MITOCHONDRIE TVORBA ATP

Transkript

1 MITOCHONDRIE TVORBA ATP

2 SEMIAUTONOMNÍ ORGANELY mitochondrie, chloroplasty vlastní DNA (mtdna) vlastní proteosyntetický aparát vlastní ribosomy (70 S) dvě samostatné membrány hlavní funkcí: konverze energie - syntéza ATP (oxidativní nebo fotosyntetická fosforylace) endosymbiotická teorie obr. 4.47; J.Darnell a kol.: Molecular Cell Biology, Scientific Americal Books, Inc., 1990

3 MITOCHONDRIE válcovité struktury - tloušťka 0,5-1 µm délka až 7 µm v buňce je 1-2 tisíce mitochondrií - tvoří nejrozsáhlejší kompartment buňky např. v játrech a ledvinách tvoří až 30 % váhy buňky vznikají dělením již existujících mitochondrií průměrná délka života mitochondrie - 7 dní mají 2 samostatné kompartmenty vnější = intermembránový prostor vnitřní = lumen (obsah se označuje jako matrix)

4 Mitochondriální membrány a matrix vnější - 40 % lipidů (fosfoinositol, cholesterol), transportní proteiny, málo kardiolipinu - velká propustnost složení intermembránového prostoru se neliší od složení cytoplazmy vnitřní - 20 % kardiolopinu stává se téměř nepropustná pro ionty tvoří cristae mitochondriales ( povrch až 5x) enzymy dých. řetězce a komplex ATPsyntetáz transportní proteiny pro pyruvát a MK matrix - obsahuje enzymy oxidace pyruvátu, β-oxidace MK a Krebsova cyklu; mtdna, trna, ribosomy

5 Chemiosmotická teorie syntézy ATP ze substrátu se odebírá vodík ve formě protonů a elektronů elektrony s vysokou energií se předávají enzymům dých. řetězce jejich energie je využita k transportu protonů z matrix do intermembr. prostoru (přenašeči jsou NADH, FADH 2 ) = vzniká protonový gradient při návratu protonů do matrix je energie využita k syntéze ATP S.L. Wolfe: Molecular and Cellular Biology, Wadsworth Publ. Comp.,1993

6 Konverze energie - syntéza ATP zdrojem energie - oxidace cukrů a MK na vodu a oxid uhličitý chemiosmotická teorie (P. Mitchell, 1964) činnost ATPázy (Boyer, Walker, Skou, 1997) etapy buněčné respirace: glykolýza Krebsův cyklus elektron-transportní řetězec a oxidativní fosforylace

7 Konverze energie - 1) zdroj elektronů oxidací substrátu se odnímá vodík jako proton (H + ) a 2 elektrony (e - ) odnímaný vodík při dehydrogenacích přenášejí koenzymy NAD nebo FAD do dýchacího řetězce v cytoplazmě glykolýza (bez ohledu na přítomnost nebo nepřítomnost kyslíku) pyruvát + NADH + ATP (zisk 2 ATP z 1 glukózy, tj. 70 kj) oxidační dekarboxylací pyruvátu (za přítomnosti O 2 ) vznik acetylcoa - vstupuje do matrix a zapojuje se do Krebsova cyklu reakcí s k. oxaloctovou na k. citronovou (je-li dostatek ATP, acetylcoa se využije místo v Krebsově cyklu k syntéze zásobních tuků) v Krebsově cyklu dekarboxylace - vznik CO 2

8 2) Tvorba protonového gradientu většina energie se uvolňuje oxidací NADH ev. FADH 2 komplexy dýchacího řetězce (NADH předá elektrony flavoproteinu a několika cytochromům prostřednictvím ubichinonu a chytochtomu c), které zprostředkují přenos elektronů na molekulární kyslík (cytochromoxidáza) za vzniku vody elektrony z FADH 2 dají asi o třetinu menší zisk ATP než elektrony z NADH

9 2) Tvorba protonového gradientu uvolněná energie se užije k čerpání protonů do intermembránového prostoru (při přechodu 2 e- až na kyslík = redoxpotenciál 1V - přečerpá se asi 10 protonů) vzniká tak: protonový gradient - vytvoří na obou stranách vnitřní mitoch. membrány rozdíl ph elektrický gradient - protony díky svému + náboji vytvoří membránový potenciál (pozitivní vnější a negativní vnitřní strana vnitřní mitochondriální membrány) elektrochemický protonový gradient (tvořen z větší části membr. potenciálem, z menší části rozdílem ph)

10 3) Syntéza ATP při vyrovnávání koncentrace protonů se osmotická energie mění na chemickou energii makroergní vazby v molekule ATP (k syntéze 1 ATP nutná energie z transportu 3 H + zpět do matrix, tj. při transportu 2 e - se tvoří asi 3 ATP) celkový zisk z oxidace 1 glukózy = ATP, (u kys. palmitové (C 16 ) již 129 ATP) z 1 glukózy 10 NADH + 2 FADH ATP z glykolýzy a 2 ATP z Krebsova cyklu - teoret. výtěžek 40 %, zbytek je teplo vytvořená ATP neprochází přes cytoplazmatickou membránu mimo buňku (polární, malá molekula, snadno difunduje po celé b.) - pracuj. sval. b. spotřebuje 10 mil. ATP/s

11 3) Syntéza ATP - komplex F 1 + F 0 F 1 se skládá z 9 proteinů v hlavičce jsou 3 dimery αβ, ostatní podjednotky γδε jsou ve spojovacím stonku, hlavička ukotvena k membráně, aby mohla rotovat pouze γ spojka celý komplex pracuje jako motor F 0 - stator - transmembránový kanál pro vyrovnání protonového gradientu F 1 - rotor - jako třídobý motor se 3 konformacemi - proudem protonů se roztočí γ podjednotka spojky, rotace dodává energii pro konformační změny podjednotek αβ

12 Využití elektrochemického protonového gradientu rozdílu ph se využívá k transportu jednak pyruvátu, resp. acetylcoa, jednak fosfátového aniontu do mitochondriální matrix membránového potenciálu se užívá k výměně ADP za ATP při transportu ATP do cytoplazmy

13 TRANSPORT LÁTEK PŘES MEMBRÁNU OSMÓZA

14 TRANSPORT LÁTEK PŘES BUNĚČNÉ MEMBRÁNY souvisí s procesy metabolismu - jde o překonávání biomembrány = transport membránový biomembrána svou stavbou a chemickým složením rozhoduje o typu látek a způsobu jejich transportu membrána je selektivně propustná (dříve semipermeabilní) membrána má aktivní úlohu v transportu některých látek podle spotřeby energie se dělí na pasivní a aktivní transport

15 Mechanismy transportu pasivní transport - prostá difuze usnadněná difuze aktivní transport - primární přenašečový sekundární přenašečový endocytóza a exocytóza obr. 120; O. Nečas, Obecná biologie, H & H Jinočany, 2000

16 VOLNÁ DIFÚZE přes lipidovou dvouvrstvu proces čistě fyzikální, není selektivní průnik hydrofobních molekul (plyny, uhlovodníky, MK, estery, steroly, org. kys.) malých nenabitých hydrofilních molekul (voda, alkoholy, urea) rychlost závistí na koncentr. spádu, teplotě a velikosti molekuly buňka difúzi nemůže regulovat obr.121; O.Nečas, Obecná biologie, H & H Jinočany, 2000

17 VOLNÁ DIFUSE - pokračování přes preformované hydrofilní proteinové kanály (nejlépe prozkoumané Na + a K + kanály nervových bb.) selektivní (konformace proteinů kanálu určuje, které ionty projdou - Na + Ø 0,5 nm, K + Ø 0,3 nm) rychlost závisí na koncentr. spádu a hustotě kanálů možnost regulace napěťová záklopka (změnou membránového potenciálu) chemická záklopka (vazbou ligandy - ionty, nukleotidy, neurotransmitery)

18 USNADNĚNÁ DIFUSE (pasivní přenašečový transport) pomocí přenašečů (AK, cukry, fosfátový aniont) rychlost závisí na: koncentračním spádu, afinitě přenašeče k substrátu, hustotě přenašečů v membráně rychlosti konformační změny přenašeče možnost regulace - např. transport glukózy do buněk ovlivňuje inzulin

19 AKTIVNÍ TRANSPORT vyžaduje transportní proteiny - mohou pumpovat látky i proti koncentračnímu gradientu transport je selektivní - přenašečem je obvykle enzym (tzv. membránové ATPázy) vyžaduje energii (přímou hydrolýzou ATP) - k uvolnění substrátu či k regeneraci konformace přenašeče živá buňka aktivně udržuje určité gradienty Uvnitř buňky (mm) Krev (mm) draslík sodík chloridy uhličitan vápník 0,0005 1,8

20 PRIMÁRNÍ AKTIVNÍ TRANSPORT energie se získává přímou hydrolýzou ATP přenašečem je enzym - membránové ATPázy nejznámější je sodíko-draslíková pumpa (ve všech bb.) na 1 mol. ATP pumpuje 3 Na + ven z b. (fosforylace) a 2 K + do b. (defosforylapřenašeče) ce

21 Na + /K + pumpa činnost nutná pro udržení objemu buňky a její osmotické hodnoty (uvnitř buňky negativně nabité proteiny, váží pozitivní ionty inaktivace pumpy vede k osmotické lýze b.) na udržení gradientů sodíku a draslíku se spotřebuje až 1/3 ATP vytvořeného v buňce většina aktivních transportů vytváří na membránách buněk elektrické napětí, což je způsobeno oddělením různě nabitých látek plazmatickou membránou Na + /K + pumpa přispívá ke vzniku elektrického gradientu, tj. membránového potenciálu cytoplasma je vždy vzhledem k vnějšímu povrchu buňky negativně nabitá asi o 0,1 V membránový potenciál kolísá mezi 50 a 200 mv (mínus znamená, že vnitřek buňky je záporný) při přenosu nervového vzruchu se v neuronu otevřou sodné kanály, jimiž Na + ionty prudce tečou do neuronu jak po koncentračním, tak po elektrickém gradientu; Na + /K + pumpa pak obnovuje membránový potenciál

22 PRIMÁRNÍ AKTIVNÍ TRANSPORT vápníková pumpa - udržuje nízkou koncentraci Ca ++ v cytosolu (vápník pumpuje ven z b. nebo ho ukládá do organel - ER, mitochondrie, sarkoplazm. retikulum) protonová pumpa v parietálních bb. žaludku - koncentrování do lumen žaludku asi x - vytváří kyselé prostředí v žaludku v distálních sběrných kanálcích ledvin - koncentrování protonů do lumen tubulů asi 1000x - protony jsou vylučovány močí (ph moči je 5,5)

23 SEKUNDÁRNÍ AKTIVNÍ TRANSPORT využívá energii uloženou v koncentračním gradientu, který vytvořil primární aktivní transport jsou spřaženy dva transportní pochody - jeden vyžaduje dodání energie, druhý využívá vzniklého koncentračního gradientu symport x antiport symport Na + a glukózy ve střevní sliznici a renálních tubulech aktivní transport glukózy je poháněn koncentrací Na + vně buňky, která je udržována činností sodíko-draslíkové pumpy

24 VESIKULÁRNÍ TRANSPORT transport makromolekul uzavřených ve váčcích aktivní proces - možnost regulace, závisí na vnitřní stavbě buňky: fluidita membrány, funkce cytoskeletu (mikrofilament) exocytóza - transportní vezikl z GA putuje k plasmatické membráně a splývá s ní - obsah veziklu se vylije do mezibuněčného prostoru molekuly extracelulární matrix, buněčné stěny, extracelulární enzymy, krevní bílkoviny, protilátky, hormony, neurotransmitery pučení - forma exocytózy (např. tak opouštějí b. někt. viry)

25 Tři typy endocytózy endocytóza - plasmatická membrána se vchlipuje dovnitř, až vytvoří vezikl uvnitř buňky fagocytóza ( cellular eating ) - buňka pomocí panožek obklopí danou látku fagozom po fúzi s lysozomem vzniká potravní vakuola granulocyty, makrofágy, bb. RES, bb. v tkáňové kultuře pinocytóza ( cellular drinking ) - buňka nespecificky pohltí část extracelulární tekutiny do malých váčků probíhá u všech eukaryontních buněk nepřetržitě

26 Tři typy endocytózy endocytóza zprostředkovaná receptorem látky z extracelulár. prostoru se specificky naváží na transmembránové proteiny, vyskytující se v membráně obvykle ve shlucích celá struktura se zanoří dovnitř buňky až vnikne vezikl a z něj se v buňce uvolňují přenesené látky tímto způsobem může buňka získat i látky, které v extracelulární tekutině nejsou příliš koncentrované takto např. lidské buňky vychytávají cholesterol (složka plasmatické membrány a prekurzor steroidních hormonů cholesterol putuje v krvi v komplexu lipidů a proteinů, tzv. LDL = Low Density Lipoproteins, na které existují v buňkách specifické receptory

27 OSMÓZA - pasivní transport vody voda - silně polární látka difuse přes membránu omezená závislá na teplotě a dynamických změnách v uspořádání lipidové dvojvrstvy předpoklad mikropórů (vznikají při termickém pohybu fosfolipidových řetězců dvojvrstvy) souvisí s fluiditou membrány (při vyšším obsahu cholesterolu v membráně fluidita i pasivní transport vody) póry v semipermeabilní membráně mohou pronikat molekuly vody, ale ne velké molekuly např. sacharózy

28 AKVAPORINY některé membrány jsou pro vodu vysoce propustné (transport vody je krát rychlejší než by se očekávalo u silně polární látky), nezávisí na teplotě voda prochází přes speciální proteinové kanálky vysoce selektivní (neprojdou ani malé molekuly - močovina, ani ionty H +, H 3 O +, OH - ) průměr kanálku menší než 0,2 nm rychlost transportu asi mol./sec známo asi 10 typů akvaporinů v membránách různých bb. (erytrocyty, dist. segment nefronu, CNS, plíce, slinné a slzné žlázy) mohou být regulovány fosforylací molekuly propustnost řízena vasopresinem (např. ledviny)

29 OSMÓZA - pasivní transport vody jsou-li dvě různě koncentrovaná prostředí oddělená semipermeabilní membránou voda se pohybuje z hypotonického roztoku do hypertonického, i když je v hypotonickém roztoku mnoho druhů molekul; směr proudění vody závisí pouze na celkové koncentraci všech zúčastněných látek (osmóza = difuse vody přes semipermeabilní membránu poháněná koncentračním gradientem rozpuštěných látek) v pravé části trubice je menší koncentrace volných molekul vody, neboť mnoho z nich je vázáno hydratačním obalem k molekulám sacharózy; výsledkem je, že voda bude proudit z hypotonického roztoku doprava do hypertonického

30 OSMÓZA - pasivní transport vody transport vody probíhá do vyrovnání koncentrací a je provázen změnou objemu roztoků (jakoby koncentrovanější roztok vysával vodu z roztoku zředěnějšího) tato sací síla je osmotický tlak = úměrný počtu částic v jednotce objemu - tj. úměrný molární koncentraci látky a její disociační konstantě závisí na teplotě, ne na velikosti, hmotnosti, tvaru či náboji rozpuštěné částice osmotická hodnota buňky 285 mosmol/kg - je dána koncentrací osmoticky aktivních částic v cytoplazmě

31 OSMOTICKÉ JEVY OsT krve 0,75 MPa, z toho onkotický tlak 0,003 MPa; fyziol. roztok obsahuje 0,9 % NaCl, jeho konc. = 0,15 mol / l hypotonický roztok hypertonický roztok živočišná buňka voda do buňky - zvětšuje se objem až b. praskne = plasmoptýza (hemolýza) rostlinná buňka buněčná stěna nedovolí zvětšení objemu b. = zvýší se turgor živočišná buňka voda z buňky - zmenší se objem, b. se svraští = plasmorhiza rostlinná buňka buněčná stěna se nemůže svraštit, jen protoplast a vakuola = plasmolýza

32 Živočišná buňka v hypertonickém prostředí b. ztratí vodu, svraští se a umírá to je zřejmě důvod, proč při zvýšení salinity vody většina živočichů umírá v hypotonickém prostředí se buňka nafoukne vodou a praskne Zleva doprava roste koncentrace roztoku. Uprostřed erytr. v izotonickém prostředí. Úplně vlevo jsou ghosts, duchové = erytr. stíny - jde o plazmatické membrány plazmoptýzou (hemolýzou) roztržených buněk, jejichž obsah se vylil do prostředí

33 Kontraktilní vakuola trepky organismy, žijící v hypotonickém či hypertonickém prostředí musí mít výkonný systém osmoregulace sladkovodní trepka Paramecium caudatum žije v prostředí hypotonickém vzhledem k buněčnému obsahu a protože plasmalema trepky je do určité míry propustná pro molekuly vody, hrozí jí neustále plasmoptýza hlavním úkolem kontraktilní vakuoly je čerpat vodu z buňky zpět do okolního prostředí tato vakuola se naplní asi za 6 vteřin; za 15 min. trepka vyloučí tolik vody, jaký je celý její objem Kontraktilní vakuola naplněná vodou Prázdná kontraktilní vakuola

34 Rostlinná buňka s buněčnou stěnou v hypotonickém prostředí buněčná stěna udrží tlak vody - turgor - zabrání plazmoptýze rostlina v nedostaku vody vadne - poklesne ji turgor v hypertonickém prostředí je buněčná stěna proti úniku vody bezmocná dojde k plasmolýze, končící obvykle smrtí plazmolýza kulatá (konvexní) plazmolýza křečová (konkávní) osmoregulačním orgánem - centrální vakuola (tonoplast) Elodea densa normální stav plazmolýza

35 CYTOSKELET MIKROTUBULY MIKROFILAMENTA STŘEDNÍ FILAMENTA

36 CYTOSKELETÁLNÍ PRINCIP objeven až v 70. letech 20. století evolučně starý a konzervativní u prokaryont dosud nebyl prokázán vláknité bílkovinné struktury v buňce známy dávno, pojem cytoskelet zaveden již v r funkce: konverze energie v mechanickou (všechny formy aktivního pohybu - lokomoční i intracelulární) určování tvaru buňky, kotví mnohé organely i některé enzymy informační (při uchování a přenosu genetické informace)

37 mikrotubuly SLOŽKY CYTOSKELETU mikrofilamenta intermediární filamenta Espero Publishing, s.r.o.

38 FUNKCE MIKROTUBULŮ tvoří mechanickou kostru b. (kortikální MT rostlin, marginální svazky trombocytů a erytrocytů, stresová vlákna bb.) výběžky buněk (axopodie, axony - neurity i dendrity) určují polaritu buněk (hlavně sekrečních buněk) transport uvnitř buňky (vezikulární, neurotransmitery) základem dělicího vřeténka základem řasinek a bičíků Espero Publishing, s.r.o.

39 MIKROTUBULY průměr 25 nm složeny ze 13 podjednotek po obvodu - protofilament základní jednotkou - tubulin (dimer tvořený podjednotkami α, β) autoorganizační proces regulován: Ca a Mg ionty, nukleosidfosfáty a organizačními centry - centrozom, basální tělísko MT je polarizován (+konec směřuje do periferie b., konec u organizač. centra) Espero Publishing, s.r.o.

40 BIČÍKY A ŘASINKY Pohyb mnoha jednobuněčných organismů pohyb spermií živočichů, řas a některých rostlin výstelka části dýchací trubice výstelka vejcovodů společným stavebním rysem je vzorec 9+2 ; jsou oba zakotveny do b. bazálním tělískem - má stejnou strukturu jako centriola (živoč. b. má 2 centrioly v centrosomu - modře jsou značeny netubulinové proteiny, které drží mikrotubulové triplety pohromadě)

41 Cilia (řasinky): Cilia a flagella - srovnání na povrchu buňky obvykle ve větším počtu průměr 0,25 µm, dlouhá 2-20 µm pracují spíše jako vesla, pohyb buňky je kolmý k ose brvy Ačkoli se cilia a flagella liší v délce, počtu na buňku a způsobem práce, mají stejnou ultrastrukturu ( 9+2 ) jde o starobylý princip. Flagella (bičíky): jen jeden nebo jen několik na buňku průměr 0,25 µm, dlouhé µm pohyb buňky je v ose bičíku

42 ASOCIOVANÉ PROTEINY molekulové motory dynein - lokomoce, nitrobuněčný transport (od + k -) kinesin - nitrobuněčný transport (od - k +) (nexin - spojuje dublety mikrotubulů v kinociliích) pohání klouzání jednoho mikrotubulu po druhém molekulové motory se mohou navázat k organele a kráčet s ní podél mikrotubulu (např. vezikly s neurotransmitery se tak dostávají na konec axonů

43 LOKOMOČNÍ POHYB molekulárním motorem je dynein, který spojuje jednotlivé dvojice mikrotubulů tyto molekuly způsobují klouzání jednotlivých dvojic MT mezi sebou jiné struktury drží celý bičík pohromadě, takže se neprodlužuje, ale ohýbá

44 TUBULÁRNÍ TOXINY kolchicin, kolcemid - brání polymerizaci tubulinu (blokuje mitózu v metafázi vznik polyploidních buněk) vinblastin, vinkristin - vznikají agregáty z nepolymerizovaného tubulinu (cytostatika) taxol - stabilizuje mikrotubuly, brání jejich dynamické přestavbě (cytostatikum)

45 MIKROFILAMENTA globulární protein - aktin (tvoří až 15 % proteinů v eukaryotické buňce) monomer G-aktin autoorganizací polymeruje v řetízek F-aktinu tloušťka MF 7 nm (2 vzájemně obtočená aktinová vlákna) tvoří např. trojrozměrnou síť pod plazmatickou membránou bb. rozlišuje se + a konec (zde je polymerace rychlejší)

46 ASOCIOVANÉ PROTEINY větší počet než u mikrotubulů fimbrin, filamin, α-aktinin - stabilizují svazky mikrofilament (např. stereocilie) gelsolin - fragmentuje mikrofilamenta tropomyosiny - stabilizují aktinomyosinový komplex ve svalových buňkách myosin - molekulový motor - jeho aktivace aktinem se projeví posunem myosinu vůči aktinu asi o 10 nm obr. 22.3; J.Darnell a kol.: Molecular Cell Biology, Scientific Americal Books, Inc., 1990

47 FUNKCE MIKROFILAMENT strukturní: stavba výběžků buněk mikroklky epitelových buněk tyčinky sítnice, stereocilie vláskových buněk mikrovilli vazivových buněk součástí desmosomů kinetická: pohyb bb. a organel kontraktilní prstenec (cytokineza) svalový pohyb améboidní pohyb (pseudopodia, lamellipodia, stresová vlákna) cyklóza (proudění cytoplazmy a pohyb organel) účast na endocytóze a exocytóze

48 MIKROFILAMENTA Espero Publishing, s.r.o. A) mikroklky, B) stresová vlákna, C) améboidní pohyb a pseudopodia, D) kontraktilní prstenec

49 MIKROFILAMENTÁRNÍ TOXINY cytochalasiny zabraňují polymerizaci aktinu, blokují cytokinezu živočišných bb. vznik vícejaderných buněk phalloidin - z muchomůrky zelené stabilizuje mikrofilamenta, brání jejich přestavbě

50 STŘEDNÍ FILAMENTA průměr 10 nm fibrilární proteiny zjištěny u všech živočišných bb., rostlinných bb. a u hub tvoří stálou strukturu (za fyziologických podmínek je méně dynamická) určují tvar buňky (buněčná kostra) Espero Publishing, s.r.o. určují pozici organel v buňce mechanicky zpevňují tkáň (výběžky nervových bb., mezibuněčná spojení typu desmosomů)

51 STŘEDNÍ FILAMENTA není žádný univerzální protein, ale konkrétní pro každý typ diferencovaných bb.: cytokeratiny (epitelové buňky) neurofilamin (nervové buňky) vimentin (ve fibroblastech) vimentin + desmin (ve svalových bb.) asociované proteiny - filagrin, synemin, plectin nejsou známé žádné toxiny - střední filamenta se ruší až po částečné proteolýze