NEKOPÍROVAT. Diagnostika polyomavirů. RNDr. Martina Saláková, Ph.D. Národní referenční laboratoř pro papillomaviry, Oddělení Imunologie, ÚHKT

Transkript

1 Diagnostika polyomavirů RNDr. Martina Saláková, Ph.D. Národní referenční laboratoř pro papillomaviry, Oddělení Imunologie, ÚHKT

2 Lidské polyomaviry virus výskyt komplikace seroprevalence JCPyV BKPyV běžná infekce v dětství, virus persistuje v epitelu ledvin, B- lymfocytech běžná infekce v dětství, virus persistuje v epitelu ledvin reaktivace při imunodeficitu (transplantace) terapie,aids), do CNS, progresivní multifokální leukoencefalopatie (PML) reaktivace při imunodeficitu, hemoragická cystitida (HSCT), polyomavirová nefropatie (transplantace ledviny) 50-80% 80-90% KIPyV respirační trakt, děti respirační? 55-90% WUPyV respirační trakt, děti respirační? 69-98% MCPyV kůže karcinom z Merkelových buněk 45-80% HPyV6 kůže? 69-80% HPyV7 kůže, sliznice? 35-60% TSPyV kůže trichodysplasia spinulosa při imunodeficitu 70-80% HPyV9 sérum? 18-50% HPyV10 kůže, stolice?? STLPyV, HPyV12 stolice?? NJPyV kůže??

3 Metody detekce polyomavirů

4 Polyomaviry diagnostika Buněčné kultury - Kultivace viru je zřídka použita k detekci infekce virem JC a BK mimo výzkumném prostředí. Tyto viry rostou pomalu ve tkáňové kultuře, a citlivé buněčné linie nejsou snadno dostupné. Izolace virů z klinických vzorků může trvat několik týdnů až měsíců Cytologie moči - Přítomnost buněk se zvětšeným jádrem s jednou velkou bazofilní intranukleární inkluzních (decoy cells). Cytopatologické změny lze zaměnit s těmi, které jsou v důsledku zhoubného bujení, nebo s jinými viry, jako je adenovirus. Nerozlišuje JC a BK polyomavirus. Elektronová mikroskopie Detekce virových částic v sedimentu moči nebo v jádrech oligodendrocytů v biopsii mozku. Virové partikule BK vylučované v moči, převzato Transplant and Hepatic Pathology Center of Excellence Buňky infikované polyomavirem decoy cells, zvětšeno 60x, převzato dr Dorothy Rosenthal.

5 Polyomaviry diagnostika Serologie Využití rekombinantně exprimovaného virového proteinu VP1 (virus like particles VLP) nebo části T-antigenu. Antigen připravený v bakulovirovém expresním systému, v kvasinkách, bakteriích nebo buněčných kulturách. Detekce IgG, IgM a IgA pomocí ELISA testů, neutralizačních testů, Luminex. Role HPyV serologie u pacientů po transplantaci zatím málo dat. BK virová infekce po tranplantaci ledvin u BK séropozitivních pacientů, protilátky nechrání proti PyVAN, vliv virově specifických T-buněk Virově specifická T-buněčná odpověď sledování množství T-buněk produkujících cytokiny po stimulaci specifickými virovými epitopy pomocí ELISPOT (The Enzyme-Linked ImmunoSpot ), intrabuněčné barvení cytokinů a průtoková cytometrie Polyomaviry velikost kapsidy 40-45nm

6 Polyomaviry diagnostika Polymerázová řetězová reakce (PCR) - Detekce HPyV infekce v různých klinických materiálech s vysokou citlivostí a specifitou. Kvalitativní výsledek - Důležitá interpretace výsledků. Klinická citlivost. Kvantitativní výsledek Virová nálož vyjádřena jako Genome Equivalent (GEq) na ml referenčního vzorku nebo na počet diploidních hostitelských buněk. Pro hodnocení je důležitá signifikantní změna virové nálože, signifikantně vyšší virová nálož ( obecně akceptovaná změna virové nálože v plazmě a mozkomíšním moku >1 log Geq/ml a >2 log Geq/ml v moči Hirsch et al., Clin Microbiol Infect, 2014)

7 qpcr standardizace Mezinárodní společnosti, které zajišťují Externí hodnocení kvality (EHK) / zkoušení způsobilosti (PT) - International External Quality Assessment (EQA) / Proficiency Testing (PT) - Poskytují podporu laboratořím, zaměřují na zlepšování kvality molekulární diagnostiky prostřednictvím externího hodnocení kvality (EQA), zkoušení způsobilosti (PT) a další podpůrné iniciativy v oblasti kvality molekulární detekce infekčních onemocnění

8 qpcr standardizace Collaborative study to evaluated the 1 st WHO International Standard candidate for JC virus (JCV) NAT-based assays February 2015 Collaborative study to evaluated the 1 st WHO International Standard candidate for BK virus (BKV) NAT-based assays April 2015 Výsledky červen 2015

9 Diagnostika polyomavirů v praxi

10 HPyV onemocnění a diagnostika HPyV způsobují vážné komplikace u pacientů po tranplantaci solidních orgánů (SOT), především po tranplantaci ledvin, pacientů po transplantaci kmenových krvetvorných buněk (HSCT), HIV/AIDS pacientů a pacientů s roztroušenou sklerózou podstupující biologickou léčbu (natalizumab). PyVAN - pacienti po transplantaci ledvin, u ostatních transplantovaných pacientů vzacné onemocněni Progresivní multifokální leukoencefalopatie u pacientů po tranplantaci, s RS a HIV/AIDS Hemoragická cystitida u příjemců HSCT Trichodisplasia spinulosa Karcinom z Merkelových buněk, nemelanomový karcinom kůže Infekce horních cest dýchacích, gastrointestinální onemocnění

11 HPyV onemocnění a diagnostika Transplantovaní pacienti SOT, HSCT Před transplantací - žádná předtransplantační HPyV diagnostika (DNA, protilátky) není doporučená Po tranplantaci - žádný rutinní skríning HPyV DNA/protilátek s výjimkou BKPyV u pacientů po tranplantaci ledvin (detekce BKPyV v moči a plazmě) - detekce HPyV při podezření na onemocnění spojené s polyomavirovou infekcí - pravidelná prohlídka kůže kvůli identifikaci zhoubných kožních onemocnění spojených s HPyV, jakož i melanomu a ne-melanomovému karcinomu kůže Pacienti s roztroušenou sklerózou Před zahájením terapie natalizumaben musí být velmi pečlivě zvážena všechna rizika léčby, včasná diagnostika PML, stanovení JCPyV protilátek HIV/AIDS pacienti Žádná HPyV diagnostika není doporučená

12 Diagnostika polyomavirů v naší laboratoři

13 HPyV serologie VLP (BKPyV, JCPyV, MCPyV, HPyV6, HPyV7, TSPyV, HPyV9, MWPyV, KiPyV) připravené v bakulovirovém expresním systému, rekombinantní HPyV VP1 protein připraveny z referenčních plasmidů pomocí PCR s primery k VP1 oblasti (Bac-to bac systém, Invitrogene). Optimalizované ELISA testy pro všechny připravené VLPs VLP ELISA test- kontrolní séra při každém testování, hodnota cut-off (CO) je vypočtena zvlášť pro každý antigen / desky. Každý výsledek ELISA je prezentován jako poměr mezi absorbance vzorku a příslušné hodnoty CO (index OD). Pro potvrzení výsledků, vzorky v rámci 10% nad hodnotou CO, stejně jako asi jedna čtvrtina všech vzorků séra jsou testovány znovu. Pouze vzorky s opakovanými pozitivní výsledky jsou považovány za reaktivní. 50 kda MCPyV BKV JCV MuPyV

14 HPyV serologie 100nm 100nm HPyV6 VP1 VLPs (22 nm diameter) HPyV7 VP1 VLPs (both 45 nm and 22 nm particles) MCPyV ~45 nm BKPyV~45 nm

15 Séroprevalence (%) HPyV serologie Séroprevalence lidských polyomavirů u zdravých dárců České republiky MCPyV BKPyV JCPyV HPyV6 HPyV7 HPyV9 MWPyV KiPyv TSPyV

16 Real time PCR pro BKPyV, JCPyV, MCPyV, HPyV6, HPyV7, TSPyV, HPyV9, MWPyV, KiPyV, WuPyV fluorogení próby 5 -FAM-NNNNN-BHQ1-3 standardy HPyV DNA detekce Schéma qpcr, převzato Wikipedia

17 HPyV DNA detekce - kůže Neuroendokrinní karcinom kůže karcinom z Merkelových buněk Imunohistochemie - V současné době se doporučuje vyšetřit nádor panelem protilátek, který zahrnuje CK 20, CK 7, TTF-1, NSE a/nebo neurofilamenta, případně chromogranin A. Výsledky imunohistochemie ale nemusí být jednoznačné. Detekce MCPyV DNA, kvalitativní qpcr, pro diagózu karcinomu z Merkelových buněk svědčí virová nálož 1 kopie virového genomu na buňku (Ota a spol.,2012) Karcinom z Merkelových buněk, HE, 100x (A) a 400x(B) zvětšeno, převzato Jirásek a spol., 2009

18 HPyV DNA detekce - kůže karcinom z Merkelových buněk - porovnání imunohistochemie a MCPyV DNA detekce Vzorek pohlaví věk v době dg. lokalizace Ck20 Ck7 TTF-1 CgA NSE CM2B4 1. muž 80 let pravé předloktí p 0 0 p p p mozaika p 1.a recidiva x x x x x nelze-technické problémy p 1.b recidiva x x x x x p p 2. muž 65 let levá gluteální krajina p 0 0 p p ojediněle p p 3. žena 76 let pravá tvář p 0 0 p 0 disperzně p p 4. muž 73 let pravé předloktí p 0 0 p p ojediněle p p 5. žena 83 let levé předloktí p 0 0 p p 50-60% p p 6. muž 48 let levá paže p 0 0 p p p p 7. žena 69 let lokalizace neuvedena p p fok 0 p p 0 p 8. žena 89 let pravá tvář p p žena 79 let levá strana čela p 0 0 p 0 50% p p 10. muž 82 let čelo-primární léze p 0 0 p p ojediněle p p 10.a recidiva p b recidiva p ojediněle p žena 71 let lokalizace neuvedena p 0 0 p p vykrájeno žena 73 let dolní víčko dx. p 0 0 p p žena 65 let levá paže p 0 0 p p ojediněle p p 14. žena 98 let pravá tvář p p muž 64 let pravé stehno p 0 0 p p p p 16. žena 93 let lokalizace neuvedena p fok 0 0 p p ojediněle p žena 89 let lokalizace neuvedena p p fok 0 0 p žena 58 let levá tvář p 0 0 p p p p 19. muž 76 let předloktí p 0 0 p p p p MCPyV DNA

19 HPyV DNA detekce - kůže karcinom z Merkelových buněk - porovnání imunohistochemie a MCPyV DNA detekce MCC, IHC barvení protilátkou proti MCPyV T- ag (CM2B4), 10x, 20x, 40x, (MUDr T.Jirásek)

20 HPyV DNA detekce - kůže karcinom z Merkelových buněk případy řešené v NRL 1. pacientka 71 let, excize suspektního basaliomu na nosním křídle vlevo, exprese CK-20, CD56, EMA, chromograninu, synaptofysinu a neuron-specifickou enolasu (NSE), závěr na základě morfologického a aimunohistochemického nálezu uzavřeno jako karcinom z Merkelových buněk, tumor neexprimuje TTF-1, nelze s úplnou jistotou vyloučit metastázu malobuněčného karcinomu plic MCPyV DNA detekce pomocí qpcr 7 kopií virového genomu na buňku 1. Pacient 42 let, exize lymfatické uzliny pacienta s neznámým zdrojem primárního nádoru, exprese CK-7, CK-20, chromograninu, synaptofysinu MCPyV DNA detekce pomocí qpcr 5 kopií virového genomu na buňku Ložisko čepičkovite pozitivity cytokeratinu 7 v cytoplazmě nadorovych buněk v jednom z vyšetřenych karcinomů, 400krát, Jirásek a spol., 2009

21 Vzorek Pohlaví HPyV DNA detekce - kůže Retrospektivní analýza pacientů s diagnózou malobuněčný plicní karcinom a kožními metastázami Rok MCPyV DNA Diagnóza narození MCPyV DNA virová nálož/buňku 1 žena 1942 ca z merkelových buněk žena 1944 excize kůže, metastáza? muž 1938 tumor pankreatu-meatstáza z plicního tu? muž 1928 excize kůže, metastáza? žena 1947 tumor pankreatu-metastáza z plicního tu? žena 1946 metastáza mozku-primární tumor plíce? žena 1952 malobuněčný plicní karcinom muž 1956 malobuněčný karcinom moč. měchýře muž 1947 malobuněčný plicní karcinom muž 1946 metastáza mozku-primární tumor plíce? žena 1931 metastáza mozku-primární tumor plíce? muž 1937 malobuněčný plicní karcinom muž 1932 malobuněčný plicní karcinom - 0

22 HPyV DNA detekce - kůže Detekce dalších polyomavirů na kůži a ve výplachu úst u zdravých dobrovolníků polyomavirus testovaný materiál MCPyV HPyV6 HPyV7 TSPyV HPyV9 MWPyV KiPyV JCPyV BKPyV stěr kůže 72%* 4% 8% 0% 0% 0% 0% 0% 0% výplach úst 30%* 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% sérum 0% * Virová nálož méně než 1 kopie na buňku, signifikantně nižší virová nálož při porovnání s karcinomem z Merkelových buněk

23 Mgr. Vojtěch Šroller, Ph.D RNDr. Eva Hamšíková RNDr. Viera Ludvíková Mgr. Jana Stašíková doc. MUDr. Tomáš Jirásek, Ph.D

24 Děkuji za pozornost

25 qpcr standardizace

26 Table 2. Recommendations for HPyV-specific pre-transplant testing of SOT donors and recipients Pre-transplant testing of all SOT donors and all SOT recipients for any HPyV DNA in urine, blood or other clinical specimens is not recommended, because current data are not sufficient for guiding organ allocation, risk stratification, immunosuppressive therapy, screening modalities or prophylactic, preemptive or therapeutic intervention pre- or post-transplant (BIII) For SOT recipients listed for kidney transplantation after terminal renal failure due to PyVAN in native or transplanted kidneys, testing of plasma BKPyV should be considered and should be undetectable prior to (re-)transplantation or at least have declined by at least >2 log 10 GEq/mL compared with documented peak plasma loads (BIII) Pre-transplant HPyV serology of SOT donors or SOT recipients is not recommended, because current data are not sufficient for guiding organ allocation, risk stratification, immunosuppressive therapy, screening modalities, or prophylactic, preemptive or therapeutic intervention pre- or post-transplant (BIII) Pre-transplant testing of HPyV-specific T-cell responses in peripheral blood of SOT donors or SOT recipients is not recommended, because current data are not sufficient for guiding organ allocation, risk stratification, immunosuppressive therapy, screening modalities, or prophylactic, preemptive or therapeutic intervention modalities in SOT recipients (BIII)