Karlova Univerzita v Praze, 3. Lékařská fakulta. Studijní program: Biologie a patologie buňky. Autoreferát dizertační práce

Transkript

1 Karlova Univerzita v Praze, 3. Lékařská fakulta Studijní program: Biologie a patologie buňky Autoreferát dizertační práce Myozin I a aktin vazebné proteiny v jádře Mgr. Hana Krásna Školitel: Prof. RNDr. Pavel Hozák, DrSc. Praha, 2013

2 Doktorské studijní programy v biomedicíně Univerzita Karlova v Praze a Akademie věd České republiky Obor: Biologie a patologie buňky Předseda oborové rady: Prof. RNDr. Ivan Raška, DrSc. Školící pracoviště: Oddělení biologie buněčného jádra, ÚMG AV ČR, v.v.i. Autor: Mgr. Hana Krásna Školitel: Prof. RNDr. Pavel Hozák, DrSc. 1

3 SOUHRN: Existuje množství prací, které dokazují přítomnost a důležitost aktinu v jádře. Aktin se v buněčném jádře pojí s procesy od chromatinového remodelingu přes transkripci, splicing, až po jaderný transport. Pro zabezpečení dynamiky jaderných procesů se aktin spojuje s jedním ze základních motor proteinů, kterým je myozin. Poukazuji na úlohu aktinu a jaderného myozinu I (NMI) v transkripci ribozomálních genů pomocí RNA polymerázy I (Pol I). Mikroinjekcí protilátek proti aktinu a NMI jsme potlačili transkripci Pol I in vivo. Skupina in vitro pokusů potvrzuje inhibici transkripce Pol I po použití protilátek proti aktinu a NMI na čisté DNA i upraveném chromatinovém templátu. Koimunoprecipitační pokusy odhalují fyzické spojení aktinu a NMI s rrna geny a s transkripčním komplexem Pol I. Zatím co se aktin váže na iniciační a elongační Pol I molekulu, NMI interaguje se subpopulací Pol I zodpovědnou za iniciaci vázanou na TIF-IA, tedy bazální transkripční faktor zodpovědný za regulaci rrna syntézy. V současnosti je známých několik hypotéz o formě jaderného aktinu. Nedávné výzkumy poukazují na pravděpodobnou dynamickou rovnováhu mezi monomerní a polymerní formou. V této práci prezentuji ultrastrukturální rozložení šesti aktin vazebných proteinů ( -aktinin, filamin, spektrin, paxilin, p190rhogap a tropomyozin) v rámci jednotlivých jaderných kompartmentů pomocí elektronmikroskopických snímků. Poprvé v tomto projektu prezentuji přítomnost tropomyozinu a p190rhogap v buněčném jádře a rovněž prostorovou kolokalizaci aktinu se spektrinem a paxilinu s -aktininem v jadérkách. SUMMARY: Many studies have established the presence and essenciality of actin in the nucleus. Recently, actin has been associated with processes in the nucleus ranging from chromatin remodeling to transcription, splicing or nuclear transport. To ensure the dynamics of the nuclear processes, actin is coupled 2

4 with one of the main motor protein such as myosin. This study demonstrates a structural role of actin and the nuclear myosin I (NMI) take in the transcription of ribonuclear genes by RNA polymerase I (Pol l). We suppressed the transcription Pol I in vitro by microinjections of antibodies anti actin and anti MNI. The series of in vitro experiments confirm transcript Pol I inhibition after applying antibodies anti actin and MNI on pure DNA as well as on pre-assembled chromatine template. The co-immunoprecipitation experiments reveal direct bound between actin, NMI and rrna genes and transcription complex Pol I. As actin binds to the primer and elonged Pol I molecule, NMI interacts with subunit of Pol I and is capable of assembling into productive initiation complex by binding up to TIF-IA, transcriptional factor responsible for regulation rrna synthesis. There are known number of hypothesis on the form of nuclear actin. Recent research suggests actin exists in equilibrium between its monomeric and polymeric form. The images produced by electron microscope and obtained on the course of my project show ultrastructural allocation of six proteins ( -actinin, filamin, spectrin, paxilin, p190rhogap and tropomyozin) within particular nuclear compartments. Through this project I can present for the first time presence of tropomyozin and p190rhogap in the nucleus, as well as spatial colocalization of actin with spectrin and paxillin with actin in the nucleus. ÚVOD: Buněčné jádro V jádře probíhá většina vitálních a primárně biologických procesů. Díky novodobým poznatkům buněčné biologie a molekulární genetiky se vytváří obraz o organizaci jádra, která vytváří komplikovanou molekulární mašinerii transkripce, RNA maturace, replikace a taky zde dochází pravděpodobně k rozpadu RNA. Dané procesy se kompletují v různých jaderných oblastech s definovanými funkčními vlastnostmi. Tato 3

5 pozorování poukazují na vysokou úroveň strukturální organizace jádra pro různé metabolické aktivity, vyskytující se v rozdílných regionech genomu (Fakan & van Driel 2007). Jaderná DNA formuje chromatin, který je organizován do jednotlivých chromozomálních teritorií oddělených interchromatinovým prostorem. V interchromatinovém prostoru je množství samostatných proteinů volně v nukleoplazmě nebo se spojují do jednotlivých jaderných kompartmentů (Misteli 2004). Nejvýraznějším kompartmentem jádra je jadérko. Jadérka jsou místem tvorby ribosomálních podjednotek, kde probíhá transkripce rdna genů (Scheer & Weisenberger 1994). V závislosti na typu a metabolickém stavu buňky se výrazně mění velikost a tvar jadérek, v této souvislosti se mění relativní velikost a konfigurace jednotlivých kompartmentů (Jarboui et al 2011). Ultrastrukturální skladba jadérka je všeobecně známá a skládá se ze tří struktur: fibrilární centra jadérka (FCs) - lehce zbarvená oblast; denzní fibrilární komponent jadérka (DFC) - více denzně zbarvený materiál, často přilehlý k FCs; granulární komponent (GC) - je to oblast, kde se granule seskupují do pre-ribozomálních partikulí. FCs jsou pravděpodobně místem uskladnění ribosomálních proteinů a mají důležitou funkci ve strukturální organizaci jadérek (Sutherland & Bickmore 2009). Velká část transkripce rdna probíhá pomocí RNA polymerázy I (Pol I) na okraji mezi FC a DFC. Následně se vytváří shluky pre-rrna v oblasti DFC, odkud migrují ven (Cmarko et al 2000, Guillot et al 2005, Hozak et al 1994). Jadérko je multifunkční kompartment, který aktivně přispívá k regulaci buněčných funkcí a pravděpodobně se účastní na vytváření kompaktní jaderné architektury. Jaderný aktin Aktin patří k nejčastěji se vyskytujícím proteinům v eukaryotické buňce. Je potřebný pro buněčné dělení, motilitu, mechanickou pružnost a buněčnou integritu. Aktin má 42 kda, sestává z 375 aminokyselin, a je kódován velkou skupinou konzervované genové rodiny. U vyšších eukaryot existují 4

6 tři izoformy aktinu: -aktin specifický pro svalové buňky, zatím co -aktin a aktin je přítomen téměř ve všech nesvalových buňkách (Korn 1982). Existuje několik hypotéz, co se týče formy jaderného aktinu. První hypotéza je přítomnost aktinu jako monomerického proteinu v chromatinremodelačním komplexu, v takovém případě se může ATP-ázová aktivita aktinu podílet na regulaci cyklu formováním remodelačního komplexu. Druhá hypotéza hovoří o aktinu v jádře, ve formě krátkých filament do velikosti 7 monomerů, příliš krátkých nebo rozptýlených na to, aby mohli být značeny faloidinem (Bettinger et al 2004). Třetím vysvětlením je, že se aktin vyskytuje ve formě antiparalelního dimeru nazývaného redukovaný dimer (LD). LD se vytváří na začátku polymerizace aktinu a současně se připojuje na aktinové vlákno v místě větvení (Schoenenberger et al 2011). Aktin se dostává do jádra pasivně difuzí, nebo aktivně pomocí Importinu-9 (Dopie et al 2012). Aktin je exportovaný z jádra dvěma vysoce konzervovanými a funkčními jadernými exportními signály (NESs). Exportní signály byly nalezeny na α-, β- a γ-aktinu (Stuven et al 2003). Tento rychlý transport zabezpečuje maximální transkripční aktivitu. Jaderný myozin I Jednou z nejvýznamnějších biologických mašinerií zabezpečujících pohyb v buněčném světě jsou molekulární motory. V současnosti známe tři typy cytoplazmatických motorů: myoziny, dyneiny a kineziny. Hydrolýzou ATP mění molekulární motory chemickou energii na mechanický pohyb. Myoziny se na základě strukturální domény a hlavičky rozdělují do 18-ti skupin (Kim & Flavell 2008). U obratlovců se podskupina myozinu I, což je nekonvenční jedno hlavičkový nesvalový myozin, následně rozděluje do devíti tříd (Berg et al 2001, Hofmann et al 2009). Myoziny I třídy mají podobnou strukturální stavbu a jejich komponenty se dělí do tří funkčních sub domén. Motor doména obsahuje N-terminální sekvenci, která zabezpečuje interakci s aktinem a po vzniku vazby hydrolýzu ATP. - helikální střední část domény váže lehký řetězec myozinu, nebo 5

7 kalmodulin pomocí helikální aminokyselinové struktury, která obsahuje jednu až šest IQ (isoleucine-glutamin) motivů. Funkcí C-terminální domény je zachytávat náklad, který je pak myozinem přenášen. Jaderná izoforma myozinu I (NMI) obsahuje unikátní aminoterminální prodloužení 16-ti aminokyselin, nenacházející se v žádných jiných myozinech typu I (Hofmann et al 2009, Kahle et al 2007, Wagner et al 1992). Tímto specifickým prodloužením se NMI transportuje do jádra. Po působení - amanitinu a aktinomycinu D na buňky, byla konfokální a elektronovou mikroskopií odhalena kolokalizace s RNA polymerázou II (Pol II). Kromě toho protilátky proti N-terminálnímu peptidu koiminoprecipitují s Pol II a inhibují transkripci in vitro (Pestic-Dragovich et al 2000). Tyto výsledky potvrzují význam NMI v transkripci polymerázou II. Regulace transkripčního mechanizmu je konzervovaný proces, dá se předpokládat, že aktinmyozinový komplex má svou funkci nejenom v transkripci kódujících genů pomocí Pol II, ale také ve všech třech typech RNA polymeráz. Aktin vazebné proteiny Dynamická transformace a organizace buněčného mikrofilamentárního systému je hnací sílou základních biologických procesů, jako je mobilita buněk, cytokineze a proliferace. Polymerizace a depolymerizace aktinu v buňkách je kontrolována množstvím přídatných proteinů nazývajících se ABPs (aktin vazebné proteiny). Některé ABPs díky své schopnosti ukotvit aktinový filament umožňují polymerizaci a formování aktinových filament. Jiné ABPs zabezpečují rozpad filament nebo jejich štěpení na malé části. Další ABPs zase zabezpečují křížení filament, vytváření pevných svazků nebo chrání filament před rozpadem. Většina těchto proteinů se vyskytuje v cytoplazmě, ale zároveň jsou schopny vstoupit do jádra. První jaderný aktin-vazebný protein byl evidován v roce 1987 (Nishida et al 1987). Od té doby přibylo do tohoto seznamu množství dalších proteinů zahrnujících profilin, tymozin 4, Cap G, gelsolin, Flightles I, myopodin, -actininy, plastiny, supervillin a filaminy (Gettemans et al 2005). Aby nedocházelo 6

8 ke spontánní a neregulované polymerizaci, váže se monomerní aktin na profilin a 4-tymozin. Tymozin brání polymerizaci aktinu a profilin naopak směřuje aktin k nastartování polymerizace (Schoenenberger et al 2005). Pro zahájení polymerizace aktinu jsou nutné proteiny vytvářející krystalické očko, takovým proteinem je například Arp2/3. Tento proces je kontrolován ionty Ca 2+ a Rho rodinou GTPáz. (Olave et al 2002). Rho protein se aktivuje molekulárním mechanizmem, působícím na plasmatické membráně v čase, kdy se buňky stimulují růstovými faktory a dalšími signály (Carlier et al 2003). Buněčný povrch absorbuje signály, které se šíří dále ve směru integrinů pomocí proteinu paxilin (Schaller 2004). Paxilin obsahuje motivy, které slouží jako kotvící místa nejenom pro aktin a cytoskeletární proteiny, ale také tyrozin kinázy, serin/treonin kinázy, GTPází aktivující proteiny a další adaptorové proteiny, které vychytávají přídavné enzymy do komplexu s paxilinem (Schaller 2001). Na stabilizaci systému aktinových filament v cytoskeletu nesvalových buněk se podílí tropomyozin. In vitro studie ukazují, že nesvalové tropomyoziny jsou schopny chránit aktin před štěpící aktivitou gelsolinu (Ishikawa et al 1989). Mezi proteiny zabezpečující křížové vazby patří -aktinin, vytváření svazků zabezpečuje filamin, a uchycení aktinových filament na buněčnou membránu pak spektrin, dystrofin, -aktinin, utrofin (Baines 2009, Djinovic-Carugo et al 2002). Filaminy jsou proteiny, které organizují vlákna aktinu do sítí a stresových vláken. Filaminy vytvářejí důležitou stabilizující konstrukci pro více než 90 vazebných partnerů, jako jsou receptory, kanály, nitrobuněčné signální molekuly a transkripční faktory (Nakamura et al 2011). Jaderný aktin je nepostradatelný při transkripci RNA polymeráz (Hofmann et al 2004) a jaderné ABPs mohou být důležitými modulátory těchto procesů tím, že regulují interakci mezi aktinem a RNA polymerázou, čímž nepřímo kontrolují expresi genů. Například profilin hraje roli v inhibici transkripčního faktoru Myb (Lederer et al 2005), ve spojení s dalšími proteiny se podílejí na vytváření spliceozomů, tedy na úpravě mrna 7

9 (Zimber et al 2004). Spektriny a filaminy se účastní reparace DNA (McMahon et al 2009, Velkova et al 2010), Arp pak chromatinového remodelingu (Oma & Harata 2011). Transkripce Transkripce patří mezi významné hybné procesy v živých buňkách. Po dobu tohoto procesu se syntetizuje RNA dle předlohy DNA templátu, což je zabezpečeno komplexy enzymů RNA polymeráz společně s dalšími transkripčními faktory. V jádrech eukaryotických buněk rozeznáváme tři různé Pol komplexy, Pol I, Pol II a Pol III. Všechny komplexy se skládají z pěti podjednotek se základními strukturami podobnými eukaryotické a archeální větvi (Hahn 2004). Pol I se nachází v jadérkách a syntetizuje ribosomální RNA, zatím co Pol II transkribuje především geny kódující proteiny, malé jaderné RNA (snrna) a nekódující RNA (Szymanski & Barciszewski 2002), Pol III transkribuje geny kódující zůstávající malé jaderné RNA, trna a 5S rrna. Polymerázy se shlukují do velkých megakomplexů, obsahujících minimálně dvě různé aktivně transkripční jednotky. Komplexy obsahují kromě jiného také transkripční faktory a ribonukleoproteiny, společné pro všechny tři polymerázní komplexy (Melnik et al 2011). Obvykle se zde nově vytváří megakomplexy polymerázy II u vysoce aktivních genů se silnými promontory a již vytvořené promontory jsou dále využívány ostatními transkribovanými geny (Eskiw & Fraser 2011, Papantonis et al 2010). CÍLE PRÁCE Hlavním cílem této práce je popsat přesný výskyt a rozmístění aktin vazebných proteinů v jaderných oblastech a jejich spojitost s aktinem. Hlouběji proniknout do funkce aktinu a jaderného myozinu I v komplexu s transkripcí ribozomálních genů. Specifické cíle práce: 8

10 1. charakterizace funkce aktinu a NMI v transkripci ribozomálních genů in vivo 2. charakterizace funkce aktinu a NMI v transkripci RNA polymerázy I in vitro 3. ukázat přítomnost aktin vazebných proteinů v jádře na ultrastrukturální úrovni 4. zjistit vzájemný výskyt aktin vazebných proteinů s aktinem v jednotlivých komponentech jádra PŘEHLED POUŽITÉHO MATERIÁLU A METOD Buněčné kultury HeLa a lidské lymfocyty Protilátky proti aktinu, NMI a aktin vazebným proteinům Mikroinjekce a detekce pomocí imunofluorescenční mikroskopie In vitro transkripční pokusy Abortivní transkripční iniciační pokus Imunoprecipitační pokusy Příprava vzorků na elektronovou mikroskopii Vyhodnocení imunoznačení na vzorcích elektronové mikroskopie VÝSLEDKY Studium funkcí aktinu a NMI Aktin a NMI jsou potřebné pro transkripci Pol I in vivo. Abychom zjistili funkci jaderného aktinu a NMI v rdna transkripci, byl aktin a NMI vyblokován protilátkami proti aktinu a NMI pomocí mikroinjekce dovnitř jader HeLa buněk. Pre-rRNA syntéza byla monitorována použitím nepřímé imunofluorescence s protilátkou proti bromodeoxyuridinu (BrU). Mikroinjekce protilátky proti aktinu anebo NMI výrazně snižuje jak počet jadérek, tak fluorescenční intenzitu Br-UTP značení, které indikuje, že syntéza pre-rrna byla ovlivněna (Obr. 1). Mikroinjekce dextranu (kontrola) nebo protilátky proti vimentinu respektive myozinu II nijak neovlivňuje jadernou transkripci, což dokazuje 9

11 specifickou inhibici transkripce Pol I použitím protilátek proti aktinu a NMI. Obrázek 1.: Inhibice Pol I in vivo Mikroinjekce protilátek proti aktinu a NMI inhibuje jadernou transkripci. Konfokální záběry transkripčních míst v jadérkách HeLa buněk mikroinjikovaných s dextranem (kontrola), s protilátkou proti vimentinu, myozinu II, aktinu a NMI. Funkce aktinu a myozinu I v transkripci Pol I in vitro Abychom určili molekulární mechanismus, který váže aktin a NMI k jadérkové aktivitě, otestovali jsme efekt každého proteinu na transkripci Pol I in vitro. Principem testování bylo zjistit, jestli se aktin a NMI přímo účastní inicializace anebo elongace transkripce Pol I, nebo mají jenom nepřímý efekt na syntézu pre-rrna, protože regulují jiné jaderné procesy jako je chromatinový remodeling a ukotvení aktivních transkripčních komplexů na nukleoskelet. Částečně purifikován jaderný extraxt (frakce DEAE-280), který obsahuje Pol I a všechny esenciální transkripční faktory, byl preinkubován s protilátkami proti aktinu nebo NMI, než byla transkripce zahájena přidáním nukleotidů a rdna templátu. Preinkubace s protilátkami proti NMI zrušila transkripci samotné DNA a také chromatinu, zatím co protilátky proti myozinu II neovlivňují 10

12 specifickou Pol I transkripci (Obr. 2a). Při pozměněném přístupu, kdy se k reorganizovanému transkripčnímu systému obsahujícímu částečně purifikovanou Pol I a bazální transkripční faktory, ale nedetekovatelnou úroveň endogenního NMI, přidává imunopurifikováný NMI a transkripce pol I se zvyšuje v závislosti na dávce (Obr. 2b). Při maximální koncentraci (50 ng) byla pozorována stimulace transkripce přibližně sedmkrát (dráha 3). Tato pozorování podporují in vivo data indikující potřebnost NMI v Pol I transkripci a zároveň vylučuje možnost, že NMI zvyšuje transkripci Pol I pomocí chromatinového remodelingu nebo ukotvením transkripčního aparátu na jaderné anebo jadérkové struktury. Obrázek 2.: Aktivace Pol I transkripce aktinem a NMI a, Anti-NMI protilátky inhibují Pol I transkripci in vitro. Transkripční pokusy byly provedeny na DNA (dráha 1-3) nebo na chromatině (dráha 4-6). Frakce DEAE-280 byla preinkubována 40 min s pufrem (dráha 1, 4), s 4 g anti-nmi (dráha 2,5) nebo s 4 g anti-myozin II protilátkou (dráha 3, 6). b, aktivace Pol I transkripce pomocí NMI v reorganizovaném systému. Směs částečně purifikované Pol I s TIF-IA, TIF-IC, TIF-IB, rekombinatním UBF a TTFΔN185 byla preinkubována 20 min s rekombinantním NMI anebo 70ng Flag peptidem, před zahájením transkripce. 11

13 Abychom zjistili mechanizmus průběhu aktivace transkripce Pol I sprostředkované navázáním aktinu, použili jsme pokus abortivní transkripční iniciace. Tento pokus má výhodu, že funkční iniciační komplex vytváří cyklicky krátké RNA produkty specifické pro startovací místo transkripce, přičemž není potřeba velkého množství nukleotidů. V pokusu prezentovaném na obrázku č. 3 byla frakce DEAE-280 inkubována s DNA templátem v přítomnosti ATP a CTP (první dva nukleotidy myší pre-rrna), kdy se tvoří iniciační komplexy. Jedna část reakční směsi byla doplněna o GTP a - 32 P-UTP a proces transkripce běžel 1 hodinu. Druhá část reakční směsi obsahovala jenom - 32 P-UTP. V tomto případě nemůže probíhat elongační fáze Pol I, protože není přítomen čtvrtý nukleotid (GTP) pro tvorbu pre-rrna. Místo toho se tvoří trinukleotid pppapcpu, který se uvolňuje z ternárního komplexu a opakuje se abortivní iniciace bez následné elongace. Protilátka proti aktinu inhibuje syntézu run-off transkriptů (Obr. 3 nahoře). Formování abortivních trinukleotidů nebylo ovlivněno (Obr. 3 dole). Tyto výsledky poukazují na aktin, který je kritický v následujícím kroku za transkripční iniciací, pravděpodobně při odstraňování promotorů anebo v elongaci. Obrázek 3.: Abortivní transkripční iniciační pokus Frakce DEA-280 byla inkubována 40 min s protilátkami předtím, než byly přidané templáty ATP a CTP, pak inkubace pokračovala ještě 20 min (dráha 3). K polovině reakční směsi bylo přidáno GTP a - 32 P-UTP, aby se mohly syntetizovat celé transkripty (nahoře). Do druhé poloviny reakční směsi byl přidán jen - 32 P-UTP, aby se mohl syntetizovat trimer (dole). Reakce obsahovaly: dráha 1 - žádnou protilátku, dráha 2-1 g teplotně inaktivní protilátky proti aktinu, dráha 3-1 g protilátky proti aktinu. 12

14 Aktin a NMI ve vazbě s Pol I transkripčním komplexem. V následujících testech jsme zjisťovali, jestli jsou proteiny aktinu NMI fyzicky spojeny s Pol I transkripčním komplexem. Pol I a aktin nebo NMI byly imunoprecipitovány z frakce DEAE-280 a koprecipitované proteiny byly monitorovány na Western blotu (Obr. 4a). Značné množství aktinu koprecipitovalo s Pol I (dráha 3). Podobně Pol I (RPA116) koprecipitovala s aktinem (dráha 4), což indikuje fyzické spojení aktinu s Pol I. Aktin a Pol I koprecipitují s NMI (dráha 5). Tyto výsledky indikují, že aktin a také NMI se váží s transkripčním komplexem. Právě v buňkách vykazujících vysokou transkripční aktivitu pre-rrna, je jenom frakce s Pol I schopna poskládat produktivní iniciační komplex, který vede k transkripci rdna (Miller et al 2001, Tower & Sollner-Webb 1987). Iniciační komponent Pol I je asociován s TIF-IA, bazálním transkripčním-iniciačním faktorem, který sprostředkuje regulaci Pol I v závislosti na růstu. TIF-IA interaguje s Pol I a s TBP, který obsahuje selektivní faktor TIF-IB/SL1 a právě tato interakce je potřebná pro vytvoření iniciačního komplexu na rdna promotoru (Miller et al 2001, Yuan et al 2002). Pro zjistění, které komponenty nebo komponent transkripčního aparátu Pol I asociuje s aktinem a NMI, precipitovali jsme pol I, aktin, NMI, TIF-IA, UBF a TAF I 95 z frakce DEAE-280 a testovali jsme imunoprecipitáty na přítomnost aktinu a NMI. TIF-IA asociuje s frakcí Pol I a stejně tak protilátky proti TIF-IA koprecipitují s Pol I (Obr. 4a, dráha 6). Je nutno upozornit, že imunoprecipitáty obsahují velké množství aktinu a NMI, což naznačuje asociaci aktinu a NMI s frakcí Pol I, která je obohacena o TIF-IA. Naopak aktin, ani NMI jsme nenašli v precipitátu s anti-taf I 95 nebo s anti-ubf protilátkami (dráha 7, a 8). Frakcionací Pol I na MonoS rychlé vodní chromatografické koloně (FPLC) se separuje většina buněčné populace ze subpopulace Pol I, která je asociována s TIF-IA, proto je schopna formovat funkční transkripční iniciační komplexy (Bodem et al 2000). Individuálně frakce obsahují 13

15 různé podíly Pol I, které se rozlišují v schopnosti specificky transkribovat rdna templát. Obrázek 4.: Aktin a NMI se váží s transkripčním komplexem Pol I. a, koimunoprecipitace aktinu a NMI s Pol I a TIF-IA. Myší IgG a protilátky proti Pol I (anti-rpa116), aktinu, NMI, TIF-IA, UBF a TIF-IB-SL1 (anti- TAF I 95) byly imobilizovány na proteinové G agaróze a inkubovány s frakcí DEAE % ze vstupu (dráha 1) a 50% koprecipitátu Pol I (RPA116), aktinu, NMI a TIF-IA bylo analyzováno na Western blotu. b, kofrakcionace NMI a aktinu s Pol I. Pol I byla frakciována chromatograficky na MonoS FLPC koloně a individuální frakce (s číslem 12, 14, 18) byly analyzovány na aktivitu v reorganizovaném transkripčním systému (dráha 1-3 nahoře). Western blot podtím ukazuje úroveň Pol I (RPA116), NMI, aktinu a TIF-IA v jednotlivých frakcích. c, významnost asociace NMI s Pol I-TIF-IA komplexem při transkripci Pol I. Z MonoS kolony byly tři frakce (číslo 12, 14 a 18) imunoprecipitovány s anti-tif-ia protilátkou a koprecipitovány s Pol I (RPA116), NM I a aktinem a následně anylyzovány Western blotem. V experimentu na Obr. 4b, byly tři sloupy MonoS FLPC frakcí (číslo 12, 14 a 18) testovány na transkripční aktivitu a přítomnost Pol I, NMI, aktin a TIF-IA. Aktin je přítomen ve všech frakcích, které obsahují Pol I, naproti tomu NMI a TIF-IA eluované v časné frakci společně 14

16 s transkripčně aktivní Pol I nebyly detekovány ve frakci 18. Pravděpodobným vysvětlením přítomnosti NMI ve frakci obsahující TIF- IA je, že asociace NMI a TIF-IA je nezbytná pro Pol I transkripci. Pol I je asociována s aktinem a TIF-IA ve všech třech frakcích (Obr. 4c). Důležitým momentem je největší obsah NMI v asociaci s TIF-IA ve frakci 14, tedy ve frakci s nejvyšší transkripční aktivitou. Na druhé straně NMI neasociuje s TIF-IA ve frakci 12 a 18, kde je prokázaná malá nebo žádná transkripční aktivita. Z toho vyplývá, že subpopulace Pol I obohacena o TIF-IA a NMI, ale ne většinová Pol I, je schopna vytvořit produktivní iniciační komplex a zahájit iniciaci a elongaci transkripce Pol I. Lokalizace aktinu a aktin vazebných proteinů Aktin vazebné proteiny mají charakteristický model lokalizace v jádrech HeLa buněk a neaktivních lidských lymfocytech. Jednou ze součástí výzkumu byla analýza uspořádání aktinu a aktin vazebných proteinů v jádře a jadérku HeLa buněk a v neaktivních lidských lymfocytech pomocí imunogold značení. Výsledky ultrastrukturálního mapování aktinu a aktin vazebných proteinů v HeLa buňkách a neaktivních lidských lymfocytech jsou prezentovány na Obr. 5 a 6. V neaktivních lidských lymfocytech se vytváří shluk aktinového značení, lokalizován v dekondenzovaném chromatinu na okraji heterochromatinových blocích a ve fibrilárních centrech jadérek (Obr. 5). Na ultratenkém řezu HeLa buněk, které byly značeny polyklonální králičí protilátkou proti p190 RhoGAP proteinu (Chang et al 1995), bylo značení distribuováno v nukleoplazmě v oblastech s různými velikostmi ( nm v průměru). Rho GAP se nachází současně v kondenzované a dekondenzované oblasti chromatinu a také v jadérkách nad granulárním komponentem. 15

17 Obrázek 5.: Ultrastrukturální mapování aktinu, p190rhogap, spektrinu, a filaminu v HeLa buňkách a neaktivních lidských lymfocytech. 16

18 Ultratenké řezy HeLa buněk (vlevo) a neaktivních lidských lymfocytů (vpravo) byly imunoznačené zlatými partikulami s protilátkami proti aktinu a s aktin vazebným proteinem, které jsou popsané v levém sloupci. Oblasti zvýšené hustoty značení v jádře jsou zvýrazněné červenou barvou. Značení v cytoplasmě není znázorněné. Měřítko v horní části obrázku zobrazuje 1 m. V neaktivních lidských lymfocytech je RhoGAP lokalizováno v méně četných oblastech větších rozměrů v porovnání s HeLa buňkami. Značení je pozorováno především v oblastech kondenzního chromatinu v těsné blízkosti jaderného obalu nebo na rozhraní kondenzního a dekondenzního chromatinu. Shluky interchromatinových granulí a GC jadérek vykazují také značení. (Obr. 5). Naše výsledky reprezentují první důkaz jaderné lokalizace proteinu p190 RhoGAP. Zajimavé je, že se oblasti výskytu RhoGAP liší mezi HeLa buňkami a neaktivními lidskými lymfocyty, což může být spojené s rozdílnou úrovní transkripční aktivity v těchto dvou buněčných typech. Spektrinové shluky v HeLa buňkách jsou seskupené v prodlužujících se rozvětvených místech, které zabírají velké oblasti v nukleoplazmě okolo kondenzovaného i nekondenzovaného chromatinu. Výjimkou jsou interchromatinové granule, kde se značení protilátkou nevyskytuje. V mnoha případech jsou spektrinové shluky lokalizované na jaderném obalu. Intenzivní značení bylo pozorované i v jadérkách, především v oblasti DFC a GC (Obr. 5). Spektrin je v neaktivních lidských lymfocytech asociovaný především s kondenzovaným chromatinem a je přítomný prakticky podél celého jaderného obalu. V jadérkách lymfocytů se spektrin na rozdíl od HeLa buněk nachází v FC (Obr. 5). Filaminové značení v HeLa buňkách je zastoupeno velmi intenzivně ve formě husté sítě v rámci celého jádra, včetně jadérek. V lidských lymfocytech filaminové shluky navzájem splývají a formují velké značené oblasti, které pokrývají velkou čast kondenzovaného chromatinu 17

19 a perichromatinové oblasti, ale nenachází se v interchromatinových granulích. V jadérkách je filamin přítomný ve všech třech komponentech (FC, DFC aj GC) (Obr. 5). Tropomyozin se koncentruje v HeLa buňkách do mnoha malých shluků a je distribuovaný v rámci celé nukleoplazmy a jadérka bez zjevné preference k jednotlivým kompartmentům (Obr. 6). V neaktivních lidských lymfocytech jsme pozorovali pár oblastí značených tropomyozinem v průměru 70 nm, a to hlavně v oblasti interchromatinových granulí, v oblasti dekondenzovaného chromatinu a na okraji heterochromatinové oblasti. Aktinin je v HeLa buňkách koncentrovaný do malých bodů o průměru 30 nm řídce roztroušených v oblasti dekondenzovaného chromatinu v nukleoplazmě a v rámci jadérek v oblasti GC (Obr. 6). V neaktivních lidských lymfocytech vytváří aktininové značení shluky podobné jako v HeLa buňkách (o průměru nm) a jsou umístěné hlavně v oblasti interchromatinových granulí v blízkosti heterochromatinu. Překvapivě se značná čast aktininu nachází v těsné blízkosti jaderného obalu. Podobně jako v HeLa buňkách i v lidských lymfocytech je aktinin přítomný v GC jádrech (Obr. 6). Paxilin značí jadérka HeLa buněk, kde je ojediněle rozložený do malých bodů (přibližně 40 nm v průměru), které jsou lokalizované okolo interchromatinových granulí, některé značení je spojené i s okrajem jadérek. V neaktivních lidských lymfocytech je paxilin koncentrovaný v rámci nukleoplazmy ve velkých oblastech v porovnání s HeLa buňkami, značí interchromatinové granule a GC jadérek (Obr. 6). 18

20 Obrázek 6.: Ultrastrukturální mapovaní tropomyozinu, -aktininu a paxilinu v HeLa buňkách a neaktivních lidských lymfocytech. Ultratenké řezy HeLa buněk (vlevo) a lidských lymfocytů (vpravo) byly imunoznačené zlatými partikulami s protilátkami proti aktinu a aktin vazebným proteinem/vazebným proteinům, které jsou popsané v levém sloupci. Oblasti zvýšené hustoty značení v jádře jsou zvýrazněné červenou 19

21 barvou. Značení v cytoplazmě není znázorněné. Měřítko v horní části obrázku znázorňuje 1 m. Kolokalizace aktinu a aktin vazebných proteinů v jadérkách neaktivních lidských lymfocytů a HeLa buňkách. Existují početné výzkumy ohledně lokalizace a funkcí aktin vazebných proteinů v buněčném jádře, ale nejsou žádné dostupné informace o jejich interakci s jaderným aktinem. My jsme analyzovali kolokalizacii aktin vazebných proteinů s aktinem v jadérkách HeLa buněk a neaktivních lidských lymfocytech. Statisticky signifikantní kolokalizace byly prokázané jen v jadérkách. Spektrin statisticky signifikantně (p<0.01) kolokalizuje s aktinem v jadérkách obou analyzovaných buněčných typů. V neaktivních lidských lymfocytech se spektrin společně s aktinem nachází v FC jadérkách, které jsou známé jako uskladňovací místo proteinů důležitých pro transkripci a procesing RNA. V jadérkách HeLa buněk, které jsou transkripčně aktivnější, spektrin kolokalizuje s aktinem na okraji DFC a především v GC, kde probíhá rrna procesing. Paxilin kolokalizuje s aktinem v GC v jadérkách HeLa buněk, ale ne v lidských lymfocytech. Aktinin kolokalizuje s aktinem právě v neaktivních lidských lymfocytech v GC jadérek. DISKUSE Mnoho předcházejících výzkumů poskytlo podrobné důkazy o úloze aktinu v transkripci. Existují například studie poukazující na význam aktinu při formování iniciačního komplexu jako i transkripce Pol II (Hofmann et al 2004). Nově syntetizované RNA molekuly jsou asociované s aktinem v jaderném matrixu (Nakayasu & Ueda 1985, Schroder et al 1987), aktin je asociovaný se specifickou skupinou hnrnp A/B typu proteinů (Percipalle et al 2001). Podobný význam v transkripci štětkovitých chromozomů u Chironomus tentans má i interakce aktinu 20

22 s RNA vázanými proteiny (hsr) (Percipalle et al 2003). V našem projektu jsme prokázali esenciální úlohu obou proteinů aktinu i NMI v rdna transkripci. Mikroinjekcí protilátek proti aktinu a NMI se jaderná transkripce v kultivovaných HeLA buňkách in vivo signifikantně zredukovala. Toto jsme potvrdili i v transkripčních pokusech na samotném templátu DNA. Přidáním exogenního aktinu se inhibice transkripce způsobená přidáním anti aktinových protilátek dá zvrátit. Našimi výsledky dokazujeme funkci aktinu a NMI v komplikovaném systému Pol I transkripce. Oba dva proteiny se však podílí na rozdílných krocích v rámci transkripčního procesu. Protilátky proti aktinu inhibují syntézu kompletních transkriptů, neovlivňují však formaci ACU trimerů, tedy prvních nukleotidů myší pre-rrna, z čehož vyplývá, že aktin se zúčastňuje Pol I transkripce až po iniciačním kroku. Aktin je podobně jako Pol I přítomný na 5 -terminálním úseku rdna transkripční jednotky a zároveň i v oblasti právě probíhající transkripce. Na rozdíl od aktinu NMI obsazuje jen 5 -terminální úsek rdna, na kterém jsou ukotvené promotory a kde se nachází startovací sekvence transkripce. V této souvislosti se NMI spojuje s transkripčním komplexem Pol I v čase jeho spojení s TIF-IA, což je bazální transkripční faktor zodpovědný za iniciační schopnost Pol I a zabezpečuje regulaci syntézy rrna v závislosti na růstu (Grummt 2003, Grummt 2006). Interakce myozinu I s TIF-IA nezávisí na aktivitě TIF-IA ani na aktivitě Pol I transkripce, což naznačuje, že vazba NMI na TIF-IA předchází asociaci TIF-IA s Pol I, a zároveň poukazuje na úlohu NMI ve vytváření produktivního iniciačního komplexu Pol I. V nasledujícím kroku se Pol I dostáva k iniciačnímu komplexu pomocí interakce s TIF-IA, který pravděpodobně umožňuje interakci a navázání aktinu na Pol I a NMI, které jsou už navázané s TIF- IA. Preferujeme model, ve kterém asociace NMI s TIF-IA vytváří komplex s Pol I, čímž proběhne konformační změna Pol I, a právě tato strukturální změna je potřebná pro efektivní transkripci. Předpokladáme, že právě tento jaderný komplex aktin-myozin umožňuje toto přepínání, 21

23 pravděpodobně v souladu se supramolekulární strukturou, která vede ke správné pozici rrna genů v rozdílných funkčních zónách v rámci jadérek. V jádře se aktin nachází pravděpodobně v dynamické rovnováze mezi monomerní a polymerní formou, ale přesná konformace není známa (Schleicher & Jockusch 2008). Z rovnováhy mezi monomerním, oligomerním a popřípadě polymerním aktinem v jádře můžeme předpokládat kontrolovanou regulaci pomocí aktin vazebných proteinů podobně jako v cytoplazmě. Otázkou zůstává, zda tyto proteiny kontrolují dané jaderné procesy sami, anebo v asociaci s aktinem a jak tyto procesy probíhají, zůstává stále neobjasněné. Každý ze studovaných aktin vazebných proteinů: -aktinin, filamin, paxilin, p190rhogap, spektrin a tropomyozin se nachází ve specifických kompartmentech buněčného jádra anebo jadérka. Donedávna byly jen dvě domény RhoGAP proteinů identifikované v jádře. Je to DLC1 tumor supresorový protein s jadernou lokalizací (Lv et al 2007, Yuan et al 2007) a ARHGAP19 protein obsahující jaderný lokalizační signál a exprimovaný v jádrech některých lidských tkáních (Lv et al 2007, Yuan et al 2007). Naše výsledky poprvé prezentují jadernou lokalizaci p190rhogap. Existují jasné důkazy o existenci izoformy spektrinu SpecII, která hraje důležitou roli v zabezpečení DNA úprav, kde funguje pravděpodobně jako podporný protein DNA reparace (McMahon et al 2001, Sridharan et al 2003, Sridharan et al 2006). Na našich elektronmikroskopických snímcích se spektrin vyskytuje především podél jaderného obalu v HeLa buňkách i lidských lymfocytech. Vzhledem k jejich funkci spojení cytoskeletu s plazmatickou membránou, může mít spektrin podobnou úlohu v jádře, kde poskytuje ukotvení jaderných aktinových struktur na jadernou membránu. V naší práci jsme poprvé odprezentovali i přítomnost tropomyozinu v jádře. Předpokládáme, že má tropomyozin svoji stabilní funkci v jádře vzhledem k jeho velkému množství, což bude zároveň předmětem dalšího bádání. 22

24 HeLa buňky a neaktivní lidské lymfocyty se výrazně liší na úrovni buněčné transkripce. Při většině analyzovaných proteinech se jejich jaderná lokalizace v HeLa buňkách a lymfocytech liší v rámci jaderných kompartmentů. Z rozložení jednotlivých proteinů je možné usuzovat ať už o regulaci jaderných funkcí anebo funkcí proteinů v reorganizaci jaderné architektury ve spojitosti s různými úrovněmi transkripce. Poprvé se nám podařilo prezentovat přítomnost tropomyozinu a p190rhogap proteinu v buněčném jádře. Při analýze kolokalizace jednotlivých proteinů s aktinem jsme překvapivě nenašli žádnou z nich v nukleoplazmě. Aktin má ve spojení s aktin vazebnými proteiny překvapivě specifickou konformaci, která není rozpoznávána námi použitými protilátkami, anebo jsou epitopy aktinu maskované. Zatím co v první části výzkumu o aktinu a jaderném myozinu jsme se dostali k jedné z konrétních funkcí v jádře ve spojitosti s transkripcí, kde jsme schopni poukázat na jejich důležitost v jednotlivých krocích transkripce RNA polymerázy I, situace s aktin vazebnými proteiny uvedenými v druhé části práce, jsme zatím v bádání na počátku. Tyto proteiny mají svoji stabilní pozici co do výskytu i funkce v cytoplazmě, ale je jen málo informací o aktin vazebných proteinech v jádře. Na základě našich výsledků předpokladáme jejich spojitost s důležitými jadernými procesy, ale přesné funkce těchto proteinů v jádře a modely regulace jaderného aktinu zůstávají předmětem studia do budoucnosti. ZÁVĚRY V této práci prezentuji přítomnost aktinu v buněčném jádře ve spojitosti s dvěma typy proteinů. Jednak je to spojení s molekulárním motorem jaderným myozinem I a na druhé straně jaderný aktin v přítomnosti aktin vazebných proteinů typických pro vytváření základních cytoskeletárních struktur. Získané výsledky jsem shrnula do nasledujících bodů: 1. Jaderný aktin a NMI jsou nezbytné pro fungování transkripce ribozomálních genů pomocí RNA polymerázy I 23

25 2. Aktin se váže na Pol I transkripční komplex i po dobu iniciace i po dobu elongace transkripce 3. NMI se váže na iniciační subpopulaci Pol I pomocí bazálního faktoru TIF-IA 4. Specifický výskyt šesti aktin vazebných proteinů v jednotlivých jaderných kompartmentech 5. Poprvé ukazujeme přítomnost tropomyozinu a p190rhogap v buněčném jádře 6. V jadérkách neaktivních lidských lymfocytech kolokalizuje aktin s - aktininem a spektrinem 7. V jadérkách HeLa buněk kolokalizuje aktin se spektrinem a paxilinem Dokázali jsme přítomnost aktinu a NMI v jádře jako součást transkripčního komplexu Pol I. Zatím však není známa jejich přesná úloha a vzájemná interakce aktinu a NMI v buněčném jádře. Aktin a NMI mají specifické rozložení v jadérkách buněk v závislosti na aktivitě buněk (Kysela et al 2005). Aktin vazebné proteiny se srovnatelně specificky vyskytují v určitých oblastech buněčného jádra. Navzdory tomu, že se nám nepodařilo v některých případech dokázat spojení těchto proteinů s aktinem v jádře, předpokládáme širší spojitosti s dynamikou aktinu jako i vytvářením oporné struktury v jádře. Aktin se podílí na exportu retrovirální RNA jako i transportu snrnp (Cossart & Toledo-Arana 2008, Wasser & Chia 2000). Kromě toho se aktin váže s proteinem 4.1, se kterým spolu vytvářejí filamenty navazující se na jaderné póry (Kiseleva et al 2004) a zároveň přímým spojením aktinu s laminem A dochází i k propojení s jaderným obalem (Simon et al 2010). Zkoumání nových strukturálních úloh aktinu a na něho navázaných proteinů zůstává stále otevřené. POUŽITÁ LITERATURA 24

26 Baines AJ Evolution of spectrin function in cytoskeletal and membrane networks. Biochem Soc Trans 37: Berg JS, Powell BC, Cheney RE A millennial myosin census. Mol Biol Cell 12: Bettinger BT, Gilbert DM, Amberg DC Actin up in the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol 5: Bodem J, Dobreva G, Hoffmann-Rohrer U, Iben S, Zentgraf H, et al TIF-IA, the factor mediating growth-dependent control of ribosomal RNA synthesis, is the mammalian homolog of yeast Rrn3p. EMBO Rep 1: Carlier MF, Wiesner S, Le Clainche C, Pantaloni D Actin-based motility as a self-organized system: mechanism and reconstitution in vitro. C R Biol 326: Cmarko D, Verschure PJ, Rothblum LI, Hernandez-Verdun D, Amalric F, et al Ultrastructural analysis of nucleolar transcription in cells microinjected with 5-bromo-UTP. Histochem Cell Biol 113: Cossart P, Toledo-Arana A Listeria monocytogenes, a unique model in infection biology: an overview. Microbes Infect 10: Djinovic-Carugo K, Gautel M, Ylanne J, Young P The spectrin repeat: a structural platform for cytoskeletal protein assemblies. FEBS Lett 513: Dopie J, Skarp KP, Kaisa Rajakyla E, Tanhuanpaa K, Vartiainen MK Active maintenance of nuclear actin by importin 9 supports transcription. Proc Natl Acad Sci U S A 109: E Eskiw CH, Fraser P Ultrastructural study of transcription factories in mouse erythroblasts. J Cell Sci 124: Fakan S, van Driel R The perichromatin region: a functional compartment in the nucleus that determines large-scale chromatin folding. Semin Cell Dev Biol 18: Gettemans J, Van Impe K, Delanote V, Hubert T, Vandekerckhove J, De Corte V Nuclear actin-binding proteins as modulators of gene transcription. Traffic 6:

27 Grummt I Life on a planet of its own: regulation of RNA polymerase I transcription in the nucleolus. Genes Dev 17: Grummt I Actin and myosin as transcription factors. Curr Opin Genet Dev 16: Guillot L, Le Goffic R, Bloch S, Escriou N, Akira S, et al Involvement of toll-like receptor 3 in the immune response of lung epithelial cells to double-stranded RNA and influenza A virus. J Biol Chem 280: Hahn S Structure and mechanism of the RNA polymerase II transcription machinery. Nat Struct Mol Biol 11: Hofmann WA, Richards TA, de Lanerolle P Ancient animal ancestry for nuclear myosin. J Cell Sci 122: Hofmann WA, Stojiljkovic L, Fuchsova B, Vargas GM, Mavrommatis E, et al Actin is part of pre-initiation complexes and is necessary for transcription by RNA polymerase II. Nat Cell Biol 6: Hozak P, Cook PR, Schofer C, Mosgoller W, Wachtler F Site of transcription of ribosomal RNA and intranucleolar structure in HeLa cells. J Cell Sci 107 ( Pt 2): Chang JH, Gill S, Settleman J, Parsons SJ c-src regulates the simultaneous rearrangement of actin cytoskeleton, p190rhogap, and p120rasgap following epidermal growth factor stimulation. J Cell Biol 130: Ishikawa R, Yamashiro S, Matsumura F Annealing of gelsolinsevered actin fragments by tropomyosin in the presence of Ca2+. Potentiation of the annealing process by caldesmon. J Biol Chem 264: Jarboui MA, Wynne K, Elia G, Hall WW, Gautier VW Proteomic profiling of the human T-cell nucleolus. Mol Immunol 49: Kahle M, Pridalova J, Spacek M, Dzijak R, Hozak P Nuclear myosin is ubiquitously expressed and evolutionary conserved in vertebrates. Histochem Cell Biol 127:

28 Kim SV, Flavell RA Myosin I: from yeast to human. Cell Mol Life Sci 65: Kiseleva E, Drummond SP, Goldberg MW, Rutherford SA, Allen TD, Wilson KL Actin- and protein-4.1-containing filaments link nuclear pore complexes to subnuclear organelles in Xenopus oocyte nuclei. J Cell Sci 117: Korn ED Actin polymerization and its regulation by proteins from nonmuscle cells. Physiol Rev 62: Kysela K, Philimonenko AA, Philimonenko VV, Janacek J, Kahle M, Hozak P Nuclear distribution of actin and myosin I depends on transcriptional activity of the cell. Histochem Cell Biol 124: Lederer M, Jockusch BM, Rothkegel M Profilin regulates the activity of p42pop, a novel Myb-related transcription factor. J Cell Sci 118: Lv L, Xu J, Zhao S, Chen C, Zhao X, et al Sequence analysis of a human RhoGAP domain-containing gene and characterization of its expression in human multiple tissues. DNA Seq 18: McMahon LW, Sangerman J, Goodman SR, Kumaresan K, Lambert MW Human alpha spectrin II and the FANCA, FANCC, and FANCG proteins bind to DNA containing psoralen interstrand cross-links. Biochemistry 40: McMahon LW, Zhang P, Sridharan DM, Lefferts JA, Lambert MW Knockdown of alphaii spectrin in normal human cells by sirna leads to chromosomal instability and decreased DNA interstrand cross-link repair. Biochem Biophys Res Commun 381: Melnik S, Deng B, Papantonis A, Baboo S, Carr IM, Cook PR The proteomes of transcription factories containing RNA polymerases I, II or III. Nat Methods 8: Miller G, Panov KI, Friedrich JK, Trinkle-Mulcahy L, Lamond AI, Zomerdijk JC hrrn3 is essential in the SL1-mediated recruitment of RNA Polymerase I to rrna gene promoters. Embo J 20: Misteli T Spatial positioning; a new dimension in genome function. Cell 119:

29 Nakamura F, Stossel TP, Hartwig JH The filamins: organizers of cell structure and function. Cell Adh Migr 5: Nakayasu H, Ueda K Ultrastructural localization of actin in nuclear matrices from mouse leukemia L5178Y cells. Cell Struct Funct 10: Nishida E, Iida K, Yonezawa N, Koyasu S, Yahara I, Sakai H Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Proc Natl Acad Sci U S A 84: Olave IA, Reck-Peterson SL, Crabtree GR Nuclear actin and actinrelated proteins in chromatin remodeling. Annu Rev Biochem 71: Oma Y, Harata M Actin-related proteins localized in the nucleus: from discovery to novel roles in nuclear organization. Nucleus 2: Papantonis A, Larkin JD, Wada Y, Ohta Y, Ihara S, et al Active RNA polymerases: mobile or immobile molecular machines? PLoS Biol 8: e Percipalle P, Fomproix N, Kylberg K, Miralles F, Bjorkroth B, et al An actin-ribonucleoprotein interaction is involved in transcription by RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci U S A 100: Percipalle P, Zhao J, Pope B, Weeds A, Lindberg U, Daneholt B Actin bound to the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein hrp36 is associated with Balbiani ring mrna from the gene to polysomes. J Cell Biol 153: Pestic-Dragovich L, Stojiljkovic L, Philimonenko AA, Nowak G, Ke Y, et al A myosin I isoform in the nucleus. Science 290: Schaller MD Paxillin: a focal adhesion-associated adaptor protein. Oncogene 20: Schaller MD FAK and paxillin: regulators of N-cadherin adhesion and inhibitors of cell migration? J Cell Biol 166: Scheer U, Weisenberger D The nucleolus. Curr Opin Cell Biol 6:

30 Schleicher M, Jockusch BM Actin: its cumbersome pilgrimage through cellular compartments. Histochem Cell Biol 129: Schoenenberger CA, Buchmeier S, Boerries M, Sutterlin R, Aebi U, Jockusch BM Conformation-specific antibodies reveal distinct actin structures in the nucleus and the cytoplasm. J Struct Biol 152: Schoenenberger CA, Mannherz HG, Jockusch BM Actin: from structural plasticity to functional diversity. Eur J Cell Biol 90: Schroder HC, Trolltsch D, Wenger R, Bachmann M, Diehl-Seifert B, Muller WE Cytochalasin B selectively releases ovalbumin mrna precursors but not the mature ovalbumin mrna from hen oviduct nuclear matrix. Eur J Biochem 167: Simon DN, Zastrow MS, Wilson KL Direct actin binding to A- and B-type lamin tails and actin filament bundling by the lamin A tail. Nucleus 1: Sridharan D, Brown M, Lambert WC, McMahon LW, Lambert MW Nonerythroid alphaii spectrin is required for recruitment of FANCA and XPF to nuclear foci induced by DNA interstrand crosslinks. J Cell Sci 116: Sridharan DM, McMahon LW, Lambert MW alphaii-spectrin interacts with five groups of functionally important proteins in the nucleus. Cell Biol Int 30: Stuven T, Hartmann E, Gorlich D Exportin 6: a novel nuclear export receptor that is specific for profilin.actin complexes. Embo J 22: Sutherland H, Bickmore WA Transcription factories: gene expression in unions? Nat Rev Genet 10: Szymanski M, Barciszewski J Beyond the proteome: non-coding regulatory RNAs. Genome Biol 3: reviews0005 Tower J, Sollner-Webb B Transcription of mouse rdna is regulated by an activated subform of RNA polymerase I. Cell 50:

31 Velkova A, Carvalho MA, Johnson JO, Tavtigian SV, Monteiro AN Identification of Filamin A as a BRCA1-interacting protein required for efficient DNA repair. Cell Cycle 9: Wagner MC, Barylko B, Albanesi JP Tissue distribution and subcellular localization of mammalian myosin I. J Cell Biol 119: Wasser M, Chia W The EAST protein of drosophila controls an expandable nuclear endoskeleton. Nat Cell Biol 2: Yuan BZ, Jefferson AM, Millecchia L, Popescu NC, Reynolds SH Morphological changes and nuclear translocation of DLC1 tumor suppressor protein precede apoptosis in human non-small cell lung carcinoma cells. Exp Cell Res 313: Yuan X, Zhao J, Zentgraf H, Hoffmann-Rohrer U, Grummt I Multiple interactions between RNA polymerase I, TIF-IA and TAF(I) subunits regulate preinitiation complex assembly at the ribosomal gene promoter. EMBO Rep 3: Zimber A, Nguyen QD, Gespach C Nuclear bodies and compartments: functional roles and cellular signalling in health and disease. Cell Signal 16: Články, které jsou podkladem k dizertaci: V.V. Philimonenko, J. Zhao, S. Iben, H. Dingová, K. Kyselá, M. Káhle, H. Zentgraf, W.A. Hofmann, P. de Lanerolle, P. Hozák and I. Grummt: Nuclear actin and myosin I are required for RNA polymerase I transcription. (2004) Nature Cell Biol. 6, H.Dingová, J. Fukalová, M. Maninová, V.V. Philimonenko, P. Hozák: Ultrastructural localization of actin and actin-binding proteins in the nucleus. (2009) Histochem Cell Biol 131:

32 E. Castano, V.V. Philimonenko, M. Kahle, J. Fukalová, A. Kalendová, S. Yildirim, R. Dzijak, H. Dingová-Krásna, P. Hozák: Actin complexes in the cell nucleus: new stones in an old field. (2010) Histochem Cell Biol 133: