Laboratorní kolečko v zimním semestru modul: Buněčné základy medicíny

Transkript

1 Laboratorní kolečko v zimním semestru modul: Buněčné základy medicíny B1 B2 B3 B4 Stanovení koncentrace kreatininu v moči (spektrofotometrie) Chromatografické metody (TLC a HPLC) Stanovení acidity žaludeční šťávy (titrace) Měření ph fosfátového pufru (potenciometrie) Obecné informace Praktická cvičení z biochemie jsou součástí modulu Buněčné základy medicíny vyučovaném v 1. ročníku magisterského oboru Všeobecné lékařství. Cílem praktik je názorně přiblížit využití teorie v laboratorní praxi. Všechny prováděné úlohy seznamují studenty s aplikací biochemie v klinické medicíně. V 1. semestru jsou do výuky zařazeny laboratorní úlohy zaměřené převážně na seznámení studentů s běžně používanými analytickými metodami, důraz je kladen i na prohloubení manuálních dovedností studentů. Jak postupovat v přípravě na praktika? 1. Před prvním praktikem je student povinen seznámit se s pravidly bezpečné práce v laboratoři (= samostatný dokument, viz. Před zahájením práce studenti podepisují, že s bezpečnostními předpisy byli seznámeni. 2. Dále je nezbytné obstarat si potřebné laboratorní pomůcky: bílý laboratorní plášť lihový popisovač na sklo psací potřeby, včetně sešitu na poznámky kalkulačku volný list papíru formátu A4 na vypracování protokolu na úlohu B1 milimetrový papír formátu A5 3. Před praktikem doporučujeme seznámit se s laboratorním vybavením, které bude student během praktik používat. Práci se základními laboratorními pomůckami si studenti před prvním praktikem vyzkouší pod vedením svého vyučujícího. K dispozici je i elektronická prezentace používaných laboratorních pomůcek (viz Domácí příprava na praktika zahrnuje řádné prostudování laboratorní úlohy (viz. tato skripta), tj. seznámení se s teorií používané laboratorní metody a s postupem práce daného experimentu (což ovšem neznamená, že je nutné se naučit postup zpaměti :) 5. Student řádně připravený na praktika by měl být schopen odpovědět si na otázky: Co je cílem daného experimentu? Jaký je obecný postup vedoucí k danému cíli? Jaký je princip používané analytické metody (tj. jak daná metoda funguje)? 6. Součástí každého návodu laboratorní úlohy jsou i požadované znalosti, které student musí mít před zahájením práce. Během praktika bude každý přezkoušen z pochopení dané laboratorní úlohy a z teorie, která s úlohou souvisí. 7. Student je povinen seznámit se s požadavky na vypracování pracovního protokolu, viz. níže. Řádně vypracovaný protokol je podmínkou pro absolvování každé laboratorní úlohy. Pracovní protokol vypracovává každý student samostatně, a to již během práce v laboratoři. Před odchodem z laboratoře musí být protokol odevzdán vyučujícímu, který jej zkontroluje a případně vrátí studentovi k přepracování. Správně vypracovaný protokol vyučující podepíše - úloha je tak studentovi uznána jako absolvovaná. Doporučujeme protokoly uschovat až do doby, dokud nemá student udělen zápočet (protokoly slouží jako doklad o absolvování praktika). 1

2 Protokol obsahuje: 1) jméno a příjmení studenta + číslo studijního kroužku 2) datum 3) číslo a název úlohy 4) cíl práce (formulován stručně, vlastními slovy) 5) princip použité analytické metody (stručně, vlastními slovy) 6) případné odchylky od pracovního postupu (do protokolu neopisujte postup práce, ani seznam laboratorního vybavení) 7) všechny naměřené hodnoty 8) použité výpočty (vztahující se k přípravě analýzy i k jejím výsledkům), u úlohy B1 přiložený kalibrační graf na milimetrovém papíru 9) výsledky shrnuté v přehledné tabulce (včetně identifikačního čísla neznámého vzorku, pokud je součástí experimentu) 10) závěr obsahující odpověď na všechny zadané úkoly, včetně zhodnocení výsledků vlastními slovy Vzor správně vypracovaného protokolu Bonifác Ježíšek / kruh 9 Datum: Úloha: B5 / Stanovení koncentrace bilirubinu v séru Cíl práce: Naším cílem bylo zjistit koncentraci bilirubinu ve vlastním séru a v kontrolním vzorku pomocí spektrofotometrie. V obou vzorcích jsme zjišťovali dvě hodnoty: koncentraci celkového bilirubinu a koncentraci bilirubinu konjugovaného. Výsledky jsme porovnali s fyziologickým rozmezím hodnot. Princip použité laboratorní metody: Spektrofotometrie je analytická metoda založená na absorpci monochromatického záření stanovovaným analytem. Čím větší je koncentrace analytu ve vzorku, tím vyšší je hodnota absorbance (Lambert-Beerův zákon: A = c x l x e, kde A = absorbance, c = molární koncentrace, l = tloušťka optické vrstvy, e = molární absorpční koeficient). Pomocí známé koncentrace bilirubinu ve standardním vzorku a z naměřených hodnot absorbance lze vypočítat koncentraci bilirubinu v séru i v kontrolním vzorku: c vz / A vz = c st / A st Celkový bilirubin (= bilirubin konjugovaný + nekonjugovaný) se stanovuje po přeměně bilirubinu na azobarvivo, které absorbuje ve viditelné oblasti. Konjugovaný bilirubin lze stanovit po přidání činidla přímo (odtud jeho alternativní název "přímý bilirubin"), zatímco pro stanovení celkového bilirubinu je nutno přidat akcelerátor, který uvolňuje frakci nekonjugovaného (nepřímého) bilirubinu z vazby na albuminu a tím umožní jeho rychlé fotometrické stanovení. Postup: Postupovali jsme přesně podle návodu. Jedinou odchylkou byl počet analyzovaných roztoků: pro zvýšení přesnosti jsme každý vzorek analyzovali dvojmo, jako výsledek jsme uvedli průměrnou hodnotu obou stanovení. Naměřené hodnoty: absorbance standard kontrolní vzorek č. 5 sérum blank celkový bilirubin 0,690 0,322 0,083 0,700 0,326 0,087 0,695 0,324 0,085 0,016 přímý bilirubin 0,124 0,015 0,011 0,125 0,017 0,011 0,125 0,016 0,011 0,005 Výpočty: c vz / A vz = c st / A s tc vz = (c st / A st) x A vz Absorbance blanku byla od všech dalších naměřených absorbancí odečtena automaticky spektrofotometrem (po vynulování přístroje na destilovanou vodu jsme změřili absorbanci blanku a vynulovali spektrofotometr ještě jednou na tuto hodnotu). Výsledky: koncentrace (µm) standard (zadáno) kontrolní vzorek č. 5 sérum celkový bilirubin přímý bilirubin Závěr: Koncentrace bilirubinu ve vlastním séru se nacházejí v rozmezí fyziologických hodnot (celkový bilirubin: 3,4-17,1 µm, konjugovaný bilirubin 0-3,4 µm). V kontrolním vzorku č. 5 jsme nalezli zvýšenou hodnotu celkového bilirubinu, zatímco konjugovaný bilirubin zvýšen nebyl. Příčinou může být poškození jater pacienta, případně zvýšená hemolýza erytrocytů. Výsledky nalezené v kontrolním vzorku se liší od očekávaného výsledku, který nám sdělil vyučující, o 3%, což je v mezích povolené odchylky pro danou analytickou metodu (10%). Z toho lze usuzovat i na správnost výsledku koncentrace bilirubinu zjištěnou ve vlastním séru. Bonifác Jezísek 2

3 Organizace praktik Na praktika je nezbytné chodit včas, podle platného rozvrhu svého kroužku. Při pozdním příchodu musí student praktikum nahradit v náhradním termínu (viz. níže). Laboratorní úlohu vypracovávají studenti ve dvojicích (mimořádně ve trojici; celý kruh je rozdělen na 8 pracovních skupin), pracovní protokol však píše každý student samostatně. V 1. semestru probíhají praktika 4 týdny za sebou, v každém týdnu jsou řešeny všechny čtyři úlohy (vždy dvě pracovní skupiny vypracovávají stejnou úlohu, v dalším týdnu řeší úlohu následující: studenti se ve vypracování úloh střídají podle "kolečka", viz. obrázek). KOLEČKO jednotlivých úloh v 1. semestru: B1 B4 B2 B3 Vypracování každé úlohy probíhá následovně: 1. převléknout se do pracovního pláště již v šatně, do laboratoře vzít jen potřebné pomůcky 2. přečíst si celý postup práce najednou (je k dispozici v laboratoři, není nutno si nosit vlastní kopii) 3. rozmyslet si návaznost jednotlivých pracovních kroků 4. postupovat podle návodu krok za krokem 5. během práce psát průběžné poznámky do protokolu (např. případné odchylky od návodu, naměřené hodnoty,...) 6. umýt používané laboratorní nádobí, uklidit po sobě pracovní stůl 7. umýt si ruce mýdlem, případně v desinfekčním roztoku 8. vypracovat pracovní protokol 9. protokol odevzdat vyučujícímu Náhrada praktika je možná s jiným kruhem, avšak pouze po předchozí domluvě s příslušným vyučujícím, který náhradu povolí jen pokud je v laboratoři volné místo. Další možnost náhrady praktik je ve zkouškovém období daného semestru, v němž byla praktika zařazena do rozvrhu (tj. praktika z 1. semestru není možno nahrazovat ve zkouškovém období po 2. semestru). Ve zkouškovém období ZS bude vypsán jeden termín, v němž je možno nahradit všechna nesplněná praktika. Všechna praktika musí být splněna do konce zimního semestru, termín odevzdání protokolů určí vyučující. Literatura Na základní zvládnutí praktik je dostatečnou studijní literaturou tento dokument, doplněný o prostudování pravidel bezpečnosti práce, které jsou dostupné na internetu ( Zájemce o další informace najde odkazy na doporučenou literaturu přímo v návodech jednotlivých úloh. Další informace k analytickým metodám: Praktikum z lékařské chemie a toxikologie (skripta UK, 1994) / Z. Bardoděj, E. Samcová, J. Urban Chemické principy metod klinické biochemie (Karolinum, 1998) / J. Prokeš, K. Vulterin, B. Černý 3

4 Stanovení koncentrace kreatininu v moči (B1) ÚVOD Kreatinin je cyklická dusíkatá organická látka. Vzniká ve svalech jako konečný produkt degradace kreatinfosfátu, který je energetickou rezervou pro svalový stah (slouží k doplňování ATP). Kreatinin je tedy odpadním produktem svalového energetického metabolismu: kreatin kreatinfosfát kreatinin (dusíkatá látka odvozená z aminokyselin Gly, Arg, Met) (energeticky bohatá forma kreatinu sloužící ve svalu jako zdroj energie) (anhydrid kreatinu, je vylučován močí) CH 3 CH 3 HOOC N NH N NH + H 2 O kreatin NH 2 O NH kreatinin Množství kreatininu v organismu je přímo úměrné množství svalové hmoty. Kromě endogenní syntézy se však tato látka dostává do organismu také potravou. Ze svalu je kreatinin uvolňován do krve, odkud se dostává do moči a je tak z těla vyloučen. Za normálních podmínek je poměr produkce a exkrece kreatininu konstantní, oba pochody jsou v rovnováze. Kreatinin přechází do moče glomerulární filtrací a tubulární sekrecí (tj. většina kreatininu se do moči dostane filtrací krve a další část je do moči ještě sekretována tubulárními buňkami ledvin). Zpět do krve se nevstřebává (narozdíl od většiny dalších endogenních látek). Množství secernované tubuly roste s jeho vzrůstající koncentrací v séru. Denní exkrece kreatininu může být o % vyšší než syntéza, což souvisí s příjmem kreatinu a kreatininu v mase, masných výrobcích a polévkách. Obecně závisí množství kreatininu vyloučeného za 24 hodin na množství svalové hmoty, dietě a funkci ledvin. Skutečnosti, že se veškerý v ledvinách profiltrovaný kreatinin vyloučí močí, se využívá v klinické praxi. V laboratoři se stanovuje koncentrace kreatininu v séru i v moči (nejčastěji střádané 24 hodin). Zvýšené koncentrace v séru ukazují na poškození ledvin. Z vyšetření koncentrace kreatininu v séru i moči zároveň lze hodnotit filtrační schopnost ledvin (vyšetření zvané creatininová clearance). V moči se stanovuje buď látková koncentrace (= molarita), nebo látkový tok (= odpad močí za 24 hodin). Celkové denní množství vyloučeného kreatininu je poměrně konstantní a při správné funkci ledvin odpovídá hmotnosti a aktivitě svalstva. Využití: odhad glomerulární filtrace z hodnoty clearance kreatininu: při normální funkci ledvin odpovídá clearance kreatininu glomerulární filtraci, s pokračujícím poškozením ledvin však klesá pomaleji než odpovídá skutečnému poklesu glomerulární filtrace (příčinou je zvýšená sekrece kreatininu do moči v tubulech) odhad úplnosti sběru moči: odpad kreatininu vztažený na kg hmotnosti se pohybuje v úzkém rozmezí, neboť závisí na množství svalové hmoty; pokud je odpad nižší více jak o 30 % než očekávaná vypočítaná hodnota, jde téměř s jistotou o neúplný sběr moči za 24 hod. ukazatel míry zředění moči: hodnota látkového množství se naředěním nebo zahuštěním roztoku nezmění, zatímco hodnota koncentrace ano: čím je nižší objem moče (např. při dehydrataci, nerovnoměrném příjmu tekutin) tím je koncentrace všech látek v moči vyšší; c = n/v pro standardizaci odpadu látek močí: pokud neznáme objem vyšetřované moči, lze koncentrace látek vylučovaných močí vztáhnout na 1 mmol vyloučeného kreatininu, což eliminuje vliv zředění či zakoncentrování moči 4

5 Fyziologické hodnoty: sérum µmol/l moč 5,7-14,7 mmol/l Literatura: Masopust, J.: Klinická biochemie. Požadování a hodnocení biochemických vyšetření. Karolinum, Praha, ISBN Racek, J. et al: Klinická biochemie, 1. vydání. Galén, Praha, ISBN Karolinum, Praha, ISBN POUŽITÁ ANALYTICKÁ METODA Kreatinin se nejčastěji stanovuje spektrofotometricky, používané přístroje se nazývají spektrofotometry. Spektrofotometrie je analytická metoda založená na interakci elektromagnetického záření s analyzovaným roztokem. Část záření je pohlcena (absorbována) analyzovanou látkou, zbývající záření, které analyzovaným roztokem projde, je detekováno detektorem. Intenzita záření po průchodu vzorkem (I) je menší než původní intenzita záření (I 0 ) do vzorku vstupující: I < I 0. Množství pohlceného záření závisí na množství analyzované látky ve vzorku: čím vyšší je koncentrace dané látky, tím více záření je pohlceno. Mnoho látek přítomných v biologických tekutinách (hlavně krvi a moči) je v klinických laboratořích analyzováno spektrofotometricky. Schéma spektrofotometru: I 0 I zdroj čočka štěrbina monochromátor vzorek v kyvetě detektor Pro spektrofotometrickou analýzu barevných roztoků se používá elektomagnetické záření v oblasti viditelného světla (VIS, λ = nm), zdrojem světla je žárovka. Dále je časté použití ultrafialového záření (UV, λ = nm), kterým můžeme analyzovat i roztoky bezbarvé, zdrojem světla bývá nejčastěji deuteriová výbojka. Každá látka absorbuje záření určité vlnové délky (obsahuje tzv. chromofory schopné toto záření pohltit). Záření určité vlnové délky se označuje jako monochromatické. Získá se rozkladem polychromatického záření (u VIS jde o rozklad bílého světla emitovaného žárovkou) pomocí optické mřížky nebo hranolu. Vhodným nastavením štěrbiny za monochromátorem vstupuje do kyvety jen záření o určité vlnové délce, ostatní vlnové délky se odrážejí pod jiným úhlem. Podle oblasti elektromagnetického záření se volí použité kyvety: skleněné pro VIS, křemenné pro UV oblast (UV záření je sklem pohlcováno); v současné době se používají i speciální plastové kyvety. Principem analýzy prováděné v praktickém cvičení je metoda, která je založena na Jaffého reakci. Kreatinin je bezbarvá látka, ale v alkalickém prostředí reaguje s kyselinou pikrovou za vzniku červenooranžově zbarveného produktu. Množství tohoto produktu je přímoúměrné množství kreatininu. Jelikož jde o látku barevnou, můžeme ji stanovit spektrofotometricky ve viditelné oblasti spektra. Doplňkové barvy viditelného světla (viz. také Obr.1): Pokud roztok absorbuje určitou vlnovou délku viditelného spektra (viz. prostřední sloupec tabulky), jeví se nám tento roztok jako barevný. Ostatní vlnové délky roztokem projdou, avšak pozorované zbarvení roztoku je dáno tzv. doplňkovou (komplementární) barvou k barvě pohlcené (viz. sloupec vpravo): 5

6 vlnová délka (nm) absorbovaná část VIS spektra komplementární - propuštěná barva (= určuje zbarvení roztoku ) fialová žlutá modrá žlutooranžová zelenomodrá oranžová modrozelená červenooranžová zelená červená žlutozelená purpurová žlutá fialová oranžová modrá červená zelená Příklady: pokud roztok absorbuje záření mezi 400 a 480 nm (modrofialová), bude propouštět všechny ostatní barvy, které budou okem vnímány jako barva žlutooranžová; znamená to, že žlutooranžová barva je komplementární k barvě modrofialové pokud necháme procházet bílé světlo roztokem, který absorbuje záření mezi 505 a 555 nm (zelená), propuštěné záření a tudíž i zbarvení roztoku budou vnímány v barvě červené; původní bílé světlo obsahovalo všechny vlnové délky VIS v určitém poměru, tento poměr byl průchodem světla roztokem narušen a světlo tudíž změnilo barvu pokud necháme procházet červeným roztokem červené světlo, bude toto záření propuštěno, neboť červený roztok červené záření neabsorbuje; naopak zelené záření (zelená je komplementární k červené) bude při průchodu červeným roztokem pohlcováno Obr.1 Komplementární barvy se nacházejí v kolečku naproti sobě Z uvedeného vyplývá, že pro spektrofotometrické stanovení musíme vybrat takovou vlnovou délku, která bude analyzovanou látkou nejvíce pohlcována. Optimální je, pokud je tato vlnová délka současně co nejméně pohlcována ostatními látkami přítomnými v roztoku. Vhodná vlnová délka se zjišťuje před vlastní spektrofotometrickou analýzou: proměří se tzv. absorpční spektrum jako závislost schopnosti absorbovat záření různých, kontinuálně měněných vlnových délek (viz. Obr.2). Pro vlastní analýzu se vybírá vlnová délka, která je analyzovanou látkou nejvíce pohlcována. 6

7 Obr.2 Příklad absorpčního spektra analyzované látky: maximální absorbce byla nalezena kolem 500 nm Princip spektrofotometrie: Při spektrofotometrii vycházíme z Lambert-Beerova zákona, který vyjadřuje vztah mezi koncentrací látky v roztoku a její absorbancí, tj. schopností molekul látky pohlcovat elektromagnetické záření o dané vlnové délce. Při průchodu světelného toku roztokem tak dochází k jeho zeslabení, protože částice látek přítomných v roztoku část elektromagnetického záření pohltí (absorbují). Záření, které projde kyvetou dopadá na detektor, který měří jeho intenzitu. Z tohoto důvodu je zavedena veličina zvaná transmitance (propustnost), která je definována vztahem: T = I / I 0 kde I 0 = intenzita záření vstupujícího do kyvety; I = intenzita záření po průchodu kyvetou; transmitance (T) nabývá hodnot 0 až 1:nulovou hodnotu má pokud je veškeré záření pohlceno, hodnotu 1 naopak tehdy, pokud kyvetou veškeré záření projde Někdy se transmitance vyjadřuje v procentech: T = (I / I 0 ) x 100 tj. nabývá hodnot 0 až 100 % Množství absorbovaného záření lze vypočítat z hodnoty transmitance: A = - log T = log (1/T) T = 10 -A Veličina A se nazývá absorbace a je definována jako záporně vzatý dekadický logaritmus transmitance. Nabývá hodnot od nuly výše, většinou měříme v rozmezí 0 až 1,5 (nebo méně). Vyšší hodnoty absorbance již bývají málo přesné, měření vždy závisí na citlivosti detektoru (neboť např. A = 2 odpovídá T = 0,01, tj. pouze jedno procento z původní intenzity záření dopadlo na detektor; pro A = 3 je T = 0,001, tj. na detektor dopadá jen 0,1 % z původní intenzity záření). Lambert-Beerův zákon: A = c. l. e nebo T = 10 -c.l.e A = absorbance; c = molární koncentrace; l = délka kyvety, resp. tloušťka vrstvy roztoku, kterou prochází záření; e = molární absorpční koeficient (tabelovaná hodnota); T = transmitance; Lambert-Beerův zákon platí pro monochromatické záření a obor nízkých koncentrací, řádově menších než 10-2 mol. l -1. Z Lambert-Beerova zákona vyplývá, že čím je koncentrace látky v roztoku vyšší, tím je vyšší hodnota naměřené absorbance (tj. absorbance je přímo úměrná koncentraci a naopak). Tato závislost je lineární, neboť Lambert-Beerův zákon připomíná rovnici přímky (A = c. l. e y = kx + q, kde x odpovídá hodnotě c, hodnota l.e odpovídá k, tj. směrnici přímky; q = 0, tj. závislost absorbance na koncentraci prochází počátkem), viz. Obr.3 U barevných roztoků naměříme ve viditelném spektru tím větší absorbanci, čím větší je jejich intenzita zbarvení (= tmavší, koncentrovanější roztok). 7

8 Kalibrační křivka a b so rb a n ce A 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, koncentrace c (mol/l) Obr.3 Závislost absorbance na koncentraci Transmitance (propustnost) je nepřímo úměrná koncentraci: čím vyšší je koncentrace látky, tím méně záření vzorek propustí, tj. méně záření projde kyvetou méně záření dopadne na detektor. Mezi koncentrací a transmitancí je exponenciální závislost (T = 10 -c.l.e ). Aby bylo možno určit koncentraci stanovované látky je nejprve nutné proměřit a sestrojit kalibrační křivku. Kalibrační křivka (Obr.4) pro fotometrická stanovení je grafické znázornění závislosti absorbance roztoku na koncentraci v něm přítomné stanovované látky. Křivku lze zpracovat na počítači, na praktiku však budeme používat ruční zpracování, je nutné přinést si milimetrový papír. Pro sestrojení kalibrační křivky používáme tzv. standardní roztoky stanovované látky (tzv. kalibrační roztoky). Standardním roztokem se rozumí roztok látky o známém složení a koncentraci. V praxi se používají minimálně tři, raději však více, standardní roztoky o různé koncentraci. Lze je nejlépe připravit naředěním koncentrovaného, tzv. zásobního roztoku standardu na několik nižších koncentrací. Rozmezí koncentrací by mělo být tak široké, aby se výsledky analýzy vzorků o neznámé koncentraci vešly mezi nejnižší a nejvyšší hodnotu kalibrační křivky. Vzhledem k tomu, že koncentrace kreatininu v moči je vysoká, je nutno vzorek moči před analýzou 100x naředit destilovanou vodou. Výsledek koncentrace kreatininu odečtený z kalibrační křivky je proto nutné vynásobit 100, abychom získali skutečnou koncentraci této látky v nenaředěné moči. Vynesením naměřených hodnot absorbancí standardních roztoků (osa y) proti jejich koncentracím (osa x) získáme lineární závislost mezi absorbancí a koncentrací (viz. Lambert-Beerův zákon). Při sestrojování kalibrační křivky nepropojujeme jednotlivé body přímo, ale proložíme jimi přímku procházející co nejblíže všem bodům. Kalibrační přímka by měla procházet také nulou (průsečíkem os x a y). Standardní roztoky je vhodné zpracovávat současně se vzorky o neznámých koncentracích, aby byly zachovány stejné podmínky analýzy, včetně případných nepřesností, např. při pipetování. Po proměření absorbancí standardních roztoků i neznámých vzorků a sestrojení kalibrační křivky vyneseme do kalibrační křivky naměřenou hodnotu absorbance neznámých vzorků. Spuštěním kolmice od bodu, kde hodnota absorbance odpovídá bodu na kalibrační křivce odečteme na ose x hodnotu koncentrace látky v analyzovaném vzorku. Obr.4 Kalibrační křivka (x = neznámý vzorek, A = absorbance, c = koncentrace) 8

9 Absorbanci měříme proti tzv. slepému vzorku (= slepý pokus, blank). Jedná se o roztok obsahující stejné množství všech přidaných činidel jako obsahuje analyzovaný vzorek (standard nebo vzorek o neznámé koncentraci), avšak s výjimkou vlastní stanovované látky. Pipetovaný objem stanovované látky (standardu nebo moči) nahradíme ve slepém pokusu stejným objemem destilované vody. Výraz měříme proti slepému pokusu znamená, že fotometr před vlastním měřením absorbancí vynulujeme na slepý pokus: do kyvety nalijeme tento roztok a naměřenou absorbanci položíme rovnou nule. Při měření absorbancí standardních roztoků i vzorků o neznámé koncentraci tak bude automaticky odečtena případná absorbance pozadí, která není dána absorpcí záření analyzovanou látkou (v některých případech mohou totiž dané monochromatické záření absorbovat i přidaná činidla, což by bez použití slepého pokusu způsobilo naměření falešně vyšší absorbance a tím i falešně vyšší hodnotu zjištěné koncentrace). V praxi se většinou fotometr nejprve vynuluje na vodu (bezbarvá kapalina, samotné rozpouštědlo, s absorbancí = 0). Po té se do kyvety nalije slepý pokus, naměřená hodnota absorbance se zapíše (pro kontrolu, při příštím měření bychom při správné přípravě reakční směsi měli získat stejnou absorbanci) a fotometr se pak opět vynuluje. Pokud je fotometr vynulován pouze na vodu, je pak třeba od každé naměřené absorbance standardu či vzorku hodnotu absorbance slepého pokusu odečíst samostatně. Teprve tehdy je zajištěno, že při měření vzorků odpovídá absorbance pouze stanovované látce. Hodnota absorbance, a tudíž i výsledná koncentrace, nebude pak zkreslena jinou látkou, která je součástí roztoku. Výsledná hodnota kvantitativního stanovení (= zjišťujeme koncentraci, tj. kvantitu) závisí na přesnosti a pečlivosti při zpracování. Přidání pouze přibližného množství činidla, nepřesné pipetování vzorků, nesprávná práce s fotometrem (nepřesné vynulování, špinavé kyvety, zbytky koncentrovanějšího roztoku v kyvetě při měření roztoků méně koncentrovaných, naředění vzorků vodou, která zůstala v kyvetě po proplachování) - to vše vede k získání nepřesných výsledků. POŽADOVANÉ ZNALOSTI Princip spektrofotometrie, základní pojmy, porozumění fotometrickému způsobu analýzy, představa o využití fotometrie v praxi (příklady). Způsoby vyjadřování koncentrace, schopnost vypočítat koncentraci při ředění roztoků, schopnost připravit roztok o definované koncentraci. POSTUP ANALÝZY Vybavení: spektrofotometr 2 automatické pipety + špičky stojan na zkumavky zkumavky (9x) odměrná baňka (100 ml) kádinka šampuska na moč sáček na odpadky střička s destilovanou vodou buničina Chemikálie: nasycený roztok kyseliny pikrové (dávkovač) 1 M NaOH (dávkovač) roztok kreatininu 40 mg/l (zásobní roztok v lahvičce) vzorek vlastní moče (šampuska) destilovaná voda (v lahvičce) kontrolní vzorek kreatininu (tj. vzorek pro kontrolu správnosti práce; vyučující zná jeho koncentraci)! Opište si z lahvičky jeho identifikační číslo! 9

10 Postup: A) Příprava kalibrační řady z roztoku kreatininu o známé koncentraci Ze zásobního roztoku o koncentraci kreatininu 40 mg/l připravte 5 standardních roztoků (= kalibrační roztoky mající různou koncentraci). Zásobní roztok nařeďte podle následujícího postupu: 1. do pěti označených zkumavek č. 1-5 rozpipetujte roztok kreatininu následujícím způsobem: zkumavka č pipetovaný objem (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 2. doplňte destilovanou vodou do konečného objemu 0,5 ml v každé zkumavce, promíchejte 3. dále tyto zkumavky (č.1-5) s připravenými standardními roztoky zpracujte podle bodu C) Koncentraci jednotlivých standardních roztoků lze vypočítat z hodnoty koncentrace zásobního roztoku a ze znalosti způsobu naředění (pipetovaný objem viz. tabulka, konečný objem ve zkumavce = 0,5 ml). B) Naředění vzorku moče Napipetujte 1 ml moče do 100 ml odměrné baňky, baňku doplňte po rysku destilovanou vodou a roztok řádně promíchejte. Pro analýzu dle bodu C) použijte tuto naředěnou moč. Výsledná koncentrace kreatininu však musí být nakonec přepočítána na moč původní, tj. neředěnou. C) Stanovení koncentrace kreatininu Standardní roztoky připravené v bodě A), kontrolní vzorek (v lahvičce na pracovním stole), vzorek naředěné moče a slepý pokus musí být zpracovány současně a stejným postupem. Pro získání přesnějšího výsledku zpracujte vzorek moče dvakrát, jako výslednou koncentraci uveďte aritmetický průměr těchto dvou stanovení. zkumavka číslo: 1-5 (viz. bod A) KALIBRAČNÍ ŘADA 6 KONTROLNÍ VZOREK 7-8 MOČ 9 SLEPÝ POKUS standard. roztok / ml 0, kontrolní vzorek / ml - 0,5 - - ředěná moč / ml - - 0,5 - destilovaná voda / ml 0,5 0,5 0,5 1,0 kyselina pikrová / ml 0,5 0,5 0,5 0,5 NaOH / ml 0,5 0,5 0,5 0,5 konečný objem Σ 2,0 ml Σ 2,0 ml Σ 2,0 ml Σ 2,0 ml 10

11 1. všechny zkumavky řádně promíchejte 2. vizuelně zkontrolujte objem reakční směsi ve všech zkumavkách: musí být stejný (= 2 ml, viz. tab.) 3. zkumavky nechte 20 minut stát při laboratorní teplotě 4. pod dohledem laborantky nebo asistenta se naučte pracovat se spektrofotometrem 5. při 505 nm změřte absorbance všech analyzovaných roztoků: nejprve vynulujte spektrofotometr na vodu, změřte absorbanci slepého pokusu (opište si ji), pak teprve nulujte na slepý pokus 6. změřte postupně absorbance ve všech připravených zkumavkách Úkoly: 1. vypočítejte koncentrace použitých standardních roztoků (v mg/l) 2. na milimetrový papír sestrojte kalibrační křivku a odečtěte z ní koncentrace kreatininu v kontrolním vzorku a ve vzorku moče (nezapomeňte výslednou koncentraci vynásobit ředěním moče) 3. výsledné koncentrace kreatininu, uvedené v mg/l, přepočítejte na mmol/l (M r = 113) 4. výsledky přehledně shrňte do tabulky; nezapomeňte do protokolu zaznamenat identifikační číslo používaného kontrolního vzorku (uvedeno na lahvičce) 5. zjištěné koncentrace porovnejte s fyziologickým rozmezím, závěry diskutujte PŘÍKLADY ZKUŠEBNÍCH OTÁZEK teorie spektrofotometrie Definujte absorbanci. Definujte transmitanci. Jaký je vztah mezi absorbancí a transmitancí? Napište Lambert-Beerův zákon Vysvětlete pojem kalibrační křivka" Co jsou to standardní roztoky"? Vysvětlete termín "slepý pokus" (složení, využití). Jaký je princip spektrofotometrie? Schematicky nakreslete uspořádání spektrofotometru. vlastní praktikum Co je cílem této laboratorní úlohy? Co je to kreatinin? Jaký je princip stanovení koncentrace kreatininu v moči? K čemu se v klinické praxi používá stanovení kreatininu v moči? Uveďte příklad výpočtu ředění (změna koncentrace vzorku po jeho naředění x-krát). Definujte molární koncentraci. Definujte hmotnostní koncentraci. Definujte molární hmotnost. Jaké je rozmezí vlnových délek pro UV a VIS? Jaké kyvety se ve spektrofotometrii používají? 11

12 Chromatografické metody (B2) 1. Chromatografie lipofilních barviv na tenké vrstvě 2. Demonstrace přístrojového vybavení HPLC a GC ÚVOD Chromatografie je analytická separační metoda kvalitativní (určí o jakou látku se jedná) i kvantitativní (určí kolik látky je obsaženo ve vzorku). Chromatografická separace je založena na rozdílné afinitě jednotlivých složek směsného vzorku ke dvěma různým fázím: stacionární a mobilní. Afinitou se rozumí např. rozpustnost dělených složek v kapalné fázi, schopnost adsorpce složky na stacionární fázi nebo jiný vztah mezi složkou dělené směsi a chromatografickou fází (afinita obecně = určitý stupeň příbuznosti, vzájemného vztahu; chemicky: tendence jedné látky ke sloučení s jinou látkou nebo s jinými částicemi). Stacionární fází může být pevná látka = sorbent (aktivní uhlí, silikagel apod.) naplněná v chromatografické koloně nebo nanesená na inertním nosiči (destičce), skrz nebo přes kterou prochází fáze mobilní (pohyblivá) - plynná nebo kapalná (podle typu mobilní fáze se chromatografické metody klasifikují: plynová chromatografie = Gas Chromatography = GC a kapalinová chromatografie = Liquid Chromatography = LC ). Kolonou bývá skleněná nebo ocelová trubice nebo kapilára naplněná sorbentem, nejčastěji ve formě kuliček. Jako stacionární fáze se může použít i vysokovroucí kapalina nanesená v tenké vrstvě na inertním nosiči. Příkladem chromatografie se stacionární fází na destičce je TLC (Thin Layer Chromatography), příkladem chromatografie v koloně je HPLC (High Performance /Pressure/ Liquid Chromatography). Vzorek je vpraven přímo do mobilní fáze vstupující do kolony, nebo na začátek sorbentu naneseného na destičce nebo koloně. Zaleží na afinitě jednotlivých složek vzorku ke stacionární a mobilní fázi, jak dlouho kolonou nebo destičkou která složka prochází. V kontaktu se sorbentem každá složka vzorku přechází do stacionární fáze ve snaze dosáhnout termodynamické rovnováhy. Ty molekuly dané látky, které se nacházejí v mobilní fázi jsou unášeny ve směru průchodu mobilní fáze. Každá složka vzorku je tudíž rozdělena mezi obě fáze a je-li ustavování výše zmíněné rovnováhy dostatečně rychlé, látka postupuje kolonou nebo destičkou v jedné zóně. Pokud není stacionární fází zadržována vůbec, prochází stejně rychle jako fáze mobilní, pokud je zadržována stacionární fází (déle trvá, než se z ní opět uvolní do mobilní fáze, která stále proudí systémem), vychází z kolony později. Čím vyšší je afinita složky ke stacionární fází, tím později složka opouští kolonu, nebo tím kratší urazí za daný čas vzdálenost na destičce (Obr. 1) Obr. 1 Kolona obsahující stacionární fázi (1), nanesení vzorku (2), mobilní fáze unáší jednotlivé složky vzorku různou rychlostí (3, 4, 5) - dochází k jejich separaci. Frakce obsahující jednotlivé složky mohou být postupně sbírány a analyzovány např. spektrofotometricky. Obrázek převzat z (listopad 2006) Složení mobilní fáze vytékající z kolony může být kontinuálně zaznamenáváno detektorem (při instrumentální analýze), výsledkem je grafický zápis, tzv. chromatogram (Obr.2). Na ose x je vynášen čas (tzv. retenční či eluční, t R ) = doba, po kterou látka procházela kolonou, neboli doba od aplikace vzorku do kolony (tzv. nástřik) k dosažení vrcholu (píku) látky zaznamenanému detektorem. Každé rozdělené složce 12

13 odpovídá na chromatogramu jedna eluční vlna (pík). Mrtvý retenční (eluční) čas t M je doba odpovídající průchodu mobilní fáze kolonou (není zadržována stacionární fází). Na ose y je odezva detektoru (např. absorbance, vodivost, aj.). Obr. 2 Vztah chromatogramu k analýze Z plochy, případně z výšky, píku můžeme zjistit koncentraci látky ve vzorku. Provádí se z porovnání ploch (nebo výšek, h) píků standardních roztoků analyzovaných stejným způsobem. Standardem se rozumí roztok o známé koncentraci stanovovanélátky. Po sestrojení kalibrační křivky (plocha nebo výška píku na ose y, koncentrace na ose x) lze z grafu odečíst koncentraci látky v analyzovaném vzorku. U chromatografie, kde je pevná fáze zakotvena na destičce, zjišťujeme koncentraci látky složitějším způsobem. K určení typu látky (kvality) se používá srovnání polohy píku se standardy (stejný eluční čas). Při destičkovém uspořádání porovnáváme vizuelně vzdálenosti, kam doputovala složka od startovní linie. Porovnává se tzv. retardační faktor (R f ) všech skvrn s R f standardů analyzovaných stejnou technikou jako vzorek (R f = a/b, kde a = vzdálenost středu skvrny látky od startu, b = vzdálenost čela, tj.místa kam doputovala mobilní fáze, od startu, Obr. 3). Pokud analyzované vzorky nejsou barevné je možno polohy skvrn složek, které absorbují UV záření, označit pod UV lampou, nebo lze destičku po provedené chromatografii postříkat detekčním činidlem (látkou, která s analyzovanými složkami přítomnými ve vzorku, vytvoří barevný, okem viditelný produkt). Obr. 3 Vyhodnocení TLC chromatografie: vlevo vzdálenost od startu k čelu mobilní fáze (b), vpravo vzdálenost od startu do středu skvrny látky (a) Obrázek převzat z (listopad 2006) 13

14 Klasifikace chromatografických technik Kapalinová chromatografie používá jako mobilní fázi kapalinu. Používají se rozpouštědla polární (alkoholy, etery, nitrily) nebo nepolární - nejčastěji uhlovodíky (pentan, hexan). Věštšinou se používá směs dvou nebo více rozpouštědel o rozdílné polaritě namíchané v různém poměru. Pokud je mobilní fáze nepolární, používá se polární stacionární fáze; pokud je stacionární fáze nepolární, používá se polární mobilní fáze (tzv. chromatografie s reverzní fází). V plynové chromatografii (Obr. 4) je mobilní fází plyn, tzv. nosný plyn - používají se plyny inertní, např. He, N 2, apod.tyto plyny vzorek unáší kolonou, ale neúčastní se separačního procesu. Plynovou chromatografií lze separovat látky plynné a také těkavé kapaliny, které lze snadno převést do plynné fáze. Další způsob klasifikace chromatografických technik vychází z podstaty dělícího procesu, např. rozdělovací chromatografie (rozdílná rozpustnost složek ve stacionární a mobilní fázi), adsorpční chromatografie (dochází k adsorpci složek na pevnou fázi), aj. Modifikací základních chromatografických metod je chromatografie gradientová - pro tuto metodu se používá mobilních fází se vzrůstající eluční silou (změna složení mobilní fáze během analýzy) nebo se mění teplota, při které dochází k nástřiku a průchodu kolonou. V biochemii se často k separaci biomolekul používá tzv. gelová (permeační) chromatografie (GPC) (Obr. 4a). Principem této metody je průchod analyzovaného vzorku porézní gelovou vrstvou. Velké molekuly nejsou schopny procházet póry a proto projdou kolonou rychleji než molekuly menší, které se zdržují průchodem přes póry. Významná je také tzv. afinitní chromatografie, která využívá k zachycení separovaných látek z roztoku specifické vazby mezi afinantem navázaným na inertním nosiči (např. protilátkou) a separovaným analytem. Používá se k separaci biologicky aktivních látek schopných specificky a reverzibilně vázat jiné látky (Obr. 4c). Další technikou jsou tzv. ionexy (iontoměniče, IONEX = ion exchanger) - materiály používané jako stacionární fáze při chromatografii na iontoměničích (Obr. 4b) Jsou to specielně upravené gelové materiály, mající na povrchu kyselé nebo bazické funkční skupiny. Ionexy s kyselými skupinami (katexy) mohou z roztoku protékajícího kolonou vázat kationty, dochází k výměně kationtů mezi katexem a roztokem. Katex obsahující jako kation navázaný H + se označuje jako ionex v H-cyklu. Ionexy se zásaditými funkčními skupinami (anexy) slouží k výměně aniontů. Obrázky převzaty z 55/255tech/255techniques.htm (listopad 2006) Obr. 4 Příklad různých chromatografických metod: gelová permeační chromatografie (a), chromatografie na iontoměničích (b), afinitní chromatografie (c) 14

15 Použití mnoha chromatografických metod se překrývá. Pro volbu optimální metody je nutno, jako při každé analýze, přihlédnout k mnoha skutečnostem. Důležitá je znalost charakteru analytu, charakteru matrice (voda, půda, vzduch, biologický materiál atd.), množství vzorku a jeho stability, přítomnosti kontaminantů, možnosti využití různých detektorů (UV, VIS, fluorimetr, hmotnostní detektor, vodivostní detektor ) a autosamplerů, zajišťujících automatické dávkování vzorku do kolony. Nutno též přihlížet k časové a finanční náročnosti analýzy. Pro dosažení vhodného oddělení stanovované látky (složky vzorku) lze upravit podmínky analýzy: výběr vhodné kolony (velikost, náplň) výběr vhodné mobilní fáze nastavení optimální rychlosti toku mobilní fáze kolonou Důležité chromatografické termíny: nástřik = způsob zavedení analyzovaného vzorku do chromatografického systému pík (eluční křivka, eluční vlna) = část chromatogramu, zaznamenávající odezvu detektoru na složku nebo skupinu nerozdělených složek směsi eluční (retenční) čas - t R (min) = čas od nástřiku vzorku k maximu eluční křivky dané složky mrtvý eluční (retenční) čas - t M (min) = eluční čas složky, která není v koloně zadržována, prochází kolonou stejně rychle jako mobilní fáze, vychází z kolony jako prvá mrtvý objem kolony - V M (ml) = je přibližně roven celkovému objemu mobilní fáze v koloně citlivost detekce = změna odezvy detektoru, odpovídající jednotkové změně koncentrace detegované látky mez detekce = nejmenší koncentrace analyzované látky, jež lze zjistit z chromatogramu kvalitativní hodnocení = identifikace složek ve vzorku; stejné látky mají za stejných podmínek dělení shodné retenční časy: porovnáním s retenčními časy standardních roztoků lze určit kvalitativní složení vzorku; podmínkou je dokonalé oddělení eluční vlny látky (píku) od ostatních píků nalezených v chromatogramu kvantitativní hodnocení = množství složky ve vzorku; ke zjištění koncentrace používáme kalibrační křivku sestrojenou ze známých koncentrací standardů téže látky, jako závislost výšky nebo plochy píku na koncentraci; vynesením výšky nebo plochy píku stanovované látky do kalibrační křivky odečteme odpovídající koncentraci Obr. 5 Kalibrační křivka (x = neznámý vzorek, c = koncentrace, A = absorbance jako odezva detektoru v chromatografii se však místo ní udává výška nebo plocha píku) 15

16 Literatura: Podrobnější informace o chromatografické analýze naleznete na internetu, viz. ve studijních materiálech pro modul Buněčné základy medicíny. POUŽITÁ ANALYTICKÁ METODA Chromatografie lipofilních barviv na tenké vrstvě (TLC) Chromatografie na tenké vrstvě používaná k separaci lipofilních barviv v praktickém cvičení je názornou a jednoduchou demonstrací principu chromatografie. Jedná se o modifikaci kapalinové chromatografie v planárním uspořádání. Stacionární fází je zde silikagel (polární: vysušený gel kyseliny křemičité) nanesený v tenké vrstvě na hliníkové folii (Silufol), mobilní fází je nepolární rozpouštědlo toluen. Lipofilní barviva jsou barevné organické látky dobře rozpustné v nepolárních rozpouštědlech, špatně rozpustné ve vodě. Jejich směsný roztok lze rozdělit pomocí chromatografie a následně identifikovat pomocí standardních roztoků. Před zpracováním vzorků je nutno si chromatografickou destičku připravit (viz. vzor vyvěšený na laboratorním stole; čtěte pozorně postup úpravy destičky uvedený níže). Na připravenou destičku se na startovní čáru nanesou standardy a vzorek (směs několika barviv): tenká vrstva silikagelu nesmí být při nanášení vzorku porušena (nesmí být vyryta až na hliníkovou folii) a vloží se do vany s toluenem, který slouží jako fáze mobilní. Okamžitě po vložení desky do chromatografické vany je nutno vanu přikrýt víkem, aby páry toluenu neunikaly ven. Celý objem chromatografické vany by měl být parami toluenu nasycen, proto se mobilní fáze umísťuje do vany alespoň půl hodiny před použitím. Toluen vzlíná podél desky (je nasáván kaplilárními silami tenké vrstvy) a složky analyzovaného roztoku unáší s sebou. Jednotlivá barviva jsou unášena různou rychlostí: látky s vyšší afinitou k mobilní fázi (tj. látky nepolární, které se v toluenu dobře rozpouští) postupují destičkou rychleji. Naopak polárnější složky, které mají větší afinitu ke stacionární fázi, postupují pomaleji (adsorbují se pevněji na sorbent - TLC je příkladem adsorpční kapalinové chromatografie). Skvrny získané separací vzorku porovnáváme se standardy na základě hodnoty retardačních faktorů R F. Retardační faktor je typický pro každou látku bez ohledu na velikost chromatografické desky, odpovídá určité rychlosti vzlínání. Jeho hodnoty musí být v intervalu od 0,15 do 0,85 - čím vyšší je afinita látky k mobilní fázi, tím látka doputuje dál od startu, má větší retardační faktor a tedy nižší afinitu k fázi stacionární. Hodnoty mimo toto rozmezí svědčí o nedostatečné účinnosti chromatografického dělení použitou metodou. Jelikož vzorek i standardy jsou látky barevné, není nutné před vyhodnocováním skvrn používat další detekční činidla. Demonstrace přístrojového vybavení HPLC a GC HPLC (High Performance / nebo Pressure / Liquid Chromatography) = vysokoúčinná (vysokotlaká) kapalinová chromatografie používá se k separaci látek rozpuštěných v roztoku, tj. analyzuje se kapalný vzorek nepříliš těkavých látek (rozdíl od GC) široké použití na stanovení různých biologicky a farmakologicky účinných látek (organické kyseliny, polyaromatické uhlovodíky, bílkoviny, sacharidy, vitamíny, léčiva, různé metabolity) mobilní fáze prochází pod tlakem (pumpa) kolonou, která je naplněna stacionární fází (ocelová trubice dlouhá cm, o vnitřním průměru 3-5 mm, vyplněná malými pevnými částicemi, které mají podle druhu kolony určité funkční skupiny) vzhledem k typu jednotlivých fází jde buď o uspořádání "s normálními fázemi" (= starší uspořádání) nebo "s reverzními fázemi", tj. s obrácenými fázemi než bylo původní (je ekologičtější, často používané): chromatografie s normálními fázemi stacionární fáze: polární (polární funkční skupiny, např. - CN, - NH 2 ) mobilní fáze: nepolární (chloroform, methylenchlorid) chromatografie s reverzními fázemi (RP HPLC) stacionární fáze: nepolární (tj. nepolární funkční sk.) mobilní fáze: polární (methanol, H 2 O, acetonitril aj.) 16

17 detektor je připojen k výstupu z kolony, v různém čase jím prochází mobilní fáze s jednotlivými složkami dělené směsi; záznamem z detektoru je závislost odezvy detektoru na čase (chromatogram) příklady detektorů měří se koncentrace spektrofotometrický (UV-VIS) fluorescenční absorbance intenzita fluorescence až 10-7 g/l až 10-9 g/l demonstrovaný kapalinový chromatograf je propojen s UV detektorem a integrátorem, ovládá se přes počítač příklad analytické metody: kolona Supelcosil LC-18 (5 µm), 5 cm x 4,6 mm ID (tj.stacionární fáze s nepolárním sorbentem), polární mobilní fáze: methanol /H 2 O /0,2M fosfátový pufr 2:7:1, podmínky analýzy: průtok mobilní fáze = 0,8 ml/min, teplota kolony = 25 o C, detekce při 280 nm Obr. 6 Uspořádání HPLC: do proudu mobilní fáze je aplikován vzorek, mobilní fáze vstupuje pod tlakem do kolony hustě "napěchované" stacionární fází; na počítači je pak záznam z detektoru převeden do grafické podoby: chromatogram tvořený píky jednotlivých látek. GC (Gas Chromatography) = plynová chromatografie (Obr. 7) obecně se stanovují těkavější látky, s bodem varu do cca 400 o C (alkoholy, nižší uhlovodíky, těkavé (lehčí) ropné frakce, mastné kyseliny, PCB, těkavější metabolity vzorek je na vstupu do kolony převeden do plynného skupenství (teplota nástřikové komory bývá o 10 až 30 C vyšší než teplota kolony; kolona je t emperována na teplotu blízkou bodu varu dělené směsi (je umístěna v termostatu) mobilní fází je inertní plyn (He, H 2, N 2 ), který je veden z tlakové lahve do kolony (dlouhé kovové kapiláry o délce 10 až 50 metrů a vnitřním průměru v mikrometrech) naplněné stacionární fází (buď pevným sorbentem nebo vysokovroucí kapalinou, která je jako tenký film nanesená na pevný inertní nosič nebo přímo na vnitřní povrch kapiláry) detektor je připojen k výstupu z kolony, v různém čase jím prochází nosný plyn s jednotlivými složkami dělené směsi; používají se různé typy detektorů: plamenově-ionizační (FID), tepelněvodivostní (TCD), detektor elektronového záchytu (ECD) aj. Záznamem z detektoru je opět závislost odezvy detektoru na čase 17

18 Obr. 7 Uspořádání plynové chromatografie: dusík jako nosný plyn (mobilní fáze), kolona spirálovitě stočená v termostatu, detektor FID = dvě elektrody, mezi nimiž hoří plamen (vzduch + vodík) - látka unášená nosným plynem je v plameni ionizována a detektor tak zaznamená proud mezi elektrodami; na počítači je záznam z detektoru převeden do grafické podoby: chromatogram tvořený píky jednotlivých látek Obrázek převzat z (listopad 2006) POŽADOVANÉ ZNALOSTI Princip metody, rozdělení chromatografických technik, základní pojmy, porozumění chromatografickému způsobu analýzy, představa o využití chromatografie v praxi (příklady). Dokázat popsat chromatogram (např. z HPLC) a vysvětlit způsob kvantitativního a kvalitativního vyhodnocení. Vysvětlit pojmy polární a nepolární látky, jejich vlastnosti, příklady. POSTUP ANALÝZY Vybavení: Chemikálie: chromatografická komora s víkem TLC destička: Silufol (silikagel na hliníkové folii) filtrační papír na vyzkoušení nanášení vzorku nanášecí kapiláry (2 ml) nebo umělohmotné špičky mobilní fáze: toluen roztoky standardů: azobenzen, dimethylová žluť, sudan I, sudan IV neznámý vzorek (tj. vzorek o neznámém složení)! Opište si jeho identifikační číslo! Postup: Nedotýkejte se bílého povrchu destičky holýma rukama 1. na chromatografické desce vyznačte 3 cm od okraje velmi jemně tužkou startovní čáru a na ní ve vzdálenosti 1 cm od bočních okrajů, i mezi sebou, místa pro nanášení vzorků (viz. hotový chromatogram nad pracovním stolem). Startovní čára, ani body pro nanášení vzorků, nesmí být vyryté, tj. nesmí odkrýt hliníkovou folii, která je pod silikagelem. 2. vyryjete bodcem (tužkou) rýhy do vrstvy silikagelu ve vzdálenosti 2-3 mm od bočních okrajů a 10 cm od startu tak, aby byla odkryta hliníková fólie (ohraničí se tak plocha určená k separaci) 3. na označená místa na startu opatrně naneste špičkami roztoky standardů a neznámý vzorek (tečky o průměru max. 0,5 cm by měly být přibližně stejně velké); k nanášení každého vzorku použijte samostatnou špičku Před vlastní aplikací si můžete vyzkoušet nanášení vzorků na filtrační papír. 18

19 4. hladina toluenu v chromatografické komoře musí sahat do výše asi 1 cm ode dna 5. desku s nanesenými vzorky (po jejich zaschnutí!) vložte do komory startovní částí dolů a opřete o stěnu, komoru ihned uzavřete víkem a zapište si čas 6. vyvíjení chromatogramu ukončete jakmile vzlínající rozpouštědlo dosáhne horní rýhy 7. desku vyjměte a nechte ve vodorovné poloze oschnout v digestoři Zapište si dobu trvání vyvíjení chromatogramu. Úkoly: 1. určete R F standardů a jednotlivých složek vzorku, hodnoty přehledně zapište do tabulky 2. porovnáním hodnot R F vzorku se standardy proveďte identifikaci barviv v neznámém vzorku 3. do protokolu nezapomeňte poznamenat identifikační číslo používaného neznámého vzorku (uvedeno na lahvičce) Exkurzi do laboratoře s HPLC a GC není nutno popisovat do protokolu PŘÍKLADY ZKUŠEBNÍCH OTÁZEK teorie chromatografie Definujte mobilni fázi a stacionární fázi (+ příklady). Vysvětlete pojmy: eluční (retenční) čas. Vysvětlete pojem citlivost (obecně), pozor na pojem mez detekce. Co to je gradientová chromatografie? Vysvětlete pojem chromatogram. Princip chromatografie (obecně). Uveďte příklady polárních rozpouštědel užívaných v LC. Uveďte příklady nepolárních rozpouštědel užívaných v LC. Jaké nosné plyny se používají při GC? Které látky se dají analyzovat GC? (obecně). K čemu se používá gelová chromatografie? Na čem je závislá separace při gelové chromatografii? Vysvětlete princip afinitní chromatografie. Jaké znáte způsoby kvalitativního a kvantitativního vyhodnocování chromatogramů? Jaký je obecný princip ionexů? vlastní praktikum Co je to TLC, vysvětlete princip této metody Vysvětlete pojem retardační faktor. K čemu se využívá? Jak se při TLC chovají dvě látky se stejnou hodnotou R F? Popište způsoby detekce a hodnocení chromatogramu při TLC Lze chromatografií stanovovat pouze barevné látky? Vysvětlete. Co je to HPLC, vysvětlete princip této metody Co jsou to standardní látky v chromatografii? (k čemu se používají) Jaký typ chromatografie používáte k analýze lipofilních barviv? (stacionární a mobilní fáze) Co znamená termín: lipofilní látka? 19

20 ÚVOD Stanovení acidity žaludeční šťávy (B3) Acidita žaludeční šťávy je dána přítomností HCl produkované parietálními buňkami žaludeční sliznice. Pohybuje se kolem ph = 1,0-1,5. Sekrece HCl (Obr. 1) je řízena neurohumorálně, významným faktorem je hladina peptidového hormonu gastrinu, produkovaného buňkami žaludeční sliznice. Vyšetřování žaludeční sekrece je založeno na stimulaci parietálních buněk pentagastrinem, což je syntetický analog gastrinu. V praxi se jako výsledek vyšetření udávají hodnoty látkového množství HCl vyloučené za určitý časový úsek. Po nočním lačnění se odčerpá žaludeční sekret nazogastrickou sondou a obsah se vylije. Následně se odebírá žaludeční šťáva ve čtyřech 15 minutových intervalech: získáme tak 4 vzorky žaludeční šťávy před stimulací (tj. na lačno). Celkové látkové množství HCl přítomné v těchto vzorcích (tj. HCl vyloučenou za 1 hodinu) pak označujeme jako bazální sekrece = BAO (Basal Acid Output). Po stimulaci pentagastrinem (podává se s.c. nebo i.m.) se opět odebírají 4 patnáctiminutové porce žaludeční šťávy, součet látkových množství HCl v těchto porcích se označuje jako maximální sekrece = MAO (Maximal Acid Output). Látkové množství, případně koncentraci, HCl v žaludeční šťávě lze stanovit pomocí odměrné analýzy. Známe-li koncentraci HCl v žaludeční šťávě (v mol.l -1 ), můžeme vypočítat také její ph. Obr. 1 Produkce HCl parietálními buňkami žaludeční sliznice: CO 2, produkovaný metabolismem, je v buňce hydratován za vzniku H 2 CO 3, jejíž disociací vzniká H + a HCO 3 -. H + se dostává do lumen žaludku aktivním transportem pomocí K + /H + ATP-ázy. HCO 3 - se vrací do krve výměnou za Cl -, který je dále samostatně transportován do lumen žaludku. Sekrece HCl tak probíhá na úrovni iontů, nikoli celé molekuly HCl (jde o silnou, zcela disociovanou kyselinu). Obrázek převzat z (listopad 2006) Literatura: Masopust, J.: Klinická biochemie. Požadování a hodnocení biochemických vyšetření. Karolinum, Praha, ISBN Ganong, W. F.: Přehled lékařské fyziologie. H & H, Jinočany, 1995, dotisk ISBN Junqueira, L. C. a kol.: Základy histologie. H & H, Jinočany, 1997, dotisk ISBN

21 POUŽITÁ ANALYTICKÁ METODA Odměrná analýza (titrace, volumetrie) je základní kvantitativní analytická metoda. Podstatou této metody je chemická reakce mezi stanovovanou látkou a odměrným (titračním) činidlem. Lze využít jen takových reakcí, které probíhají kvantitativně, jednoznačně a dostatečně rychle. Do zkoumaného roztoku přidáváme z byrety po malých částech roztok odměrného činidla o známé molární koncentraci. Odměrný roztok reaguje se stanovovanou látkou podle chemické rovnice. Znalosti stechiometrických koeficientů obou látek v této chemické reakci, koncentraci a objem spotřebovaného odměrného činidla a objem analyzovaného vzorku využíváme při výpočtu koncentrace stanovované látky. Stav v průběhu reakce, při němž látkové množství přidaného titračního činidla je chemicky ekvivalentní látkovému množství stanovované látky, nazýváme bod ekvivalence. Jinými slovy jsme v bodě ekvivalence právě přidali tolik odměrného roztoku, kolik bylo přesně potřeba ke zreagování veškeré naší stanovované látky. K experimentálnímu zjištění bodu ekvivalence využíváme v odměrné analýze takové vlastnosti titrovaného roztoku, která se výrazně změní v nejtěsnější blízkosti bodu ekvivalence. Může to být např. barevná změna způsobená indikátorem přidaným do titrovaného roztoku (methylenová modř, fenolftalein, murexid = látky, které za určitých známých podmínek změní barvu roztoku; přidává se pár kapek do titrační baňky). Pokud k určení bodu ekvivalence používáme změnu zbarvení titrovaného roztoku, po dosažení bodu ekvivalence titraci ukončíme (tj. odměrný roztok přestaneme přidávat okamžitě, jakmile se trvale změní zbarvení titrovaného roztoku). V některých případech změnu zbarvení roztoku v bodě ekvivalence způsobí první nadbytečná kapka odměrného roztoku (např. fialový roztok KMnO 4 ) a není proto nutno používat indikátor. Bod ekvivalence může být také určen za použití grafického znázornění průběhu titrace, a to z titrační křivky získané např. použitím potenciometrie (během analýzy měříme ph nebo napětí přístrojem). V tomto případě se titruje dále, tj. i po dosažení bodu ekvivalence, abychom získali grafický záznam celé křivky. Objem roztoku titračního činidla přidaný do titrovaného roztoku od počátku titrace do dosažení bodu ekvivalence nazýváme spotřebou odměrného roztoku. Tento objem musí být zjištěn co nejpřesněji, neboť jeho hodnota slouží k výpočtu koncentrace látky ve vzorku. Proto je odměrné činidlo přidáváno do titrovaného roztoku po kapkách, za stálého míchání titrovaného roztoku. V okolí bodu ekvivalence začne docházet k přechodné změně zbarvení titrovaného roztoku kolem kapky přidaného odměrného činidla (rychlost reakce závisí na koncentraci reagujících látek, před dosažením bodu ekvivalence je stanovovaná látka přítomna již jen v malém množství). Proto je třeba přidávat odměrný roztok opatrně a vždy před další kapkou titrovaný roztok promíchat. Odměrné roztoky o přesné koncentraci připravujeme z nejčistších látek, které mají být stálé na vzduchu a mají se dobře rozpouštět ve vodě na stálé roztoky. U látek v nepřesně definovaném stavu (většina kyselin a louhů) je možno připravit roztoky pouze přibližné koncentrace. Například NaOH není stálý, neboť absorbuje CO 2 ze vzduchu. Znamená to, že navážením přesného množství hydroxidu a jeho rozpuštěním ve vodě získáme odměrný roztok pouze přibližné (teoretické) koncentrace, která se časem mění. Má-li být takový roztok použit k odměrnému stanovení, musí se před vlastní analýzou stanovit jeho aktuální (skutečná) koncentrace, neboli titr. Skutečná koncentrace odměrného roztoku se určuje experimentálně tak, že titrujeme odměrným roztokem (OR) o teoretické koncentraci tzv. standardní roztok. Standardní roztok je roztok, jenž může být připraven o přesně známé koncentraci a je stálý (např. kyselina šťavelová); známe tedy jeho koncentraci a očekávanou (tj. předem vypočítanou) spotřebu odměrného roztoku. Tu pak porovnáme se spotřebou skutečnou a vypočítáme titrační faktor použitého odměrného roztoku (f): f = předpokládaná spotřeba OR (ml) / skutečná spotřeba OR (ml) Faktor udává, kolika mililitrům roztoku aktuální koncentrace odpovídá 1 ml roztoku o přibližné koncentraci. Roztoky o přesné koncentraci mají f = 1,00; roztoky zředěnější mají f < 1,00; roztoky koncentrovanější f > 1,00. Při výpočtu koncentrace neznámého vzorku se vychází z poměru látkových množství reaktantů, dasaženého v bodě ekvivalence (n = c x V). Faktor nám tedy pomůže zjistit aktuální přidané látkové množství odměrného roztoku. Nezáleží na tom, zda faktorem násobíme spotřebu v bodě ekvivalence (V) nebo teoretickou koncentraci odměrného roztoku (c): skutečné přidané látkové množství odměrného roztoku je n = c x V x f. 21

22 Výpočet: a A + b B c C + d D a/b = n(a) / n(b) a x n(b) = b x n (A) a x n(b) = b x n(a) x f a x c(b) x V(B) = b x c(a) x V(A) x f chemická reakce, kde A = odměrný roztok, B = analyzovaná látka a / b = poměr stechiometrických koeficientů, který udává poměr reagujících látkových množství rovnici upravíme tak, aby každý reaktant byl na jedné straně látkové množství odměrného roztoku korigujeme faktorem na skutečnou hodnotu za látkové množství dosadíme: n = c x V Stechiometrické koeficienty známe z vyčíslené chemické rovnice, která popisuje probíhající reakci, objem (spotřebu) odměrného roztoku v bodě ekvivalence odečteme z byrety (na byretě je napsaná i jeho koncentrace a faktor), objem vzorku použitého pro analýzu známe, a tak jedinou neznámou veličinou v rovnici je koncentrace analyzované látky. Metody odměrné analýzy klasifikujeme podle typu probíhající reakce : 1. neutralizační titrace - reakce mezi kyselinou a zásadou (alkalimetrie = odměrným roztokem zásady titrujeme kyselinu; acidimetrie = odměrným roztokem kyseliny titrujeme zásadu) 2. srážecí titrace - při reakci vzniká nerozpustná sraženina 3. komplexotvorné titrace - tvorba málo disociovaných, avšak ve vodě rozpustných sloučenin - kovových komplexů 4. oxidačně redukční titrace při reakcích dochází k výměně elekronů (oxidimetrie = odměrným roztokem je oxidační činidlo, např. KMnO 4 - pak mluvíme o tzv. manganometrii; reduktometrie = odměrným roztokem je redukční řinidlo) Průběh titrace znázorňujeme graficky pomocí tzv. titrační křivky (Obr. 2 a 3). Jde o funkční závislost sledované veličiny, např. u acidobazických titrací závislost změny ph titrovaného roztoku (osa y), na objemu přidaného titračního činidla (osa x). Při titraci silné kyseliny silnou zásadou nebo silné zásady silnou kyselinou se bod ekvivalence nachází v oblasti ph = 7; v bodě ekvivalence dochází k velké změně ph - tzv. titrační skok. Titrujeme-li však slabou kyselinu silnou zásadou nebo slabou zásadu silnou kyselinou je bod ekvivalence posunut mimo oblast neutrálního ph; titrační skok je menší, ale dostatečný k odečtení bodu ekvivalence z křivky. Kdybychom titrovali slabou kyselinu slabou zásadou, ph během titrace by se změnilo jen nepatrně a na titrační křivce by tento malý titrační skok neumožnil přesné odečtení bodu ekvivalence. Obr. 2 Titrační křivka titrace silné zásady silnou kyselinou (ph na počátku titrace je alkalické, v bodě ekvivalence neutrální) Obr. 3 Titrační křivka titrace kyseliny silnou zásadou (ph na počátku titrace je kyselé, v bodě ekvivalence je ph neutrální jen u titrace silné kyseliny). V obrázku je znázorněno i rozmezí ph pro barevný přechod (tj. změnu zbarvení) jednotlivých acidobazických indikátorů 22

23 Látkové množství HCl v žaludeční šťávě zjistíme pomocí neutralizační titrace hydroxidem sodným. Jako indikátor používáme fenolftalein - látku, která mění své zbarvení během očekávaného titračního skoku (v kyselém prostředí je bezbarvý, v alkalickém růžovo-fialový). V bodě ekvivalence odečteme z byrety spotřebu titračního činidla NaOH, u něhož známe teoretickou koncentraci a faktor (údaje na štítku byrety). Literatura: Podrobnější informace o volumetrické analýze naleznete na internetu (viz. ve studijních materiálech pro modul Buněčné základy medicíny. POŽADOVANÉ ZNALOSTI Princip metody, rozdělení volumetrických technik, základní pojmy, porozumění volumetrickému způsobu analýzy, představa o využití odměrné analýzy v praxi (příklady). Dokázat vysvětlit princip výpočtu koncentrace analyzované látky z experimentálních dat a chemické rovnice dané reakce. Definice a způsob výpočtu ph, molární koncentrace a látkového množství. POSTUP ANALÝZY Z podstaty titrací vyplývá, že v bodě ekvivalence jsou si látková množství obou látek ekvivalentní. Jelikož na ztitrování 1 molu HCl potřebujeme 1 mol NaOH (HCl + NaOH NaCl + H 2 O), můžeme psát: n (NaOH) = n (HCl), kde n = c x V. U NaOH známe spotřebovaný objem a koncentraci korigovanou faktorem, u HCl známe objem použitý k titraci (= objem žaludeční šťávy pipetovaný do titrační baňky). Z rovnosti látkových množství obou látek spočítáme koncentraci (nebo přímo látkové množství) HCl v každém vzorku použitém k analýze. Dále je třeba vypočítat látkové množství HCl obsažené v každé porci (B 1 až B 4 a M 1 až M 4 ) - od vzorku použitého k analýze se liší objemem, viz. postup. Součet látkových množství HCl v porcích B 1 až B 4 udává hodnotu BAO, součet látkových množství v porcích M 1 až M 4 udává hodnotu MAO. Posledním krokem je výpočet ph před a po stimulaci: 1. ph před stimulací vychází z molární koncentrace (v mol/l) žaludeční šťávy odebrané na lačno: c(bao) = n(bao) / V(BAO), kde V(BAO) je součet objemů frakcí B1 až B4 2. ph po stimulaci vychází z molární koncentrace (v mol/l) žaludeční šťávy odebrané po podání pentagastrinu: c(mao) = n(mao) / V(MAO), kde V(MAO) je součet objemů frakcí M1 až M4 Podrobné informace k jednotlivým vzorkům: Před stimulací pentagastrinem byly pacientovi během hodiny (každých 15 minut) odebrány celkem 4 porce žaludeční šťávy: vzorky B 1 - B 4 pro zjištění tzv. bazální sekrece. Po aplikaci pentagastrinu byly následující hodinu odebírány další 4 porce: M 1 - M 4 - pro zjištění tzv. stimulované sekrece. Před odebráním vzorků na titrační stanovení acidity byly změřeny celkové odebrané objemy jednotlivých porcí žaludeční šťávy: vzorky před stimulací: B 1 = 15 ml B 2 = 20 ml B 3 = 20 ml B 4 = 15 ml vzorky po stimulaci M 1 = 70 ml M 2 = 90 ml M 3 = 100 ml M 4 = 90 ml 23

24 Vybavení: Chemikálie: byreta 4 titrační baňky skleněná pipeta (10 ml) nástavec na pipetu 0,1 M NaOH v byretě (faktor uveden na štítku) fenolftalein 4 vzorky žaludeční šťávy odebrané nalačno (B1-B4) 4 vzorky žaludeční šťávy odebrané po stimulaci (M1-M4) destilovaná voda Postup: Před titrací vzorků žaludeční šťávy si nejprve vyzkoušejte práci s byretou: 1. naplňte byretu 2. odměrnou baňku naplňte asi z jedné třetiny vodou 3. přidejte 3-5 kapek fenolftaleinu, krouživým pohybem obsah baňky promíchejte 4. z byrety přidávejte pomalu po kapkách odměrný roztok (přikapávejte jej přímo do roztoku v baňce, nesmí stékat po stěně) 5. po každé kapce obsah odměrné baňky řádně promíchejte 6. první kapka odměrného činidla způsobí trvalou změnu zbarvení roztoku (bezbarvý růžovo-fialový) - totéž se stane při titraci vzorků v bodě ekvivalence (NaOH změní ph roztoku a tím i zbarvení indikátoru, neboť v titrační baňce už není žádná kyselina, která by přidaný hydroxid zneutralizovala) Správný postup je důležitý pro získání přesného výsledku Titrace vzorků žaludeční šťávy: 1. naplňte byretu 2. řádně promíchejte první vzorek žaludeční šťávy (B1) 3. pomocí skleněné pipety s nástavcem napipetuje 10 ml vzorku do titrační baňky 4. do titrační baňky přidejte ze zásobní lahve destilovanou vodu (kulatá část baňky by měla být zaplněna asi z jedné třetiny) 5. přidejte 3-5 kapek fenolftaleinu, krouživým pohybem řádně promíchejte 6. titrujte odměrným roztokem 0,1 M NaOH (faktor je uveden na štítku byrety), dokud roztok trvale nezmění své zbarvení: bod ekvivalence je indikován první (jedinou!) nadbytečnou kapkou odměrného roztoku 7. z byrety odečtěte přesnou spotřebu odměrného roztoku, zapište si ji 8. stejným způsobem zpracujte všechny vzorky žaludeční šťávy, tj. opakujte kroky 1-7, včetně plnění byrety Úkoly: 1. všechny následující údaje přehledně zapište do tabulky: 2. z hodnot spotřeby, známé koncentrace a titračního faktoru odměrného roztoku a ze stechiometrie chemické reakce mezi HCl a NaOH vypočítejte látkové množství NaOH přidaného v bodě ekvivalence 3. vypočítejte látkové množství HCl v každé odebrané porci žaludeční šťávy (tj. v celém objemu každé porce B1-B4 a M1-M4) 24

25 BAO = součet látkových množství HCl v porcích B 1 - B 4 MAO = součet látkových množství HCl v porcích M 1 - M 4 4. vypočítejte hodnoty BAO a MAO 5. z hodnoty BAO a z celkového objemu odebraných porcí (B1+B2+B3+B4) vypočítejte nejprve koncentraci HCl v žaludeční šťávě odebrané nalačno a pak hodnotu ph, tj. ph před stimulací 6. z hodnoty MAO a z celkového objemu odebraných porcí (M1+M2+M3+M4) vypočítejte nejprve koncentraci HCl v žaludeční šťávě odebrané po stimulaci a pak hodnotu ph, tj. ph po stimulaci 7. výsledné hodnoty BAO, MAO a ph žaludeční šťávy porovnejte s fyziologickými údaji B 1 B 2 B 3 B 4 M 1 M 2 M 3 M 4 spotřeba NaOH (ml) látkové množství NaOH v bodě ekvivalence (mmol) objem celé porce (ml) látkové množství HCl v dané porci (mmol) Fyziologické hodnoty: BAO: 1-5 mmol HCl / hodinu MAO: mmol HCl / hodinu ph = 1,0-3,5 PŘÍKLADY ZKUŠEBNÍCH OTÁZEK teorie odměrné analýzy Jaký je princip odměrné analýzy a její využití? Jaký je princip neutralizační titrace? Vysvětlete pojem bod ekvivalence. Jaké znáte druhy odměrné analýzy? (rozdělení podle typu reakce, titračního činidla) Nakreslete titrační křivku pro acidimetrickou titraci (rozdíly: slabé a silné kys. a zásady). Nakreslete titrační křivku pro alkalimetrickou titraci (rozdíly: slabé a silné kys. a zásady). Nakreslete titrační křivku pro redox titraci. Vysvětlete způsoby indikace bodu ekvivalence. Co je to titr a co je faktor odměrného roztoku? Vysvětlete princip výpočtu koncentrace stanovované látky při odměrné analýze. Co je to odměrný roztok? Jaké musí mít vlastnosti? vlastní praktikum Čím je dána kyselost žaludeční šťávy? Co je to gastrin? Vysvětlete pojmy: látkové množství, molární koncentrace, ph Jaký je princip pentagastrinového testu? Vysvětlete zkratky BAO a MAO. K čemu se používá fenolftalein? 25

26 Měření ph fosfátového pufru (B4) ÚVOD Pufry (nárazníky, tlumivé nebo ústojné roztoky) jsou směsi slabé kyseliny a její konjugované zásady (tj. soli této kyseliny; např. kyselina octová a octan sodný) nebo slabé zásady a její konjugované kyseliny (tj. soli této zásady; např. hydroxid amonný a chlorid amonný) nebo směs dvou solí vícesytné kyseliny (NaH 2 PO 4 a Na 2 HPO 4 jako konjugovaný pár kyselina - zásada; NaH 2 PO 4 je kyselejší, neboť obsahuje více vodíků), případně amfoionty, jako jsou např. proteiny, které obsahují ve své molekule jak kyselé tak zásadité funkční skupiny. Funkcí pufrů je tlumit výkyvy ph při malém přídavku kyseliny nebo zásady a tím udržovat konstantní ph. Tato schopnost pufrů vyplývá z dostatečné koncentrace obou složek konjugovaného páru: konjugované báze jsou rezervou bránící větší změně ph na stranu kyselou po přidání kyseliny, konjugované kyseliny jsou rezervou bránící větší změně ph po přídavku zásady. Po přidání kyseliny nebo zásady do pufru jde nejprve o vychýlení z rovnováhy (= zvýšení nebo snížení původních rovnovážných koncentrací složek pufru) a následné opětovné ustálení nových rovnovážných koncentrací (*): a) Po malém přídavku kyseliny jsou dodané kationty vodíku vázány na bazickou složku pufru za tvorby málo disociované slabé kyseliny nebo v případě bazického pufru jsou zneutralizovány slabým hydroxidem za tvorby soli a vody. ph se proto změní jen nepatrně. kyselý pufr: CH 3 COOH CH 3 COO - + H + po přidání H + : CH 3 COOH CH 3 COO - + H + CH 3 COONa CH 3 COO - + Na + (* zvýší se koncentrace kyseliny) CH 3 COOH + CH 3 COO - + Na + + H+ Cl - 2 CH 3 COOH + Na + + Cl - bazický pufr: NH 4 OH NH OH - po přidání H + : NH 4 OH + H + NH H 2 O NH 4 Cl NH Cl - (* zvýší se koncentrace soli) NH 4 OH + NH Cl - + H + Cl - H 2 O + 2 NH Cl - b) Po malém přídavku zásady jsou hydroxylové ionty zneutralizovány slabou kyselinou nebo s kationtem soli vytvoří málo disociovanou slabou zásadu. kyselý pufr: CH 3 COOH CH 3 COO - + H + po přidání OH - : CH 3 COOH + OH - CH 3 COO - + H 2 O CH 3 COONa CH 3 COO - + Na + (* zvýší se koncentrace soli) CH 3 COOH + CH 3 COO - + Na + + Na+ OH - H 2 O + 2 CH 3 COO Na + bazický pufr: NH 4 OH NH OH - po přidání OH - : NH 4 OH NH OH - NH 4 Cl NH Cl - (* zvýší se koncentrace hydroxidu) NH 4 OH + NH Cl - + Na + OH - 2 NH 4 OH + Na + + Cl Hodnota ph pufru závisí na vzájemném poměru koncentrací obou složek, zředěním pufru se jeho ph změní jen málo. Pro výpočet ph pufru používáme Henderson-Hasselbalchovu rovnici: pro kyselý pufr: ph = pk a + log (c soli /c kyseliny ) pro bazický pufr: poh = pk b + log (c soli / c báze ) kde ph = 14 - poh pk a = záporně vzatý dekadický logaritmus disociační konstanty kyseliny (pk a = - log K a ) K a je rovnovážná konstanta popisující disociaci kyseliny: HA H + + A - pk b = záporně vzatý dekadický logaritmus disociační konstanty hydroxidu (pk b = - log K b ) K b je rovnovážná konstanta popisující disociaci hydroxidu: BOH B + + OH - 26

27 Hodnoty koncentrací, dosazovaných do výše uvedených rovnic, se týkají již hotového pufru, nikoli koncentrací samotného roztoku soli a roztoku kyseliny (příp. zásady) použitých na přípravu pufru. Jde tedy o aktuální koncentrace složek v pufru. Abychom nemuseli počítat aktuální koncentrace (c) složek po jejich smíchání při přípravě pufru (oba roztoky se smícháním naředí), lze do rovnic dosadit koncentrace (c ) složek před smícháním vynásobené objemem použitým na přípravu pufru, tj. ve zlomku se objeví, v jakém poměru byly složky smíchány: pro kyselý pufr: ph = pk A + log (c soli x V soli / c kyseliny x V kyseliny ) pro bazický pufr: poh = pk B + log (c soli x V soli / c báze x V báze ) O účinnosti pufru při udržování konstantního ph nás informuje tzv. pufrační kapacita. Je definována jako podíl látkového množství přidané silné kyseliny (báze) a změny hodnoty ph pufru, vyvolané přídavkem tohoto množství. Pufrační kapacita závisí jednak na celkové koncentraci (součtu koncentrací) obou složek pufru, jednak na jejich poměru. Při stejné koncentraci obou složek pufru je kapacita největší při jejich poměru = 1, tj. při ph pufru rovnající se hodnotě pk. Obecně se uvádí, že pufr nejlépe pufruje pokud je jeho ph v intervalu pk ± 1. V laboratoři se pufry používají např. při stanovování aktivity enzymů v biologických materiálech (aktivita enzymů je závislá na ph prostředí) a při separaci různých proteinů v elektrickém poli (náboj proteinů závisí na ph prostředí). Kromě laboratorního použití mají pufry také zásadní význam pro udržení stálosti vnitřního prostředí organismu - konstantní ph je důležité pro průběh základní reakcí umožňujících život. Na udržování stálého ph se v lidském těle podílí uhličitanový pufr (tzv. bikarbonátový pufr), fosfátový pufr (organické i anorganické fosfáty) a proteiny (v plazmě hlavně albumin, v erytrocytech hemoglobin). Fosfátový pufr se také významně uplatňuje při pufrování moče. Je tvořen dihydrogenfosforečnanem (v pufru vystupuje jako konjugovaná kyselina) a hydrogenfosforečnanem (zde je konjugovanou zásadou): HPO /H 2 PO 4 Pokud potřebuje organismus vylučovat nadbytečné protony, dochází k jejich vazbě na HPO 2-4 za tvorby H 2 PO - 4 a ph moče se tak příliš nězmění. pufr v rovnováze před přidáním H + vychýlení z rovnováhy přidáním H + nebo OH - nebo OH - HPO 4 2- / H 2 PO 4 - HPO 4 2- / H 2 PO 4 - HPO H + H 2 PO 4 - pufr po opětovném ustálení rovnováhy HPO 4 2- / H 2 PO 4 - H 2 PO OH - HPO H 2 O HPO 4 2- / H 2 PO 4 - Literatura: Robert K. Murray a kol.: Harperova biochemie (1998) ISBN Jiří Urban: Lékařská chemie (skripta 3.LF UK 1995) ISBN POUŽITÁ ANALYTICKÁ METODA Úkolem v praktickém cvičení je zjistit při jakém poměru obou fosfátových solí bude fosfátový pufr nejvíce pufrovat: tlumit změny ph po přídavku kyseliny chlorovodíkové, tj. kdy bude rozdíl ph před a po přidání HCl nejmenší. K měření se používá přístroj zvaný ph-metr. Jde o upravený potenciometr - měří se rozdíl potenciálů, tj. napětí, mezi elektrodami ponořenými do zkoumaného roztoku. Potenciometrie je elektrochemická analytická metoda používaná ke stanovení aktivity látek v roztocích. Principem je bezproudé měření elektromotorického napětí galvanického článku, tj. potenciálového rozdílu mezi indikační (měrnou) elektrodou a referentní (srovnávací) elektrodou ponořenými do analyzovaného roztoku. Metoda se používá i k určení bodu ekvivalence při neutralizačních nebo redoxních titracích. 27

28 Potenciál indikační elektrody závisí na aktivitě stanovované látky v roztoku. Na stanovení různých látek používáme různé typy elektrod. Příkladem jsou iontově-selektivní elektrody, tzv. ISE, které slouží ke specifickému stanovení aktivity určitého iontu, např. "skleněnou elektrodou" se stanovuje aktivita H + (přesněji H 3 O + ) a tedy i hodnota ph. Potenciál referentní elektrody na aktivitě stanovované látky nezávisí, je stabilní. Používá se např. argentchloridová nebo kalomelová elektroda. Závislost elektrodového potenciálu na aktivitě stanovované látky popisuje Nernstova-Petersonova rovnice: E 0 = tabelovaný standardní elektrodový potenciál R = molární plynová konstanta (8,314 J.K -1 mol -1 ) E = E 0 + (RT/nF) ln (a ox / a red ) T = termodynamická teplota v Kelvinech (25 C = 298,15 K) n = počet vyměňovaných elektronů (Ox + e - Red) F = Faradayova konstanta ( C.mol -1 ) n = přirozený logaritmus; ln a = 2,303 x log a a = aktivita analyzované látky (při výpočtech někdy dosazujeme místo aktivity koncentraci) (a = γ x c; γ = aktivitní koeficient, c = molární koncentrace; ve zředěných roztocích se γ blíží 1, proto a = c). dosazením získáme tvar: E = E 0 + (0,059/n) log (a ox / a red ) Pokud se v redoxním páru vyskytuje látka ve standardním stavu, dosazujeme její jednotkovou aktivitu (a red = 1) a rovnice pak má tvar: E = E 0 + (RT/nF) ln a ox E = E 0 + (0,059/n) log a ox (tzv. Nernstova rovnice) Dohodou bylo určeno, že standardem, od kterého se budou odvozovat hodnoty potenciálů všech elektrod, bude elektroda vodíková (tz. standardní vodíková elektroda, SHE). Její potenciál byl položen roven nule při všech teplotách. Standardní potenciál (E 0 ) jakékoli elektrody je pak potenciál naměřený mezi touto elektrodou a elektrodou vodíkovou, které jsou ponořené do roztoku o jednotkové aktivitě analyzovaných iontů. Na měření ph se v praxi používá tzv. "skleněná elektroda" v kombinaci s některou referentní elektrodou. Skleněná elektroda je příkladem membránové iontově selektivní elektrody. Je tvořena tenkou skleněnou membránou ze speciálního sodno-vápenatého skla. Baňka elektrody je naplněna pufrem o konstantním ph, do kterého je ponořena vnitřní referentní elektroda (nejčastěji argentchloridová). Po ponoření skleněné elektrody do analyzovaného roztoku dochází k vzájemné výměně sodných iontů ze skla za vodíkové ionty z roztoku. Potenciál membránové iontově-selektivní elektrody (např. sklaněné elektrody) lze popsat rovnicí, která sice není rovnicí Nernstovou, ale tvarem ji připomíná (na elektrodě nedochází k redoxní reakci, ale pouze k iontové výměně): E M = K + (0,059/n) log a(x n+ ) kde K je konstanta, X je analyzovaný ion pro měření ph platí E M = K + (0,059/1) log (H + ) E M = K - 0,059 ph Konstantu z uvedené rovnice není třeba zjišťovat, při práci s elektrodou se používá kalibrace přístroje pomocí roztoků o známé aktivitě analyzovaného iontu. Před vlastním měřením ph musí být tedy ph-metr nejprve nakalibrován roztoky o známé hodnotě ph a tedy známé aktivitě protonů, přesněji oxoniových kationtů (ph = - log a (H 3 O + ). Při kalibraci si přístroj automaticky proměří závislost naměřeného napětí a zadaných hodnot ph kalibračních roztoků. K této kalibraci se používají komerčně dodávané pufry o známé hodnotě ph. Hodnota ph analyzovaného vzorku musí být v rozmezí hodnot ph použitých kalibračních pufrů. 28

29 V praktickém cvičení používáme tzv. kombinovanou elektrodu: referentní elektroda je vestavěna spolu se skleněnou elektrodou do jednoho tělesa, tj. do analyzovaného roztoku ponořujeme místo dvou samostatných elektrod (skleněné a referentní) jen toto jedno dvojče. Obr.2 Kombinovaná skleněná elektroda (dvojče) pro měření ph Literatura: Podrobnější informace o potenciometrické analýze naleznete na internetu (viz. ve studijních materiálech pro modul Buněčné základy medicíny. POŽADOVANÉ ZNALOSTI Princip metody, základní pojmy, porozumění potenciometrickému způsobu analýzy, představa o využití v praxi (příklady). Definice a způsob výpočtu ph. Mít představu o hodnotách disociačních konstant slabých kyselin a zásad (řádově). Pufry - složení, využití, příklady. POSTUP ANALÝZY Fosfátový pufr o různé pufrační kapacitě připravíme smícháním různých objemů roztoků NaH 2 PO 4 a Na 2 HPO 4 (tj. složky pufru budou v různém poměru, což se projeví také na hodnotě ph připravených pufrů). Po smíchání těchto složek je třeba nejprve vytvořený pufr promíchat magnetickým míchadlem, pak teprve měříme ph. Před ponořením elektrody do analyzovaného roztoku musí být elektroda opláchnutá destilovanou vodou. Jakmile se ph na displeji ph-metru ustálí na konstantní hodnotě, hodnotu zapíšeme a vyjmeme elektrodu. Do kádinky ihned přidáme dávkovačem HCl (kyselinu nikdy nepřidávejte do kádinky v níž je ponořena elektroda), roztok promícháme magnetickým míchadlem a opět ponoříme elektrodu (jelikož ji ponořujeme do kádinky se stejným roztokem pufru, není třeba elektrodu mezi měřeními oplachovat vodou). Po ustálení ph a zapsání jeho hodnoty elektrodu vyjmeme z kádinky, opláchneme destilovanou vodou a vložíme do kádinky s dalším pufrem. Nejsou-li měření ph prováděna bezprostředně za sebou, je nutno mezi měřeními elektrodu uchovávat v kádince s destilovanou vodou (elektroda nesmí zůstat nasucho ). Vybavení: Chemikálie: ph-metr kombinovaná elektroda stojan magnetická míchačka odměrné válce kádinky 2 kalibrační pufry (hodnota ph uvedena na lahvičce) 0,1 M NaH 2 PO 4 0,1 M Na 2 HPO 4 0,1 M HCl v dávkovači destilovaná voda 29