diagnostika in vitro Vysokorychlostní buněčný sorter MoFlo Astrios EQ Počítání dendritických buněk pomocí automatického buněčného analyzátoru Vi-Cell

Transkript

1 in vitro diagnostika Vysokorychlostní buněčný sorter MoFlo Astrios EQ Počítání dendritických buněk pomocí automatického buněčného analyzátoru Vi-Cell Význam stanovení vitaminu D v rutinní praxi Rozšiřujeme menu testů řady AU souprava TP Latex pro screening syfilis Projekt riešenia a realizácie technologického vybavenia klinických laboratórií Fakultnej nemocnice s poliklinikou F. D. Roosevelta, Banská Bystrica Movember ve Frýdku Místku Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

2 IRIS je součástí Beckman Coulter Vážení čtenáři, dostává se vám do rukou další číslo časopisu IVD. Toto informační médium nám slouží jako jeden z prostředků vzájemné komunikace mezi odbornou veřejností a společností Beckman Coulter. Jeho prostřednictvím se vám snažíme již několik let přinášet novinky o naší firmě, o lidech, kteří v ní pracují, a současně zveřejňovat vaše názory na naši činnost. V In Vitro Diagnostice neinzerujeme pouze naše produkty, ale snažíme se, aby to byla zároveň vzdělávací platformou. Pravidelně vás zde informujeme o nových poznatcích vědy a výzkumu a především o jejich aplikaci v praxi. V editorialech často reagujeme na aktuální dění ve sféře zdravotnictví, vědy a výzkumu a zejména se zajímáme o vliv dané situace na naše odvětví. V dnešním úvodníku bych se rád pozastavil nad situací, s níž se v současné době společnost Beckman Coulter Česká republika s.r.o. potýká. Naneštěstí se nejedná o jev až tak výjimečný. Koncern Beckman Coulter Inc. před více než dvěma lety oznámil akvizici (nákup) společnosti IRIS Inc. Ta se krom jiného již tradičně zabývá vývojem, výrobou a prodejem zdravotnických prostředků pro močovou analýzu analyzátorů, reagencií, dalšího spotřebního materiálu a softwaru. IRIS byla na základě distributorské smlouvy zastupována na území naší republiky českou distributorskou firmou. Platnost dohody, na jejímž základě byla založena kooperace s tímto distributorem a výrobcem, dnem skončila. Produkty firmy IRIS, která je dnes nedílnou součástí koncernu Beckman Coulter Inc., bude v České republice prodávat a podporovat společnost Beckman Coulter Česká republika s.r.o., o čemž byl původní dodavatel produktů IRIS obeznámen již začátkem roku Naše společnost přesně v souladu s podmínkami distributorské smlouvy a s ohledem na potřeby uživatelů systémů IRIS o této skutečnosti informovala trh na konci roku Všichni klienti, uživatelé či potenciální zájemci o produkty IRIS obdrželi oznámení o převzetí prodeje a produktové podpory naší firmou. V rámci zabezpečení takové činnosti Beckman Coulter Česká republika s.r.o. splnil celou řadu legislativních požadavků, aby tak postupoval přesně v souladu se zákonem o zdravotnických prostředcích, jakož i v souladu s právními předpisy Evropské unie. Těmito předpisy je povinen řídit se každý, kdo nabízí a poskytuje služby ve zdravotnictví mající přímý dopad na zdravotní stav pacienta. Přes veškerou naši snahu vyhnout se nepříjemné situaci, jež by měla nežádoucí vliv na uživatele systémů IRIS, jsme svědky toho, že po bývalý distributor nejedná dle výše zmiňovaného zákona. Společnost Beckman Coulter Česká republika s.r.o. při svém podnikání vždy dodržovala veškeré právní a etické normy. Jejím středem zájmu je prospěch pacienta a potřeby zákazníka. Budeme tak činit i v tomto případě. Rádi poskytneme všem uživatelům systémů pro močovou analýzu IRIS legislativní a regulatorní poradenskou a konzultační službu. Pokud máte o tuto pomoc zájem, vyžádejte si ji, prosím, na telefonických či ových kontaktech uvedených na našich webových stránkách V dnešní době není snadné zorientovat se v tom, co je nezbytné, aby byl zabezpečen soulad s legislativními požadavky. Výklad různých pojmů, jako je například používání zdravotnického prostředku ve shodě a v návaznosti na výrobce, si dost často vyžaduje odborníka erudovaného v této problematice. Naše společnost takovými experty disponuje a jsou vám zcela k dispozici pro účely uvedené regulatorní podpory. Pevně věřím, že nám všem leží na srdci především práva a prospěch pacienta. Přeji vám, abyste také v tomto vydání našeho časopisu nalezli články a informace, které vás zaujmou či jakkoliv obohatí. ŠTĚPÁN TINTĚRA OBSAH Editorial: IRIS je součástí Beckman Coulter Š. Tintěra Stanovení životnosti buněk průtokovou cytometrií P. Kružík Nová CE IVD verze soupravy PerFix-nc pro současné značení intracelulárních a povrchových znaků P. Kružík Nové monoklonální protilátky pro průtokovou cytometrii P. Kružík Duraclone R. Vlček, P. Kružík Kaluza G R.Vlček Vysokorychlostní buněčný sorter MoFlo Astrios EQ R. Vlček Srovnání Coulterova principu a dynamického rozptylu světla M. Polčík Kryobiologie - kryoprezervace a viabilita buněk J. Šebek VALIDAČNÍ STUDIE - Počítání dendritických buněk pomocí automatického buněčného analyzátoru Vi-Cell I. Bottová Automatická hematologická linka Beckman Coulter UniCel DxH P. Boudal Vitamin D novinka v portfoliu T. Tietze, I. Mičíková Význam stanovení vitaminu D v rutinní praxi O. Topolčan, R. Fuchsová, R. Kučera Maligní melanom I. Třešková Nádory plic a stanovení MonoTotal IRMA/ELISA H. Krátká Rozšiřujeme menu testů řady AU souprava TP Latex pro screening syfilis V. Novák Projekt riešenia a realizácie technologického vybavenia klinických laboratórií Fakultnej nemocnice s poliklinikou F. D. Roosevelta, Banská Bystrica H. Bazovská Stretnutie užívateľov koagulačných systémov Instrumentation Laboratory, októbra 2013, Nový Smokovec J. Bernátová XVII. celostátní konference DNA diagnostiky, listopadu 2013, Dolní Morava E. Králová Movember slovem i ve fotografiích T. Tietze, I. Mičíková, F. Vičar vizitka: Ing. Petra Kabeleová I. Mičíková Křížovka Kde se můžeme setkat in vitro diagnostika Časopis vydává a distribuuje Beckman Coulter Česká republika s.r.o., Radiová 1, Praha 10, Časopis připravují Ing. Kateřina Kožaná Ing. Eva Králová Ing. Hana Krátká Mgr. Pavel Kružík Ing. Kateřina Sikorová, Ph.D. Ing. Petr Suchan Mgr. Patrik Šaf RNDr. Jozef Smolka Do časopisu přispěli RNDr. Štěpán Tintěra Mgr. Pavel Kružík Ing. Roman Vlček RNDr. Martin Polčík, CSc. Bc. Jaroslav Šebek, Dis. Iveta Bottová, Ph.D. Ing. Petr Boudal Mgr. Ing. Tereza Tietze Ing. Mgr. Ivana Mičíková Prof. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc. FN Plzeň a LF v Plzni, UK v Praze MUDr. Radka Fuchsová FN Plzeň a LF v Plzni, UK v Praze PharmDr. Radek Kučera, Ph.D. FN Plzeň, Beckman Coulter Česká republika s.r.o. MUDr. Inka Třešková, Ph.D. FN Plzeň Ing. Hana Krátká Ing. Vratislav Novák, Ph.D. Mgr. Helena Bazovská Mgr. Jozefína Bernátová Ing. Eva Králová Mgr. František Vičar Ing. Kateřina Kožaná Ivan Šarkan - autor křížovky Ing. Stanislav Čermák - autor tajenky Grafik Jiří Adámek Náklad čísla 2000 výtisků 2 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

3 Originál je pouze jeden Iris je součástí Beckman Coulter Stanovení životnosti buněk průtokovou cytometrií Značení pomocí 7-AAD, DRAQ7 nebo DAPI umožňuje stanovit životnost buněk s volbou pro modrý, červený nebo fialový laser v kombinaci se značením povrchových znaků buněk monoklonální protilátkami. 7-aminoaktinomycin D (7-AAD) se vmezeřuje mezi po sobě jdoucí cytosinové (C) a guaninové (G) báze dvojitého řetězce DNA. 7-AAD je optimální např. pro značení živých kmenových buněk v kombinaci s CD45-FITC a CD34- -PE. DRAQ7 je fluorescenční barvivo DNA, které značí POUZE jádra mrtvých, nebo permeabilizovaných buněk. Může být kombinováno s dalšími fluorochromy, zejména s GFP a FITC, a PE konjugovanými protilátkami. Kompenzace v kombinaci s FITC/GFP + PE není nutná. Emisní fluorescenční vlnová délka je vyšší než 665 nm. Optimálními emisními filtry jsou 695LP, 715LP nebo 780LP. Pro excitaci lze použít lasery 488 nm, 568 nm a 633 nm nebo optimálně 647 nm. Narozdíl od propidium jodidu není DRAQ7 excitován UV laserem. DRAQ7 Far-Red Fluorescent Live-Cell Impermeant DNA Dye DAPI pro fialový laser je ideální pro mnohabarevné analýzy s použitím monoklonálních protilátek. Všechny reagencie jsou určeny k přímému použití. Obj. číslo B25595 Popis 1 ml, ready-to-use, 200 testů DAPI UV/violet excitable DNA Dye B ml, ready-to-use, 200 testů 7-AAD Viability Dye A ml, ready-to-use, 150 testů Příklad použití DRAQ7 v mnohabarevném panelu: 488 nm 638 nm 405 nm FITC PE ECD PC5.5 PC7 APC APC AF700* APC AF750* Pacific Blue* Krome Orange HLA-DR CD56 CD20 CD38 CD4 CD8 DRAQ7 CD3 CD19 CD45 Příklad použití DAPI v mnohabarevném panelu: 488 nm 638 nm 405 nm FITC PE ECD PC5.5 PC7 APC APC AF700* APC AF750* Pacific Blue* Krome Orange CD19 CD56 CD20 CD38 CD4 CD8 CD3 DAPI CD45 Nová CE IVD verze soupravy PerFix-nc pro současné značení intracelulárních a povrchových znaků Reagencie PerFix-nc (no centrifugation) je určena pro cytometrické analýzy intracelulárních epitopů, nebo kombinované značení povrchových a intracelulárních znaků, včetně fixace, permeabilizace leukocytů periferní krve nebo kostní dřeně a lýzy erytrocytů bez nutnosti centrifugace. Počet kroků přípravy vzorků je výrazně zredukován. Celkový čas manuální manipulace je tak kratší než 15 minut. Souhrnná doba přípravy včetně inkubací je 45 min. Tento postup je nejrychlejší přípravou vzorků pro intracelulární značení bez centrifugace. Značení více povrchových a intracelulárních znaků se provádí současně během permeabilizace. Buňky si po permebilizaci uchovávají své optické vlastnosti. Je tak možné gatovat jednotlivé populace leukocytů. Reagencie je velmi šetrná k fluorochromům, včetně ECD, PC5.5, APC, APC-Alexa 700, APC-Alexa 750, Pacific Blue, Krome Orange a dalším. Je optimální pro použití v mnohabarevných analýzách. Typickým příkladem v hematologii je použití různých kombinací znaků MPO-FITC, CD79a- -PE, CD3-ECD, CD14-Pacific Blue a CD45-Krome Orange. Pro některé znaky je možné přidat jako poslední krok v postupu promytí v centrifuze. Obj. číslo Název Počet testů B31167 PerFix-nc Kit (no centrifuge assay kit) 75 B31168 PerFix-nc Kit (no centrifuge assay kit) 150 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

4 CD80 a CD86 Obě molekuly jsou exprimovány na povrchu antigen prezentujících buněk, především B-lymfocytů a dendritických buněk. Váží se na molekuly CD28 a CD152 (CTLA-4) exprimovaných na povrchu aktivovaných a aktivačních T-lymfocytů. Návrh panelu s použitím CD80 a CD86 pro stanovení myeloidních dendritických buněk: Nové monoklonální protilátky pro průtokovou cytometrii Nové monoklonální protilátky jsou určeny jak pro základní cytometry se 488nm laserem, tak pro systémy vybavené červeným ( nm), žlutým 561nm a fialovým 405nm laserem. Popis Fluorochrom Obj. číslo Klon Phospho-Erk1/2 (Thr202/Tyr204) Alexa Fluor 488 B23137 E10 CD294 FITC B40020 BM16 CD197 (CCR7) PE B30632 G043H7 Phospho-Stat5 (Tyr694) PE B23139 C71E5 CD79a PC5.5 B42018 HM47 CD279 PC5.5 B36123 PD1.3 CD80 PC7 B30644 MAB104 CD86 PC7 B30648 HA5.2B7 CD206 PC7 B B1.10 CD274 (PD-L1) PC7 A78884 PD-L1 CD335 (NKp46) PC7 B38703 BAB281 CD85j APC B30645 HP-F1 IgD APC B30651 IA6-2 CD127 APC B42026 R34.34 CD134 APC B30629 Ber-ACT35 CD274 (PD-L1) APC B36126 PDL1.3.1 CD278 APC B36127 ISA-3 CD11c APC-Alexa Fluor 700 B43304 BU15 CD30 APC-Alexa Fluor 700 B42017 HRS4 CD36 APC-Alexa Fluor 700 B46022 FA6.152 CD80 APC-Alexa Fluor 750 B30643 MAB104 CD86 APC-Alexa Fluor 750 B30646 Thy1/310 CD90 APC-Alexa Fluor 750 B37789 Thy1/310 CD161 APC-Alexa Fluor 750 B B8 CD36 Pacific Blue TM B43302 FA6.152 CD44 Pacific Blue TM B37789 J nm 638 nm 405 nm FITC PE ECD PC5.5 PC7 APC APC AF700* APC AF750* Pacific Blue* Krome Orange HLA-DR CD86 CD16 CD11c CD85k CD80 CD14 CD33 CD206 CD45 Obě molekuly doplňují spektrum znaků určených pro stanovení B-lymfocytů: FITC PE ECD PC5 PC5.5 PC7 APC APC -A700 APC -A750 Pacific Blue Krome Orange CD5 CD10 CD11c CD19 CD20 CD21 CD22 CD23 CD24 CD25 CD27 CD38 CD43 CD45 CD56 CD79a CD79b CD80 CD81 CD86 CD103 CD138 FMC7 IgM IgD kappa lambda PAVEL KRUŽÍK pkruzik@beckman.com CD138 Pacific Blue TM B37788 B-A38 CD206 Pacific Blue TM B B1.10 Phospho-S6 Ribosomal Protein Pacific Blue TM B23136 D57.2.2E FoxP3 Alexa Fluor 647 B D 6 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

5 Duraclone Kaluza G V loňském roce získala společnost Beckman Coulter firmu Reametrix, která vlastní ojedinělou a patentovanou technologii pro koutování protilátek pro průtokovou cytometrii na dno cytometrických zkumavek ve vysušeném stavu (nikoliv lyofilizovaném) a to včetně konjugovaných fluorochromů. Tato technologie je nabízena pod obchodním názvem DURACLONE a je nyní k dispozici v rámci koncernu Beckman Coulter. Uvedená unikátní technologie umožňuje namíchání koktejlů v podstatě jakýchkoliv konjugátů protilátek s jakýmikoliv fluorochromy zahrnujícími i citlivé tandemové fluorochromy PC5.5, PC7, APC-AlexaFluor 700, APC-AlexaFluor 750 apod. a jejich následné vysušení na dno cytometrické zkumavky klasického formátu 12 x 75 mm. Takto připravený a vysušený koktejl vykazuje mimořádnou stabilitu při běžné laboratorní teplotě. Je testován dokonce také v extrémních podmínkách při teplotě 60 C bez jakékoliv ztráty funkčnosti protilátky i fluorochromu. Odpadá tak nutnost skladování mnoha lahviček v lednici, což ocení zejména laboratoře využívající mnohobarevné experimenty. Při použití zkumavek DURACLONE se značně zjednodušuje proces přípravy vzorku. Do zkumavky, na jejímž dně je příslušný vysušený koktejl protilátek, se přidá vzorek (krev). Tato zkumavka se pak nechá 20 minut inkubovat. Následně se vzorek zlyzuje běžnými komerčními lyzačními činidly a tím je připraven pro měření. Výsledky jsou velmi reprodukovatelné, neboť příprava ze své podstaty vylučuje možnost chyby pipetování, nestability protilátky/ fluorochromu apod. Beckman Coulter nabízí tyto soupravy jako CDS (Custom Design Service) i jako komerční hotové IVD-CE soupravy. V případě CDS si zákazník může dle svých požadavků nechat přímo u naší společnosti namíchat vlastní koktejl protilátek označených preferovanými fluorochromy a následně si jej nechat nakoutovat na dno zkumavek. Volit lze z 2 až 10 barevných koktejlů. Tato služba je dostupná také pro tekuté formáty koktejlů. Z CE-IVD certifikovaných souprav je k dispozici pro evropský trh zejména souprava pro stanovení HLA B27 antigenu. Souprava DuraClone HLA B27 Reagent Kit (objednací číslo B36862, 50 testů) je určena pro průtokové cytometry FACScan a FACSCalibur (výrobce BD). Obsahuje ve zkumavce dvě monoklonální protilátky proti HLA B27 antigenu (ABCm3 a FD705), monoklonální protilátku proti HLA B7 (BB7.1), CD3-PE-Dyomics649 a kalibrační partikule. Monoklonální protilátka FD705 se přednostně váže na HLA B7 antigen, čímž snižuje zkříženou reaktivitu. Specificita soupravy je 96 %. Pro bližší informace navštivte stránky nebo nás kontaktujte. ROMAN VLČEK rvlcek@beckman.com PAVEL KRUŽÍK pkruzik@beckman.com Od ledna tohoto roku je k dispozici nový akviziční software pro průtokový cytometr Gallios Kaluza G. Tento software byl vyvinut pro maximální zefektivnění práce ve výzkumné laboratoři. Vyniká v jednoduchosti obsluhy i zaškolení. Kaluza G přímo spolupracuje s analyzačním software Kaluza v 1.3, do níž přímo přenáší naměřená data. Nový software rovněž obsahuje zcela ojedinělou funkci SIMULATOR. Ta umožňuje postakviziční načítání (simulaci) měření z již uloženého FCS souboru, přičemž lze měnit nejen kompenzace, ale také napětí na jednotlivých fotonásobičích. To bylo do současnosti možné Software ukládá data jako FCS soubory verze 3.1 pouze v průběhu vlastního měření vzorku. Jedná se tak o zcela jistě revoluční a velmi vítanou funkcionalitu. Průtokový cytometr Gallios je standardně vybaven modrým 488nm a červeným 638nm laserem. Lze jej navíc dovybavit fialovým 405nm a žlutým 561nm laserem. Může být rovněž vybaven až 10 fotonásobiči pro fluorescence. 6 color, 2 laser (488nm Blue & 638nm Red) (5 + 1) 8 color, 2 laser (488nm Blue & 638nm Red) (5 + 3) 10 color, 3 laser (488nm Blue, 638nm Red & 405nm Violet) ( ) 10 color, 4 laser (488nm Blue & 561nm Yellow [co-linear], 638nm Red, 405nm Violet) ( ) Zároveň, díky vylepšené optice pro přímý rozptyl (Forward Scatter) umožňuje měření mikropartikulí již od 0,3 µm. ROMAN VLČEK rvlcek@beckman.com + + Take dry unitized dried-down reagent tube Add blood sample Vortex & incubate Add lysis solution & incubate Acquire & analyze by flow cytometry 8 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

6 Vysokorychlostní buněčný sorter MoFlo Astrios EQ V prosinci minulého roku uvedla naše společnost na trh novou generaci vysokorychlostního buněčného sorteru MoFlo Astrios EQ. Ta navazuje na uzavřený koncept předchozí generace MoFlo Astrios a přináší navíc celou řadu vylepšení pro jednoduchou, automatizovanou a přitom velmi specializovanou cytometrickou analýzu a sortování buněčných populací. MoFlo Astrios EQ je 6cestný jet-in-air sorter, který při zachování všech výhod systému jet- -in-air, tedy zejména vysoké viability buněk, ověřené, stabilní fluidiky a na trhu nejrychlejší elektroniky, umožňuje sortovat buněčné populace až při rychlosti buněk/sekundu při zachování čistoty všech sortovaných populací přes 99 %. Tyto parametry jsou validovány a výrobcem garantovány. Systém lze vybavit až 7 nezávislými (7 pinholový systém) lasery od 355 nm až po 642 nm, což minimalizuje potřebu interlaserové kompenzace Každý laser má pak své detekční hnízdo (POD), celkem tedy až s 49 detektory, přičemž systém umožňuje současně používat až 32 parametrů během experimentu. Optické lavice jsou uživatelsky definovatelné (filtry) standardně optimalizované pro následující fluorochromy: 355nm laser PI, Hoechst (Red and Blue), DAPI 405nm laser SSC, Cascade Blue*, Pacific Blue*, Cascade Yellow* 488nm laser SSC, FITC, PE, ECD (PE-Texas Red*), PE-Cy5/PerCP, PE-Cy5.5, PE-Cy7 532nm laser SSC, PE, PE-Alexa* 610, PE-Alexa 647, PE-Cy5.5, PE-Alexa nm laser SSC, mcherry, DSRed, mplum, HCRed 592nm laser SSC, Texas Red, APC, APC- -Cy7, Alexa 647, Alexa 700, Alexa nm laser SSC, APC, APC-Cy7, Alexa 647, Alexa 700, Alexa 750 Cascade Blue, Pacific Blue, Cascade Yellow, PE-Texas-Red a Alexa Fluor jsou registrované obchodní značky firmy Molecular Probes, Inc. Zapomeňte na zažitou představu, že je jet-in-air buněčný sorter náročný na obsluhu a vyžaduje od operátora mimořádné, pokročilé znalosti a zkušenosti. Buněčný sorter MoFlo Astrios EQ disponuje zcela automatizovanými procedurami včetně: - programovatelného automatického zapnutí a předehřátí systému na konkrétní zvolený čas - automatického alignmentu laserů - automatizované QC procedury - v neposlední řadě zcela automatickým nastavením a udržováním zpoždění kapek (drop delay) a to bez nutnosti použití jakýchkoliv kalibračních partikulí (systém IntelliSort II). Systém IntelliSort II nastaví automaticky optimální drop delay pro dané podmínky experimentu. Pomocí analýzy obrazu udržuje úpravou parametrů (amplituda, frekvence) podmínky stabilní v čase. Při dlouhých sortovacích experimentech obecně hrozí nebezpečí ucpání trysky, což většinou vede k nekorigovatelným změnám sortovacích podmínek. Různé systémy různých výrobců poté na tyto nové podmínky reagují různě, nebo nereagují vůbec. MoFlo Astrios EQ pomocí systému IntelliSort II vyhodnotí situaci během velmi krátkého časového úseku (v řádu mikrosekund) a v případě nekorigovatelnosti změn parametrů ukončí ihned proudění vzorku a nosné tekutiny a vydá příkaz propojenému systému Sort Rescue, který fyzicky odstraní zkumavky nebo destičky, do nichž se frakce sortují, a tím zabrání jakékoliv jejich kontaminaci. Zde právě obsluha ocení systém IntelliSort II sorteru MoFlo Astrios EQ. Ten pro znovunastavení drop delay žádné kalibrační partikule nepotřebuje. Vlastní nastavení tak probíhá za zcela sterilních podmínek. Tyto vlastnosti jsou výhodou zejména pro laboratoře, jež potřebují zajistit dlouhodobě stabilní podmínky experimentu s minimální náročností nastavovaní systému. Pokud navíc probíhá experiment za sterilních či aseptických podmínek, je vždy nutné ucpání trysky odstranit buď použitím některého čistícího algoritmu software sorteru, nebo, není-li to dostatečné, fyzickým vyjmutím a sonifikováním sortovací trysky. Pro zajištění pokračování sterilního sortu je pak třeba znovu sterilizovat fluidní dráhu a znovu nastavit drop delay. V případě systémů, které jsou sice schopny automaticky nastavit drop delay, ale potřebují k tomu jakékoliv kalibrační partikule, jež samozřejmě nejsou sterilní, musí obsluha po jejich použití znovu sterilizovat systém. V případě sorteru MoFlo Astrios EQ vybaveného systémem IntelliSort II je nastaven nový drop delay bez nutnosti použití partikulí, čímž je zcela eliminováno riziko zanesení kontaminace. Problém tak odpadá a práce operátorem je tím výrazně usnadněna. Většina laboratoří sortujících své populace buněk pak samozřejmě vyžaduje minimalizaci ztrát těchto vzácných populací tzv. hard aborty (buňky jsou v takovém případě odvedeny do odpadu, tedy ztraceny pro další analýzy), které jsou dány pomalou elektronikou systémů s 16, resp. 18bitovým zpracováním dat a vzorkovací frekvencí na úrovni jednotek či desítek MHz. Při vyšších rychlostech sortování jednoduše nejsou schopny zachytit všechny události v daném časovém rámci. Systém MoFlo Astrios EQ vybavený 100MHz vzorkovací frekvencí a 32 bitovým zpracováním dat s rozlišením přes 4 miliardy kanálů ve škále je nevýkonnějším buněčným sorterem na trhu. Minimalizuje jakékoliv ztráty buněk dané hard aborty při zachování unikátního rozlišení všech analyzovaných populací. 6cestné sortování může probíhat třemi různými technikami: 1) Purity kdy je dosaženo maximální čistoty vysortované frakce (sortuje se jakákoliv kapička obsahující jen buňky našeho zájmu) 2) Enrich - kdy není prioritou maximální čistota frakce, ale maximální zisk buněk, které nás zajímají (je sortována každá kapička obsahující buňky našeho zájmu i za cenu příměsi jiné buňky) 3) Single cell Mode kdy se do dané frakce sortují pouze kapičky obsahující právě jednu buňku, která je předmětem zájmu Zcela unikátní vlastností systému MoFlo Astrios EQ je tzv. MIX MODE sorting. Jedná se o uživatelsky volitelnou techniku sortování pro každý sortovací proud samostatně v rámci jednoho sortovacího experimentu. To vede k minimalizaci ztrát vzácných populací buněk. Nahoře je uveden názorný příklad výhody tohoto uspořádání, kdy jsou sbírány veškeré frakce včetně abortů, díky čemuž jsou všechny k dispozici pro případnou reanalýzu, nikoliv tedy znehodnoceny odvedením do odpadu. Sortování může probíhat z nejširší škály zkumavek na trhu od 0,5ml až po 50ml, což usnadní práci obsluze a zcela eliminuje nutnost alikvotace vstupního vzorku. Výstupním formátem sortovacích frakcí pak může být jak jakákoliv zkumavka o objemu 0,5 50 ml, tak podložní mikroskopické sklíčko, 96-, 384- či 1536jamkové destičky nebo jakýkoliv uživatelsky definovatelný formát. Samozřejmostí je možnost chlazení vzorku i sortovaných frakcí v širokém rozmezí od -2 do 40 C. Vezmeme-li v úvahu také nejširší spektrum velikostí sortovacích trysek, počínají od 50 µm a končící u 400 µm, je zřejmé, že pokrývá apli- Counts kace pro prakticky libovolnou velikost buněk či partikulí, které chceme sortovat. MoFlo Astrios EQ má nově modifikovanou detekci přímého rozptylu světla (Forward Scatter). Díky uživatelsky výměnným filtrům umožňuje unikátní detekci mikročástic již od 0,2 µm včetně až do 30 µm a to v jedné zobrazené škále. Uživatel tak může zároveň analyzovat a sortovat například mikropartikule odvozené od krevních destiček a granulocyty. Noise 0.2 um 0.3 um 488-FSC2-Log ND=0 Celý systém lze volitelně uzavřít do BioSafety boxu Class II (BSL2), který splňuje standardy European Standard (EN 12469:2000) a ISAC. Biosafety box navíc není pouze pasívní schránkou zajišťující ochranu personálu či vzorku, ale je zároveň aktivně propojen a komunikuje se softwarem sorteru MoFlo Astrios EQ. V případě jakékoliv nestability v proudění vzduchu BioSafety boxem reaguje ukončením sortování, a tak zajišťuje maximální ochranu personálu při práci s vysoce infekčním materiálem. Pro více informací navštivte stránky: ROMAN VLČEK rvlcek@beckman.com 30 um 1 um 10 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

7 Sorting made simpler. Maximize safety without compromising workflow. NOVÁ stolní centrifuga ALLEGRA X-5 ZVYŠTE VÝKON A KAPACITU VE VAŠÍ DIAGNOSTICKÉ LABORATOŘI * 7 pinholes * až 7 nezávislých laserů od 355 po 642nm * akviziční rychlost buněk/sekundu * měření až 32 parametrů současně * sortování validováno až do buněk/sekundu * automatické nastavení a udržování drop delay bez použití partikulí (IntelliSort II) * 6 cestné sortování třemi různými technikami * sortování na sklíčka, do 6 - až well plates * 32 bitové zpracování dat * více než 4 miliardy zobrazených kanálů na škále * možnost do umístění BioSafety boxu Class II * zcela automatický start up * zcela automatický QC proces * rozlišení ForwardScatter 0,2 až 30 um v jedné škále VÝKYVNÝ ROTOR S ADAPTÉRY PRO ODBĚROVÉ ZKUMAVKY 4x35 ks ø13 mm 4x25 ks ø16 mm rpm g (rcf) PŮDORYS JEN 50x64 cm (šxh) EQ VČETNĚ ROTORU A 4+4 KS ADAPTÉRŮ ZA Kč Nabídka platí do bez DPH ADAPTÉRY PRO STOJÁNKY Z ANALYZÁTORŮ DxC a DxI For Research Use Only. Not to be used in diagnostic procedures. Class I laser product. MoFlo Astrios is a trademark of Beckman Coulter, Inc. Beckman Coulter and the stylized logo are trademarks of Beckman Coulter, Inc. and are registered with the USPTO. Beckman Coulter Česká republika s.r.o. Murmanská 1475/4, Praha 10, tel.: beckman.cz@beckman.com

8 Srovnání Coulterova principu a dynamického rozptylu světla V této zprávě srovnáváme dvě rozdílné metody charakterizace submikronových objektů lipozomů pomocí přístrojů společnosti Beckman Coulter. Porovnáváme nejnovější Multisizer 4e (MS4e), pracující na Coulterově principu, a Delsa Max Core (DM Core), který využívá dynamický rozptyl světla (DLS). Lipozomy jsou tuková tělíska o průměru od 50 nm do 5 µm. Mají širokou škálu využití, např. v textilním a kosmetickém průmyslu, v medicíně a biologii. Jednu z potenciálně významných aplikací představuje cílený přenos léků v těle. V biologickém výzkumu se dají použít jako modelový systém ke studiu vlastností buněčných membrán. Údaje o jejich velikosti a počtu, tedy koncentrace, jsou téměř vždy jedním ze základních parametrů, který je potřeba znát. Informace o velikosti objektů v submikronové oblasti lze získat buď měřením jednotlivých částic, nebo jejich souborů. Metody založené na analýze souboru částic jsou např. sedimentace, prosévání nebo rozptyl světla (dynamický i statický). Studovat individuální objekty dovoluje např. elektronová a optická mikroskopie nebo Coulterův princip. Sedimentace a prosévání mají malé rozlišení a jsou časově náročné. Dynamický rozptyl světla (DLS) poskytuje rychlé informace o velikosti a polydisperzitě částic, ne však o jejich koncentraci. Zobrazovací metody ukazují velikost a tvar objektů, ale pouze z omezeného a ne vždy reprezentativního souboru. Coulterův princip podává informace o koncentraci částic nebo buněk a poslouží jako nezávislá verifikace dat z DLS. Obr. 1: Delsa Max Core (obr. 1). Lipozomy byly rozředěny v poměru 1:100 v DI vodě. Vzorek o objemu 20 µl byl napipetován do plastikové jednorázové kyvety umístěné do přístroje. Pět měření se skládalo ze tří pětisekundových skenů při teplotě cely 25 C. Ve všech měřeních byl součet čtverců (SOS) menší než 10, což odpovídá čistému vzorku bez kontaminace a bublin. Hodnota polydisperzity a průměru ukazuje na monomodální vzorek. To také potvrzuje regularizační analýza (obr. 2.). Multisizer 4e Původní vzorek lipozomů s koncentrací 0,8 mg/ml byl použit k měření na Multisizeru 4e (obr. 3) s aperturou 10 µm. 5 µl původního roztoku bylo rozptýleno v 19,995 ml Isotonu II (ředění 1:4000). Použitá apertura dovoluje analyzovat objekty v rozmezí 0,2 až 6 µm se 400 měřícími kanály. Aperturou prošlo celkově 10 µl kapaliny při každém z deseti skenů (obr. 4). Multisizer 4e má největší dynamický rozsah mezi přístroji využívajícími Coulterův princip (od 200 nm do 1600 mikronů). Měření se provádí v elektrolytu, který je vhodný pro většinu biologických vzorků. Analyzuje celý vzorek, částici po částici, s vysokou citlivostí. Při použití maximálního počtu měřených kanálů (400) lze dosáhnout nejmenšího kroku ve škále velikostí až 0,1 nm (!). Výsledkem popsaných měření je koncentrace 1,513 ± 0,144 * 1010 lipozomů/ml, což v původním vzorku odpovídá koncentraci 6,052 ± 0,574 * 1013 lipozomů/ml. Srovnání s DLS je znázorněno v tabulce 1. Distribuce velikostí lipozomů změřená pomocí Delsa Max Core dává stejnou hodnotu středního průměru jako u MS4e. Relativně větší příspěvek částic větších poloměrů v distribuční funkci je dán tím, že rozptyl světla na nich je silnější než na malých částicích. Vysoká shoda výsledků dvou různých metod měření velikostí nanočástic ukazuje jedinečnou možnost měření absolutních koncentrací nanočástic pomocí MS4e. Současně potvrzuje správnost měření na těchto přístrojích. Přístroj Technologie Průměr Medián Polydisperzita Delsa Max Core DLS 320,2 ± 19,8 nm 42,0±8,2 nm MS4e Coulterův princip 343 ± 174 nm 292 nm Obr. 3: Multisizer 4e Tabulka 1: Srovnání měření velikosti lipozomů na MS4e a DM Core MARTIN POLČÍK mpolcik@beckman.com Měření Delsa Max Core Zkoumané lipozomy byly získány od firmy Librede. Měření proběhla do tří týdnů od jejich produkce. Lipozomy byly tvořeny lipidem DPhPC rozptýleném v pufru, jenž byl tvořen 15 0mM NaCl, 5 mm CaCl2 a 10 mm HEPES při ph = 8. Počáteční koncentrace byla 0,8 mg/ml. K měření byl použit přístroj Delsa Max Core Obr. 2 Obr Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

9 KRYOBIOLOGIE Kryoprezervace a viabilita buněk Agencourt SPRI Izolace a purifi kace nukleových kyselin eluce nukleových kyselin imobilizace nukleové kyseliny odstranění kontaminací a promytí Magnet Do vědní disciplíny označované jako kryobilogie, jejímž předmětem zkoumání je účinek nízkých teplot na biologické systémy, spadá také problematika lyofilizace/kryokonzervace buněk potažmo tkání. Ta vychází z jednoduchého funkčního vztahu, kdy snižování teploty indukuje v přímé úměrnosti pokles metabolických pochodů v živé hmotě. Při úplné stagnaci jakýchkoliv molekulárních struktur pak docílíme dokonalého zakonzervování. Přibližně od roku 1950 studovali tento soubor jevů (nezávisle na sobě) James Ephraim Lovelock a John Christopher Polge. Podařilo se jim zjistit příčinu poškození buněk vlivem nízkých teplot pod bodem mrazu. Uvedené úskalí následně dokázali překonat. Prostřednictvím chemických látek, obecně nazývaných kryoprotektiva a, v případě lyofilizace, lyoprotektiva, se podařilo na buněčných modelech poškození vlivem mrazu minimalizovat. Prokázali tak, že je možné kryoprezervovat buňky a současně jim po ukončení stáze zachovat viabilitu. Díky jejich úsilí byla na začátku šedesátých let minulého století kryobiologie vědeckou veřejností přijata. Během kryostáze běžně skladujeme biologický materiál při teplotách alespoň -80 C. Pokud je chladícím médiem kapalný dusík, konečná teplota dosáhne až -196 C. Tekuté hélium se využívá sporadicky. ňované mikrokrystaly utvářejí přednostně v extracelulárním prostředí s typickým uspořádáním, což označujeme jako dendritickou krystalovou deformaci. Od místa chlazení kapalinou postupně prorůstají podlouhlé relativně velké krystaly, mezi nimiž jsou dendritické kanály. Zde se buňky v průběhu kryoprezervace soustředí. Avšak pod vlivem hyperosmolární kapaliny ztrácejí vodu a svrašťují se, dokud zbylá voda nezmrzne. Proces označujeme jako efekt krystalizace vody (obr. 1). Bohužel opačný postup, kdy zvolíme rychlé navození kryostáze, problém neřeší. Mikrokrystaly v tomto případě vznikají především intracelulárně. Sice dosahují menší velikosti, nicméně mají tendenci rekrystalizovat ve větší útvary. Hyperosmolalita pak nastává uvnitř buněk (obr. 2). Výsledkem je efekt roztoku (z anglického termínu solution effect), kdy nastává rozvrat nitrobuněčného ph a paradoxní zrychlení metabolismu, protože ztráta vody zvyšuje koncentraci látek participujících na biochemických reakcích. Následně se zvyšuje influx vody do intracelulárního prostředí do doby, než buňka nebo okolní tekutina kompletně zmrzne. Stres na celulární struktury indukovaný ledovými krystaly bohužel nedokáže vyřešit ani metoda lyofilizace, která je založena na principu sublimace. V případě buněk ji můžeme uplatnit jen při kryoprezervaci prokaryot. Podstata sublimace vychází z fyzikálněchemických vlastností vody, kdy zmrazení v materiálu indukuje vznik ledových krystalů a následné snížení tlaku navodí sublimaci vody z pevného skupenství na plynné. Mnohem více se lyofilizace osvědčila pro dlouhodobou konzervaci biologického materiálu na úrovni molekul, jež vykazují termolabilní charakter. Proto se od roku 1930 začala používat ve větší míře, aby bylo možné stabilizovat penicilin jakožto beta-laktamové antibiotikum pro parenterální aplikaci. Kryoprotektiva Výše popsané technologické postupy pomalého i rychlého zamrazení (včetně lyofilizace), které vyvolávají vznik ledových krystalů, buňky během kryoprezervace mechanicky poškozují a posléze znemožňují jejich přežití po vrácení teploty do fyziologického normálu. K potlačení tohoto problému používáme tzv. kryoprotektiva, ve zkratce CPA (z anglického termínu cryoprotective agent), jež se vyznačují nižším bodem tuhnutí. Poněvadž nahrazují část intracelulární vody a stávají se také součástí mimobuněčného prostředí, redukují mikrokrystaly Magnet Poškození buněk mrazem Hlavní úskalí zamrazování buněk, eventuálně tkání o velikosti několika milimetrů, tkví v tom, že intracelulární i extracelulární voda při teplotách pod bodem mrazu vytváří mikrokrystaly, které rostou z tzv. nukleačních center a zvětšují svůj objem. Hexagonální led vznikající za běžného tlaku má navíc tendenci rekrystalizovat za vzniku větších útvarů. Protože krystaly narušují integritu fosfolipidových membrán, poškozují buněčné kompartmenty. Vznik mikrokrystalů vede rovněž ke zvýšené koncentraci minerálů, jež při změně skupenského stavu vody z ledu vypadávají do prozatím nezmrzlé kapaliny. Pokud zpracováváme buněčnou suspenzi, potýkáme se zároveň s faktem, že postupně narůstající mikrokrystaly vytlačují buňky do prozatím nezmrzlé kapaliny, kde se nakupí a mohou zfúzovat. Označujeme to termínem cell packing effect. V případě pomalého zamrazování se zmi- Obrázek 1: Efekt krystalizace vody Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

10 biologicky aktivní látky (ionty, enzymy, organely) Obrázek 2: Efekt roztoku Četné studie poukazují na prospěšnost kombinovaných médií obsahujících jak penetrující, tak nepenetrující složku. Intracelulárním kryoprotektivům sice připisujeme zásadní význam, nicméně mohou poškozovat buňky. Proto ke snížení jejich negativního dopadu používáme například hydroxyethylenový škrob. Augmentační působení nepenetrujících látek tak napomáhá snižovat toxicitu ethylenglykolu nebo dimethylsulfoxidu. Tabulka uvádí optimální složení ochranného média, teplotu uskladnění podle typu a koncentrace zamrazeného materiálu. K dalším doplňkům kryomédií náleží purifikované bílkoviny ve smyslu albuminu, eventuelně oligopeptidů a pufrovací látky. Často se kombinuje fosfátový pufr s tzv. HEPES, který má chemický název N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N-(2-ethansulfyziologická buňka vyrůstající z tzv. nukleačních center. Dále brání osmotickému stresu nebo posunu ph. Podle mechanismu účinku rozeznáváme ochranná média penetrující a nepenetrující. z Kryoprotektiva penetrující, neboli intracelulární, pronikají díky své nízké molekulové hmotnosti po koncentračním gradientu do buněk, kde nahrazují vodu. Nejpoužívanější je ethylenglykol a dimethylsulfoxid (DMSO), přičemž velmi účinná bývá jejich kombinace v poměru 1:1. Nevýhodou je toxicita, což platí především u dimethylsulfoxidu. Proto volíme takový postup práce, aby expozice buněk nebyla zbytečně zdlouhavá. z Kryoprotektiva nepenetrující zůstávají v extracelulárním prostředí, což koresponduje s faktem, že jsou minimálně cytotoxická. Mají vyšší molekulovou hmotnost. Sacharidový základ jim propůjčuje osmotickou aktivitu, která napomáhá vytahovat vodu z buněk. Příkladem nepenetrujících akumulace biologicky aktivních látek ledové krystaly protektiv mohou být sacharóza, trechalóza, dextran. Nejúčinnější však je hydroxyethylový škrob. fonová kyselina). Chemicky se jedná o organickou molekulu. Vhodně zvolené kryomédium společně s postupem chlazení nám zvyšuje úspěšnost zamrazování. Můžeme dosáhnout viability buněk, jež činní % z původní buněčné populace. Uvedené číslo životaschopných buněk je nejvíce ovlivněno teplotním přechodem z -20 C na -40 C, což pokládáme za nejkritičtější fázi úvodu do kryostáze. Metody kryoprezervace Během kontrolovaného mrazení, jež pokládáme za nejšetrnější postup, teplota klesá pozvolna přibližně v řádu jednoho stupně celsia za minutu. Celková doba úvodu do kryostáze by ve většině případů měla trvat minut. Buňky nejvíce poškozuje efekt krystalizace vody, kdy led v médiu zvenčí narušuje buněčné struktury. Následný vzestup osmolality z nich poté nadměrně vytahuje vodu do extracelulárního prostředí. Proto nepenetrující protektiva sehrávají důležitější roli než u rychlého mrazení. Navíc se zde výrazněji uplatňuje cell packing effect. Existuje mnoho osvědčených protokolů řízeného zamrazování zvolených dle typu buněk, přičemž se vzájemně liší časovou náročností i rychlostí poklesu teploty. Ovšem je nutné použít speciální programovatelné mrazicí boxy s aktivní regulací, jejichž chladicí kapalinou bývá kapalný dusík. Dva grafy ukazují průběh korespondující s množstvím zamrazovaného materiálu. Pro rychlé mrazení častěji používáme termín vitrifikace. Při ní buněčnou suspenzi přibližně o chladničkové teplotě vystavíme účinku tekutého dusíku. V případě použití kapalného dusíku jako chladicího média teplota zprudka poklesne až na -196 C. Kryomédium při těchto fyzikálních podmínkách podléhá právě vitrifikaci, kdy se nevytváří klasický krystalic- ký led, nýbrž mráz extrémně zvýší viskozitu, a médium tak zesklovatí. Nevznikají tedy krystaly, které by zvenčí poškozovaly buněčný povrch. Z pohledu buněčného stresu se nejvíce uplatňuje efekt roztoku, protože intracelulárně vzniká velké množství mikrokrystalů, což doprovází nerovnováha v osmolalitě. Proces na přijatelnou úroveň potlačíme, když použijeme vyšší koncentrace penetrujících kryoprotektivních látek, než tomu bylo u kontrolovaného mrazení. Pro vitrifikaci jsou vhodné buňky neobsahující větší množství vody. Rekonstituce buněk a měření viability Po ukončení kryoprezervace rozmrazujeme buňky rychle v řádu několika minut. Účelem není pouze obnovení fyziologické teploty, ale také náhrada penetrujícího kryoprotektiva jakožto toxické látky zpět za vodu, a to co nejrychleji. Po vyjmutí z chladícího média se biologický materiál podrobí ohřevu v lázni při 37 C. Jakmile rozmrzne, je zapotřebí buňky přemístit do kultivačního média, eventuelně izotonického roztoku s fosfátovým pufrem a HEPES. Nastane diluce kryoprotektiv i jejich vyplavení z intracelulárního prostředí. Aby buňky nebyly osmoticky poškozeny, měl by objem vyměněného protektiva za vodu probíhat rovnoměrně. teplota ( C ) Úspěšnost zamrazení a opětovného rozmrazení lze ověřit stanovením viability, kdy se určí procentuální zastoupení vitálních buněk vůči odumřelým. K měření můžeme použít analyzátor buněk Vi-Cell XR. Princip stanovení vychází z vlastnosti cytoplazmatické membrány živých buněk. Narozdíl od mrtvých nepropouští do svých kompartmentů barvivo, kterým je v tomto případě trypanová modř. Rozdíly v barvitelnosti snímá kamera v okamžiku, kdy buněčná suspenze prochází plochou průtokovou kyvetou. Rozpětí částic vhodných k měření se pohybuje v rozmezí 2 70 μm. Software přístroje po digitálním zpracování obrazu nevyhodnocuje jen data týkající se viability, ale dovoluje měřit rovněž koncentraci, velikost či distribuci velikosti buněčné populace. Literatura Protokol zamrazení suspenze (objemu do 1 ml) 1. BROCKBANK, Kelvin, COVAULT, James, TAYLOR, Michael. Cryopreservation guide. USA: Thermo Fisher Scientific Inc., 2007, 24 s. ISBN -; PF-LECS-CRYOGUIDE Dostupné z: 2. DAY, John, STACEY, Glyn. Cryopreservation and freeze-drying protocols. 2. vyd čas (minuty) New Jersey: Humana Press Inc., 2007, 347 s. ISBN KRUŽÍK, Pavel, MOOS, Jiří, VLČEK, Roman. Analyzátory buněk a částic. In vitro diagnostika: Informační magazín Beckman Coulter. Praha 10: Beckman Coulter Česká republika, 2006, č. 3, s RYAN, John. General guide for cryogenically storing animal cell cultures: Technical bulletin. USA: Corning Inc., 2004, 9 s. Life science. ISBN -; 3/04-TC-306. Dostupné z: 5. THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. Thermo scientific nalgene and nunc cryopreservation guide. USA: Thermo Fisher Scientific Inc., 2009, 9 s. ISBN -; BRLSPCRYOPRES Dostupné z: BC. JAROSLAV ŠEBEK, DIS. AESKULAB K.S., NEPOMUCKÁ 159A, PLZEŇ jarda.sebku@seznam.cz Typ organismu Koncentrace Kryoprotektivum (%) Teplota ( C) živočišné buňky buněčné hybridomy kmenové buňky /ml 107/ml /ml DMSO nebo glycerol 5 10 nepenetrující médium 1-5 DMSO 5 10 sérum 20 DMSO 5 10 sérum bakterie 107/ml glycerol buňky infikované viry 105/ml DMSO 7 sérum 10 nukleové kyseliny není potřeba upravovat není potřeba kryoprotektivum teplota ( C ) Protokol zamrazení suspenze (objemu 1-3 ml) čas (minuty) Tabulka: Příklady zamrazovaných materiálů 18 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

11 VALIDAČNÍ STUDIE Počítání dendritických buněk pomocí automa- a pomocí Bürkerovy komůrky nebyl žádný významný rozdíl. Automatický analyzátor počtu buněk Vi-Cell byl potvrzen jakožto správná a vhodná metoda počítání dendritických buněk. VÝSLEDKY Hodnocení správnosti měření u analyzátoru Vi-Cell správném rozmezí 0,9 x 10 6 /ml 1,1 x 10 6 /ml (1 x 10 6 /ml ± 10 %), jak požaduje příručka pro kontrolu koncentrace (obrázek č. 1). Hodnocení přesného stanovení průměru a cirkularity pro optimální nastavení analyzátoru Vi-Cell pro analýzu vakcíny DCVAC Vakcína DCVAC/PCa obsahuje několik buněčných populací, ale především dendritické buňky a lymfocyty. Protože zobrazovací sys- Správnost automatické počítací metody u analyzátoru Vi-Cell byla určena pomocí tém analyzátoru Vi-Cell analyzuje různé typy odlišit dendritické buňky od lymfocytů tak, aby t byl proveden pomocí částic pro kontrolu koncentrace (1 x 10 6 /ml) pracovníky č. 1 a 2 třikrát za stejných provozních podmínek na obou zařízeních. Pro každého pracovníka byl výpočtu vypočítán variačního průměr ze koeficientu tří počtů a jejich CV% v směrodatná rámci buněk odchylka na základě SD pro obě jejich zařízení, velikosti čímž a cirkularity, byla získána hodnota při počítání CV% na v rámci analyzátoru jednoho Vi-Cell pracovníka. bylo možné Pro získání hodn mezi pracovníky tického byl vypočítán průměrný buněčného počet částic spočítaných dvěma pracovníky a jeho směrodatná odchylka (Prac. 1 Prac. 2). Počet částic získaných na analyzátoru Vi-Cell jednoho byl srovnatelný pracovníka s počtem a mezi částic pracovníky z Bürkerovy (analyzátor počítací byly komůrky. tyto parametry Variační stanoveny koeficient u (CV) dendritických je definován jako lymfocyty poměr vyloučit. směrodatné Bylo odchylky zjištěno, k že průměru. charakte- Prac. = pracov Vi-Cell oproti Bürkerově komůrce). buněk a lymfocytů, aby bylo možné nastavit ristické rozmezí velikosti činí u dendritických variační koeficient, SD = směrodatná odchylka. analyzátoru Vi-Cell Správnost analyzátoru Vi-Cell byla testována analyzátor Vi-Cell na správné rozpoznávání buněk µm a u lymfocytů 5 12,5 µm, za použití kontrolní suspenze částic o známé dendritických buněk a vyloučení lymfocytů. Ke což vede k částečnému překryvu u dolní meze koncentraci (1 x 10 6 /ml). Koncentraci částic stanovení obou parametrů byl použit mikroskop pro populaci dendritických buněk. Nicméně stanovili dva pracovníci třikrát za stejných NIKON Eclipse při 20násobném zvětšení procentuální velikost tohoto překryvu není SOUHRN provozních podmínek. Pro hodnocení správnosti (stejném jako u mikroskopu Vi-Cell) a zobra- vysoká (4 %). stanovení počtu byly výsledky získané na zovací software NIS Elements BR. automatickém analyzátoru Vi-Cell porovnány Validace počítání buněk za použití automatického analyzátoru Vi-Cell s výsledky získanými pomocí Bürkerovy komůrky. Variační koeficient mezi jednotlivými ží vakcíny DCVAC/PCa (2 kontrolních a 3 od Cirkularita buněk byla analyzována u 5 šar- stanoveními počtu, ale ani mezi pracovníky, subjektů klinické studie), přičemž u každé bylo Protože rozlišení obou populací na základě nepřekročil u žádné z použitých počítacích měřeno 20 dendritických buněk a 10 lymfocytů velikosti buněk nebylo úplně jednoznačné, metod 5 %. Konečná koncentrace kontrolních a pro každou z nich byla vypočítána prů- byly jakožto možné parametry pro nastavení částic stanovená manuální a automatickou měrná hodnota (obrázek 2A). Byla porovnána analyzátoru Vi-Cell na počítání dendritic- ANALYZÁTOR Vi-CELL Počet částic [x10 6 ] CV% v rámci jednoho pracovníka počítací metodou byla srovnatelná a ve cirkularita u každého typu buněk. Mezi denkých buněk testovány 2 velikostní parametry: dritickými buňkami a lymfocyty nebyly zjištěny významné rozdíly (P = 0,6560; párový t-test). Tyto typy buněk tudíž není možné rozlišovat na základě jejich cirkularity. Průměr buněk byl analyzován u 19 šarží vakcíny DCVAC/PCa (6 kontrolních šarží a 13 šarží od subjektů klinické studie), přičemž u každé bylo měřeno 20 dendritických buněk a 10 lymfocytů (obrázek 2B). Průměry obou buněčných populací byly porovnány s cílem stanovit rozmezí velikosti, které by umožnilo Populace dendritických buněk (DB) je klíčovou funkční složkou konečného produktu vakcíny DCVAC/PCa. Správný počet dendritických buněk a jejich dostatečná životnost jsou jedním z kritérií kontroly jakosti při uvolňování konečného produktu. Počet funkčních dendritických buněk se v současné době určuje pod mikroskopem metodou manuálního počítání za využití Bürkerovy komůrky a barvení trypanovou modří pro vyloučení mrtvých buněk. Analyzátor Vi-Cell je automatizovaný hemocytometr, který využívá vylučovací protokol barvení trypanovou modří. Poskytuje údaje o koncentraci buněk a jejich viabilitě. Analyzátor Vi-Cell byl v této studii vyhodnocen jako metoda vhodná pro kontrolu jakosti z hlediska počtu a životnosti dendritických buněk. Test správnosti analyzátoru Vi-Cell pro počítání buněk byl proveden pomocí kontrolních částic o známé koncentraci, a to třikrát za stejných provozních podmínek. Ve vakcíně DCVAC/PCa byly pomocí mikroskopu NIKON Eclipse stanoveny průměr a cirkularita dendritických buněk a lymfocytů, aby bylo možné analyzátor správně nastavit na rozpoznávání dendritických buněk a vyloučení lymfocytů. Bylo stanoveno rozmezí velikosti pro dendritické buňky tak, aby byly vyloučeny lymfocyty a analyzovány celkové počty dendritických buněk, počty funkčních dendritických buněk a viabilita dendritických buněk. Tyto údaje byly porovnány s počty získanými pomocí Bürkerovy komůrky. Mezi počtem dendritických buněk získaných na analyzátoru Vi-Cell Průměr prac. 1 1,03 1,68 Průměr prac. 2 1,02 4,10 Průměr prac ,02 2,89 SD prac ,005 CV% mezi prac ,46 BURKER Počet částic [x10 6 ] CV% v rámci jednoho pracovníka Průměr prac. 1 1,03 1,12 Průměr prac. 2 0,99 6,44 Průměr prac ,01 3,78 SD prac ,028 CV% mezi prac ,81 Obrázek 1: Test správnosti Test byl proveden pomocí částic pro kontrolu koncentrace (1 x 10 6 /ml) pracovníky č. 1 a 2 třikrát za stejných provozních podmínek na obou zařízeních. Pro každého pracovníka byl vypočítán průměr ze tří počtů a jejich směrodatná odchylka SD pro obě zařízení, čímž byla získána hodnota CV% v rámci jednoho pracovníka. Pro získání hodnoty CV% mezi pracovníky byl vypočítán průměrný počet částic spočítaných dvěma pracovníky a jeho směrodatná odchylka (Prac. 1 Prac. 2). Počet částic získaných na analyzátoru Vi-Cell byl srovnatelný s počtem částic z Bürkerovy počítací komůrky. Variační koeficient (CV) je definován jako poměr směrodatné odchylky k průměru. Prac. = pracovník, CV = variační koeficient, SD = směrodatná odchylka. A B Lymphocytes Obrázek 2: Stanovení cirkularity a průměru buněk u vakcíny DCVAC/PCa Ke stanovení obou parametrů byl použit mikroskop NIKON Eclipse při 20násobném zvětšení a zobrazovací software NIS Elements BR. A) Cirkularita byla stanovena u 5 šarží vakcíny DCVAC/PCa, u nichž bylo měřeno 20 dendritických buněk (šedé body) a 10 lymfocytů (černé čtverečky); pro každou šarži byl vypočítán průměr. B) Byl stanoven průměr dendritických buněk a lymfocytů a na základě těchto údajů bylo pro analyzátor Vi-Cell určeno kritérium velikosti dendritických buněk: 11,5 30 µm a µm. P = subjekt klinické studie DCVAC/PCa, KON = kontrolní DCVAC/PCa, DC = dendritické buňky, LEU = lymfocyty. DC 20 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

12 A B try, nicméně při rozmezí 11,5 30 µm se analyzátor lišil oproti Bürkerově počítací komůrce méně významně než při rozmezí µm (obrázek 3A, 3B). Navíc při vynesení rozdílu mezi párem měření (hodnota analyzátoru Vi-Cell - hodnota z Bürkerovy komůrky) oproti jejich průměru (hodnota analyzátoru Vi-Cell + hodnota z Bürkerovy komůrky/2) byly rozdíly v případě rozmezí 11,5 30 µm menší a více soustředěné kolem nuly než u rozmezí µm. To potvrzuje, že rozmezí 11,5 30 µm je jako velikostní parametr pro analyzátor Vi-Cell pro počítání dendritických buněk vhodnější (obrázek 4). Hodnoty viability dendritických buněk (%) stanovené analyzátorem Vi-Cell se významně lišily od hodnot získaných pomocí Bürkerovy počítací komůrky (obrázek 3C). To s největší pravděpodobností souvisí se skutečností, že každou z metod byl analyzován jiný počet buněk. Systém Vi-Cell spočítal na každé stanovení počtu přibližně 1000 buněk, zatímco v Bürkerově komůrce to bylo přibližně 100 buněk, což naznačuje, že automatická metoda je při stanovení procentuálního podílu přesnější. ZÁVĚRY C Obrázek 4: Diagram v osách XY Pro oba parametry velikostního rozmezí 11,5 30 µm a µm byl vynesen rozdíl mezi párovými měřeními (hodnota analyzátoru Vi-Cell - hodnota z Bürkerovy komůrky) oproti jejich průměru (hodnota analyzátoru Vi-Cell + hodnota z Bürkerovy komůrky/2). Byla analyzována úroveň rozdílu a jeho poloha vzhledem k nule. V případě rozmezí 11,5 30 µm byly rozdíly menší a více soustředěné kolem nuly. Automatický analyzátor počtu buněk Vi-Cell byl potvrzen jakožto metoda, která je správná a vhodná pro počítání dendritických buněk a která je srovnatelná s aktuálně používanou metodou kontroly jakosti pomocí Bürkerovy komůrky. Mezi hodnotami počtu dendritických buněk získanými na analyzátoru Vi-Cell a prostřednictvím Bürkerovy komůrky nebyl žádný významný rozdíl. Dále se ukázalo, že jako nastavovaný parametr velikosti dendritických buněk u analyzátoru Vi-Cell je vhodné velikostní rozmezí 11,5 30 µm. DODATKY Referenční příručka k analyzátoru životnosti buněk Vi-CELL XR Obrázek 3: Počet a viabilita dendritických buněk Alikvoty vakcíny DCVAC/PCa z 20 šarží byly rozmrazeny podle standardního operačního postupu SOP 11-KON. Poté byly změřeny počty a viabilita buněk paralelně pomocí Bürkerovy komůrky (SOP 16-KON) a analyzátoru Vi-Cell. Jako možné parametry nastavení analyzátoru Vi-Cell na rozpoznávání dendritických buněk byla testována 2 rozmezí velikosti: 11,5 30 µm a µm. Pomocí analyzátoru Vi-Cell i prostřednictvím Bürkerovy počítací komůrky byly získány celkové počty dendritických buněk v každém alikvotu (A), počty životných dendritických buněk v každém alikvotu (B) a viabilita dendritických buněk v každém alikvotu (C) vakcíny DCVAC/PCa. Získané hodnoty byly porovnány v párovém t-testu s hladinou významnosti α = 0,05.P = subjekt klinické studie DCVAC/PCa, k = kontrolní DCVAC/PCa, DC = dendritické buňky. 11,5 30 µm a µm. Pro oba určené velikostní parametry byly na analyzátoru Vi-Cell a paralelně s počítáním pomocí Bürkerovy komůrky stanoveny celkové počty dendritických buněk, počty funkčních dendritických buněk a viabilita dendritických buněk u 20 šarží vakcíny DCVAC/PCa (5 kontrolních a 15 od subjektů klinické studie). Hodnoty získané na analyzátoru Vi-Cell byly porovnány s hodnotami z Bürkerovy počítací komůrky za použití párového t-testu (hladina významnosti α = 0,05), aby bylo zjištěno, který velikostní parametr je vhodnější pro rozpoznávání dendritických buněk na analyzátoru Vi-Cell, tj. ten, který neposkytuje významné rozdíly oproti počítání pomocí Bürkerovy komůrky. Ukázalo se, že mezi počty dendritických buněk (celkem a funkčních) na analyzátoru Vi-Cell a v Bürkerově komůrce neexistuje významný rozdíl (obrázek 3). Pro nastavení analyzátoru Vi-Cell na rozpoznávání dendritických buněk byly vhodné oba navržené velikostní parame- IVETA BOTTOVÁ, PH.D. SOTIO, A.S., JANKOVCOVA 1518/2, PRAHA 7 bottova@sotio.com 22 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

13 Automatická hematologická linka Beckman Coulter UniCel DxH Dnešní hematologické laboratoře čelí stále intenzivnějšímu tlaku na zvýšení produktivity, zkrácení doby zpracování vzorku a snížení celkových nákladů na svůj provoz. Systémy řady UniCel DxH jsou určeny především k vyřešení těchto problémů a k transformaci vašeho pracoviště na moderní, spolehlivou a hospodárnou analytickou jednotku. Analyzátory Beckman Coulter DxH vynikají kvalitou výsledků, robustní a odolnou konstrukcí, spolehlivou výkonností a mají revoluční a flexibilní modulární koncepci. Podle požadavků na provoz, výkonnost (tj. rozložení vzorků v čase) a nároků na zálohování a speciální testy (Body Fluid, trombokoncentráty ze separátoru apod.) je možné nakonfigurovat hematologickou linku přesně pro konkrétní laboratoř. Nejběžnější dostupné konfigurace jsou znázorněny na připojených obrázcích. Automatická hematologická linka Beckman Coulter DxH2401 představuje kompletní řešení rutinního i statimového hematologického provozu, včetně automaticky připravených a obarvených panoptických nátěrů pro manuální diferencování. Volitelnou součástí hematologické linky může být i 5barevný průtokový cytometr pro automatickou analýzu vysoce patologických diferenciálů pomocí standardizovaných monoklonálních protilátek. Tato patentovaná technologie CytoDiff nabízí zcela nový pohled na automatizovaný diferenciál leukocytů. Identifikuje celkem 16 dalších buněčných subpopulací leukocytů, včetně počtů T4/8, B, NK lymfocytů, typizace blastů aj. Základní charakteristiku systémů řady Unicel DxH lze shrnout do následujících bodů: Technologie Coulter, zlatý standard hematologických analyzátorů, dodá správný výsledek hned napoprvé. Modulární řazení jednotlivých funkčních bloků do linky podle potřeb a kapacity laboratoře. Linku je možné kdykoliv dále rozšířit a doplnit. Samostatně stojící bloky, včetně podstavců zásobníků na reagencie. Tři identické analyzátory DxH800 spojené v lince nabízí v provozní špičce max. propustnost více než 300 krevních obrazů/hod. Analyzátory se navzájem automaticky inteligentně zálohují, to znamená, že při poruše (opravě, technologické odstávce, měření statimových nebo speciálních vzorků apod.) linka rozdělí práci mezi zbývající funkční analyzátory. Patentovaný magnetický posun kazet se vzorky vylučuje jakékoliv problémy s pohyblivými díly zablokování, zranění obsluhy atd. Oboustranná komunikace s LIS s přímým řízením módu měření KO, KO + Diff, KO + Diff + Reti. Linka automaticky rozděluje práci mezi analyzátory podle zatížení a optimalizuje ji pro nejkratší možný TAT. Flow Cytometric Digital Morphology systém pro diferencování zpracovává 10 x více informací o buněčných subpopulacích než dosud užívaný VCS systém. Jednocestný aspirační systém pro zjednodušení kalibrace. Automatický kazetový podavač s kontinuálním a šetrným (non-stres) mícháním vzorků otáčením dnem vzhůru podle SLP pro libovolné typy uzavřených náběrovek s možností jejich libovolné kombinace v jedné kazetě. Vestavěná čtečka čárového kódu v podavači. Ruční čtečka čárových kódů pro manuální a statimové vzorky. Pětipopulační diferenciál (včetně frakce nezralých granulocytů % i #) měřený několika navzájem nezávislými fyzikálními metodami technologií MultiAngle VCS. Pětipopulační diferenciál (včetně frakce nezralých granulocytů % i #) měřený na nativních leukocytech bez barvení nebo jejich selektivní lýzy technologií VCS. Pětipopulační diferenciál (včetně frakce nezralých granulocytů % i #) s popisem a tříděním blastů, nezralých granulocytů atd. Software s možností vzdálené servisní správy ProService. Přímé měření počtu retikulocytů. Přímé a ekonomicky výhodné měření počtu normoblastů bez nutnosti použití dalších reagencií. Měření tělních tekutin, výpotků aj. Automatická korekce WBC o interferující buňky (NRBC, agreg. PLT, RBC fragment apod.). Volba módu měření oboustrannou komunikací s LIS. Vypínání diferenciálu s úsporou reagencií. Kompletní monitorování reagencií. Přímé načítání reagencií a kontrolních materiálů 2D čárovým kódem. Jednotný systém kontroly kvality pro všechny analyzátory linka se chová jako jeden přístroj pro LIS, QC i kalibraci. Intelligent Quality Monitoring (IQM) pro automatické sledování QC v reálném čase během rutinního provozu. Speciální statimový vstup pro statim vzorky, speciální vzorky (Body Fluid tělní tekutiny, laváže, kostní dřeň atd.) a pediatrické vzorky. Software s možností vzdálené obsluhy. 2-D digitální barcody pro bezpečný přenos většího počtu informací. Jednoduchá výměna reagencií bez nutnosti přerušení provozu. Automatické opakování vzorku podle uživatelsky definovatelných kritérií. Možnost současného založení až 60 kazet, tj. 300 vzorků. Nepřetržitá činnost 24 hod denně bez přestávek na čištění. Jednotlivé analyzátory se podle okamžitého provozního zatížení linky automaticky střídají v ShutDown. Linearita/měřicí rozsah: - WBC 0, / RBC 0,00 8,5 mil - HGB 0,00 25,5 g/dl - PLT 0,00 3/5 mil - NRBC 0,00 600/100 WBC - Retic 0, % Nedílnou součástí hematologické linky Uni- Cel DxH je nátěrový a barvicí automat Beckman Coulter DxH SMS. Tento automat v sobě sdružuje dva navzájem nezávislé funkční bloky nátěrovou jednotku a barvicí jednotku. Zhotovení nátěru (nátěrů) je řízeno inteligentním software linky na základě uživatelsky definovatelných kritérií (typ patologie, počet monocytů, počet trombocytů, agregáty PLT, blasty, posun doleva, diagnóza, oddělení apod.). Jako kritérium pro nátěr je tedy možné použít naprosto libovolná data vzorku, počínaje nejrůznějšími patologiemi, abnormalitami a suspektními hláškami, až po například oddělení nebo jméno lékaře. Jednotlivá kritéria mohou mít rovněž různou prioritu. Můžeme tak jednoduše požadovat nátěr u všech pacientů hematologické ambulance, nebo také třeba jen u těch pacientů, jejichž diferenciál se za poslední měsíc změnil nebo nebyl delší dobu vyšetřen. Další součástí linky může být také digitální mikroskopická stanice HemaCam nebo Cella- Vision pro automatizovanou digitalizaci a vyhodnocování obarvených panoptických nátěrů. Základní charakteristiku Beckman Coulter DxH SMS lze shrnout do následujících bodů: Automatický nátěr na standardní sklíčka. Příprava nátěru standardní metodou roztěru hranou sklíčka (wedge-pull) v souladu s WHO CLSI H20. Nastavení akcelerace, rychlosti a úhlu roztíracího sklíčka v závislosti na viskozitě a přilnavosti vzorku. Pro zhotovení nátěru nejsou potřebné výsledky měření krevního obrazu. Viskozita a přilnavost vzorku je měřena přímo v nátěrové jednotce při aspiraci krve pro nátěr patentované Hemasphere Technology. Možnost použití libovolně uživatelsky nastavitelných barvicích protokolů. Automatické obarvení nátěrů standardními postupy a barvivy (Giemsa/Grunwald). Možnost barvení manuálně připravených nátěrů, kostních dření aj. Možnost uživatelského naprogramování více druhů barvení (Wright apod.). Aspirace pouze 90 µl. Možnost zhotovení až 4 nátěrů z jedné aspirace vzorku. Možnost zhotovení až 12 nátěrů z jednoho vzorku (3 aspirace). Aspirace vzorku z uzavřených náběrovek v kazetách a ručně z libovolných (i otevřených a atypických) náběrovek. Samostatný modul kompatibilní také se stávajícím vybavením každé laboratoře. Uživatelsky nastavitelné parametry nátěru (tvar, délka, tloušťka apod.). Potisk každého sklíčka identifikačním štít- kem s čarovým kódem a uživatelsky nastavitelným popisem. Režimy provozu: nátěr a barvení, jenom nátěr, jenom barvení. Režim statimových vzorků (automatické předřazení vzorků pro nátěr a okamžité barvení). Režim statimového barvení. Rychlost 140 nátěrů/hod. Oboustranná komunikace s LIS. Grafické ovládání a kontrola systému zobrazení stavu jednotlivých vzorků v reálném čase. Automatická hematologická linka Beckman Coulter UniCel DxH v jakékoliv konfiguraci je tou správnou volbou pro každou laboratoř, která hledá jistotu kvalitních výsledků, jednoduchou bezpečnou obsluhu a výhodnou ekonomiku provozu. Tradice nás zavazuje, vždyť Coultery vám věrně slouží již téměř 60 let. PETR BOUDAL pboudal@beckman.com 24 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

14 Vitamin D novinka v portfoliu V poslední době se stále mluví o nedostatku vitaminu D napříč celou populací. Jedním z hlavních důvodů je obava před slunečním zářením jako jednou z příčin rakoviny kůže (o její nejagresivnější formě, maligním melanomu, si v této souvislosti můžete přečíst v jednom z následujících článků). V letošním roce proto naše společnost přichází na trh se soupravou na stanovení Vitaminu D. Ačkoliv se toto stanovení již nějakou dobu objevuje v nabídce řady konkurenčních firem, souprava Beckman Coulter má několik zajímavých a unikátních vlastností: v literatuře doporučovaná standardizace na NIST-Ghent ID-LSMS/MS Reference Method Procedure (RMP) ekvimolární stanovení 25(OH) vitaminu D2 a 25(OH) vitaminu D3 unikátní tmavý reagenční pack chránící protilátky před světlem široký dynamický rozsah 2, ng/ml (5,0 525 nmol/l) Pro další informace se, prosím, obraťte na níže uvedené kontakty. PN Název Podklady pro objednání: B24838 Access 25(OH) Vitamin D Total for Access 2, 2x50 tests Access 2 B24839 Access 25(OH) Vitamin D Total for Access 2 calibrators Access 2 A98856 Access 25(OH) Vitamin D Total for DxI, 2x50 tests DxI A98857 Access 25(OH) Vitamin D Total for DxI, 2x50 tests calibrators DxI TEREZA TIETZE ttietze@beckman.com IVANA MIČÍKOVÁ imicikova@beckman.com hmotnostní spektrometrií LC-MS/MS. Velkou výhodou stanovení 25-OH-vitaminu D je jeho vysoká stabilita v séru a plazmě. Po dobu dvou dnů může být krev skladována při teplotě 24 o C a ani při opakovaném zamražení a rozmražení séra nedochází k degradaci vitaminu D. Při skladování při teplotě -20 o C nedochází ke znehodnocení materiálu ani po 10 letech. Základním a velice palčivým problémem je srovnatelnost výsledků mezi jednotlivými metodami. Tento fakt snad může být překonán pomocí již existujícího referenčního materiálu s označením SRM 972 od amerického National Institute of Standards and Technology (NIST). Výsledky stanovení 25-OH-vitaminu D jsou v soustavě SI uváděny v nmol/l. V literatuře se setkáváme rovněž s hmotnostními jednotkami µg/l nebo ng/ml. Převodní koeficient pro 25-OH-vitamin D je nmol/l x 0,40 = µg/l; nebo naopak výsledek v µg/l x 2,5 = nmol/l. Epidemiologická data Dvě skutečnosti měly velký vliv na rozvoj poznání a především na pochopení mimořádného významu vitaminu D pro organizmus. Jednak to bylo zavedení nových metod a tím provádění rozsáhlých populačních studií a dále pak skutečnost, že vitamin D souvisí se vznikem více než 500 genů. Svým účinkem přes jaderný receptor, který se nachází ve většině tkání těla, tak má nesporně významné systémové účinky. V minulosti platila rovnice: nedostatek vitaminu D = křivice. Jestli chceme zabránit jejímu vzniku, musíme vitamin D podávat v kojeneckém a dětském věku, tedy v době, kdy se vyvíjí kosterní soustava. O úloze vitaminu D v dospělosti se uvažovalo minimálně. Mnohem později se pak začala hledat souvislost mezi vitaminem D a poruchami kostního metabolizmu. Souběžně probíhaly studie, jež hledaly souvislost mezi slunečním zářením a epidemiologií civilizačních chorob, především nádorových a kardiovaskulárních. V tomto směru jsou známy především práce dvou významných amerických autorů Granta a Garlanda, kteří např. srovnávali výskyt nádorových onemocnění u aljašských a mexických indiánů. Byl prokázán vztah vitaminu D ke kardiovaskulárním chorobám, neurologickým onemocněním a především k nádorům. Této problematice je věnována samostatná část článku. Koncem loňského roku byla publikována velmi zajímavá epidemiologická data ze Švýcarska. Pozoruhodná jsou zejména proto, že výchozí parametry studované populace by se mohly velmi přibližovat populaci naší. Z informací zmiňovaných v úvodu totiž vyplývá, že status 25-OH-vitaminu D mezi jedinci výrazně ovlivňuje zeměpisná šířka, míra slunečního svitu, etnické složení populace, BMI, stravovací návyky, zastoupení mořských ryb v jídelníčku, pigmentace kůže, znečištění ovzduší apod. Cílem této studie bylo posoudit status zásobení vitaminem D u osob dospělého obyvatelstva Švýcarska a porovnat ho s výsledky získanými v předchozích sledováních z let a Současně autoři vyhodnotili subjekty podle jednotlivých oblastí (německy, francouzsky a italsky mluvící), ročního období, pohlaví, BMI, stravovacích návyků, suplementace, pohybové aktivity, počtu hodin slunečního svitu, kouření a dalších parametrů. Účinnost slunečního záření je v naší zeměpisné šířce adekvátní pouze asi od května do září. Z výsledků vyplývá, že průměrné adjustované hladiny činí v průběhu roku u dospělé populace Švýcarska 57,7 nmol/l. Rozdíl mezi hladinami v letních a zimních měsících byl 72,4 ku 42,9 nmo/l. Současně je alarmující frekvence insuficience a deficitu v průběhu jednotlivých období roku. Statisticky významně nižší hladiny 25-OH-vitaminu D se vyskytly ve skupině s vyšším BMI, u pacientů bez suplementace, bez hormonální antikoncepce a bez pravidelné pohybové aktivity. V porovnání s výsledky z minulých sledování se průměrné hladiny nelišily. Významnou konfrontací názorů na problém vitamin D byla také konference s názvem Witamina D Minimum, maximum, optimum, která se konala na konci roku 2012 ve Varšavě. Zástupci jednotlivých evropských zemí zde prezentovali epidemiologická data o nedostatku vitaminu D v Evropě. Hlavním závěrem sjezdu byla výzva k zajištění dostatečných podkladů pro návrh plošného rozšíření a optimalizaci suplementace vitaminu D v celé populaci, která bude nepochybně vyžadovat monitoraci hladin vitaminu D v krvi. Vitamin D jako rizikový faktor nádorových onemocnění Vitamin D má řadu fyziologických vlivů, které se mohou uplatnit při nádorovém procesu. Je to především jeho účinek proti angiogenezi, podpora buněčné apoptózy a podpora klasické regulované diferenciace buněk. Není proto překvapením, že se při populačních studiích srovnávajících skupiny nemocných s nádorovým onemocněním se skupinou zdravé populace nacházejí rozdíly. Tyto odlišnosti se týkají především vysoké incidence snížené hladiny vitaminu D v krvi, což bylo prokázáno prakticky u většiny nádorů. Prvním typem, u něhož byla doložena výrazná souvislost, byl kolorektální karcinom a dále pak karcinom prsu. Nejčastěji se vyskytující nízká hladina vitaminu D byla prokázána u nádoru plic. Vztahu mezi hladinou vitaminu D a vznikem a progresí tumoru je věnována více než patnáctiletá pozornost. Existují důkazy o tom, že substituce vitaminem D snižuje riziko výskytu nádorového onemocnění. Studie jsou však zatím většinou krátkodobé a uskutečněné na malých souborech pacientů. Rovněž se výrazně liší v množství podávaného vitaminu D. Většina autorů Význam stanovení vitaminu D v rutinní praxi Úvod Vitaminu D je v posledních pěti letech věnována mimořádná pozornost. Nepochybně vysoká frekvence nedostatku vitaminu D v běžné populaci a jeho stále stoupající význam v prevenci celé řady civilizačních onemocnění je výzvou pro laboratorní pracovníky, aby se touto problematikou aktivně zabývali. V následujícím článku jsme si položili otázku, zda má pozornost věnovaná vitaminu D racionální podklad, a pokud ano, tak kdy máme v rutinní praxi stanovení vitaminu D provádět. Laboratoře by se měly rovněž snažit aktivně spolupracovat s klinickými pracovišti při epidemiologickém monitorování, především pak při monitoraci pro volbu optimální suplementace vitaminem D. Charakteristika vitaminu D Vitamin D je chemickou strukturou sekosteroid a funkcí hormon. Člověk si tvoří vitamin D přeměnou 7-dehydrocholesterolu (7-DHC) v kůži, na kterou působí sluneční záření. Množství touto cestou vzniklého vitaminu D3 (kalciferolu) závisí na řadě proměnných. Jsou to jednak parametry charakterizující efekt slunečního záření: zeměpisná šířka a s tím úzce související úhel dopadu slunečního záření, roční období, denní doba a délka expozice slunečnímu záření. Dále jsou to parametry charakterizující vnímavost lidského individua ke slunečnímu záření: obsah 7-DHC v kůži, pigmentace kůže, věk, chránění pokožky před vlivem slunečního záření (opalovací krémy, krytí povrchu těla oblečením). Druhým nejčastějším zdrojem vitaminu D u člověka je potrava. V tomto případě se však jedná o vitamin D2 (ergosterol), který je pouze rostlinného původu, včetně vitaminu D obsaženého v rybách. U ryb jde sice o určitou produkci vitaminu v jejich kůži, avšak většina vitaminu D se dostává do rybího těla z fytoplanktonu. Metabolizmus vitaminu D2 a D3 je v organizmu obdobný, proto, hovoříme-li o "vitaminu D" bez bližší specifikace, myslíme většinou obě formy. Obě podoby vitaminu D nejsou biologicky aktivní. Aktivní forma vzniká hydroxylací v poloze 25 v játrech (25-OH-vitamin D). Následně se v ledvinách a celé řadě dalších cílových tkání vytváří působením alfa hydroxylázy 1,25-dihydroxyvitamin D (kalcitriol), který je nositelem biologické funkce vitaminu D. V krvi je transportován vitamin D svým vazebným proteinem (vitamin D binding protein, DBP), malá část pak albuminem a lipoproteiny. DBP je tvořen v játrech a je příbuzný albuminu a alfa-fetoproteinu. Biologický poločas vitaminu D je 2,5 3 dny. Jeho denní produkce činí okolo 10 mg/kg. Jednotlivé metabolity vitaminu D se výrazně liší svojí afinitou k DBP. Místem účinku biologicky aktivní formy vitaminu D (kalcitriolu) je jádro, kde se kalcitriol váže na specifický jaderný receptor (vitamin D receptor, VDR). Stanovování vitaminu D Největší výpovědní hodnotu o zásobování organizmu má 25-OH-vitamin D. Výhodou je, že zohledňuje jak endogenní vitamin D vytvořený v kůži, tak i jeho exogenní formu získanou potravou. Poprvé byl stanoven 25-OH-vitamin D v 70. letech minulého století. Na konci 70. let se objevily první metody založené na chromatografických postupech. V roce 1985 byla vyvinuta první radioimunoanalytická (RIA) metoda zahrnující specifickou protilátku. Jako první byla uznána FDA pro klinickou diagnostiku nutriční deficience vitaminu D. Postupně byly vyvíjeny metody s detekční koncovkou enzymovou (EIA) nebo chemiluminiscenční (CLIA). Pokroky v tandemové hmotnostní spektrometrii umožnily v roce 2004 zavedení rutinní metodiky stanovení založené na principu kapalinové chromatografie s detekcí tandemovou 26 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

15 se shoduje na tom, že dávka vitaminu D by se měla pohybovat mezi IU denně. Často diskutovanou otázkou je vitamin D a melanom. Tato diskuze je pochopitelná. Na jedné straně radíme chránit se před slunečním zářením, na straně druhé doporučujeme preventivně zvyšovat hladinu vitaminu D v těle, jehož nejpřirozenějším zdrojem je právě sluneční záření. I zde je jako vždy nutné nalézt optimální střední cestu. Jediným karcinomem, kde se frekvence incidence mění v závislosti na hladinách vitaminu D, jsou nádory prostaty obdobně jako u jiných typů karcinomů zvyšuje nízká hladina vitaminu D výrazně frekvenci nádorového onemocnění, avšak hodnoty nad 120 nmol/l opět paradoxně, stejně jako u nízkých hladin, zvyšují výskyt karcinomu. Často se hovoří o tzv. U efektu. Pravděpodobně to souvisí se specifickou situací, kdy jsou v nádorové tkáni přítomny VDR receptory. Současně se také ukazuje, že deficit vitaminu D může negativně ovlivňovat efekt účinnosti chemoterapie, např. u nádorů plic. Bylo prokázáno, že úpravou nízké hladiny vitaminu D došlo k nárůstu efektu chemoterapie až na trojnásobek. Současný stav saturace vitaminem D v České republice V České republice existuje pouze omezený počet prací, které by ukazovaly populační hodnoty. Přesto je z tohoto omezeného počtu publikací zřejmé, že frekvence nízkých sérových hladin je v obyvatelstvu značně vysoká, a to mezi % populace. Otázku adekvátní suplementace je však potřeba diskutovat nejen teoreticky, ale hlavně na podkladě detailní plošné saturace vitaminem D. Zde je jak pro laboratorní, tak klinické pracovníky otevřené široké pole působnosti. Referenční hodnoty a interpretace výsledků V rutinní praxi je důležité vybrat vhodné referenční rozmezí. Obvykle se určuje naměřením hodnot ve zdravé populaci a vypočtením 95% intervalu u gaussovského rozložení. Je ale jasné, že tuto metodiku u analytu, jakým je vitamin D, nelze vůbec použít. Jeho hladiny kolísají v závislosti na ročním období. Již ve studiích, kde byla kromě běžné populace změřena také hladina vitaminu D u zaměstnanců pobřežní hlídky (hladiny 2,5krát vyšší), se ukázalo, že dnešní zdraví jedinci trpí ve skutečnosti nedostatkem vitaminu D, a není proto vhodné ji považovat paušálně za referenční. Vlivem našeho životního stylu jsou celkově v populaci hladiny vitaminu D neadekvátní fyziologickým požadavkům cílových tkání. Na Status VD nmol/l ng/ml základě stále probíhajících studií je nedostatek vitaminu D potvrzován jako rizikový faktor pro mnohá onemocnění. Je tedy nutné stanovovat optimální hladiny vitaminu D spíše na základě těchto dat, nežli prostřednictvím populačních studií. Podobně je tomu např. u hladiny cholesterolu, která je rovněž určena arbitrárně na základě důkazů o nejoptimálnější hladině. Vztah hladin vitaminu D k poškození organizmu či k chorobným stavům uvádí tabulka 1. Vhodnost suplementace Obecně mezi uznávané rizikové skupiny, jež je potřeba monitorovat a přednostně suplementovat, patří: novorozenci, děti, těhotné ženy, staré osoby, obézní osoby, osoby v dlouhodobé ústavní péči, osoby pracující v nočních směnách. Co se týče nemocných, v minulosti to byli především pacienti s osteoporózou a malabsorbčním syndromem, v současné době se doporučuje suplementace vitaminem D u autoimunitních onemocnění, při opakovaných zánětlivých onemocněních a u diabetu. Další skupinu představují nemocní s kardiovaskulárními a neurologickými poruchami. Vitamin D je dnes v USA také doporučován jako součást adjuvantní, ale i ostatní onkologické léčby. Literatura 1. Chiellini G., DeLuca H.F. The importance of stereochemistry on the actions of vitamin D. Curr Top Med Chem. 2011;11(7): Webb A.R., Kline L., Holick M.F. Influence of season and latitude on the cutaneous synthesis of vitamin D3: Exposure to winter sunlight in boston and edmonton will not promote vitamin D3 synthesis in human skin. J Clin Endocrinol Metab Aug;67(2): Armas L.A., Dowell S., Akhter M., Duthuluru S., Huerter C, Hollis B.W. et al. Ultraviolet-B radiation increases serum 25-hydroxyvitamin D levels: The effect of UVB dose and skin color. J Am Acad Dermatol Oct;57(4): Chen T.C., Chimeh F., Lu Z., Mathieu J., Person K.S., Zhang A. et al. Factors that influence the cutaneous synthesis and dietary sources of vitamin D. Arch Biochem Biophys Apr 15;460(2): Webb A.R., DeCosta B.R., Holick M.F.. Sunlight regulates the cutaneous production of vitamin D3 by causing its photodegradation. J Clin Endocrinol Metab May;68(5): Bikle D.D. Vitamin D: An ancient hormone. Exp Dermatol Jan;20(1): Christakos S., Ajibade D.V., Dhawan P., Riziko rozvoje křivice Svalová funkce Fechner A.J., Mady L.J. Vitamin D: Metabolism. Rheum Dis Clin North Am Feb;38(1):1,11, vii. 8. Spustova V., Dzurik R. Vitamin D: Synthesis, metabolism, regulation, and an assessment of its deficiency in patients with chronic renal disease. Vnitr Lek Jul;50(7): Kawakami M., Blum C.B., Ramakrishnan R., Dell R.B., Goodman D.S. Turnover of the plasma binding protein for vitamin D and its metabolites in normal human subjects. J Clin Endocrinol Metab Dec;53(6): Adams J.S., Hewison M. Update in vitamin D. J Clin Endocrinol Metab Feb;95(2): Wallace A.M., Gibson S., de la Hunty A., Lamberg-Allardt C., Ashwell M. Measurement of 25-hydroxyvitamin D in the clinical laboratory: Current procedures, performance characteristics and limitations. Steroids Jul;75(7): Lissner D., Mason R.S., Posen S. Stability of vitamin D metabolites in human blood serum and plasma. Clin Chem May;27(5): Cianferotti L., Marcocci C. Subclinical vitamin D deficiency. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab Aug;26(4): Taylor A.V., Wise P.H. Vitamin D replacement in asians with diabetes may increase insulin resistance. Postgrad Med J Jun;74(872): Avenell A., Cook J.A., MacLennan G.S., McPherson G.C., RECORD trial group. Vitamin D supplementation and type 2 diabetes: A substudy of a randomised placebo-controlled trial in older people (RECORD trial, ISRCTN ). Age Ageing Sep;38(5): Guessous I., Dudler V., Glatz N., Theler J.M., Zoller O., Paccaud F. et al. Vitamin D levels and associated factors: A population-based study in switzerland. Swiss Med Wkly Nov 26;142:0. PROF. MUDR. ONDŘEJ TOPOLČAN, CSC. topolcan@fnplzen.cz MUDR. RADKA FUCHSOVÁ fuchsova@fnplzen.cz PHARMDR. RADEK KUČERA, PH.D. rkucera@beckman.com CENTRÁLNÍ RADIOIZOTOPOVÁ LABORATOŘ, FN PLZEŇ A LF V PLZNI, UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE DR. E. BENEŠE 13, PLZEŇ Účinek na Ca-P metabolismus Účinek v periferních tkáních Riziko vzniku nádorů těžký deficit pod 25 pod deficience insuficience dostatek optimální hladina toxicita nad 400 nad Tabulka 1: Hodnocení hladin vitaminu D Maligní melanom Maligní melanom je zhoubný nádor vycházející z melanocytů. Postihuje nejčastěji kůži, ale může se objevit i na sliznicích či v oku. Je charakterizován schopností časného metastazování krevní nebo lymfatickou cestou. Vzniká na zdravé kůži (de novo) či v preexistujícím pigmentovém projevu. Epidemiologie Incidence tohoto onemocnění celosvětově výrazně roste. Někteří autoři dokonce hovoří o epidemii maligního melanomu. Postihuje stále mladší jedince. Průměrný věk v době stanovení diagnózy činí 56 let. V České republice je hlášeno zhruba 14 nových případů na obyvatel ročně. Etiologie Na vzniku maligního melanomu se podílí celá řada faktorů. Jedná se o genetickou dispozici, fototyp jedince či působení zevních faktorů. Zatím nebyl objeven žádný specifický gen. Rizikovou skupinou jsou jedinci s fototypem 1 a 2. Jediným prokázaným rizikovým činitelem zevního prostředí je působení UV záření a to hlavně intermitentní působení slunečního záření, zejména spálení kůže v dětství a dospívání. Typy maligního melanomu Melanom roste ve dvou fázích horizontální a vertikální. Rozlišujeme 4 základní typy maligního melanomu: 1. Superficiálně se šířící maligní melanom představuje 70 % všech melanomů 2. Nodulární melanom 3. Lentigo maligna melanom 4. Akrolentiginózní melanom vyskytuje se na ploskách, dlaních či pod nehty Diagnóza Základem stanovení diagnózy maligního melanomu je anamnestické a klinické vyšetření. Primárním pravidlem je pomůcka ABCDE: A (asymmetry; přítomnost asymetrie), B (border; nepravidelné okraje), C (color; nehomogenní barva), D (diameter; průměr > 5 mm), E (evolving; vývoj). Suspektní léze je vyšetřena dermatoskopicky. Definitivní diagnóza je stanovena až na základě histologického vyšetření. Prognóza Závisí na stádiu nemoci. Čím dříve se na onemocnění přijde, tím lepší je prognóza. Vyjadřuje se většinou % nemocných, kteří přežijí 5 let od stanovení primárního nádoru. Pro stádium 1 je to 99 %, naproti tomu u stádia 4 jde o pouhých 10 %. Existuje celá řada prognostických faktorů. Nejčastěji se používají následující: tloušťka nádoru dle Breslowa udávaná v milimetrech, postižení sentinelové lymfatické uzliny, ulcerace, regrese, mitotický index, tumor infiltrující lymfocyty. Léčba Chirurgická léčba představuje základní léčebnou modalitu. Časná diagnóza a časné chirurgické odstranění nádoru jsou jedinou možnou kurativní metodou. Optimální chirurgické okraje souvisí s tloušťkou tumoru. Pohybují se od 0,5 do 2 cm. Součástí chirurgické léčby je většinou také odstranění sentinelové lymfatické uzliny a její histologické vyšetření. Na jeho výsledku závisí volby adjuvantní terapie. Při pozitivitě sentinelové lymfatické uzliny se doplňuje disekce spádové lymfatické oblasti. Dalšími léčebnými možnostmi jsou radioterapie, chemoterapie či imunoterapie. Maligní melanom je považován za nádor radiorezistentní. Tato modalita je volena jako paliativní léčba, převážně u kostních metastáz. Chemoterapie také představuje spíše paliativní adjuvantní léčbu u metastazujícího melanomu. Imunoterapie (interferon alfa) je v současnosti nejvyužívanější adjuvantní léčbou příznivě ovlivňující délku bezpříznakového období, zatím však podle dosavadních studií bez významného ovlivnění celkového přežití nemocných. Nové možnosti představuje tzv. biologická léčba ovlivňující přímo pomocí protilátek metabolické buněčné dráhy: ipilimumab (anti-ctla-4 protilátka) a vemurafenib (inhibitor B-raf kinázy). Oba preparáty dosáhly velmi povzbudivých výsledků v rámci klinických studií. Všichni pacienti podléhají posléze dispenzární péči v dermatologických ambulancích. Závěr Maligní melanom je nejzhoubnějším kožním nádorem. Pokročilý maligní melanom stále patří k diagnózám s velmi vážnou prognózou a omezenými léčebnými možnostmi. Základem je včasná diagnóza, včasné chirurgické odstranění nádoru a dispenzace nemocného. MUDR. INKA TŘEŠKOVÁ, PH.D. ODDĚLENÍ PLASTICKÉ CHIRURGIE, FN PLZEŇ ALEJ SVOBODY 60, PLZEŇ treskovai@fnplzen.cz Spoluautor: Prof. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc., Laboratoř imunochemické diagnostiky, FN Plzeň 28 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

16 Nádory plic a stanovení MonoTotal IRMA/ELISA Karcinom plic patří celosvětově mezi nejvíce rozšířený typ rakoviny. Dle WHO statistik zabije více lidí než rakovina střev, prsu a prostaty dohromady. V roce 2008 bylo globálně diagnostikováno 1,61 miliónů nových případů tohoto onemocnění. Místy nejvyššího výskytu je Evropa spolu se Severní Amerikou, naopak nejmenší obavy z této nemoci může mít populace Afriky 1 (viz obrázek č. 1). Mezi 27 zeměmi Evropské unie byla nalezena nejvyšší incidence u mužů v Maďarsku (115 případů na obyvatel), v případě žen pak v Dánsku (51 případů na obyvatel). Naopak nejnižší výskyt u mužů najdeme ve Švédsku (27 případů na obyvatel) a u žen na Kypru (7 případů na obyvatel). Bohužel rakovina plic je také onemocnění s vysokou mortalitou. Je odhadováno, že celosvětově je odpovědná za téměř 1/5 (18 %) všech úmrtí na rakovinu. V roce 2008 to bylo celkem 1,38 mil. úmrtí. Díky poměrně pozdní diagnostice je pětileté přežití na nízké úrovni. Pouze 7,8 % mužů a 9,3 % žen přežije pět a více let od diagnózy onemocnění. S lehkou nadsázkou se dá říci, že pravděpodobnost, zda onemocníme touto chorobou, máme z velké části ve vlastních rukou. Náš životní styl je tím hlavním určujícím faktorem. Nejrizikovějším činitelem je samozřejmě kouření. Dle statistik je 85 % karcinomů plic nalezeno právě u kuřáků. Bohužel i pasivní kouření není zanedbatelné. Dalšími rizikovými faktory jsou přítomnost radonu, azbestu a celkové znečištění ovzduší. Samozřejmě rovněž genetické předpoklady zde hrají určitou roli. 30 Nádory plic lze rozdělit na dvě velké skupiny: 1. nemalobuněčný (NSCLC; non-small cell lung cancer) 2. malobuněčný (SCLC; small cell lung cancer) Zhruba % nádorů patří do skupiny NSCLC. Ty lze histologicky rozdělit na tři skupiny: karcinom squamózních buněk (SCC, squamous cell carcinoma), adenokarcinom a velkobuněčný typ karcinomu. SCLC tvoří tedy zbývajících %. Oba hlavní typy NSCLC a SCLC se od sebe významně liší klinicky i histologicky. V důsledku toho tedy existují jiné přístupy k jejich léčbě. SCLC nádory rostou mnohem rychleji než NSCLC a téměř vždy propuknou v důsledku kouření. Hlavním způsobem léčení SCLC je chemoterapie, která může být eventuálně kombinována s ozařováním. U NSCLC, zejména ve stádiích I a II, představuje hlavní volbu operační zákrok, jemuž může předcházet chemoterapie. Dalšími možnostmi jsou chemoterapie samostatně, nebo po zákroku, a ozařování. Včasná a dobrá diferenciální diagnostika je tedy velmi důležitá pro určení léčebného postupu. V případě karcinomu plic se pro primární a diferenciální diagnostiku používají zejména zobrazovací techniky a histologická vyšetření. Sledování hladiny tumorových markerů je pak využíváno k následné monitoraci zdravotního stavu pacientů, zejména k hodnocení účinku léčby a časné detekci relapsu onemocnění. Mezi nejčastěji používané markery patří cytokeratin 19 fragment, CEA, TPA, SCC v případě NSCLC a NSE a ProGRP pro SCLC. Další možnou volbou pro sledování osob s NSCLC je parametr MonoTotal od švédské firmy IDL. Souprava MonoTotal je založena na kvantitativním stanovení fragmentů cytokeratinů 8, 18 a 19. Je vyráběna ve formátu IRMA a nyní nově i ve formátu ELISA. Cytokeratiny jsou proteiny tvořící intermediální filamenta, jež jsou hlavní součástí cytoskeletu buněk. Zodpovídají se za mechanickou pevnost buněk a hrají rovněž velmi důležitou roli v jejich dělení, pohybu a signalizaci. Cytokeratiny se nacházejí zejména v epiteliálních buňkách. Je jich známo více než 20 druhů a jejich molekulová hmotnost se pohybuje mezi kda. Dle izoelektrického bodu jsou klasifikovány do dvou hlavních skupin: na kyselé (typ I) cytokeratiny 9 20 a na bazické (typ II) cytokeratiny 1 8. Exprese jednotlivých cytokeratinů je závislá na typu, stupni diferenciace a rychlosti růstu dané tkáně. Pro jednoduchý typ epitelu jsou charakteristické cytokeratiny 8, 18 a 19. Ty jsou také nejvíce hojné v případě malignit. Protože jsou cytokeratiny za fyziologických podmínek nerozpustné v séru a tkáňových tekutinách, stanovujeme jejich fragmenty, které jsou solubilní ve vodném prostředí. Poločas rozpadu uvedených fragmentů je hodin. Cytokeratiny jsou tedy důležitým markerem v případě karcinomu epitelárních buněk. Protože rychle reagují na změny rychlosti růstu tumorů, mohou poskytnout časnou prognostickou informaci. Na základě jejich hladin lze hodnotit odpověď organizmu na zvolený typ terapie a mohou přispět k včasné detekci progrese onemocnění. Nicméně, podobně jako další markery, nejsou orgánově specifické. Souprava MonoTotal může být tedy dobrým pomocníkem při sledování pacientů s NSCLC. Hlavní charakteristiky a benefity parametru MonoTotal jsou shnuty níže: stanovuje hladinu cytokeratinů 8, 18 a 19 v séru je indikátorem aktivity tumorových buněk je dostupný v IRMA a ELISA formátu u NSCLC má velmi dobrou diagnostickou sensitivitu, která se pohybuje v závislosti na histologickém typu mezi % (při 95% specificitě) může poskytnout informaci o úspěšnosti léčby během follow up může včas odhalit relaps Lung Cancer (C33-C34):2008 onemocnění Estim ates s NSCLC, kteří následně podstoupili radikální operační zákrok. Sérové koncentrace MonoTotalu u těchto osob byly srovnány s 20 pacienty s benigním onemocněním plic. Předoperační hodnoty MonoTotalu byly významně vyšší u jedinců s NSCLC než u srovnávací skupiny. Po provedení operace byli pacienti dále sledování. Mediány koncentrací MonoTotalu byly opět jasně vyšší u těch s onemocněním v progresi (medián 141,8 U/L, rozsah 39, U/L) nežli u pacientů v remisi (medián 63,7 U/L, rozsah ,3 U/L). Závěrem lze tedy konstatovat, že souprava MonoTotal je dobrým sérovým markerem, který může být ve spojení s dalšími klinickými a diagnostickými nástroji použit pro monitorování World Age-Standardised Incidence Rates per 100,000 Population,W pacientů orld s Regions NCLC. Nyní ještě několik údajů ze studie 2, do níž bylo World Region Male Fem ale zařazeno 93 nově diagnostikovaných pacientů Naše společnost je dodavatelem RIA a ELISA Northern Am erica Centraland Eastern Europe Eastern Asia W estern Europe Northern Europe Southern Europe Australia/New TPS Zealand IRMA World TPS ELISA South-Eastern Asia CaribbeanMonoTotal IRMA Southern MonoTotal Africa ELISA W estern Asia South Am erica TPAcyk IRMA CentralAmTPAcyk erica ELISA Northern Africa South-CentralAsia UBC IRMA Eastern Africa UBC ELISA W estern Africa 3.1 UBC Rapid (point of care test) 1.2 Middle Africa souprav vyráběných švédskou firmou IDL Biotech AB. Veškeré její produkty, jež na trzích v České republice a na Slovensku nabízíme, naleznete v tabulce č. 1. Literatura: Prazakova M., et al. The role of MonoTotal in the primary diagnosis, prognosis and followup of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). Anticancer rwes.2011;31: HANA KRÁTKÁ hkratka@beckman.com Kat. číslo Název kitu Charakteristika Aplikace cytokeratin 18 fragment cytokeratin 8, 18, 19 fragment cytokeratin 8, 18 fragment cytokeratin 8, 18 fragment, stanovení v moči karcinomy prsu, prostaty, vaječníků, gastrointestinální trakt nemalobuněčný karcinom plic epiteliální karcinomy obecně karcinom močového měchýře Tabulka č. 1: Produkty firmy IDL Biotech Lung AB Cancer (C33-C34): 2008 Estimates World Age-Standardised Incidence Rates per 100,000 Population, World Regions World Region Male Female Northern America Central and Eastern Europe Eastern Asia Western Europe Northern Europe Southern Europe Australia/New Zealand World South-Eastern Asia Caribbean Southern Africa Western Asia South America Central America Northern Africa South-Central Asia Eastern Africa Western Africa Middle Africa Please include the citation provided in ourfrequently Asked Q uestions when reproducing this chart: ow Prepared by Cancer Research Obrázek UK č. 1: Celosvětová incidence rakoviny plic, odhady Originaldata sources: Ferlay J,Shin HR,Bray F,Form an D,Mathers C,Parkin DM GLOBOCAN 2008 v1.2,cancerincidence and Mortality Worldw ide:iarc CancerBase No.10 [Internet].Lyon,France:InternationalAgency forresearch on Cancer,2010.Available from : May Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

17 Rozšiřujeme menu testů řady AU souprava TP Latex pro screening syfilis V České republice patří syfilis mezi nemoci, které podléhají povinnému hlášení do Registru pohlavních nemocí. Ze zdravotnické statistiky, vydávanou Ústavem zdravotnických informací, a statistiky ČR vyplývá, že za rok 2012 bylo evidováno 696 případů tohoto onemocnění. Potěšujícím faktem je, že výskyt má mírně klesající charakter. Oproti roku 2010 došlo k 32% poklesu po přepočtu na obyvatele. Náhodný záchyt nemoci představoval 62 % z celkového počtu, avšak u žen přesáhl podíl náhodně zjištěných případů 81 % oproti 52 % u mužů.(1) Jinými slovy to znamená, že asi 431 případů by zůstalo neodhaleno, kdyby neexistoval program cíleného vyhledávání. Indikace k vyšetření na syfilis tedy nestojí pouze na klinickém podezření, ale je i součástí obligátních vyšetřovacích schémat (zákon č. 258/00 Sb., vyhláška č. 195/05 Sb.) u dárců krve, v rámci prenatální péče, u základního screeningu novorozenců, při předoperační přípravě a během hospitalizace. (2) Rychlou diagnostickou metodu in-vitro pro detekci protilátek proti bakterii Treponema pallidum (TP) v séru a plazmě nyní mají ve svém portfoliu i analyzátory řady AU, konkrétně AU680/AU480/AU5800. Ze starších typů je souprava nabízena pouze pro AU2700. Souprava vznikla ve spolupráci s firmou Sentinel Diagnostics, Beckman Coulter figuruje jako distributor. Souprava Syphilis TP Latex patří mezi nepřímé diagnostické metody, do kategorie treponemových screeningových testů. Metoda je založena na principu aglutinace polystyren- -latexových částic nesoucích specifické antigeny Treponema pallidum (Nicholsův kmen). Spouštěcím podnětem aglutinace je navázání protilátky proti TP z pacientského vzorku. Jako vzorek může být použito sérum nebo heparizovaná plazma (případně EDTA). Rozhodovací kritérium pro pozitivní vzorek je 10 U. Souprava vykazuje velmi dobré parametry související se stabilitou reagencie na palubě a stabilitou kalibrace. Citlivost a specificita jsou rovněž výborné. Klíčové vlastnosti soupravy jsou přehledně shrnuty v přiložených tabulkách. Literatura 1. Pohlavní nemoci ÚZIS. Praha: Ústav zdravotnických informací a statistiky ČR, Woznicová, Vladana. Laboratorní diagnostika syfilis. Mikrobiologie online. [Online] pr01.html. VRATISLAV NOVÁK vnovak@beckman.com Projekt riešenia a realizácie technologického vybavenia klinických laboratórií Fakultnej nemocnice s poliklinikou F. D. Roosevelta, Banská Bystrica Vedenie FNsP F. D. Roosevelta v Banskej Bystrici v minulom roku oslovilo hlavných dodávatelóv IVD s požiadavkou na vypracovanie návrhu riešenia integrácie a konsolidácie centrálneho laboratórneho komplexu (ďalej CLK). Toto zadanie bolo pre nás výzvou a zároveň možnosťou stať sa súčasťou zmien a podiel ať sa na optimalizácii laboratórnych procesov. Návrh mal primárne riešiť zvýšenie efektivity daného komplexu, zníženie personálnych nákladov, zníženie nákladov na reagencie, zvýšenie výkonu, skrátenie celkového TAT pre jednotlivé oddelenia, zjednodušenie toku vzorky a konsolidáciu, zvýšenie kvality a perspektívu pre ďalší rozvoj. Pre komplexné posúdenie návrhu bolo potrebné vypracovať požiadavky objednávatel a: výkon a priepustnosť navrhovaných systémov parametre údržby časová náročnosť nároky na obsluhu v počte personálu spotreba vody priestorové a energetické požiadavky (plocha, klimatizácia, energetická náročnosť atd.) typy odberového materiálu (rozmery pre skúmavky apod.) potenciál navrhovaného riešenia referencie pracovísk s inštalovanou technológiou Navrhnuté riešenie Koncept nášho riešenia umožnil inováciu a reštrukturalizáciu bez nutnosti rozsiahlych úprav súčasnej prevádzky. Navrhnuté východisko logicky nadväzuje na vybudovaný koncept pracoviska využívajúci na príjme biologického materiálu predanalytickú linku AutoMate a nainštalovanú technológiu (analyzátory rady AU, DxI, prietoková cytometria, nefelometria, Data- Management systém, s napojením na LIS), triedenie do stojančekov pre analyzátory, automatickú alikvotáciu, archiváciu vzoriek a údajov. Konkrétne riešenie sme zamerali na výmenu AU2700 za AU5811 (zvýšenie kapacity) a doplnenie o inštaláciu 2 nových prístrojov DxH800 pre hematológiu a 2 nových analyzátorov ACL TOP pre hemokoaguláciu. Pripojenie všetkých analyzátorov našej spoločnosti do LISu sme realizovali prostredníctvom 3 staníc Remisolu 2000 Advance. Zabezpečili sme nastavenie validačných kritérií cez Remisol 2000 Advance a napojenie na diaĺkovú servisnú správu PRo- Service. Charakteristika navrhnutej technológie Linka Automate je multiodborovo schopná pokryť požiadavky všetkých odborov a typov materiálu. Systém je riadený SW Sorting Drive napojeným na Remisol Advance. Poskytuje objednávky testov z LISu do triediacich príkazov presne podĺa zadania laboratórnych požiadaviek. Vďaka inteligentnému spracovaniu skúmaviek sa zvýšila kvalita a výkonnosť laboratória pri plnej kontrole všetkých procesov (možnosť až 6 nezávislých konfigurácií). Nová technológia umožní zameranie laboratórneho personálu skôr na náročnejšie úlohy ako na rutinné spracovanie. Maximálne zvýši dosledovateĺnosť vzoriek pomocou jednoduchého zberu a exportu dát. Prehĺadné grafické zobrazenie komplexných štatistických dát poskytne detailné informácie o pracovnom vyťažení linky a požiadavkách na vzorky. Predanalytická linka AutoMate je schopná vo viacerých kolách triediť, alikvotovať a archivovať skúmavky. Konfigurácia systému je volńe editovatel ná užívateĺom. Umožňuje vkladať a triediť skúmavky priamo do konkrétnych stojančekov pre všetky typy analyzátorov na trhu, vrátane centrifugačných stojanov. Existujúca možnosť rozšírenia o modul pipetovania na mikrotitračné platničky je v tomto štádiu konsolidácie na uvedenom pracovisku nevyužitá. Do procesu predanalytiky ostáva ešte zaradenie pracoviska hemokoagulácie. Inštalované analyzátory rady AU5800 a DxI800 sú momentálne najvýkonnejšie prístroje na trhu. Kapacita metód (on-board) umožňuje u obidvoch z nich pokryť maximum vyšetrení s dostatočnou kapacitou a poskytnúť včasnú odozvu v rutinnej prevádzke či režime STATIM. Analyzátor AU5811 je možné rozšíriť o ďalšie fotometrické moduly s výkonom 2000 fotometrických testov bez stavebných či iných úprav. Zmenou pre personál bola inštalácia 2 hematologických prístrojov UniCel DxH 800 Coulter, systémov pre bunkovú analýzu. Tie dokonale spĺňajú požiadavky súčasnej LEAN laboratórnej praxe. Poskytujú výsledky s maximálnou efektivitou, ktorá sa dosahuje za menšieho úsilia, menšieho množstva vložených prostriedkov a za kratší čas. Výsledok tak predstavuje pre laboratórium bezkonkurenčnú hodnotu. Ďalšou významnou a najväčšou zmenou bola inštalácia hemostazeologických systémov ACL TOP 500 a 700 CTS od firmy Instrumentation Laboratory, ktorá predstavuje nový štandard pre analytickú výkonnosť a jednoduchosť prevádzky. V plnej miere spĺňa požiadavky náročných hemostazeologických laboratórií vyžadujúcich komplexné automatizované testovanie. Oba systémy ACL TOP 500 i 700 CTS ponúkajú vysokú produktivitu, pracujú výkonnejšie a pohotovejšie. Časovo náročné výkony, ako sú údržba a QC, sú optimalizované. Analyzátory Beckman Coulter, predanalytická linka AutoMate a analyzátory iných výrobcov sú/môžu byť napojené na systém REMISOL ADVANCE, ktorý komunikuje s LIS. Významnou událosťou v prevádzke CLK bola zmena LIS na pracovisku biochémie a zároveň zjednotenie s LIS pracoviska hematológie. Na túto zmenu sa museli všetky zúčastnené strany dôkladne pripraviť. Výsledkom úsilia je funkčnosť prevádzky CLK a kompatibilita s NIS. Organizácia prevádzky CLK Príjem materiálu je zaistený potrubnou poštou a donáškovou službou. Centrálny príjem je priestorovo delený aj tokom dát vzoriek rutin- Vlastnosti soupravy Výjimečná efektivita Typ metody Imunoturbidimetrie Barkódem označená ready-to-use reagencie Typ vzorku Sérum nebo plasma (Li-Heparin nebo EDTA) 50denní stabilita reagencie na palubě Analytické rozmezí 4 80 U 50denní stabilita kalibrace Rozhodovací kritérium 10 U Výsledek do 15 minut od vložení reagencie LOD (Limit of Detection) 1,2 U LOQ (Limit of Quantitation) 4,2 U Objednací informace Prozone (Hookův efekt) > U Syphilis TP Latex (1 x 200 testů) A53709 Sensitivita 100% Specificita 99,7% Syphilis TP Calibrator Set: 3 hladiny (2 x 3 x 1 ml) Syphilis TP Control Set: 2 hladiny (3 x 2 x 1 ml) A53710 A Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

18 ných vyšetrení od vyšetrení špecializovaných. Rutinné vyšetrenia sa vykonávajú v priestoroch centrálneho laboratória a v laboratóriách označených ako špeciálky, moče, RIA. Vačšina analýz týchto vyšetrení prebieha na 2 biochemických, 3 imunochemických, 2 hematologických a 2 koagulačných analyzátoroch. Ostatné na glukometroch, analyzátoroch AB rovnováhy a ďalšom prístrojovom vybavení laboratória. Špecializované vyšetrenia sú v priestoroch susediacich priamo s príjmom v laboratóriách cytometria, cytochémia a mikroskopia, špeciálna hemokoagulácia. Na príjme sú vytriedené vzorky vyžadujúce centrifugáciu a vzorky plnej krvi pre priamy vklad do stojančekov pre prietokovú cytometriu, hematológiu (rutinné či špeciálne vyšetrenia). Stojančeky sú prenesené priamo k analyzátorom. Vlastné triedenie môže byť uskutočnené pomocou predanalytickej linky Automate1250. Vzorky po centrifugácii sa vložia do predanalytickej linky pre následné vytriedenie do generických stojančekov či stojančekov konkrétnych analyzátorov. Po analýze sú všetky vzorky vrátené k linke AutoMate1250 a vytriedené pre archiváciu a následne uskladnené v chladničkách v priestore centrifugácie. Na príjme uskutočňuje lekár validáciu výsledkov pred ich distribúciou k lekárom. Zhodnotenie Hlavným prínosom vytvorenia CLK po úplnej realizácii návrhu nášho riešenia je konsolidácia toku vzoriek, dosledovateĺnosti materiálu a dát pre zjednodušenie procesov, zefektívnenie prevádzky. Implementácia projektu zabezpečí zvýšenie kvality procesov a úsporu manuálnej práce. Projekt konsolidácie, ktorý je v CLK naštartovaný, znamená pre našu spoločnosť možnosť pokračovať v nastavených procesoch a optimalizácii činností. Ďakujeme vedeniu FNsP a všetkým zúčastneným pracovníkom CLK za prejavenú dôveru, ochotu a ústretovosť. Tešíme sa na ďalšiu spoluprácu s nimi a veríme, že onedlho prinesieme aj vám našim verným čitateĺom ďalšie pozitívne a inšpiratívne informácie z tohto pracoviska. HELENA BAZOVSKÁ hbazovska@beckman.com Mgr. Luděk Slavík, PhD. Hemato-onkologická klinika, Fakultní nemocnice Olomouc, Česká republika Mgr. Peter Bartek, PhD. Oddelenie hematológie a transfuziológie, Onkologický ústav sv. Alžbety, Bratislava Doc. MUDr. Tomáš Lipšic, Csc Oddelenie hematológie a transfuziológie, Onkologický ústav sv. Alžbety, Bratislava Dr. Edmondo Ferretti Instrumentation Laboratory, Miláno, Taliansko Verím, že dominantou podujatia boli užitočne a príjemne strávené chvíle v kruhu kolegov a priatel ov. Teším sa na nasledujúci ročník! JOZEFÍNA BERNÁTOVÁ jbernatova@beckman.com XVII. celostátní konference DNA diagnostiky listopadu 2013, Dolní Morava Stretnutie užívateľov koagulačných systémov Instrumentation Laboratory októbra 2013, Nový Smokovec Po čtyřech letech dostali kolegové z Olomouce v čele s Radkem Vrtělem a Radkem Vodičkou opět příležitost zorganizovat tradiční setkání, jak sami říkají, nadšenců, kteří zasvětili minimálně část svého života zkoumání organické makromolekuly, jež si s námi stejně dělá, co se jí zlíbí. Někdy umí být až nepříjemně stabilní a životaschopná, jindy se nám ztrácí před očima. A když už si domýšlivě myslíme, že ji máme přečtenou, tak se nám z toho většinou pravotočivě vykroutí. Setkání proběhlo ve dnech listopadu Při výběru místa konání se tentokrát or- ganizátoři rozhodli pro netradiční krok. Po řadě let přesunuli konferenci z měst, jako je Brno, Olomouc a Praha, do hotelového komplexu Vista ve středisku Dolní Morava nacházejícího se v malebném prostředí masivu Kralického Sněžníku. Akce byla pořádána již posedmnácté, tentokráte pod záštitou Společnosti lékařské genetiky ČLS JEP, Ústavu lékařské genetiky a fetální medicíny Lékařské fakulty UP a Fakultní nemocnice v Olomouci. Garanty akce pak byl děkan LF UP prof. MUDr. Milan Kolář, Ph.D. a ředitel FN Olomouc doc. MUDr. Roman Havlík, Ph.D. Čestným hostem se stal prof. Brdička, jemuž byl na začátku konference, u příležitosti jeho 80. narozenin, předán diplom udělení čestného členství v České lékařské společnosti Jana Evangelisty Purkyně. Hlavním tématem konference byly nové trendy v DNA diagnostice, zejména zkušenosti z masivních sekvenačních technik, z hybridizačních mikročipových analýz a bioinformatického zpracování a vyhodnocování dat. Sešlo se zde přes 230 účastníků, kteří přispěli více než 60 odbornými prezentacemi. Možnost prezentovat své novinky získalo téměř 20 firem. EVA KRÁLOVÁ ekralova@beckman.com Štvrtý ročník stretnutia užívatel óv koagulačných systémov spoločnosti Instrumentation Laboratory sa konal v termíne októbra Miestom tohto stretnutia bol hotel Atrium, ktorý sa nachádza na úpätí Slavkovského štítu a je známy svojimi nádhernými panoramatickými výhl ádmi do Podtatranskej kotliny a na vrcholy tatranských štítov. Väčšia časť odborného programu bola zameraná na hemostazeológiu, avšak na rozdiel od minulých ročníkov sme sa venovali aj témam z oblasti hematológie a kvality. Zreteĺ sme kládli najmä na klinické a laboratórne aspekty vybraných chorobných jednotiek. Novinku, blok venovaný kvalite v hematologických laboratóriách, sme do programu zaradili na základe pripomienok od účastníkov predošlých ročníkov. Portfólio spoločností Instrumentation Laboratory a Beckman Coulter prezentovali naši produktoví špecialisti. Odborný program bol v dotazníkoch spokojnosti hodnotený na výbornú. Vel mi pekne ďakujem všetkým, ktorí priložili ruky k dielu, pripravili hodnotné prednášky a aktívne sa zapájali do diskusií. Externí prednášatelia: MUDr. Denisa Jankovičová Klinika hematológie a transfuziológie, Nemocnica sv. Cyrila a Metoda, Univerzitná nemocnica Bratislava MUDr. Alexander Varga Ústav hematológie, Fakultná nemocnica Nové Zámky MUDr. Janka Hulíková Centrum hemostázy a trombózy, HEMO MEDIKA, Košice MUDr. Ferdinand Sasváry, PhD. Hospitale s.r.o., Šahy MUDr. Miriam Mitníková Oddelenie laboratórnej medicíny, podoodelenie hematológie, Univerzitná nemocnica L. Pasteura Košice Mgr. Michaela Macichová Oddelenie laboratórnej medicíny, podoodelenie hematológie, Univerzitná nemocnica L. Pasteura Košice RNDr. Zdenka Šujanová Klinika hematológie a transfuziológie, Nemocnica sv. Cyrila a Metoda, Univerzitná nemocnica Bratislava 34 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

19 Movember 2013 slovem i ve fotografiích Mezi nebem a zemí Cestou necestou, polem nepolem jely jsme s Ing. Petrou Kabeleovou z pražské laboratoře Prevedig na konferenci do Karlovy Studánky. Čekalo nás krásných 350 km jízdy. A tak nebylo divu, že jsme probraly vše možné i nemožné a narazily přitom na pro mne velmi zajímavý sport. Tím je skákání padákem! Celosvětově se stal listopad měsícem boje proti rakovině prostaty. V rámci tzv. akce Movember si muži nechávají narůst knírek, čímž ostatní upozorňují na rizika spojená s touto nemocí. Ale proč ten knír? Snaží se tak poukázat na důležitost prevence a časné diagnózy. Současně probíhá sbírka finančních prostředků, které se pak využijí právě při boji s touto zákeřnou chorobou. V loňském roce se uvedené listopadové události zúčastnila i společnost Beckman Coulter, a to prostřednictvím organizace Muži proti rakovině. Ve spolupráci s několika laboratořemi jsme umožnili 400 zájemcům otestovat si zdarma tzv. index zdravé prostaty phi. V tomto článku vás ve zkratce seznámíme s průběhem našeho Movemberu ve dvou spolupracujících laboratořích. Těm jsme položili následující otázky: 1. Kolik jste v rámci této akce vyšetřili pacientů? 2. Předcházela vyšetření nějaká příprava nebo selekce zájemců? 3. Zúčastnili byste se této akce také příští rok? Současně nabídneme i pohled kolegy, který se do celé akce osobně zapojil. FN Plzeň, oddělení imunodiagnostiky MUDr. Radka Fuchsová 1. Kolem Ano, pacienti prošli úvodním pohovorem, kde jsme se ptali na detaily spojené s případnými obtížemi, léčbou a prodělanými zákroky. Již při tomto dialogu jsme některé zájemce vyloučili, protože by u nich nebyl výsledek vypovídající. V dalším stupni jsme vyšetřili PSA a teprve při zvýšeném výsledku následovalo testování phi indexu. 3. Přestože bylo za celou akcí hodně práce, určitě bychom se rádi znovu zapojili. Navíc řada těch, kteří se zúčastnili, se zajímali o možnost nechat si příští rok ověřit případný trend výsledků. Krevní centrum Frýdek Místek prim. MUDr. Boris Bubeník Podle hodnoty PSA. 3. Určitě ano, ideální by bylo dostat toto vyšetření do číselníku vyšetření proplacených pojišťovnou. František Vičar Tak trochu ze zvědavosti, tak trochu kvůli hecování se s kamarády jsem se rozhodl zúčastnit se aktivně akce Movember. Znal jsem ji samozřejmě z médií z předchozích let, ale netušil jsem, co konkrétního se za ní skrývá. Proto jsem se zaregistroval na a stal se tak na měsíc jedním z mnoha kníračů. Až na zmíněných stránkách jsem se dozvěděl celou podstatu této celosvětové akce jsou opravdu zajímavé, proto doporučuji jejich prohlídku. Už po týdnu jsem se stal terčem mnoha dotazů a vtipných komentářů, avšak vytrvale jsem využíval situaci k šíření osvěty a důležitosti preventivního vyšetření. Kupodivu větší odezvu jsem pociťoval od žen. Ty si uvědomovaly, že musí svoje partnery k vyšetření PSA dotlačit. Nakonec i mě samotného k tomu přiměla až tato akce. Bylo rovněž zajímavé potkávat další knírače, protože na většině z nich bylo patrné, že si nechali narůst knírek pouze na přechodnou dobu. Díky tomu, že jsem se osobně zapojil, jsem získal pocit, že má akce skutečně význam. Vtipnou formou upozorňuje na mužské choroby a navíc získává finanční prostředky na výzkum. Už teď se mi honí hlavou nápady, jak si v listopadu upravím svůj knír a jak se ještě aktivněji zapojím do Movemberu Budu rád, když se ke mně přidá co nejvíce čtenářů našeho časopisu! TEREZA TIETZE ttietze@beckman.com IVANA MIČÍKOVÁ imicikova@beckman.com FRANTIŠEK VIČAR fvicar@beckman.com V kolika letech jsi s tímto druhem sportu začala a jak ses k němu vůbec dostala? Ve svých 14 letech jsem začala se základním výcvikem. Za rok jsem pak absolvovala svůj první seskok padákem, a to ještě na starém vojenském OVP-68. Vzhledem k tomu, že děvčat bylo v tomto sportovním odvětví relativně málo, a protože jsem prošla fyzickými testy, vybrali mě záhy do střediska vrcholového sportu v Příbrami, kde jsem nakonec strávila nezapomenutelných 5 let v juniorské reprezentaci. K parašutismu mě přivedl taťka, který měl za sebou coby vojenský pilot pár seskoků padákem, a také trochu náhoda. Dříve jsem závodně plavala, ale chtěla jsem zkusit něco nového. Jenže začít ve 14 letech jiný sport na slušné úrovni není tak jednoduché. Volba nakonec padla na letecké sporty. Chtěla jsem létat na větroni, proto jsem se začala rozhlížet po letišti, na němž bych absolvovala pilotní výcvik. Při cestě autem vzal naštěstí taťka mladého stopaře, který byl parašutista. A tím byl můj osud zpečetěn. Domluvili se, že si můžu přijít zatrénovat do tělocvičny a zkusit se připravit na seskoky v rámci základního výcviku. Mezi partou paragánů se mi okamžitě zalíbilo. Úplně jsem tomuhle sportu propadla. Podporovali tě rodiče? Nebáli se o tebe? Rodiče mě samozřejmě podporovali, ale určitě se o mě báli, i když jsem si to tenkrát vůbec neuvědomovala. Dnes si nedovedu představit, že bych svoji dceru pustila v 15 letech na celý víkend z domu mezi partu dospělých chlapů a navíc s ní neměla žádné spojení. Tenkrát ještě nebyly mobily a já jezdila hodně často na celé víkendy na letiště mimo Prahu. O různých týdenních soustředěních ani nemluvě. Asi mi rodiče hodně věřili. Je potřeba dobrá psychická a fyzická kondice pro provozování tohoto sportu? Dobrá kondice je důležitá pro každý sport. Když jsme neskákali, chodili jsme běhat, posilovat, trénovali jsme akrobacii na trampolíně. Museli jsme si samozřejmě vést tréninkový deník, kam jsme si zapisovali, jak pracujeme na své fyzičce doma. Každý rok jsme pak absolvovali náročné fyzické testy. Kdo neprošel, mohl být z reprezentace vyřazen. 36 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

20 KŘÍŽOVKA Česká křížovka Tak si, Lojzo, představ, vylévá si vzdělaný Pepa srdce u piva v hospodě vzdělanému kamarádovi, že mi u doktora odebrali půl litru krve a z ní diagnostikovali tenisový loket, Alzheimera, močové i žlučové kameny a hašteřivou manželku. Když jsem si šel Tak si, Lojzo, představ, vylévá si vzdělaný Pepa srdce u piva v hospodě vzdělanému kamarádovi, že mi u doktora odebrali půl litru krve a z ní diagnostikovali tenisový loket, Alzheimera, močové i koupit žlučové kameny pušku, a hašteřivou abych manželku. je zastřelil, Když jsem (Tajenka). si šel koupit pušku, abych je zastřelil, (Tajenka). Tak si, Lojzo, představ, vylévá si vzdělaný Pepa srdce u piva v hospodě vzdělanému kamarádovi, že mi u doktora odebrali půl litru krve a z ní diagnostikovali tenisový loket, Alzheimera, močové i žlučové autor: kameny a hašteřivou manželku. Když jsem si šel koupit pušku, abych je zastřelil, (Tajenka). prudce jedovatý válcovitá nádoba pravoslavní eruka, Inami, ementálské Remote Area kdo kupuje, krytý ochoz francouzský Ivan krůpěj podpora omýt alkaloid obsažený modrý (angl.) s dvěma Iva (slovensky) knězi lop, ska sýry Nurse (zkr.) kupující s arkádami básnik Šarkan autor: prudce eruka, Inami, v blínu jedovatý kruhovými válcovitá nádoba pravoslavní ementálské Remote Area kdo kupuje, krytý ochoz dny francouzský Ivan krůpěj podpora omýt alkaloid obsažený modrý (angl.) s dvěma Iva (slovensky) knězi lop, ska sýry Nurse (zkr.) kupující s arkádami básnik Šarkan v blínu kruhovými dny Sbor požární užitková výklenek ochrany (zkr.) rostlina pro sochu Sbor požární užitková výklenek ochrany (zkr.) rostlina pro sochu schopnost mluvit finská jednotka savec podobný slonu objemu savec podobný finská jednotka sklon slonu (angl.) schopnost kdo orámluvit objemu sklon (angl.) kdo orá 4 4 asijské kyslé mléko asijské kyslé mléko Kansallinen Kokoomus Kansallinen (zkr.) Kokoomus (zkr.) velký korýš s klepety žijící velký vodě korýš s klepety žijící ve vodě závěsy před jevištěm závěsy před jevištěm 3 3 oxid hlinatý (vz.) oxid hlinatý (vz.) kříženec velblouda kříženec velblouda velký kurovitý prodloužená pták s lysým boční zeď velký červenavým kurovitý prodloužená pták krkem s lysým sbor boční hudebníků zeď červenavým krkem sbor hudebníků kulečníková hůl kolorit kulečníková (kniž.) hůl kolorit (kniž.) obyvatel Itálie písmeno obyvatel řecké Itálie abecedy písmeno řecké abecedy 2 2 tisíc tisíců tisíc tisíců protoplazma protoplazma jaderná mina (zkr.) jaderná mina (zkr.) systém vědeckých principů systém vědeckých turecký důstojník principů turecký důstojník první indický film první indický krutí lidé film krutí lidé strkat prodléval strkat prodléval identifikační skládací přechodné přístřeší číslo (zkr.) identifikační skládací přechodné sídlo číslo v Japonsku (zkr.) lovkyně přístřeší perel sídlo v Japonsku severské mužské lovkyně perel jméno severské závěrečné mužské slovo křesť. jméno modliteb jméno závěrečné slovo zpěvačky Lear křesť. modliteb Senior jméno Supply Officer zpěvačky (zkr.) Lear Senior Supply Officer (zkr.) obec v okrese Domažlice obec v okrese Domažlice jako (slovensky) jako styl (slovensky) hudby styl hudby 1 1 turn over (zkr.) turn over (zkr.) teplem se rozpouštělo teplem se rozpouštělo centimetr (zn.) vražedný centimetr útok (zn.) vražedný útok darovalo darovalo jednotka objemu v jednotka Srbsku objemu v Srbsku Je to finančně náročný koníček? Pro nás to tehdy finančně náročný sport nebyl, jen časově. Jako reprezentanti jsme měli vše hrazené. Ale dnes bude tato zábava asi finančně náročná. Musíš si koupit hlavní i záložní padák a ostatní potřebné vybavení, platit si jednotlivé seskoky a vše, co je se skákáním spojené. A navíc věnovat parašutismu o víkendech dost času. Není to jako si vyjet na pár hodin na kolo. Nese s sebou tento sport nějaká rizika? Byla jsi přítomna nějakému dramatickému okamžiku? Pokud se dodržují nastavená pravidla, je ve srovnání s jízdou autem tenhle sport určitě bezpečný. Mně se například zrovna při výběru do reprezentace zastavily při seskoku stopky. Prováděla jsem povinné cviky za volného pádu a stále jsem si myslela, že mám dost času. Bohužel až po delší chvíli jsem zjistila, že čas na stopkách se nemění. Byla jsem už dost nízko, rychle otevřela padák a dopadla hned do nedalekého pole. Všichni stáli vyděšení na stojánce a měli hrůzu v očích. Dostala jsem pořádně vynadáno, že nemám pud sebezáchovy. Byla jsem přesvědčená, že jsem na výběru do repre skončila. Ale asi se jim líbilo, jak jsem situaci vyřešila, protože pozvánka nakonec přišla. Párkrát se mi také stalo, že se mi neotevřel hlavní padák. Většinou jsem totiž chodila z letadla až poslední, protože jsem byla nejlehčí a musela po přistání rychle zabalit, abych stihla další výsadku. No a někdy se šňůry zašmodrchaly a já byla nucená kontejner s padákem odhodit a otevřít záložní. Ale vždycky vše dobře dopadlo. Byli jsme na takovéto situace neustále proškolováni. Byl to pro tebe adrenalin, nebo tě pád dolů nechával v klidu? Adrenalin to určitě byl, hlavně pokud se řešily nějaké nestandardní situace, nebo se zkoušely dálkové přelety, okamžité otevření ve m, seskoky v horách na sjezdovku nebo na fotbalové hřiště a podobná zpestření. Po skončení v reprezentaci a nástupu do zaměstnání mi skákání chybělo. Proto jsem si koupila svůj vlastní padák a začala se věnovat paraglidingu, což je adrenalin velký. Hlavně když létáš 2 hodiny kilometr nad lyžařským střediskem v Alpách nebo za silné termiky v Beskydech a musíš rychle reagovat na vzdušné proudy a dění kolem sebe. Jaké koníčky či sport provozuješ nyní? Jezdíme s dětmi v zimě rádi lyžovat, v létě na kolo a na výlety. Ráda také chodím po horách a poslední 2 roky jsem začala zase víc běhat. Motivací mi bylo pár běžeckých závodů, na které jsem se s kamarádkami přihlásila. Ráda také relaxuju na chatě při zahradničení, nebo u dobré knížky. No a koníček, který mě nyní nejvíc vytěžuje, je vše, co se točí kolem baseballu mých dvou synů. Děkuji za zajímavý rozhovor a přeji, ať se ti moc daří a ať jsi stále tak akční! ING. PETRA KABELEOVÁ DIAGNOSTICKÉ CENTRUM, PREVEDIG S.R.O., WASHINGTONOVA 9, PRAHA 1 kabeleova@prevedig.cz IVANA MIČÍKOVÁ imicikova@beckman.com Slovenská krížovka Tak si, si, Lojzo, Lojzo, predstav, predstav, vylieva si vzdelaný vylieva Jožko si srdce vzdelaný pri pive v krčme Jožko vzdelanému srdce kamarátovi, pri pive že v krčme mi u doktora vzdelanému odobrali pol litra kamarátovi, krvi a z nej diagnostikovali že mi u tenisový doktora lakeť, odobrali Alzheimera, močové pol i litra žlčové kamene a hašterivú manželku. Keď som si išiel kúpit pušku, aby som ich zastrelil, (Tajnička). Tak si, krvi Lojzo, a predstav, z nej diagnostikovali vylieva si vzdelaný Jožko tenisový srdce pri pive lakeť, v krčme Alzheimera, vzdelanému kamarátovi, močové že mi i žlčové u doktora kamene odobrali pol a litra hašterivú krvi a z nej manželku. diagnostikovali tenisový Keď som lakeť, si Alzheimera, išiel kúpit močové pušku, i žlčové autor: kamene aby a som hašterivú ich manželku. zastrelil, Keď som (Tajnička). si išiel kúpit pušku, aby som ich zastrelil, (Tajnička). hnedý pražský zoologická Arta, Ilem, bantamová rádiotelefón anóda, Ivan chrám dopoly sídlo v Grécku nie tento kozľacia koža austrálsky predloha elektrotechnický liatím naplniť záhrada (skr.) kakirit, Taam hmotnosť (skr.) po esperantsky Šarkan autor: Arta, Ilem, pštros hnedý podnik pražský zoologická bantamová rádiotelefón anóda, Ivan chrám dopoly sídlo v Grécku nie tento kozľacia koža austrálsky predloha elektrotechnický liatím naplniť záhrada (skr.) kakirit, Taam hmotnosť (skr.) po esperantsky Šarkan pštros podnik telocvičné krátkovlnná druh účesu náradie ovca telocvičné krátkovlnná druh účesu náradie zelené ovca policajné auto nočný motýľ zápach (odbor.) European zelené Pallet policajné nočný udieraj motýľ zápach Pool (skr.) auto (odbor.) European Pallet udieraj Pool (skr.) tamto tamto Olympia (dom.) Olympia (dom.) vavrín (bás.) vavrín (bás.) skutý skutý 1 1 opalok opalok hmla, opar hmla, opar autostop autostop pulz písmeno pulz gréckej abecedy písmeno gréckej abecedy aptien turistický aptien autobus turistický autobus herec USA (Al ) herec USA krik (Al ) krik zvratné zámeno zvratné lantán zámeno (zn.) lantán (zn.) trma-vrma cestovný trma-vrma doklad cestovný doklad vytýčený smer vytýčený smer mrak mrak la, lalá potom la, lalá potom stredná dámska móda stredná dámska móda 3 3 čínska droga Botswana čínska droga (MPZ) Botswana (MPZ) milovaná milovaná druh horniny, kataklazit (geol.) druh horniny, kataklazit vlastnil (geol.) vlastnil šermiarska zbraň šermiarska písmovkazbraň písmovka kilopond (zn.) Krupina kilopond (EČV) (zn.) Krupina (EČV) 2 akže 2 akže indická kvalitné tanečnica palivo pomoc, záchrana (hovor.) pomoc, záchrana (hovor.) vrch v Nigérii títo, po rusky zaujato, títo, po s rusky predsudkom zaujato, s predsudkom indická tanečnica kvalitné palivo vrch v Nigérii nech, po česky nech, drmancoval po česky drmancoval isto isto ostrov v Indonézii ostrov v Indonézii TAJENKA Z MINULÉHO ČÍSLA: "NĚCO DĚLAT S TOU SVOU ALERGIÍ NA DOKTORY" 38 39