Kapitola 3 Biomolecular Design and Biotechnology. Překlad: Jaroslav Krucký

Transkript

1 Kapitola 3 Biomolecular Design and Biotechnology Překlad: Jaroslav Krucký

2 Problémy chemie a biologie mohou být velmi nápomocné, jestliže se naše schopnost vidět to, co děláme, a dělat věci na atomární úrovni, nakonec vyvine - vývoj, kterému se myslím nelze vyhnout. -Richard Feynman

3 Dnes máme bohatou paletu metod pro dělání věcí na atomární úrovni. Chemici už konstruovali molekuly atom po atomu v době, kdy Richard Feynman měl své vizionářské projevy, a dnes je chemie mocný nástroj pro vytváření molekul i z několik desítek atomů. Během doby od Feynmanovi řeči, oblasti fyziky a biologie přinesly další metody pro práci v atomovém měřítku. Fyzici mají kontrolu nad atomy díky mikroskopii atomárních sil a chytají je pomocí optické pinzety, a biologové využívají bohatou sbírku přírodní bionanomašinérie k vývoji našich vlastních molekulárních prací.

4 Současné biotechnologické metody vynikají v modifikaci. To je silná schopnost, která využívá rozsáhlý soubor pracovních nano strojů, které jsou dostupné z přírodních zdrojů. Můžeme zavést specifické změny do plánů pro daný protein, nebo můžeme spojovat dohromady plány několika různých proteinů a vytvářet tak hybridní molekuly s kombinovanou funkcí. Pomocí těchto modifikovaných plánů, můžeme pak nařídit bakterii, aby produkovala velké množství mutovaných nebo chimérických proteinů. Tisíce akademických a průmyslových laboratoří používají tyto metody pro medicínské, bioremediační a nespočet dalších aplikací. A několik zajímavých nových technik, založených na biologické evoluci, popsaných v kapitole 6, umožňuje testování tisíce úprav současně, což značně urychluje objev biomolekul s novými funkcemi.

5 Na druhou stranu návrh zcela nových bionanostrojů, je v současné době těžší než modifikace přírodních bionanostrojl. Vývoj vytvořil komplexní stroje s jemnými mechanismy, zahrnující flexibilitu a stavbu sama sebe způsoby, které je obtížné předvídat a navrhnout. Projektování bionanostrojů od nuly, je v současné době velkou výzvou, která je pod intenzivním studiem v mnoha laboratořích. V ideálním případě chceme úplnou kontrolu. Například bychom mohli chtít stavět "nanotrubičkovou syntázu", která konstruuje uhlíkových nanotrubky definovaných velikostí a geometrie. Chtěli bychom být schopni si sednout k počítači a navrhnout protein, který by se složil do stabilní struktury a vytvářel tak aktivní část, která by prováděla tyto chemické reakce. Bohužel v našich znalostech existují mezery, které, než tato funkce bude možná, musí být vyplněny. Dnes nemůžeme spolehlivě předpovědět složenou strukturu proteinu z jeho chemické sekvence, a vzhledem k tomu nemůžeme důsledně předvídat jehoh chemické aktivity. Ale tyto dva kroky jsou v současné době pod dohledem vědců s očekáváním, že budou v dohledné budoucnosti vyřešeny. Pak bude opravdový biomolekulární design realitou.

6 Rekombinační DNA technologie Rekombinační DNA technologie je základní schopností bionanotechnologií. Tato technologie nám umožňuje postavit jakékoli bílkoviny, a to jednoduše změnou genetických plánů, které jsou používány pro jejich stavbu. Dva přírodní enzymy - restrikční enzymy a DNA ligáza-jsou klíčem k rekombinační DNA technologii, která nám umožňuje upravovat informace ve vlákně DNA (obr.3-1). Před objevem těchto enzymů, upravili výzkumníci genetický kód živých organismů pomocí vlastních biologických nástrojů páření a křížení nebo náhodné mutageneze s chemikáliemi či ionizujícím zářením. Dnes vědci racionálně mění genetický kód na atomární úrovni.

7 Rekombinační DNA technologie Rekombinační DNA technologie závisí na dvou klíčových enzymech. Restrikční enzymy, jako je EcoRI - na obrázku vlevo, dělí DNA na specifické sekvence. Tyto enzymy často produkují během střihu "lepivé konce", jak je uvedeno ve středu. DNA ligáza, na obrázku vpravo, spojuje dva prvky dohromady.

8 Rekombinační DNA technologie Restrikční enzymy jsou neuvěřitelně užitečné enzymy. Jsou vytvořeny bakteriemi, aby se chránily před virovou infekcí. Bakterie vytváří restrikční enzym, který štěpí DNA v jedné konkrétní sekvenci. Současně chrání vlastní DNA úpravou bází v té samé sekvenci, takže restrikční enzym neštěpí vlastní genom. Nicméně napadající virová DNA je okamžitě rozsekána restrikčním enzymem, protože není takto chráněna. Mnoho restrikčních enzymů stříhají nezávisle na sobě dvě vlákna DNA, místo přestřižení obou ramen rovnou přes šroubovici DNA. Tady je místo, kde nabízí své užití pro tyto enzymy. Tyto konce jsou "lepivé" a snadno spojitelné s jinými lepivými konci podobné sekvence.

9 Rekombinační DNA technologie Takže restrikční enzymy mohou být použity ke stříhání DNA, při kterém produkují lepivé konce, které mohou být zpětně složeny s různou orientací. Takže restrikční enzymy, které byly vytvořeny pouze pro své ničivé schopnosti, jsou nyní nástrojem pro atomárně přesné změny velkých kusů DNA. Dnes technologie rekombinační DNA vzkvétá. Chytří vědci neustále objevují nové metody využití bílkovinových produkčních mašinerií buněk novými způsoby. Konzistentní metody, často ve formě komerčních souprav, jsou k dispozici pro všechny možné procesy. Můžeme najít a extrahovat konkrétní geny z organismů. Můžeme duplikovat a určit sekvence velkého množství těchto genů. Můžeme mutovat, rekombinovat a spojovat tyto geny nebo vytvořit zcela nové geny nukleotid za nukleotidem. Konečně můžeme nahradit geny v buňkách změnou jejich genetické informace.

10 Rekombinační DNA technologie Výzkumníci používají širokou škálu přírodních biomolekul pro manipulaci s DNA. Jsou k dispozici dobře popsané protokoly a komerční zdroje pro tyto enzymy, takže jsou tyto procesy dostupné každé skromné laboratoři. Některé z nejdůležitějších biomolekul jsou:

11 Rekombinační DNA technologie Restrikční enzymy jsou izolovány z bakterií. Komerčně dostupných je více než 100 typů. Každý z nich stříhá DNA ve specifickém pořadí bází. Restrikční enzymy se typicky skládají ze dvou identických podjednotek, takže útočí na DNA symetricky a stříhají v palindromických sekvencích.

12 Rekombinační DNA technologie DNA ligáza připojí rozbité řetězce DNA. Když se dva lepkavé konce rozpojí, DNA ligáza se používá pro opětovné spojení.

13 Rekombinační DNA technologie DNA polymeráza vytváří novou DNA tak, že jako šablonu používá jiný řetězec, vytváří dvojitou šroubovici z jediného řetězce. To je používáno k vyplnění mezery a zkopírování celých kusů DNA.

14 Chemická syntéza DNA dokonale doplňuje tyto přírodní biomolekulární nástroje pro manipulaci s DNA. Současné metody umožňují automatizovanou syntézudna řetězců dlouhých asi 100 nukleotidů. Dva vzájemně se doplňující řetězce jsou snadno konstruovány a žíhány v roztoku, aby vytvořily dvojité šroubovice. Krátké oligonukleotidy jsou běžně syntetizovány a jsou komerčně dostupné. Jakmile je nová DNA je postavena, vyrábí se jich velké množství pomocí dvou hlavních metod: Klonováním DNA a polymerázovými řetězovými reakcemi. Termín "klonování"se odkazuje na vytvoření identické kopie bez normálních procesů pohlavního rozmnožování: kopie myší nebo ovce, stejné kultury buněk nebo v tomto případě mnoho identických kopií konkrétního fragmentu DNA. V DNA klonování je používána bakteriální buňka k vytvoření mnoha identických kopií DNA sekvence. Jednou z metod je vložit požadovanou DNA sekvenci do viru, který pak infikuje bakteriální buňky a nutí je k tvorbě množství kopií.

15 Alternativně může být použit bakteriální plasmid. Bakterie přirozeně obsahují, kromě své hlavní genomu, malé kruhy plazmidů DNA. Pro naklonování sekvence DNA, ji přidáme do bakteriálního plasmidu, který vložíme do bakterie. Plasmid je pak zkopírován pokaždé, když se bakterie rozdělí a tvoří tak během svého dělení velké množství DNA Polymerázová řetězová reakce (PCR) je metoda pro kopírování malého vzorku DNA. Využívá efektivní, tepelně-stabilní DNA polymerázy izolované z bakterií, které žijí v horkých pramenech. Jak je ukázáno na obrázku 3-3, PCR probíhá v cyklech a zdvojnásobuje počet řetězců DNA na každém kroku. PCR je tak mocná, že můžete začít s jedním vláknem DNA a získat kolik potřebujete.

16 Obrázek 3-3 Přes opakovaná kola syntézy DNA a oddělení dvou řetězců, polymerázová řetězová reakce zvýší množství DNA ve vzorku. (1) Proces začíná s jediným řetězcem DNA. (2) Je oddělen zahřátím, a na konce se přidají krátké primerové řetězce. (3) DNA polymeráza vytvoří nový řetězec s použitím separovaného řetězce jako šablony. (4) Na konci cyklu jsou dvě identické DNA dvoušroubovice. Tento cyklus se opakuje, zdvojnásobujeí DNA na každém kroku. Použití tepelněstabilní polymerázy je trik k tomuto automatickému procesu, protože může přežít zahřívací krok každého cyklu.

17 V mnoha případech můžeme chtít, aby se pomocí několika malých změn na stávající přírodní protein, přizpůsobila jeho funkce pro danou aplikaci. Místem řízená mutageneze se používá v těchto případech ke změně pořadí aminokyselin v proteinu tím, že se provádí konkrétní změny ve stávajícím genu. Tímto způsobem můžeme vytvářet atomicky přesné změny ve struktuře proteinů, měnit strukturu a funkci. Pro úpravy stávajících genů je k dispozici široká škála metod. Některé z těchto metod jsou tak spolehlivé, že jsou k dispozici jako balené sady z komerčních zdrojů.

18 Místa specifikované mutace jsou vhodně zavedeny do stávajících genů se speciálně konstruovaným oligonukleotidy, jak je znázorněno na obr Tyto krátká vlákna nahradí normální sekvence DNA, s výjimkou v bodě, kde je žádoucí změna. Změna může spočívat v jediné změně aminokyseliny nebo krátkém vložení nebo vymazání. Jakmile je provedena změna, užije se klonování a exprese ke konstrukci modifikovaného proteinu. Místem řízená mutageneze způsobila převrat v molekulární biologii. Je to extrémně silná metoda pro stanovení funkcí specifických aminokyselin nebo regionů v rámci proteinu. Například, mohou být naráz mutovány jednotlivé aminokyseliny, které by mohly nahradit funkci. Tímto způsobem může být lokalizováno aktivní místo enzymu nebo vazebné místo pro hormon. Místem řízená mutageneze je také široce používána v pokusech o zlepšení stability proteinů, upravováním v cross-linkujících zbytcích nebo zlepšení vybavení reziduí v rámci proteinu (obr. 3-5). Tyto metody jsou nicméně pokořující. Až příliš často zjišťujeme, jak těžké to je předvídat změny, které nenaruší stabilní strukturu a funkce přírodních proteinů

19 Obrázek 3-4 V místem řízených mutagenezích jsou konkrétní změny začleněny do genů pomocí speciálně konstruovaných malých oligonukleotidů. Oligonukleotid nahradí gen, s výjimkou místa, kde je požadovaná změna. K provedení změny je krátký oligonukleotid žíhaný za podmínek, které umožňují párování přes neshody na požadované místo. DNA polymeráza je pak použita k vyplnění zbytku sekvence DNA tak, že použije tento krátký oligonukleotid jako primeru. Tento navržený řetězec je pak oddělen a původní DNA je zlikvidovat. Výsledkem je řetězec komplementární k původní DNA, avšak se změnami na místě, kde byl navázán oligonukleotid.

20 Obrázek 3-5 Enzym lysozym byl značně přetvořen při hledání způsobu, jak zlepšit jeho funkci a stabilitu. Nativní enzym je zde na vlevo se dvěma aminokyselinami na opačných koncích řetězce bílkoviny, znázorněnými růžovou barvou. Když se protein skládá, tyto dvě aminokyseliny skončí v této struktuře blízko samy sobě. V jedné navržené verzi lysozymu, na obrázku vpravo, byly tyto dvě aminokyseliny změněny na cystein. Když se protein složí, tyto dva cysteiny vytvoří disulfidickou vazbu, naznačenou červenou barvou, která zpevňuje složenou strukturu.