Martin Písačka. ÚHKT Praha. 7. Střešovický transfuzní den

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Martin Písačka. ÚHKT Praha. 7. Střešovický transfuzní den"

Jindřiška Hrušková
před 8 lety
Počet zobrazení:

1 BloodChip Martin Písačka ÚHKT Praha 7. Střešovický transfuzní den ÚVN,

3 Bloodchip Specifications Number of farrays 1 Number of Subgrids 32 Array Size 25 x 40 mm Oligo Length mer SNPs 116 Background control 88 spots Oligo replicates for each mutation 40 spots Total number of spots 6408

mer SNPs 116 Background control 88 spots Oligo

4 podzim 2004 zahájení testování prototypu : ověření funkčnosti prvního prototypu a postupné p úpravy na dalších (prototypy 2 a 3) na normálních genotypech v rámci WP4 i na cca 150 vzácných a variantních genotypech : 2008 random trial studie vzorků podle EU legislativy potřebné testy pro získání CE značky 09 / 06 ukončení projektu světová veřejná premiéra ISBT 2006 Cape Town, JAR CE certifikát pro RhCE, Kell, Kidd, Duffy, MNSs, Diego, Dombrock, Colton

random trial studie 3 000 vzorků podle EU legislativy potřebné testy pro získání CE značky 09 / 06 ukončení projektu

6 Two separate PCR reactions I (ABO and RHD) and II ( the rest of antigen groups ).

7 Hybridization Module Closing mechanism Hybridization chambers Incubation block (4 85 C) Fluid connections MTP format slide holder for 4 slides HS 4800 Sales Presentati on Page 5

8 Tecan LSX00 Scanner TECAN

9 The PCR products are fragmented and labelled separately with two different reagents (Cy-3 and Cy-5 respectively) to allow the distinction between RHD and RHCE

10 An external control has been included to verify that the hybridisation has been performed correctly. This control will also help to place correctly the spot quantification grid. The chip also includes background hybridisation controls, which consist of spots containing solvent alone (50% DMSO) to allow the determination of background hybridisation.

This control will also help to place correctly the spot quantification grid.

11 Labelled PCR products will be applied to the microarray surface for hybridisation. Confocal scanner detects the bound DNA as fluorescence is emitted by the fluorophores upon excitation with a laser beam. 300 Background Ba ackground(med){a} Signal Raw intensity(med){a}

Confocal scanner detects the bound DNA as fluorescence is emitted by the

17 Genotypování dříve než pozítří Výrobce microarraye čipu a celého BloodChip kitu španělská firma Progenika/MedPlant Distribuce Progenika a Sanguin?? Automatizace?? Prozatím genotypování a fenotypování nebudou konkurenční metody, ale spíše SPOLUPRACOVNÍCI na poli bezpečnější transfuze

18 ISBT Meeting Cape Town Satelitní BLOODGEN sympozium Více než 200 účastníků z celého světa

19 Výsledky Clinical Validation Study (CVS) pro aplikaci o CE značku Celkem potřeba 1000 vzorků / 6 center (166,6/ctr) 6/ ÚHKT: 173 vzorků + 34 kontrol Hybridizační cykly pro CVS max. 6 vzorků + 1 Ctl

20 Výsledky Clinical Validation Study (CVS) ÚHKT 173 vzorků 123 dárci TO a AO 50 pacienti /40 ÚVN, 10 ÚHKT/ Izolace DNA, MPX-PCR, fragmentace a značení PCR produktů ÚHKT Hybridizace na sklíčka Ulm, Derio (HS Ventana) Scanování ÚHKT scanner Tecan

MPX-PCR, fragmentace a značení PCR produktů ÚHKT Hybridizace

21 Výsledky Clinical Validation Study (CVS) ÚHKT ABO shoda s určením fenotypu ve většině případů 1 diskrepance susp. nová molekulární forma /hybridní gen/ Frekvence /ovlivněny zvanými dárci/ A 50x 28,90% B 21x 12,14% AB 21x 12,14% 0 81x 46,82%

22 Výsledky Clinical Validation Study (CVS) - ÚHKT Rh shoda s určením fenotypu ve většině případů 3 diskrepance 3 nové genotypy RHD /prezentace ISBT 2010/ Kell shoda s určením fenotypu ve všech případech Kidd shoda s určením fenotypu ve všech případech Duffy shoda s určením fenotypu ve většině případů 1 diskrepance selhání serologie slabý Fy(b)/ u FYX genotypu MN a Ss shoda s určením fenotypu ve většině ě případů diskrepance všechny selhání serologie M, N a S určení

23 Výsledky Clinical Validation Study (CVS) ÚHKT Diego shoda s určením fenotypu ve všech případech Di(a+b-) 0x Di(a+b+) 1x 05% 0,5% Di(a-b+) 172x 99,5% Dombrock shoda s určením fenotypu ve všech případech Do(a+b-) 31x 18% (18%) Do(a+b+) 65x 37,5% (49%) Do(a-b+) 77x 44,5% (33%) Colton shoda s určením fenotypu ve všech případech Co(a+b-) 161x 93% (90,4%) Co(a+b+) 12x 7% (9,5%) Co(a-b+) 0

24 Three new RHD genotypes found in Czech population in 2009 single point mutation in exon 1 /48G>C/ single point mutation in exon 5 /787G>A/ susp. hybrid gene RHD(1-8)-CE(9)-D(10) Písačka M, Reference Laboratory for Immunohematology Institute of Hematolgy and Blood Transfusion Prague, Czech Republic ISBT Berlin 2010

25 Case 1 Blood donor from ÚHKT Phenotyped as D positive /4+ reaction of 2 IgM anti-d/ C+c+E-e+Cw- BLOODchip v2.0 showed NO CALL in RHD due to the nucleotidic change 48 G>C in SNP BCV015 RHD gene sequencing confirmed this mutation and showed no other mutation in the rest of the gene Further the IVS5-38del4 change was detected Fragment analysis: hemizygous for RHD Extended D epitope typing was done with workshop MoAbs /20 IgM, 48 IgG/ - all reactions were strongly positive No antibodies available for epitopes 1.2, 5.5, Positive i reaction with polyclonal l l anti-d Dfrom DIII Titre of IgM and IgG anti-d comparable with normal D /R 1 r/

26 Case 1 BCV015 nt 48 G>C Detail of sequence of exon 1 of RHD

27 Bloodchip v2.0 Case 1 No Call RHD due to a posible new SNPs combination i not previously described RHD exon 1 analysis by BLOODchip suggests a genotype Apparently non negative. RHCE exon 1 sequence: RHCE exon 1 sequence: 48G>C and homivs5 38del4.

28 Case 2 Pregnant woman from Brno Weak D in routine typing /2+ in tube test, 3+ in gel test/ C-c+E-e+Cw- PCR-SSP pattern as D Va type 2, Va, V type 7 and DCS D epitope typing with 6 MoAbs ID-Partial D Typing set: all positive, in Alba kit /12 MoAbs/: only LHM5717 negative D epitopes present: 1.1,1.2,3.1,6.3,6.5,8.1,9.1,15.1 RHD gene sequencing of exons 4 and 5 demonstrated a RHD gene sequencing of exons 4 and 5 demonstrated a single nucleotide polymorphism 787G>A in exon 5

29 Case 2 Detail of sequence of exon 5 of RHD

30 Case 3 Blood donor from ÚHKT Phenotyped as D positive /4+ reaction of 2 IgM anti-d/ C+c+E-e+Cw- BLOODchip v2.0 showed absence of signal for exon 9 BCVs Exon scanning showed absence of PCR product for exon 9 and presence for exon 10 Sequencing of exons 1-8 showed normal RHD sequence Fragment analysis: hemizygous for RHD Extended D epitope typing was done with workshop MoAbs /20 IgM, 48 IgG/ - all reactions were strongly positive No antibodies available for epitopes 1.2, 5.5, Positive i reaction with polyclonal l l anti-d Dfrom DIII Titre of IgM and IgG anti-d comparable with normal D /R 1 r/

31 Bloodchip v2.0 Case 3 Bloodchip showed a genotype exon 9 variant, a phenotype D variant. RHD exon 9 analysis by BLOODchip suggests a D(1 8) CE(9) D(10) conversion.

32 Conclusions (1) Three genotypes described here were not found in Rhesus Base and not reported in the literature Case 2 serology correspond to weak D Cases 1 and 3 have normal D qualitative and quantitative serology results Amino acids exchanges in Case 1 and 2 correspond to RhCcEe protein cdna sequencing of Case 3 should be done to clarify exon cdna sequencing of Case 3 should be done to clarify exon 9 sequence

33 Conclusions (2) Case 1 could be hybrid gene RHCE(1)-RHD(2-10) Case 2 could be either point mutation or hybrid gene with smaller RHCE exchange in exon 5 Case 3 could be hybrid gene RHD(1-8)-CE(9)-D(10) D(10) or RHD(1-7)-CE(8-9)-D(10) hypothesis RhC specific aa Cysteine in position 16 does not influence RhD expresion RHD specific sequence in exon 9 is not necessary for RHD specific sequence in exon 9 is not necessary for normal RhD expression

36 Thank you for your attention.

Podobné dokumenty

Imunohematologická DNA diagnostika

Imunohematologická DNA diagnostika Martin Písačka ÚHKT Praha Workshop PCR-SSP diagnostika firmy BAG IKEM, 11. 9. 2007 Imunohematologie obor, zabývající se klinickými a laboratorními aspekty antigenů krevních