J01. Mikroskopický průkaz mikroorganismů. Nativní preparát, barvicí metody

Transkript

1 J01 Mikroskopický průkaz mikroorganismů Nativní preparát, barvicí metody VLLM0421c (jaro 2016)

2 Osnova bezpečnost práce v laboratoři, další pokyny mikroskop, práce s ním mikrobiologie, tvary mikrobů nativní preparát buněčná stěna, barvící metody 2/48

3 Úkol 1a: Bezpečnost práce v mikrobiologické laboratoři postudujte a podepište Provozní řád praktických cvičení z lékařské mikrobiologie + První pomoc předepsaný postup při laboratorních nehodách (viz J00) 3/48

4 Úvodní pokyny šatní skříňky pro studenty jsou 1., 2. a 4. od okna nepoužívejte 3. skříňku, i kdyby byla otevřená (skříňka studentů střední zdravotnické školy) klíče od šatních skříněk nechávejte vždy na háčcích vedle dveří, visí zde i klíček od WC (vracejte na místo po použití toalety) vstup studentů do prostor ústavu za praktikárnou je zakázán 4/48

5 Nakládání s odpady malé kousky můžete dát do nádobek na svých stolech použité zápalky mají své vlastní krabičky větší odpadky vyhazujte do koše vedle umyvadel rozbité sklo patří do žlutého kbelíčku vedle koše mikroskopické preparáty připravené přímo vámi patří po použití do desinfekce 5/48

6 Literatura protokoly k praktickým cvičením (IS MU) nutné! později budete potřebovat Lékařskou mikrobiologii obecnou (2005) a Lékařskou mikrobiologii speciální (2003) volitelně Lékařská mikrobiologie vyšetřovací metody Foto: archiv MÚ 6/48

7 Podmínky zápočtu účast v praktiku by měla být pokud možno stoprocentní i přes omluvenou absenci je nutné doplnit si příslušné znalosti, vyplnit protokol a kontrolní otázky při více omluvených absencích (> 2) praktikum nutné nahradit v jiné skupině (po předchozí domluvě s daným vyučujícím) pro zápočet je také nutno mít vyplněny všechny kontrolní otázky na IS MU zápočtový test 7/48

8 Pokyny k vyplňování protokolů obrázky opravdu kreslete (nakreslete koky, nepište vidím koky ) obrázky kreslete barevně, noste pastelky (alespoň červená a modrá) kreslete to, co vidíte (pokud se vám koky v mikroskopu dotýkají, kreslete je tak, nekreslete jen obrysy, ale probarvujte) pokud nevidíte to, co máte vidět, upozorněte asistenta (!) protokoly jsou kontrolovány u zkoušky a mají vliv na výslednou známku! 8/48

9 Úkol 1b: Mikroskopické techniky v mikrobiologické laboratoři seznamte se s prezentací předvádějící používání mikroskopu v mikrobiologii a případně si udělejte poznámky vytvořte si preparát pro práci s mikroskopem (např. udělejte křížek fixem na podložní sklíčko) 9/48

10 Köhlerův princip osvětlení standardní postup nastavení optimálního osvětlení osvětlení vysoké kvality homogenní s větším kontrastem sníženým množstvím rozptýleného světla i když není zdroj osvětlení dokonalý roviny v nichž vzniká obraz preparátu jsou dostatečně vzdálené od rovin s rušivými elementy (vlákno žárovky, povrchové plochy optických elementů s nečistotami) 10/48

11 Špatné vs. dobré nastavení 11/48

12 Postup zapnout mikroskop, vložit vzorek a zaostřit při zcela otevřené aperturní (kondenzorové) i polní (kolektorové) cloně (objektiv 4x nebo 10x) upravit intenzitu zdroje světla zavřít polní clonu zaostřit kondenzorovou čočku tak, aby byla polní clona ostrá (bude vidět modrý a červený lem, zaostřit mezi, popř. blíže k modré) 12/48

13 Postup (2) pomocí centrovacích šroubů vycentrujeme kondenzorovou čočku tak, aby byla polní clona ve středu zorného pole otevřeme polní clonu těsně za zorné pole (snižuje přesvětlení, tj. pozitivně se projeví na kontrastu) nastavíme aperturní clonu (většinou ¾ NA objektivu) změna objektivu a/nebo vzorku vyžaduje nové nastavení 13/48

14 Nastavení aperturní clony kompromis kontrast spolu s hloubkou ostrosti rozlišení a barevné podání přesvícení (ztráta detailů, mnoho rozptýleného světla) optimum: vyšší rozlišení / nižší kontrast vysoký kontrast / nižší rozlišení ( přeclonění ) 14/48

15 Špatné vs. dobré nastavení 15/48

16 Špatné vs. dobré nastavení 16/48

17 Pracovní postup (přehled) zaostřit na vzorek při zcela otevřených clonách upravit intenzitu zdroje světla zavřít polní (kolektorovou) clonu zaostřit kondenzorovou čočku na polní clonu vycentrovat kondenzorovou čočku otevřít polní clonu těsně za zorné pole nastavit aperturní clonu 17/48

18 Mikrobiologie věda studující mikroorganismy (mikroby) nebuněčné formy (organismy?): priony (infekční prionová bílkovina) viry (a bakteriofágy viry bakterií) buněčné organismy: Bacteria Archea Eucarya (eukaryotní organismy) jednobuněčné mnohobuněčné 18/48

19 Lékařská mikrobiologie věda zabývající se mikroorganismy, které jsou medicínsky významné pro člověka (např. původci infekcí, přirozená mikroflóra atp.) zabývá se studiem a identifikací mikroskopických, růstových, biochemických i genetických vlastností bakterie bakteriologie mikromycety (plísně a kvasinky) mykologie (řasy) (algologie) parazité prvoci helminti členovci parazitologie protozoologie helmintologie entomologie viry virologie 19/48

20 Morfologie vybraných klinicky významných mikroorganismů viry, vláknité houby a paraziti až v jiných prakticích bakterie: koky, ve dvojicích (diplokoky), v řetízcích a ve shlucích tyčinky rovné či zahnuté (vibria), případně několikrát zahnuté (spirily), krátké nebo dlouhé, tvořící až vlákna či rozvětvená vlákna; konce mohou být oblé či špičaté; tyčinky můžou být různě uspořádané kokobacily (též kokotyčinky) spirochety tenké spirálovité bakterie pleomorfní (beztvaré) bakterie, například mykoplasmata (nemají buněčnou stěnu, takže nemají tvar) 20/48

21 Morfologie vybraných klinicky významných mikroorganismů (2) kvasinky: oválné buňky, dlouhé cca 5 10 μm (tzn. větší než bakterie) někdy pučící, někdy tvořící vlákna (pseudomycelia) Foto: archiv ústavu, převzato z 21/48

22 Morfologie vybraných klinicky významných mikroorganismů (3) 22/48

23 Vzorek vs. kmen kmen vzorek odebráno pacientovi, přichází na vyšetření do laboratoře kusový či tekutý materiál ve zkumavce či jiné nádobce (krev, sérum, moč...) stěr či výtěr na vatovém tamponu, obvykle v transportním médiu čistá kultura ( výpěstek ) jednoho druhu mikroba kmen získáme jedině kultivací (pěstováním) mikroba na pevné půdě Kochův objev, že bakterie lze takto pěstovat, měl zásadní význam v dějinách mikrobiologie někdy pracujeme s celým vzorkem, jindy je nutno získat ze vzorku kmen nebo kmeny patogenních mikrobů 23/48

24 Přímé vs. nepřímé metody přímé hledáme mikroba, jeho část či jeho produkt (produktem může být například nějaký bakteriální jed toxin) přímý průkaz ve vzorku pracujeme s celým vzorkem (močí, krví, výtěrem z krku atp.) identifikace kmene určení vypěstovaného izolátu nepřímé hledáme protilátky protilátka není součástí ani produktem mikroba (produkt makroorganismu, odezvou na činnost mikroba) 24/48

25 Přímé metody přehled Metoda Průkaz ve vzorku Identifikace kmene Mikroskopie ano ano Kultivace ano ano Biochemická identifikace ne ano Průkaz antigenu ano ano Pokus na zvířeti ano v praxi ne Molekulární metody ano v praxi ne* *netýká se molekulární epidemiologie (sledování příbuznosti kmenů) 25/48

26 Mikroskopie pozorujeme mikroby, v případě vzorku i buňky hostitelského organismu (epitelie, leukocyty apod.) nativní preparát velké a/nebo pohyblivé mikroby (parazity, houby, pohyblivé bakterie) nativní preparát v zástinu (hlavně spirochety) fixované a barvené preparáty barvení podle Grama, podle Giemsy, podle Ziehl-Neelsena (použití pro různé skupiny bakterií, hub či parazitů) elektronová mikroskopie u virů; spíše pro výzkum než pro běžný průkazu 26/48

27 Mikroskopie vzorku a kmene Foto: O. Zahradníček 27/48

28 Hlavní mikroskopické metody v klin. mikrobiologii Sušení a fixace Krycí sklíčko Imerzní systém Nativní preparát NE ANO NE Nativní zástinový preparát NE ANO ANO ANO NE ANO Barvené preparáty 28/48

29 Příprava mikroskopického preparátu vzorek tekutý vzorek na podložní sklíčko kápneme nátěr na špejli buď rozmícháme ve fyziologickém roztoku, nebo (pouze u barvených preparátů) přímo natřeme na sklíčko kmen kápneme na podložní sklíčko kapku fyziolog. roztoku vyžíháme mikrobiologickou drátěnou kličku v plameni po zchladnutí (!) nabereme trochu hmoty bakterií hmotu rozmícháme v připravené kapce 29/48

30 Příprava nativního preparátu kapku, ve které je vzorek či rozmíchaný kmen, nesušíme přikryjeme krycím sklíčkem a pozorujeme objektivy, které zvětšují např. 4, 10 či 40. nepoužíváme imerzní olej (!) 30/48

31 Úkol 2: Příprava nativního preparátu ze vzorku a z kultury Úkol 2a: Plastové zkumavky obsahují výtěry rozmíchané v médiu. Kápněte na sklíčko, kapku překryjete sklíčkem a pozorujte epitelie, popř. leukocyty, a mezi nimi mikroby. Úkol 2b: Provádíte pouze s kmenem X, je to kvasinka. Vyžíhanou kličkou naberete, rozmícháte, kličku opět vyžíháte, kapku překryjete sklíčkem a pozorujte (uvidíte pouze kvasinky). výsledky zakreslete a popište 31/48

32 Úkol 2: Ukázka nativního preparátu C. A. T. epiteliální bb. s adherovanými bakteriálními buňkami (malé tečky); pacientka s bakteriální vaginózou 32/48

33 Buněčná stěna bakterií grampozitivní mechanicky odolné buněčná stěna silná a jednoduchá gramnegativní chemicky odolné buněčná stěna tenčí a složitější Gramem se nebarvící bakterie 33/48

34 Buněčná stěna bakterií: peptidoglykan 34/48

35 Buněčná stěna bakterií: Gram pozitivní (G+) 35/48

36 Buněčná stěna bakterií: Gram negativní (G) 36/48

37 Gramovo barvení Chemikálie Grampozitivní Gramnegativní Krystal. violeť obarví se fialově obarví se fialově Lugolův roztok vazba se upevní upevní se méně Alkohol neodbarví se odbarví se Safranin zůstanou fialové obarví se červeně 37/48

38 Gramovo barvení G+ bakterie tlustší vrstva peptidoglykanu mureinu pevněji váže krystalová (genciánová) violeť vazbu upevníme Lugolovým roztokem neodbarví se alkoholem výsledná barva fialová G bakterie odbarví se alkoholem dobarví se na červeno safraninem (nebo karbolfuchsinem) 38/48

39 Bakterie nebarvící se Gramem mykobakteria acidorezistentní, stěna je hydrofobní nebarví se vůbec mykoplasmata nemají buněčnou stěnu vůbec cytoplasma se barví slabě na červeno velice špatně viditelná (nejen kvůli špatné barvitelnosti, ale i malé velikosti) spirochety G typ buněčné stěny, ale jsou velmi tenké Gramovo barvení se u nich také nepoužívá 39/48

40 Gramovo barvení: další buňky kvasinky barví se fialově (jako G+) specifická buněčná stěna (jiná než bakterie), která se jen chová jako G+ BS lidské buňky barví se většinou červeně (jádra mohou být i trochu do modra) artefakty různá vlákna, buněčná drť, artefakty vzniklé při barvení možná záměna za bakterie (!) 40/48

41 Úkol 3a: Příprava fixovaného preparátu na sklíčko kápněte dvě malé kapky fyziologického roztoku vyžíhejte kličku a nechte zchladnout kličkou opatrně naberte hmotu mikrobů (kmeny A E) jednou naberte tolik, aby nabraná hmota nebyla viditelná, do druhé kapky dejte hmoty více rozmíchejte v kapce kličku opět vyžíhejte a uložte zpět do stojanu kapku nechte uschnout sklíčko se zaschlou kapkou fixujte rychlejším protažením plamenem, a to třikrát 41/48

42 Úkol 3a: Gramovo barvení krystalová violeť: (20 ) 30 sekund (opláchnout vodou lze vynechat) Lugol. roztok: (20 ) 30 sekund (opláchnout vodou lze vynechat) Alkohol: do viditelného výstupu barviva (cca sekund) opláchnout vodou nezbytné!!! Safranin: 60 sekund opláchnout vodou osušit filtračním papírem (stačí papír z obou stran přiložit 42/48

43 Úkol 3b: Pozorování vzorku sputa obarveného podle Grama prohlédněte si předložené preparáty při zvětšení 1000x (použijte imerzi) zakreslete výsledek pozorování, popište i případné artefakty sklíčka po prohlédnutí nevyhazujte (!) 43/48

44 Úkol 4a: Další mikroskopické metody jednoduché barvení: nouzové řešení, znázorňuje tvar velikost a uspořádání mikrobů barvíme methylenovou modří (cca 2 minuty) Giemsovo barvení: pro některé prvoky, hlavně Trichomonas vaginalis a Plasmodium sp. (původci malárie) barvení dle Ziehl-Neelsena: pro acidorezistentní bakterie, zejména Mycobacterium tuberculosis, ale také Actinomyces sp. a Nocardia sp.; barví se i někteří prvoci (kokcidie) 44/48

45 Úkol 4a: Další mikroskopické metody (2) Gomoriho trichrom: barvení alciánovou modří: na polysacharidové hmoty v bakteriálním biofilmu zástinová mikroskopie: pro střevní jednobuněčné parazity (Giardia intestinalis, Entamoeba histolytica atd.) zvláštní případ nativního preparátu, vhodný zvláště u spirochet fluorescenční barvení: fluorescenční barviva; nutno odlišit od imunofluorescence 45/48

46 Úkol 4b: Barvení pouzder dle Burriho v barvení dle Burriho byly nabarveny bakterie na červeno a pozadí dobarveno tuší mikroskopista pak tuší pouzdro tam, kde se nic neobarvilo pathmicro.med.sc.edu 46/48

47 Praktické poznámky objektivy se utírají zásadně gázou (jednou použitá gáza se vyhodí a nepoužívá znovu) mikroskopický stolek lze otřít buničitou vatou; s benzínem, pokud je třeba (po použití se vyhodí) pokud pracujete s imerzí, očistěte imerzní objektiv gázou s benzínem případně takto očistěte i další objektivy, pokud jste je znečistili mikroskop vypněte a zakryjte 47/48

48 Po tomto cvičení byste měli umět: pracovat s mikroskopem vysvětlit obor zájmu lékařské mikrobiologie orientovat se ve tvarech a možných uspořádání mikrobů připravit nativní preparát vzorku i kmene znát nejrůznější barvící metody nabarvit preparát podle Grama a vyhodnotit jej 48/48