široké spektrum migračně invazivních mechanismů, zahrnující jak individuální, tak kolektivní způsoby migrace (31). Tyto mechanismy jsou téměř identické s mechanismy, jež využívají nenádorové buňky k migraci např. během embryonálního vývoje či hojení tkání (30), s tím rozdílem, že v nádorových buňkách dochází k výraznému zvýšení pro-migračních a snížení anti-migračních (inhibičních) signálů. Obecně lze říci, že migrace nádorových buněk je regulována cytoskeletálními proteiny, rozličnými integriny, enzymy degradujícími ECM (např. MMPs) a molekulami zapojenými do buněčné komunikace a adheze. Tyto molekuly se liší v závislosti na typu nádorových buněk a ECM, jenž je obklopuje, v důsledku čehož se liší také jednotlivé migračně invazivní mechanismy. Je však nutno říci, že nádorové buňky jsou schopny své migračně invazivní mechanismy modifikovat a měnit v závislosti na podmínkách prostředí (30). Individuální migrace, tedy migrace jednotlivých nádorových buněk, se v závislosti na typu zapojených integrinů, typu buněk, produkovaných proteáz a cytoskeletální struktuře vyskytuje ve třech morfologických variantách. První z nich je vysoce účinný mezenchymální typ migrace, vyskytující se především u nádorových buněk vzniklých z pojivové tkáně (např. sarkomy, gliomy). Buňky vykazující tento typ migrace mají vřetenovitý tvar, jež vzniká v důsledku aktivace MMPs a upa (31) a v důsledku adhezní dynamiky zprostředkované integriny (30). Druhý typ individuální migrace, která je na rozdíl od předchozího typu tzv. proteázově nezávislá, je migrace améboidní (31). Ta se vyskytuje především u lymfoidních a leukemických buněk, u nichž k migraci dochází v důsledku opakující se morfologické expanze a kontrakce buněk. Buňky migrující tímto způsobem jsou elipsoidní, vykazují značnou deformabilitu a relativně nízkou adhezi k podkladu v důsledku nízkých hladin integrinů (β1 a β3) (30). Třetím typem je migrace v řetězcích, ta se vyskytuje např. u infiltrujícího lobulárního nebo metaplastického karcinomu prsu a představuje obzvláště efektivní penetrační mechanismus se značnou metastatickou kapacitou a špatnou prognózou (30). Na koncích buněk migrujících tímto způsobem zůstávají zachovány některé buněčné spoje (např. adhezní) a buňky tak migrují ve formě řetězců po jakýchsi kolejích v ECM. Tvorba těchto kolejí je připisována signálům produkovaným nádorovými buňkami, které vedou k remodelaci ECM (především aktivace a zvýšení hladin různých proteáz) (30). Kromě individuálních mechanismů migrace existují i kolektivní migrační mechanismy (31), které lze rozdělit na dva typy (30). První z nich je migrace ve formě vyčnívajících štítů či řetězců, jež udržují kontakt (jsou fyzicky spojeny) s primárním nádorem. Tento způsob byl detekován u invazivních epiteliálních nádorů např. u mamárního karcinomu či karcinomu ~ 26 ~

27 tlustého střeva. Buňky tvořící štíty a řetězce exprimují cadheriny (E, C, VE cadheriny) a jsou propojeny a vzájemně komunikují pomocí gap junctions. Druhým typem kolektivní migrace je migrace v podobě buněčných shluků (clusterů), jež tvoří jakási hnízda vzdálená od primárního nádoru. Tento způsob migrace byl pozorován např. u rhambdomyosarkomu (maligní nádor příčně pruhované tkáně). Na rozdíl od individuální migrace, která je typická pro značně dediferenciované nádorové buňky (30), kolektivní migrační mechanismy jsou charakteristické pro diferenciované nádory, např. lobulární karcinom prsu (31). Výhody kolektivní migrace spočívají v tom, že masa buněk může autokrinně produkovat vysoká množství pro-migračních faktorů, proteáz degradujících ECM a vytváří také ochranu před vrozeným imunitním systémem, což umožňuje iniciovat migraci i u značně diferenciovaných a tedy většinou málo invazivních nádorů (30). Již bylo zmíněno, že v závislosti na podmínkách mohou nádorové buňky měnit své migrační mechanismy (31). Buňky migrující ve formě tzv. vyčnívajících štítů či řetězců se mohou v důsledku ztráty buněčné adheze způsobené (např. inhibicí funkce cadherinů) uvolnit a mohou prodělat již výše zmíněnou nádorovou EMT, která vede ke změně jejich fenotypu z epiteliálního na mezenchymální a k iniciaci individuální mezenchymální migrace. Jsou-li u mezenchymálně migrujících buněk zablokovány proteázy, např. MMPs, cathepsin a další (31), adaptují se tyto buňky pomocí tzv. mezenchymálně améboidní transice na proteázově nezávislou améboidní migraci (30). Ke vzniku améboidní migrace může dojít i po tzv. kolektivní améboidní transici, ke které dochází po ztrátě β1 integrinů u kolektivně migrujících buněk. K těmto transicím může docházet během progrese nádorů spontánně, ale mohou být také vyvolány rozličnými léčivy navrženými k inhibici migrace např. antagonisté integrinů, inhibující kolektivní migraci mohou aktivovat migraci améboidní (30). I přes značné pokroky při studiu migračních mechanismů, je třeba dalších studií pro lepší pochopení těchto dějů a k identifikaci dalších faktorů a potenciálních markerů zapojených jak do jednotlivých migračních mechanismů, tak také do jejich remodelace Metastatické markery spojované s nádory prsu Identifikace nových biomarkerů spjatých s metastazováním představuje velmi důležitou oblast klinického výzkumu, kterou se zabývá celá řada výzkumných týmů. Doposud byla identifikována celá řada potenciálních biomarkerů spjatých se špatnou prognózou, vysokým rizikem relapsu a tvorbou metastáz, z nichž některé byly již validovány a jsou využívány v klinické praxi (24). ~ 27 ~

28 Americká společnost klinické onkologie (ASCO) doporučuje jako markery asociované s invazí, angiogenezí a metastazováním u nádorů prsu dvě komponenty plasminogen aktivujícího systému, urokinázový aktivátor plazminogenu (upa) a inhibitor aktivátoru plazminogenu (PAI-1), jejichž zvýšené hladiny jsou také asociovány s relapsem u těchto nádorů (32). Retrospektivní studie také naznačují, že stanovení hladiny upa/pai-1 v duktální tekutině může být užitečné pro screening vysokého rizika vzniku nádorů prsu u žen, tato data nicméně ještě vyžadují další verifikaci (32). Další možné metastatické markery spjaté s nádory prsu jsou: člen receptorové rodiny epidermálních růstových faktorů Her-2, spjatý s agresivním chováním nádorových buněk, dále karcioembryonální antigen (CEA) (32), jehož zvýšené hladiny byly detekovány u 60% pacientů s metastatickou chorobou, sérový marker mucin 1 (MUC-1), jehož zvýšené hladiny byly detekovány u 75 až 90% pacientů, cathepsin D (26), jehož vysoké hladiny korelují s vysokým rizikem relapsu a marker buněčné proliferace Ki-67, jež hraje důležitou roli při regulaci buněčného cyklu a je spjat s mikroinvazí, vysokým gradem a mohl by sloužit jako prognostický marker relapsu (33). Je však nutné říci, že kromě Her-2, jež je využíván jako prediktivní marker pro léčbu transtuzumabem u Her-2 pozitivních nádorů prsu, nejsou současná data dostatečná pro aplikaci těchto markerů do klinické praxe (26). 3.4 Studované proteiny Předchozí část této práce byla věnována obecnému úvodu do problematiky nádorových onemocnění a metastazování nádorů, především se zaměřením na nádory prsu. Následující část bude věnována popisu proteinů korelujících s metastazováním u karcinomů prsu, vybraných na základě předchozí proteomicko-transkriptomické studie pro funkční charakterizaci, zahrnující především identifikaci vztahu těchto proteinů k metastazování, migraci a invazivitě nádorových buněk a identifikaci jejich interakčních partnerů. Proteomicko-transkriptomická studie, byla provedena na klinickopatologicky reprezentativní soustavě 96 primárních nádorů prsu a odhalila změny hladin řady proteinů u low-grade metastazujících nádorů (G1N1) oproti nemetastazujícím (G1N0) a také oproti high grade metastazujícím nádorům (G3N1) a to jak na proteinové tak na transkripční úrovni (1). Z těchto proteinů byly jako potenciálně nejslibnější cíle pro funkční studium vybrány proteiny stathmin-1 (STMN1), ring finger protein 25 (RNF25), TRAF3 interacting protein 2 (TRAF3IP2) a PDZ a LIM domain protein 2 (PDLIM2). Kromě proteinu STMN1 vykazovaly všechny zmíněné proteiny zvýšené proteinové i transkripční hladiny u low-grade metastazujících nádorů prsu oproti nemetastazujícím a také oproti high grade nádorům. ~ 28 ~

29 Protein STMN1 vykazoval zvýšené hladiny u low-grade metastazujících nádorů oproti nemetastazujícím, jeho hladiny však korelovaly s malignitou nádoru, jelikož u high grade metastazujících nádorů byly vyšší než u low-grade metastazujících nádorů. V následujících odstavcích budou rozebírány vlastnosti a funkce těchto proteinů, a u těch, u nichž je to známo také jejich vztah k nádorům, především tedy k nádorům prsu, dále jejich vztah k metastazování (migraci a invazivitě) a jejich interakční partneři STMN1 Prvním studovaným proteinem byl stathmin like protein 1 (STMN1), jinak také onkoprotein 18 (Op18), metablastin, LAP18 (34), prosolin, pp20 (35), p17, p18, p19 či 19K (36) je 149 aminokyselin dlouhý, ubikvitě se vyskytující cytosolický fosfoprotein o velikosti 19 kda (37), jehož gen je lokalizován na chromosomu 1 v oblasti 1p (38) a jehož nadměrná exprese byla popsána u celé řady nádorových onemocnění včetně nádorů prsu (39). Tento protein je organizován do 4 subdomén, α helikální lokalizované mezi aminokyselinami , zodpovídající za interakce STMN1 a dvou N-koncových a jedné C-koncové regulační subdomény, jež zodpovídají za regulaci mikrotubuly-destabilizující aktivity STMN1 (viz dále) (40). STMN1 byl prvním objeveným členem mikrotubuly-destabilizující rodiny proteinů (36), jež kromě STMN1 zahrnuje i stathmin like protein 2 (SCG10), stathmin like protein 3 (SCLIP) a stathmin like protein 4 (RB3), který se vyskytuje ve dvou sestřihových variantách RB3 a RB3 (39). Mikrotubuly jsou polymerní struktury tvořené heterodimery α/β tubulinu, které hrají v buňkách velmi důležité strukturní a funkční role. Ovlivňují tvar buněk, jejich motilitu, distribuci organel v cytoplazmě, segregaci chromozomů během mitózy či přenos intracelulárních signálů. Mikrotubuly-destabilizující proteiny tedy ovlivňují průběh celé řady velmi významných buněčných dějů (41). STMN1, jako mikrotubuly-destabilizující protein, je zapojen do regulace celé řady na mikrotubulech závislých dějů, jako jsou např. buněčná proliferace, diferenciace a růst (37), či motilita buněk (34). Regulace mikrotubulydestabilizující aktivity STMN1 se děje pomocí jeho posttranslačních modifikací, přesněji fosforylace a defosforylace na serinových zbytcích 16, 25, 38 lokalizovaných v regulačních N-koncových doménách a dále na serinu 63 lokalizovaném v α helikální doméně (42). Fosforylovaná forma STMN1 je nezbytná pro výstavbu mitotického vřeténka a tedy správný průběh mitózy v rámci buněčného cyklu (43). Ukazuje se, že pro správné sestavení mitotického vřeténka je nutná fosforylace na všech čtyřech zmíněných serinových zbytcích (43), k níž dochází v průběhu mitózy v závislosti na různých extracelulárních signálech a ~ 29 ~