Metody detekce a identifikace MO se zaměřením na PCR a její variace. Kamila Zdeňková

Transkript

1 Metody detekce a identifikace MO se zaměřením na PCR a její variace Kamila Zdeňková

2 Metody detekce a identifikace MO rozdělení metod pro mikrobiologické zkoušení potravin přehled rychlých metod detekce MO metody založené na polymerásové řetězové reakci (PCR) biočipy (microarrays nebo arrays) real on time PCR digitální PCR normativní postupy zahrnující PCR

3 Metody pro mikrobiologické Klasické kultivační metody zkoušení potravin metody uvedené v Nařízení Komise (ES) č.2073/2005 v platném znění jsou metody referenční a jejich použití je nezbytné pro úřední kontrolu potravin téměř všechny vydány jako ČSN ISO, ČSN EN nebo ČSN EN ISO vydává a seznam platných norem udržuje ÚNMZ (Úřad pro normalizaci, metrologii a státní zkušebnictví) alternativní metody mohou být použity pro ostatní účely a tehdy, pokud byly validovány postupem podle EN mezinárodně uznávanými organizacemi Rozdělení metod: Kvalita Ano či ne Kvantita Kolik

4 Česká technická norma ICS Únor 2006 Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metody pro průkaz a stanovení počtu bakterií čeledi Enterobacteriaceae - Část 2: Technika počítání kolonií ČSN ISO ICS Únor 2006 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal methods for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae - Part 2: Colony count method Microbiologie des aliments - Méthodes horizontales pour la recherche et le dénombrement de Enterobacteriaceae - Partie 2: Méthode par la comptage des colonies Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln - Horizontale Verfahren für den Nachweis und für die Zählung von Enterobacteriaceae - Teil 2: Koloniezahlverfahren Tato norma je českou verzí mezinárodní normy ISO :2004. Mezinárodní norma ISO :2004 má status české technické normy. This standard is the Czech version of the International Standard ISO :2004. The International Standard ISO :2004 has the status of a Czech Standard. Nahrazení předchozích norem Touto normou spolu s ČSN ISO z února 2006 se nahrazuje ČSN ISO 8523 ( ) z října 1995 a ČSN ISO 7402 ( ) z října 1995.

5 Klasické versus rychlé metody stanovení mikroorganismů v potravinách Klasické metody stanovení závazné normy (ČSN, ISO) či standardní operační postupy (SOP) dobře charakterizované, akceptované náročné na materiál a práci zdlouhavé 2-10 dní Rychlé metody stanovení doba trvání do 24 h vhodné pro orientační rozbor většího množství vzorků náročné na přístrojové vybavení positivní nález musí být potvrzen normovanou metodou pro daný MO

6 Přehled metod používaných pro detekci MO Horizontální metody ISO normy Klasické kultivační metody, ISO normy PCR Molekulárně-biologické metody (detekce DNA, případně RNA) Detekce proteinu založené na interakci antigenu s protilátkou Ostatní metody Polymerázová řetězová reakce (PCR) a její variace (multiplex, nested apod.), reversní transkripce PCR (RT PCR), sekvenace PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase (qpcr), digitální PCR (dpcr) Genotypizační metody (AFLP, RFLP, PCR-RFLP, PFGE atd. ELISA (Enzymová imunoanalýza na pevné fázi ) Imunochromatografická technika na membráně Imumomagnetická separace Aglutinace Imunosenzory MALDI-TOF-MS, VIDAS, impedanční metody, stanovení značeného substrátu (CO 2 ), stanovení ATP luminiscenčně, Limulův test atd.

7 I II Centrální dogma molekulární biologie popisuje cestu přenosu informace v biologických systémech DNA: nositelka dědičnosti RNA: realizace genetické informace (čili exprese genu) III I II III Replikace Transkripce Translace Literature and sources used Edited by

8 Literatura a použité zdroje Obrázky: Polymerasová řetězová reakce (angl. Polymerase Chain Reaction PCR) Navržena Kary B. Mullisem roku 1983 Nobelovou cenou udělena roku 1993

9 Polymerasová řetězová reakce (angl. Polymerase Chain Reaction PCR) in vitro reakce umožňující amplifikaci DNA katalyzována termostabilní DNA polymerasou k namnožení cílového úseku používá oligonukleotidových primerů 1. Vlastní PCR - cyklické opakování 3 kroků Fáze Prů bě h DENATURACE tepelné oddě lení vláken dvojšroubovice DNA Teplota C 2. ANNEALING př ipojení primerů úsek seků m v DNA k jejich komplementárn rním C 3. ELONGACE prodlouž ení primerů polymerasou 72 C

10 Polymerasová řetězová reakce (angl. Polymerase Chain Reaction PCR) Denaturace Nasedání primerů Prodlužování primerů Literatura a použité zdroje Obrázek: Andy Vierstraete (1999)

11 PCR. Literature and sources used Andy Vierstraete (1999)

12 PCR teoretická účinnost reakce - 100% teoreticky dochází v každém cyklu ke zdvojnásobení N; N=N0*2^n No=1 No=10 n 2^n ,43597E ,09951E+12 1,09951E+12 1,09951E+13 N = počet molekul DNA v n-tém reakčním cyklu N 0 = počet molekul DNA v 0-tém reakčním cyklu (na začátku reakce) n = počet cyklů

13 Reakční směs (mastermix, MM) složka deionizovaná voda reakční pufr Mg 2+ dntp (dctp, datp, dttp, dgtp) primer A, primer B DNA polymerasa templát DNA funkce bez DNas, RNas vhodné prostředí pro polymerasu (iontová síla, ph) vazba s nukleotidy kofaktor polymerasy, (MgCl 2, MgSO 4 ) nukleotidy - stavební kameny polymerace synteticky připravené oligonukleotidy o délce nukleotidů, ohraničení amplifikovaného úseku termostabilní DNA polymerasa, polymerace DNA izolovaná z buněk, plazmidová DNA (genomové knihovny), buněčný extrakt podrobený lýzi

14 Reakční směs (koncentrace) složka obvyklá koncentrace v reakční směsi nízká koncentrace vysoká koncentrace templát DNA 0,01 ng-1000ng (plazmid-genomová DNA) nízký výtěžek nízká specifita nasedání primerů přítomnost inhibitorů PCR reakce- EDTA, heparin, (PO 4 ) 3- primer A 0,1-1µM nízký výtěžek nízká specifita nasedání primer B 0,1-1µM primerů DNA polymerasa Mg 2+ Reakční pufr dntp (dctp, datp, dttp, dgtp) 0,01-0,05 U/µl nízký výtěžek nízká specifita 1-5mM (množství Mg 2+ je přímo úměrné množství dntp) 10mM Tris-HCl, 50mM KCl 200µM pro každý nukleotid nízký výtěžek ph<7 poškození templátu vyšší přesnost nízká přesnost DNA polymerasy stabilizace ds DNA neúplná renaturace nižší výtěžek stabilizace nespecifické vazby primerů-nespecifické chybné zařazení

15 Reakční cyklus (teplotní a časový profil) proces T ( C) t cykly Počáteční denaturace C 2-5min přerušení vodíkových vazeb (hlavně genomová DNA), denaturovaná vlákna obsazena primery (nadbytek) Denaturace 95 C 30s-1min N=25-30, max. 40 teplota dle délky produktu, typu termocycleru, zkumavek nízká teplota = při ochlazení renaturace vysoká teplota = tepelné poškození templátu, hlavně u delších produktů (chyby) Annealing C 1min optimální T a (teplota annealingu) je blízká tzv. teplotě tání primerů = teplota 50% disociace duplexu primer/templát (různé vzorce, záleží na obsahu CG a TA) oba primery by měly mít podobnou T a stejná specifita nasedání vysoká teplota = primer nenasedá nízká teplota = primer nasedá nespecificky teplota dle množství templátu: dostatek s, málo déle (musí najít svůj úsek) Elongace 72 C 45s-3min teplota optimální pro DNA polymerasu, teplota podle délky fragmentu Závěrečná elongace 72 C 5-15 min dokončení nedosyntetizovaných řetězců hybridizace komplementárních vláken

16 DNA polymerasy Taq DNA polymerasa termofilní bakterie Thermus aquaticus (nyní rekombinantně) aktivní při pokojové teplotě nutnost pracovat na ledu při teplotách nad 90 C je inaktivní, ale při ochlazení se znovu aktivuje pouze 5 exonukleasová aktivita (degradace Okazakiho fr.), nikoliv 3 exonukleasová aktivita (proofreading) 1 chyba na 10-20tisíc nukleotidů Další typy polymeras Proofreading polymerasy (3 exonukleázová aktivita) = oprava reverzní transkripce (Mn 2+ ) nebo polymerázová aktivita (Mg 2+ ) v závislosti na přítomných kofaktorech Hot start polymerasy = ovlivnění začátku reakce Platinum Taq DNA Polymerasa Proofreading polymerasy Tth Tma Deep Vent TM Tli Pfu Pwo Thermus thermophilus HB-8 Thermotoga maritima Pyrococcus sp. Thermococcus litoralis Pyrococcus furiosus Pyrococcus woesei

17 Hot-start PCR technika, která snižuje nespecifické amplifikace při přípravě mastermixu při pokojové teplotě byly vyvinuty specializované enzymatické systémy, které inhibují polymerázovou aktivitu enzymu při pokojové teplotě vazbou protilátky v přítomnosti kovalentně vázaných inhibitorů odloučí až po zahřátí enzymu Platinum Taq DNA Polymerasa je rekombinantní Taq DNA polymerasa dodávána v komplexu s protilátkou, která inhibuje polymerázovou aktivitu při pokojové teplotě. DNA polymeráza se aktivuje vysokou teplotou (při 94 C) v průběhu počáteční denaturace PCR jakmile se polymeráza oddělí od inhibitoru znovu získá svou aktivitu v plném rozsahu

18 Primery oligonukleotidy o délce nukleotidů bez intramolekulárních komplementárních sekvencí tvorba sekundárních struktur vyrovnaný poměr GC a AT 3 konce primerů - probíhá od nich syntéza neměly by být vzájemně komplementární tvorba a amplifikace dimerů na 3 konci by neměl být tymin (nízká specifita párování), degenerace kodonu na 3 konci by neměly být více jak dva G či C-vysoká stabilita (3 vodíkové vazby)-nespecifické produkty (nasednutí i při nekomplementaritě zbytku) často na 3 konci tzv. GC svorka (zakončení GC)-zvýšení účinnosti hybridizace k templátu 3 konec nutná komplementarita k templátu 5 konce primerů sekvence nemusí zcela odpovídat vložení restrikčního místa, detekce mutace, různé značky

19 Primery amplifikace ne zcela známé sekvence či sekvence s variabilními pasážemi = degenerované primery směs primerů lišící ve variabilním místě zařazení inosinu (páruje se se všemi bazemi) či tyminu (nízká specifita k A) GAYTST GHGKAG

20 amplifikace genu Primer, kterým začíná 5 -konci řetězce genu a v průběhu PCR se elonguje ve směru transkripce, se označuje jako kódující = forward primer (5 primer, upstream primer). Vznikající sekvence identická se sekvencí kodonového vlákna. 3 primer nasedá na 3 konec genu, nasedá na kodonové (+) vlákno. Vznikající sekvence identická se sekvencí antikodonového vlákna. degenerované primery: amplifikace ne zcela známé sekvence na místo neznámého nukleotidu zařazeno více možných variant = směs primerů lišící se v dosazené bázi celkový počet variant vynásobení počtu variant na jednotlivých pozicích případně lze zařadit inosin (páruje se se všemi bazemi) či tymin (nízká specifita k A)

21 Směr DNA produktů nejdostupnější metodou detekce produktů PCR je elektroforesa v agarosovém gelu interkalační barvivo Ethidium bromid či SYBR Green I Mr Detekovaný vzorek * - Nemodifikovaná plodina (negativní kontrola) 1 0,1% GM plodina 1000bp 429bp 2 0,5% GM plodina 3 1% GM plodina 4 2% GM plodina 500bp 100bp + + 5% GM plodina (pozitivní kontrola) Negativní a pozitivní kontroly se zařazují z důvodu odhalení případné kontaminace či technické chyby, která by mohla za konečné zkreslení výsledků. Z důvodu jistoty u celého průběhu se obě kontroly řadí mezi vzorky již na počátku celého testu. * Ústav pro referenční materiály a měření (Institute for Reference Materials and Measurements), organizace Evropské komise EC JRC,

22 Elektroforetická detekce Analýza délky vzniklých fragmentů princip molekulového síta koncentrace agarosy: princip molekulového síta velikost produktu se srovnává se standardem obsahujícím fragmenty DNA známé délky Doporučená koncenrace agarosového gelu % agarose DNA size range (bp) elektroforetická separace v polyakrylamidovém gelu na automatickém sekvenátoru přesné zjištění délky fragmentů v genotypizační metodě AFLP alespoň jeden primer musí být značen fluorescenční značkou

23 Analýza PCR produktů Analýza specifity fragmentu hybridizační analýza=hybridizace s fluorescenčně značenou sondou DNA (shoda sekvencí) Southern blot: přenos na membránu hybridizace se značenou sondou DNA (část sekvence shodná s produktem) přenos přímo (technika dot blot)=dna čipy štěpení restrikčními enzymy restrikční místo uprostřed sekvence sekvenace PCR produktu přímo (vše se sekvenuje, v případě polymorfismu nejednoznačné)- příprava jednovláknové DNA asymetrické PCR: různá koncentrace primerů (obvykle 50:1 až 100:1), po cyklech dojde k vyčerpání - tvoří se pouze jednovláknový produkt z primeru o vyšší koncentraci sekvence na tuhé fázi: primer značený biotinem + tuhá fáze pokrytá streptavidinem = navázání po zaklonování (jednoznačné) žádaný produkt lze též po elektroforéze vyříznout a po přečištění sekvenovat PCR produkt má svojí specifickou délku a sekvenci

24 Multiplex PCR PCR s násobným množstvím párů primerů Výhoda: + možnost analýzy více parametrů Nevýhoda: - zvýšení tvorby nespecifických produktů - diskriminace delších DNA fragmentů

25 Příklad multiplex PCR Mr Nt bp 101 bp 151 bp 100 bp Detekční limit duplex PCR s primery P35S 1-3 / P35S 1-5 a nost 2-3 / nost 2-5. Dráha 1: nemodifikovaná sója, dráha 2: 0,1% RR sója, dráha 3: 0,25% RR sója, dráha 4: 0,5% RR sója, dráha 5: 1% RR sója, dráha 6: 5% RR sója, Nt: beztemplátová kontrola. Mr: marker 100 bp DNA ladder, očekávaná velikost produktů: 101 a 151 bp.

26 Nested PCR dvě po sobě následující amplifikační reakce dva druhy oligonukleotidových primerů - vnitřní a vnější templát první reakce - DNA extrahovaná z vyšetřovaného vzorku templát druhé reakce - produkt získaný první amplifikací + zvýšení citlivosti a přesnosti 1. PCR 2. PCR vnější primery DNA templát cílový produkt 1. PCR vnitřní primery DNA templát (cílový produkt 1. PCR) Cílový produkt 2. PCR

27 Standardy a kontrola PCR procesu vhodné zařazení pozitivní, negativní či beztemplátové kontroly PCR procesu - negativní kontrola - necílová DNA Nt beztemplátová kontrola - sterilní voda + pozitivní kontrola - ověřená cílová sekvence negativní nebo beztemplátové kontrola: ověření možné kontaminace reagencií a používaných pomůcek pozitivní kontrola: ověření funkčnosti všech kroků vhodné zařazení beztemplátové kontroly celého procesu analýzy vzorku, tzn. nejprve je podrobena izolačnímu procesu společně s analyzovaným vzorkem (beztemplátová kontrola izolačního procesu) a dále je podrobena všem PCR procesům jako analyzovaný vzorek

28 PCR pro detekci a identifikaci MO pro sledovaný MO vznikl jedinečný produkt (komplementární primery), tzn. nevzniká stejný produkt pro jiné MO detekce patogenních bakterií: nejčastěji identifikace genů zodpovědných za projevy virulence. Listeria spp.: iap gen při vhodně nastavené reakci tvoří produkt jen bakterie rodu Listeria, druhová specifita určena velikostí amplifikovaných produktů E. coli O157: rfb gen - pro O157 somatický antigen stx1, stx2 - geny kódují produkci toxinů eaea gen (virulenční faktor intimin), hlya (enterohemolysin A)

29 Analytická PCR Co hledám? Co chci zjistit? Přítomnost specifické sekvence, specifického genu druhově specifická PCR (např. detekce patogenu Campylobacter, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes apod.) deteguji délku fragmentu, mohu ověřit restrikčním štěpením více dvojic primerů multiplex PCR 1000bp 500bp 559bp Mr Nt Detekce tet(o) gen rezistence k tetracyklinu v bakterii Campylobacter A-100bp marker, 1-4-kmeny rezistentní k tetracyklinu 5-9 kmeny sensitivní k tetracyklinu 10-beztemplátová kontrola

30 typizace a identifikace bakterií na úrovni kmenů: důležité parametry při diagnostice i léčbě onemocnění a zároveň při monitorování epidemiologie infekcí (např. zeměpisné rozšíření, zdroj nákazy, hostitelská specifita, patogenita, virulence) dva typizační systémy: 1. Fenotypizace Biochemické testy 2. Genotypizace: Typizace MO 1. metody založené na porovnávání získaných vzorů DNA fragmentů, které využívají rozdílnosti ve velikosti fragmentů DNA získaných buď amplifikací genomové části DNA nebo jejich štěpením specifickými restrikčními endonukleasami, či kombinací obojího (např. AFLP, RFLP, PFGE, Rep-PCR) 2. metody založené na sekvenci, kdy jsou bakteriální kmeny rozlišeny na základě polymorfismů v DNA (např. SLST, MLST) 3. metody založené na hybridizaci DNA s próbami o známé sekvenci

31 Typizace MO fenotypový typizační systém spočívá v určení bakteriálního fenotypu na základě koloniální morfologie na různých růstových médiích, biochemických testů, sérologie, citlivosti ke killer toxinům, patogenitě a citlivosti k různým druhům antibiotik apod. V některých případech však není fenotypová typizace dostatečně účinná při určování blízce příbuzných bakteriálních kmenů genotypizace využívá rozlišení bakteriálních kmenů na základě zkoumání jejich genetického materiálu a získaný genetický profil je unikátní (můžeme jej přirovnat např. k otisku prstu, tzv. DNA fingerprint)

32 analyzovat rozdíly mezi různými DNA v rámci druhu = genotypizace (fingerprinting) DNA fingerprinting náhodným primerem štěpení DNA, připojení adaptérů, z kterých vedeno PCR 1517bp 1200bp 1000bp 800bp 500bp 4000bp 3000bp 2000bp 1500bp 1000bp 750bp 500bp REP PCR 38bp dlouhý úsek s 6 degenerovanými pozicemi (sekvencemi) srovnání vzniklých profilů A B B

33 PFGE (pulsed field gel electrophoresis) elektroforetická technika používaná při dělení velkých molekul DNA (10 kbp 10 Mbp) při klasické gelové elektroforese v konstantním elektrickém poli je možné účinně dělit fragmenty DNA do velikosti zhruba 20 kbp, protože nad touto hranicí fragmenty DNA vykazují stejnou pohyblivost a není možné je od sebe rozlišit aplikace střídavého elektrického pole ve třech různých směrech (posun vždy o 120 ), umožňuje účinné rozdělení i velkých fragmentů DNA principem této metody je opět štěpení genomové DNA restrikční endonukleasou (tentokrát však lyse buněk a štěpení DNA probíhá in situ v agarosových bločcích připravených smícháním bakteriální suspenze s rozpuštěnou agarosou) volena méně často štěpící RE, poskytující menší počet dlouhých fragmentů rozdělením fragmentů pomocí PFGE a obarvením gelu (např. v roztoku ethidiumbromidu) opět u jednotlivých kmenů získáme různé vzory bandů (profilů), jež mezi sebou velmi dobrá reprodukovatelnost a diskriminační schopnost = metoda považována za tzv. zlatý standard v oblasti genotypizačních metod

34 Pulsní gelová elektroforesa (Pulsed field gel electrophoresis, PFGE) mohou být rozděleny molekuly 10 Mb v agarosovém gelu gel je vystaven elektrickému poli, jehož směr se pod určitým úhlem ( ) v časových intervalech periodicky mění DNA periodicky mění svůj směr migrace (nutná reorientace molekuly) díky změnám orientace elektrického pole CHEF contour-clamped homogenous electrical field úhel 120 nebo 106, také 90 pro kb

35 Výhody a nevýhody PCR Výhody + nízká mez detekce 0,001% až 0,5% GMO či jednotky cílového MO + možnost sériových analýz + možnost analýz několika parametrů v jedné reakci (multiplex PCR) + malé reakční objemy (nižší cena stanovení) + možnost analýz potravinářských surovin i technologicky opracovaných potravin Nevýhody - nemožnost kvantifikace pomocí klasické metody PCR - některé sekvence podléhají patentovému zákonu (v běžné praxi jsou nedostupné pro návrh primerů) - poměrně vysoká cena základního vybavení - malé reakční objemy (náročné na zkušenost experimentátora a výběr vhodných podmínek reakce) - neschopnost odlišit živé a mrtvé buňky MO

36 RNA v buňce Ribosomes with ribosomal RNA Messenger RNA (mrna) Chromosomal DNA Bacterial cell Small RNAs multiple RNA copies for every one DNA copy, depending on the state of the cell Životnost mrna v buňce je velmi nízká u bakterií 1 až 6 minut, kvasinky okolo 20 minut mrna je v živé buňce neustále syntetizována a degradována

37 PCR kombinované s reverzní transkripcí (RT-PCR, Reverse transcription PCR) mrna cdna amplifikace genu (PCR) Reverzní transkripce Použitelné pro izolaci genu z mrna např. eukaryotní organismy, poté cdna (nejsou v ní obsaženy introny)

38 Literatura a použité zdroje RT-PCR reakce, která amplifikuje RNA namísto DNA zejména mrna: kontrola exprese, rozlišení živých a mrtvých buněk počátečním krokem je izolace celkové RNA nebo mrna z vzorku, pomocí nukleas jsou odstraněny zbytky DNA, následně je pomocí reverzní transkriptasy přepsána templátová mrna do cdna a ta je poté podrobena PCR

39 Fluorescence - aplikace Odlišení živých/mrtvých buňky - kity LIVE BacLight Bacterial Gram Stain Kit LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit LIVE/DEAD Reduced Biohazard Cell Viability Kit #1 LIVE/DEAD Yeast Viability Kit Cíl Bakterie Kvasinky Výsledek Fluorescenční látky Standardní filtry Živé G+ se barví zeleně a živé G- se barví červeně Odlišné zbarvení je založeno na propustnosti membrán. Živé buňky se barví hlavně zeleně a mrvé buňky převážně červeně (proniknou obě barviva) Aktivní buněčné vakuoly se barví oranžově, živé i mrvé buněčné stěny modře SYTO 9 SYTO 9 SYTO 10 FUN 1 Hexidium iodid Promidium iodid Ethidium homodimer-2 Calcofluor White M2R FITC FITC FITC FITC Texas Red Texas Red Texas Red DAPI Ex/Em (nm) 480/ / / / Introduce.htm 480/ / / /440

40 Koncentrace a kvalita DNA Převážně spektrofotometricky [ng/ml] A260/A280 ratio: indicates pollution proteins, in pure DNA is 1.8 to 2.0 A260/A230 ratio: less than 1.8 indicates the presence of organic contaminants - (poly) phenols, thiocyanates, carbohydrates, urea, etc., in a clean DNA is in the range (-2, 2) Horizontální agarosová elektroforesa Lambda/HindIII marker

41 Detekce specifického genu 1000bp 500bp 559bp Mr Nt Detekce tet(o) gen rezistence k tetracyklinu v bakterii Campylobacter A-100bp marker, 1-4-kmeny rezistentní k tetracyklinu 5-9 kmeny sensitivní k tetracyklinu 10-beztemplátová kontrola

42 PCR detekce - reálný vzorek účinnost izolace DNA z potravinové matrice účinnost PCR detekce=citlivost (závislost signálu na výchozím množství templátu) DETEKČNÍ LIMIT!!!! L. monocytogenes 1kb Primery komplementární k Listeria spp bp 593 bp Primery komplementární k Listeria monocytogenes

43 BAX system Q7 validovaný systém pro detekci potravinových patogenů komerční kit pro izolaci DNA a PCR reakci validované schéma zkoušky (izolace DNA z malých objemů po pomnožení) detekce specifického produktu pomocí křivky tání (případně též Real-Time PCR aplikace)

44 BAX system Q7 Salmonella Listeria monocytogenes Genus Listeria Enterobacter sakazakii E. coli O157:H7 Staphylococcus aureus Real-time Campylobacter jejuni/coli/lari Real-time Vibrio cholerae/ parahaemolyticus/vulnificus Real-time Yeast and molds en_us/index.html

45 Provedení Vzorek Příprava vzorku Teplotní lyze PCR Detekce a analýza Není nutné použít izolovanou DNA Lyofilizované reagencie (tableta) DNA-Polymerase Primery Nukleotidy Pufr Barvička Pozitivní kontrola: interní

46 Kmen Výsledek Analýza křivky tání Izolát z masa - T [ C] E. coli (CCM 3954) - T [ C] Avirulentní EC 4787 O157:H7 (pasážovaná) - T [ C] Avirulentní EC 4787 O157:H7 + T [ C]

47 Biočipy (microarrays nebo arrays) kolekce mikroskopických spotů DNA navázaných k pevnému povrchu (např. sklo, plast nebo křemíkový čip) až tisíce krátkých DNA sond komplementárních k hledaným sekvencím založeno na klasické technologii hybridizace DNA imobilizované DNA fragmenty (sondy) mohou být kratší oligonukleotidy (20-30 bp), PCR produkty, genomová DNA, umělé bakteriální chromosomy (BAC), plazmidy nebo i dlouhé oligonukleotidy DNA biočipy jsou nejčastěji využívány k měření exprese velkého množství genů současně NK bývají izolovány z buněk, RNA je převedena na cdna nebo crna, a jsou amplifikovány pomocí PCR technik řetězec NK hybridizuje se sondou imobilizovanou na povrchu pevného nosiče, detekce je prováděna buď stříbrem, chemiluminiscenčně (pro DIG značku) nebo přímo fluorescenčně

48 Biočipy (microarrays nebo arrays) Navázaný cílový fragment Imobilizovaný DNA fragment Pevný povrch Literatura a použité zdroje Počítačový model prost. uspořádání na DNA biočipu. Převzato z

49 Kvantifikace NK pomocí PCR PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase (qpcr, angl. Real on Time PCR) monitorování vznikajícího produktu v průběhu celého amplifikačního procesu qrt PCR je nejpřesnější a nejvýhodnější v současné době dostupná kvantitativní metoda vysoká pořizovací cena nástrojů interkalační barviva - (např. SYBR green I, Ethidium bromid) = levnější fluorescenčně značené sondy - přesnější

50 Prahový detekční cyklus C T (threshold cycle) nejnižší cyklus ve kterém hodnota fluorescence měřeného vzorku vzroste nad hodnotu fluorescence pozadí C T

51 Fluorescence reportéru ( Rn) Vzorek beztemplátová kontrola Ct Amplifikační křivka Vzorek 1: 10 6 kopií cílového úseku vzorek 2: 10 5 kopií cílového úseku vzorek 3: 10 4 kopií cílového úseku vzorek 4: 10 3 kopií cílového úseku vzorek 5: 10 2 kopií cílového úseku zelená přímka znázorňuje mezní hodnotu pozadí Počet cyklů

52 PCR teoretická účinnost reakce - 100% teoreticky dochází v každém cyklu ke zdvojnásobení N; N=N0*2^n No=1 No=10 n 2^n ,43597E ,09951E+12 1,09951E+12 1,09951E+13 N = N 0 (2) n N = počet molekul DNA v n-tém reakčním cyklu N 0 = počet molekul DNA v 0-tém reakčním cyklu (na začátku reakce) n = počet cyklů

53 Skutečná amplifikační účinnost reakce N = N 0 (1+E) n N = počet molekul DNA v n-tém reakčním cyklu N 0 = počet molekul DNA v 0-tém reakčním cyklu (na začátku reakce) E = amplifikační účinnost reakce <0,1> n = počet cyklů

54 SYBR Green I Systém SYBR Green I (SG I) interkaluje do malého žlábku dsdna fluorescence SG I se po navázání do dsdna zvýší až 1000-krát delší amplikony = vyšší fluorescenční signál detekce veškeré dsdna = nižší specifičnost systému nutnost pečlivého výběru reakčních podmínek nutná analysa křivek tání cenově dostupnější než detekce pomocí fluorescenčně značených sond

55 SYBR Green I a) b) c) a) prostředí reakce po teplotní denaturaci b) nasednutí primerů a vazba barviva c) prodlužování primerů upraveno dle

56 Křivka tání Nahoře: Křivky tání. Dole: Záporná derivace fluorescence dělená derivací teploty

57 Kalibrační a disociační křivka

58 Fluorescenční rezonanční přenos energie (FRET, angl. Fluorescence Resonance Energy Transfer) Zdroj < 2 fluorofor je excitován pomocí vhodné vlnové délky energie z dárce (donoru) je přenesena na druhý fluorofor (akceptor) excitovaný akceptor emituje světlo s vyšší vlnovou délkou

59 Real on Time PCR přesná, rychlá, univerzální metoda vhodná pro sériové analýzy vysoké pořizovací náklady

60 Digitální PCR (dpcr) Rozdělení analyzovaného vzorku do velkého počtu separátních reakčních komor Literatura a použité zdroje

61 Digitální PCR (dpcr) dosažené pomocí 1) čipu (dynamické čipy (mikrofluidika), OpenArray ) teplotní protokol jako u klasického PCR 2) maličkých kapiček nanolitrové velikosti (ang. doplet) fluorescenční detekce umožněna použitím Taqman hydrolyzačních sond (endpoint PCR, nárůst fluorescence) kvantifikace je provedena odečtem fluorescence velkého počtu individuálních reakcí (komor) na konci amplifikační reakce počítají se jednotlivé komůrky + positivní (detekce fluorescence, tzn. obsahuje cílový úsek) - negativní (nedetekuje se fluorescence, tzn. neobsahuje cílový úsek) používá se statistické vyhodnocení pomocí Poissonovo rozdělení (zákon vzácných jevů) počet cílových úseků průměrně připadající na jednu reakční komoru = - ln (1 počet pozitivních komůrek/ celkový počet analyzovaných komůrek)

62 Digitální PCR (dpcr) absolutní kvantifikace přítomnost cílového úseku je měřena přímo (není potřeba porovnání se standardní křivkou) jednoduché porovnání výsledků získaných z jednotlivých PCR běhů (dpcr počítá přímo cílové úseky, není ovlivněno různými použitými přístroji, standardní křivkou či zkušenostmi experimentátora). relativní kvantifikace provedena poměrem absolutních kvantifikací dvou cílových úseků vhodné i pro kvantifikaci nízké koncentrace cílového úseku ve vysokém množství doprovodné nukleové kyseliny citlivější než real on time PCR

63 Digitální PCR (dpcr) Rozdělení vzorku do komůrek zmenšuje (odstraňuje?) efekt přítomnosti inhibitorů amplifikační reakce. Vzorek, který by nemusel být vhodný pro kvantifikaci pomocí qpcr může být spolehlivě kvantifikován pomocí dpcr. Sestavy (angl. Arrays) 1. Dynamické čipy pro genotypování a genovou expresi (Fluidigm BioMark TM ) 2. OpenArray Real-Time PCR Systém (Life Technologie, Applied Biosystems) Droplet digital PCR (ddpcr) 1. Biorad QX100

64 Díly A-E představují sérii ředění analyzovaného vzorku cdna (1:1) Díl F je negativní kontrola Každý díl obsahuje 765 komůrek (individuální PCR reakce) Černá políčka negativní signál Červená políčka pozitivní signál (detekce fluorescence) Sloupec označený Estimated : odhad kopií cílového úseku určený pomocí qpcr Sloupec označený Biomark : odhad kopií cílového úseku pomocí dpcr Literatura a použité zdroje

65 OpenArray Real-Time PCR Systém Kombinace OpenArray Real-Time PCR Instrument a OpenArray AccuFill Systém (Applied Biosystems life technologies) Literatura a použité zdroje

66 Kapkový digitální systém PCR (ddpcr) Kapkový digitální systém PCR angl. Droplet digital PCR (ddpcr) vzorek a olej vytvoří emulzi až kapiček ( komůrek ) v analyzovaném vzorku 1. Přístroj 2. přístroj 3. přístroj emulgátor PCR termální cycler angl. droplet reader Literatura a použité zdroje a Ředění analyzovaného vzorku