Podmínky získání zápočtu...2. Laboratorní řád...3. Bezpečnost práce v laboratoři...3. Základní techniky práce v laboratoři...4

Transkript

1 / 1 Obsah Podmínky získání zápočtu...2 Laboratorní řád...3 Bezpečnost práce v laboratoři...3 Základní techniky práce v laboratoři Obecné zásady odměřování objemů Pipetování skleněnou pipetou Odměřování objemů automatickou pipetou Vážení Příprava roztoků Ředění roztoků, ředicí řady Filtrace Centrifugace...10 Zpracování experimentálních dat Zaokrouhlování a platné číslice Chyby měření, základy statistického zpracování výsledků Zásady pro sestrojování grafů Pracovní protokoly...13 Úloha 1. ODMĚŘOVÁNÍ OBJEMŮ, ŘEDĚNÍ ROZTOKŮ...14 Pracovní postup...14 Úloha 2. PŘÍPRAVA ROZTOKŮ...16 Pracovní postup...16 Úloha 4. SPEKTROFOTOMETRICKÉ METODY...17 Pracovní postup...20 Úloha 7. ph A PUFRY...21 Pracovní postup...23 Úloha 8. "STANOVENÍ BÍLKOVIN"...25 Pracovní postup...26

2 Podmínky získání zápočtu / 2 Podmínky získání zápočtu 1. vypracování všech úloh se ziskem alespoň 50 % bodů(viz dále) 2. vypracování protokolů se ziskem alespoň 50 % bodů (viz dále) 3. absolvování zápočtového testu s úspěšností 60 % (max. 3 pokusy) Test je možné absolvovat pouze v případě, že jste splnili 1. podmínku a ze všech úloh odevzdali protokoly (není nutno, aby již byly opravené). Bodové hodnocení ad 1 DOMÁCÍ PŘÍPRAVA A PRÁCE V LABORATOŘI Na každou úlohu je nezbytné se dopředu připravit. Pozorně si přečtěte celý návod. Teoretická část před vlastním návodem k úloze vám pomůže k pochopení daného tématu a toho, co budete v praktiku dělat. Do pracovního deníku (vázaný sešit A4) před každou úlohou zpracujte kontrolní otázky, veškeré výpočty potřebné k postupu a schematicky návod tak, abyste se v laboratoři nezdržovali výpočty objemů nebo navážek, ale rovnou mohli pracovat bez zbytečných prostojů. V případě zcela nedostatečné přípravy bude student z praktika vyloučen a úlohu vykoná v náhradním termínu (max. 2x). Během práce v laboratoři zapisujete veškeré experimentální hodnoty do pracovního deníku například přesné navážky a objemy při přípravě roztoků, ředění vzorků, výsledné naměřené hodnoty, typ a šířku použitých kyvet, vlnové délky při kterých jste měřili, podmínky centrifugace nebo dobu, po kterou probíhala reakce. Vaši domácí přípravu a přístup k práci včetně zpracování pracovního deníku budeme hodnotit 0 5b./úlohu. Sankcionovány budou zejména prohřešky proti laboratornímu řádu či bezpečnosti práce, konkrétně např.: neomluvená absence pozdní příchod (v ojedinělých případech lze tolerovat zpoždění do 15 min) opouštění praktika během experimentu nedostatečná domácí příprava (včetně přípravy v pracovním deníku) nedodržení návodu či pokynů vyučujícího praktika nedbalost při práci (např. hrubá nepřesnost při odměřování objemů, vážení apod.) vyhýbání se práci (pracuje převážně 1 z dvojice) neuklizené pracovní místo Opakované závažné prohřešky proti laboratornímu řádu (např. neomluvené absence, nedostatečná domácí příprava) nebo dokonce bezpečnosti práce budou potrestány vyloučením z praktik a tedy neudělením zápočtu již v průběhu semestru. ad 2 HODNOCENÍ PROTOKOLŮ Protokoly ze všech úloh je nutno odevzdat vždy do týdne (před vypracováním následující úlohy). Za každý týden prodlevy bude odečtena desetina maximálního počtu bodů, který lze z protokolu získat. Protokoly nebudeme vracet k přepracování, pouze je ohodnotíme body (protokoly z úloh č. 1, 2 a 3 v rozsahu 0-5 b., ostatní protokoly 0-10 b.). K nahlédnutí a konzultaci budou protokoly k dispozici vždy cca týden po odevzdání v konzultačních hodinách. Všechny protokoly vám budou vráceny na konci praktik. K udělení zápočtu je třeba za protokoly dosáhnout 50 % bodů. Bodové hodnocení bude zohledňovat dodržení požadavků na zpracování protokolu uvedených na str. 13 těchto skript. Opsaný protokol či jeho část hodnotíme 0 b., a to i při pozdějším odhalení!

3 Laboratorní řád / 3 Laboratorní řád Student je povinen před zahájením práce v laboratoři se seznámit s laboratorním řádem, s bezpečnostními předpisy a poskytováním první pomoci (nutno stvrdit podpisem). vypracovat všechny úlohy v řádném termínu; případnou absenci (pouze ze závažných důvodů) je nutno předem omluvit a ihned dohodnout s vedením praktika náhradní termín pro vypracování úlohy (možnosti náhrady úlohy jsou velmi omezené!). přicházet do laboratoře včas a řádně připraven, tj. mít v prac. deníku provedeny potřebné výpočty, zodpovězené kontrolní otázky, schematický nákres či základní body pracovního postupu apod. (v opačném případě bude student z praktika vyloučen a úlohu vykoná v náhradním termínu). průběh práce a dosažené výsledky zaznamenávat do pracovního deníku (vázaný sešit formátu A4), který vždy po skončení cvičení předkládá ke kontrole vedoucímu cvičení. používané chemikálie neprodleně vracet na původní místo. po skončení práce uklidit pracovní místo, použité sklo řádně umýt a opláchnout destilovanou vodou, doplnit destilovanou vodu do příslušných střiček a stůl předat laborantovi/laborantce. samostatně vypracovat protokol a odevzdat do týdne (ještě před vypracováním další úlohy). Bezpečnost práce v laboratoři 1. Při práci v laboratoři je nezbytné mít vlastní pracovní plášť a obuv k přezutí (boty s pevnou špičkou; zcela nevhodné jsou vysoké podpatky či žabky); tašky, oblečení a venkovní obuv uložit do skříňky mimo laboratoř. 2. V laboratoři je zakázáno jíst, pít, kouřit, telefonovat a přijímat návštěvy. 3. Pracujte pouze dle pracovního návodu či pokynů vyučujícího. 4. Všechny přístroje (spektrofotometry, centrifugy, ph-metr) lze používat až po konzultaci s vyučujícím. 5. Během práce udržujte čistotu. 6. Nikdy nepipetujte ústy, používáme k tomu určený nástavec či balonek. 7. S jedovatými, těkavými a páchnoucími látkami pracujte pouze ve spuštěné a zapnuté digestoři. 8. Při provádění pokusů držte ústí zkumavek odvrácené od obličeje. 9. Koncentrované kyseliny a zásady ředíme tak, že kyselinu nebo zásadu lijeme tenkým proudem po tyčince do vody za současného míchání, případně i chlazení. 10. Při práci s hořlavinami nesmí být v blízkosti otevřený oheň. 11. Skleněné střepy musí být odkládány do nádoby zvlášť k tomu určené. 12. Zbytky jedů a organických rozpouštědel likvidujte podle pokynů vyučujícího. 13. Případné závady, nedostatky, nehody nebo poranění (i drobná) je nutné neprodleně hlásit vyučujícímu a v případě potřeby poskytnout okamžitě první pomoc. Voda z vodovodu obsahuje značné množství solí, proto je pro experimenty v biochemické laboratoři nepoužitelná. Pro účely laboratorních cvičení (včetně oplachování nádobí) je nutné používat vodu destilovanou. Z nebezpečných látek budete v laboratoři pracovat zejména s organickými rozpouštědly. Při práci s těmito látkami se vždy chráníme ochrannými pomůckami používáme rukavice a pracujeme v digestoři. Do zvláště nebezpečné skupiny těkavých látek s mutagenním a karcinogenním účinkem patří chloroform.

4 Základní techniky práce v laboratoři / 4 Základní techniky práce v laboratoři 1. Obecné zásady odměřování objemů Odměrné sklo i automatické pipety jsou běžně kalibrovány na měření objemu při 20 ºC. U zásobních kapalin, které byly uskladněny v lednici, necháme láhev ještě před otevřením (kvůli možné kondenzaci vzdušné vlhkosti) vždy nejprve vytemperovat na laboratorní teplotu. Při měření objemu pak odměrné sklo nezahříváme rukou. Nikdy kapalinu nenabíráme ze zásobní lahve - mohli bychom totiž do kapaliny zanést pipetou nečistoty. Přibližné potřebné množství kapaliny odlijeme do pracovní kádinky. Zásobní láhev při odlévání držíme tak, aby byl štítek v dlani a případná kapka nezničila označení zásobní lahve. Kapalinu se také doporučuje nalévat pomocí tyčinky. Zabráníme tak vystřikování kapaliny z kádinky (to je obzvláště důležité u nebezpečných a žíravých kapalin). Objem na stupnici vytištěné nebo vyleptané na stěně skleněného nádobí odečítáme v místě, kam dosahuje meniskus povrchové blanky odměřované kapaliny: Při odečítání objemu se oko musí nacházet v úrovni menisku (tj. kružnice rysky splyne v úsečku). Pokud by oko bylo výše či níže, odečtený objem by neodpovídal skutečnosti (paralaxní chyba) Odměrné nádobí je kalibrováno buď na dolití, nebo na vylití. Tento dvojí způsob kalibrace je opodstatněn tím, že při vylití kapaliny z nádoby ulpí trvale vlivem smáčivosti skla určité množství kapaliny na stěnách nádoby v podobě tenkého filmu. Vyteklý objem je pak o toto množství menší, než byl původní objem kapaliny v nádobě. Nádoby kalibrované na vylití na nádobě vyznačeno zkratkou EX. přesný objem vypuštěné kapaliny Nádoby kalibrované na dolití na nádobě vyznačeno zkratkou IN. přesný objem kapaliny uvnitř nádoby odměrné válce, pipety, byrety (používají se na titrace - mají u svého ústí ventil) Je počítáno s tím, že určitá část vypouštěného roztoku ulpí na stěnách nádoby vlivem smáčivosti skla nebo je zadržena kapilárními silami, skutečný vnitřní objem takto kalibrovaných nádob je tedy o toto malé množství kapaliny větší. odměrné baňky (a některé odměrné válce) Slouží k přípravě roztoků o přesných koncentracích (viz dále). K přesnému odměřování objemu NESLOUŽÍ: Kalibrace uváděná na tomto nádobí je pouze orientační! Kádinky Erlenmayerovy baňky Pasteurovy pipety (plastová či skleněná kapátka) 2. Pipetování skleněnou pipetou Sklo je poměrně inertní materiál, který na svůj povrch neváže ani látky značně hydrofobní. Obecně jsou pipety přesnější než odměrné válce, což je dáno velkým poměrem výšky a průměru pipety, kdy se stejná chyba v odečtení menisku projeví v podstatně menším objemu. Pipety mohou být vyrobeny buď jen pro jeden určitý objem (např. 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml a 25 ml) nebo pro více objemů, tedy tzv. dělené pipety. Roztok nikdy nepipetujeme ze zásobní láhve, ale z kádinky, do které si odlijeme přiměřené množství roztoku určeného k pipetování (viz výše). Pokud pipeta není zcela čistá a suchá, je vhodné začít několikanásobným promytím pipety destilovanou vodou a poté alespoň dvakrát odměřovaným roztokem - tím se odstraní z pipety voda, která by odměřovanou kapalinu zředila.

5 Základní techniky práce v laboratoři / 5 Dříve se mnoho látek pipetovalo ústy, což mělo za následek v lepším případě znečištění vzorku slinami, v horším pak poleptání úst. Při pipetování kapalinu nikdy nenasáváme ústy, ale k nasátí vzorku používáme pístový nástavec na pipetu nebo balónek. Roztok je vhodné nasát asi 2 až 3 cm nad rysku, následně je třeba pipetu rychle uzavřít ukazováčkem, vyjmout nad hladinu roztoku, špičku opřít o vnitřní stěnu nádoby a opatrným nadzvedáváním ukazováčku upouštět nadbytečnou kapalinu tak, aby se meniskus právě dotýkal rysky (viz výše) u požadovaného objemu. Kapalinu z pipety necháme pozvolna vytékat po stěně kádinky. Při kalibraci se předpokládá, že roztoky budou vypouštěny při svislé poloze volným výtokem bez napomáhání pístovým nástavcem, foukáním nebo poklepem. Aby vytekla i kapalina pomalu stékající po vnitřních stěnách, je třeba vyčkat ještě alespoň 10 sekund (tzv. výtoková doba), ačkoli se pipeta jeví již prázdná. V ústí pipety i poté vždy zůstane malá část objemu odměřované kapaliny. Vzhledem k tomu je důležité ihned po použití pipetu promýt destilovanou vodou, aby v ní roztok nevyschl a nekrystalizoval, a následně vysušit. 3. Odměřování objemů automatickou pipetou a) ZÁKLADNÍ TECHNIKA PIPETOVÁNÍ K odměřování přesných objemů roztoků se v současné laboratorní praxi nejčastěji používají pístové automatické pipety. Dávkování je prováděno tlačítkem, které pohybuje pístem ve válci pipety. Automatické pipety mohou být buď na fixní objem nebo plynule nastavitelné. Vzorek je nabírán do nesmáčivé (polypropylenové) vyměnitelné špičky, takže s pístem ani tělem pipety vůbec nepřichází do styku. Základní jednorázové špičky používané pro automatické pipety bývají odlišeny barevně, nejčastěji viz tabulka: barva špičky: rozsah objemů: Nastavení požadovaného objemu: Vždy je nutné dodržet bílá 0.2 až 10 μl rozsah objemů, pro které je pipeta určena a použít žlutá 2 až 200 μl odpovídající jednorázovou špičku. Objem je modrá 200 až 1000 μl bílá 1 až 5 ml nastavován otáčením šroubu, u některých pipet případně otáčením ovládacího tlačítka pístu. Nastavování by mělo být prováděno pomalu a plynule. K dosažení nejvyšší správnosti a reprodukovatelnosti při změnách nastavení pipetovaného objemu překročte požadovaný objem o jednu třetinu otáčky a potom pomalu snižujte na požadovaný objem. Nastavením objemu se píst v těle pipety pohne do odpovídající pozice. Vlastní pipetování (viz schéma vpravo): 1)Stiskněte ovládací tlačítko pipety k prvnímu dorazu (mimo pipetovaný vzorek!), píst v těle pipety vytlačí stejný objem vzduchu, jako je nastavený objem. 2)Pipetu ve vertikální poloze ponořte špičkou jen asi 2-4 mm pod hladinu kapaliny. Pokud byste špičku ponořili více, množství tekutiny ulpělé zvenku na špičce by vedlo k hrubé nepřesnosti pipetování. VELMI POMALU a plynule uvolňujte tlačítko, špičku přitom udržujte stále ponořenou ve stejné hloubce. Vznikající podtlak postupně nasává do špičky tekutinu, přičemž pomalým nasáváním kapaliny do špičky se omezí možný vznik turbulence, která může vyvolat vznik aerosolu a bublinek plynu, vycházejících z kapaliny. Po úplném uvolnění ovládacího tlačítka vyčkejte ještě alespoň 1 sekundu, poté vytáhněte špičku z kapaliny. Vždy sledujte, zda do špičky nevnikly bublinky vzduchu (např. při prudším povolení pístu ovladače nebo špatně nasazené špičce). Pipetu s nasátou kapalinou udržujte ve svislé poloze tak, aby kapalina nemohla vniknout do těla pipety. 3)Umístěte špičku pipety k vnitřní stěně cílové nádoby v úhlu o. Při pipetování vzorků s biologickou aktivitou, kde nesmí dojít k porušení solvatačního obalu makromolekul (např. proteiny, zejména enzymy) vypouštíme vzorek pod hladinu rozpouštědla. Plynule stiskněte tlačítko k prvnímu dorazu. Vyčkejte 1 sekundu a stiskněte tlačítko k druhému dorazu a tím vypudíte zbytek kapaliny. Za současného držení stisknutého tlačítka na druhém dorazu vytáhněte špičku podél vnitřní stěny nádoby. 4)Uvolněte tlačítko (mimo vzorek). Odhoďte špičku stisknutím tlačítka odhazovače. (Stejnou špičku lze pro další pipetování použít jen při pipetování téže kapaliny.) Přípravné propláchnutí: Při pipetování se na vnitřní stěně špičky vytváří tenký film kapaliny. Tato chyba vypuzeného objemu se tedy projeví významně pouze u prvního vzorku s novou špičkou. V okamžiku, kdy je vytvořen film, jsou následující vzorky pipetovány s lepší přesností a reprodukovatelností. Proto je vhodné před pipetováním provést přípravné propláchnutí špičky tak, že nasajete pipetovanou kapalinu z první polohy pístu tak, jak je uvedeno výše v bodech 1 a 2, špičku z kapaliny nevytáhnete, ale stisknutím pístu do první polohy vypudíte kapalinu zpět do původní nádoby. Propláchnutí musí být provedeno vždy při zvětšení pipetovaného objemu nebo výměně špičky. Snižujete-li pipetovaný objem, použijte novou špičku.

6 Základní techniky práce v laboratoři / 6 b) DALŠÍ VYUŽITÍ AUTOMATICKÉ PIPETY Těkavé kapaliny: Výpary rozpouštědel mohou porušit těsnost pístu běžně používaných automatických pipet, pro pipetování těkavých rozpouštědel je proto nutné použít speciální automatické pipety, které k nasávání vzorku používají kapiláry s písty na jedno použití, které zabraňují kontaktu a proniknutí aerosolu do těla pipety. V praktiku k pipetování těkavých kapalin používejte pipety skleněné, případně (pokud nezáleží na přesném objemu přenášeného rozpouštědla - např. k oddělení těkavého rozpouštědla od vodné fáze po extrakci) lze použít plastové Pasteurovy pipety. Zde je však nutno uvážit, zda dané rozpouštědlo nebude reagovat s plastem použitým pro výrobu pipety (nejčastěji deriváty PE). Při pipetování těkavých kapalin dochází k odkapávání kapaliny ze špičky způsobené tlakem par nad kapalinou. Tento efekt lze významně omezit vícenásobným propláchnutím špičky. Viskózní kapaliny a kapaliny s vysokou hustotou: K manipulaci s hustými, viskózními kapalinami nebo i krémy se doporučuje používat pipety k tomu určené, s aktivním vypuzováním. Při použití běžných pipet je nutné velmi prodloužit nasávání i vypuzování vzorku, nejlépe ještě za použití reverzní techniky pipetování. Pro urychlení pipetování je možné rozšířit otvor ve špičce ustřižením konce, v tom případě však nelze pipetovat celý maximální objem špičky. Pokud je však potřeba odměřit opravdu přesný objem, je nutné použít gravimetrické ověření (= vážením). Reverzní technika pipetování (viz schéma vpravo): oproti základnímu postupu nasajeme vzorek do celého objemu pipety, tedy ze druhého dorazu (2), a vypustíme jen požadované množství, tj. stiskneme pouze k prvnímu dorazu pístu (3). Tato technika je vhodná pro pipetování viskózních či těkavých kapalin a vzorků, které snadno tvoří pěnu. Automatická pipeta je zcela nevhodná pro pipetování agresivních a korodujících kapalin. U hydrofobních látek může docházet k jejich vychytávání z vodného roztoku adsorpcí na vnitřní povrch špičky. (adsorpce = hromadění látky rozpuštěné v kapalině na povrchu pevné látky účinkem mezipovrchových přitažlivých sil) 4. Vážení a) OBECNÉ ZÁSADY VÁŽENÍ Navažujte zásadně objekty pokojové (laboratorní) teploty. Nádobu se vzorkem vyjmutou z lednice či mrazícího boxu otevírejte vždy až po jejím vytemperování na laboratorní teplotu, abyste zabránili kondenzaci vzdušné vlhkosti. Nedodržení této zásady má za následek nejen hrubou chybu navážky, ale i znehodnocení celého vzorku. Naopak teplý nebo horký objekt způsobí vedení proudu vzduchu kolem váženého objektu, přičemž tato síla redukuje tlak vzduchu na misku vah a způsobuje problémy s kolísáním vážené hodnoty. Navažujte pokud možno suché objekty. Vlhkost odpařovaná ze vzorku vede k hrubé nepřesnosti celého vážení. Vyhněte se přímému kontaktu vážené chemikálie s miskou vah. Používejte váženky, tj. speciální polypropylenové mističky s nízkou adhezivitou, případně alobal či přímo mikrozkumavky ( eppendorfky ). Váženku umístěte do středu plochy misky vah. Abyste nemuseli hmotnost nádobky od váženého vzorku odečítat, pomocí tlačítka TARE (RE-ZERO) můžete předvážky i analytické váhy vynulovat i s nádobkou. S naváženým vzorkem na vážence či alobalu neodcházejte, vzorek převeďte do baňky či kádinky přímo u vah! Předvážky jsou velmi jednoduchými elektrickými váhami, váží většinou s přesností ± 0.01 g a jsou proto vhodné například k odvážení pouze přibližného množství chemikálie, která má být v reakci v nadbytku a nevyžaduje vysokou míru přesnosti. Dále, jak samo označení napovídá, jsou vhodné k předvážení přibližného množství látky a přesná hmotnost je posléze navážena diferenčně na analytických vahách. Analytické váhy. K přesnému vážení a vážení velmi malých hmotností (v řádu mg) je nezbytné použít analytické váhy, které jsou o několik řádů citlivější než předvážky. Jsou velmi citlivé na chyby v podmínkách okolního prostředí, vyžadují opatrnější manipulaci než předvážky. Měření mohou například ovlivnit nepatrné otřesy (pohyb osob ve stejné místnosti, opíraní se o stůl), nerovnosti podlahy místnosti či proud vzduchu směřovaný na plochu vah. Proto se váhy umísťují na těžký stůl (nejlépe z kamene) a poblíž stěny, kde jsou otřesy nejmenší, případně se budují tzv. váhovny, tedy místnosti, kde jsou pouze váhy. Při odečítaní přesné hodnoty se pak doporučuje zavírat skleněná dvířka. Obecně při vážení na analytických vahách není vhodné použití skleněných nádob, zejména pro jejich vlastní vysokou hmotnost. V případě, že jsme nuceni skleněné nádoby použít, se jich nedotýkáme rukou (přenos nečistot z pokožky) - používáme buď rukavice, pinzetu nebo kontakt přes papír. Stejně tak na skleněné objekty nedýcháme, protože z dechu na nich kondenzuje voda a zvyšuje hmotnost objektu. Používejte stejné váhy (analytické i předvážky), zejména v případě, že pracovní postup vyžaduje více než jedno měření (například níže uvedené vážení z rozdílu). Každý přístroj může být totiž kalibrován s jemnými odchylkami.

7 Základní techniky práce v laboratoři / 7 b) DŮLEŽITÉ POJMY PŘI NAVAŽOVÁNÍ PEVNÝCH LÁTEK NAVÁŽENÍ ASI PŘESNÉHO MNOŽSTVÍ. Ve většině případů potřebujeme navážit asi přesné množství chemikálie. Pojem "asi přesně 1 g" představuje množství okolo 1 g ( g), ale navážené s vysokou přesností na analytických vahách (tj. např g). Nestačí tedy navážit na předvážkách 1.00 g, ale je také zcela nesmyslné snažit se navážit g na analytických vahách, zvláště pokud nevážíme přímo do cílové nádoby. Chemikálii nikdy nepřeneseme z jedné nádoby do druhé (např. z váženky do kádinky) beze ztrát. Pokud není možné vážit přímo do cílové nádoby (mikrozkumavka eppendorfka ), jsou možné následující přístupy: DIFERENČNÍ VÁŽENÍ NEBOLI VÁŽENÍ Z ROZDÍLU. Navažte přibližné množství dané chemikálie (možno i na předvážkách). Poté hmotnost vzorku i s váženkou zvažte na vahách analytických (případně váhy na tuto hmotnost vynulujte), chemikálii z váženky přesypte do cílové nádoby a opět važte vyprázdněnou váženku na stejných analytických vahách (i se zbytkem nepřenesené chemikálie). Rozdíl hmotností získaných v těchto dvou krocích určí přesnou hmotnost navážené chemikálie. KVANTITATIVNÍ PŘEVEDENÍ VZORKU. Při přípravě vodného roztoku do odměrné baňky (již obsahující malé množství vody či roztoku), navážku do baňky kvantitativně převedeme, což prakticky znamená, že navážku látky sklepneme do malé nálevky zasunuté do hrdla odměrné baňky a následně vodou ze střičky opláchneme váženku i nálevku. 5. Příprava roztoků Směšovací objem Při rozpouštění vychytává rozpouštědlo z rozpouštěné tuhé látky molekuly nebo ionty, přerušuje síly, které je drží pohromadě, a tak je dostává do roztoku. Rozpuštěné molekuly nebo ionty jsou rovnoměrně rozptýleny a obaleny molekulami rozpouštědla neboli solvatovány (u vody mluvíme o hydrataci). V důsledku změn uspořádání molekul rozpouštědla při tvorbě solvatačních obalů při rozpouštění pevných látek i ředění roztoků často dochází ke snížení výsledného objemu roztoku oproti součtu objemů složek roztoku (směšovací objem). Roztok o požadované koncentraci připravíme navážením přesného množství dané látky a doplněním rozpouštědlem na přesný objem v nádobě kalibrované na dolití (IN - odměrná baňka). Správně postupujeme tak, že přidáváme rozpouštěnou látku či ředěný roztok do rozpouštědla a ne naopak. Příprava vodného roztoku v odměrné baňce Látku naváženou na analytických vahách (s přesností ± 1 %) či odměřené množství kapaliny kvantitativně převedeme do odměrné baňky již obsahující malé množství vody, tj. navážku látky sklepneme do malé nálevky zasunuté do hrdla odměrné baňky, vodou ze střičky do nálevky opláchneme i váženku tak, aby by celkový objem směsi zaujímal cca 1/3 celkového objemu baňky. Rozpouštění urychlíme mícháním krouživým pohybem celé baňky (ne tyčinkou ani míchadlem). Teprve po úplném rozpuštění (a případném vytemperování roztoku na teplotu, na kterou je baňka kalibrována) doplníme baňku po rysku destilovanou vodou - poslední kapky přidáváme opatrně pipetou. Naplněnou baňku uzavřeme suchou zátkou a několikrát promícháme obrácením baňky dnem vzhůru a zpět, přičemž zátku přidržujeme palcem. Rychlost rozpouštění (nikoliv však rozpustnost viz odstavec vpravo) můžeme ovlivnit intenzívním mícháním směsi (odstraníme tak lokální přesycení danou látkou v roztoku) či ultrazvukem. Biologicky aktivní látky jsou však na tyto vlivy citlivé - vysoká teplota, příliš bouřlivé míchání či působení ultrazvuku mohou vyvolat ztrátu jejich biologické aktivity. Schopnost látek se rozpouštět v daném rozpouštědle za daných podmínek a vytvářet s rozpouštědlem roztok se nazývá rozpustnost. Látky úplně nerozpustné neexistují, avšak u špatně rozpustných látek je rozpuštěné množství těžko postřehnutelné. Jsou možné tyto stupně rozpustnosti látek: neomezená rozpustnost (resp. mísitelnost, př. voda-ethanol), omezená/částečná rozpustnost (př. voda-ether, většina pevných látek a plynů v kapalinách viz dále) praktická nerozpustnost (př. voda-petrolej, voda-pbcl 2). Většina pevných látek i plynů je v daném objemu rozpouštědla částečně rozpustná, tedy existuje určitá maximální možná koncentrace, nasycený roztok. Míru rozpustnosti tuhých látek za daných podmínek proto charakterizujeme právě jejich koncentrací v nasyceném roztoku. Na zvýšení rozpustnosti má vliv teplota (s rostoucí teplotou se u většiny tuhých látek zvyšuje i rozpustnost). Příprava roztoků v biochemické laboratoři Práce s odměrnou baňkou neumožňuje např. úpravu ph roztoku a práce s ní je prakticky nemožná, pokud je rozpouštěného vzorku větší množství a zároveň je hůře rozpustný. Tam, kde nezáleží na zcela přesné koncentraci roztoku např. u pufrů nebo činidel přidávaných do reakčních směsí v nadbytku se uchylujeme k ne zcela přesnému postupu, kdy si sami orientačně kalibrujeme vhodnou nádobu na potřebný objem (na dolití). Pomocí odměrného válce odměříme např. do kádinky s magnetickým míchadlem požadovaný objem destilované vody, popisovačem vyznačíme rysku, část destilované vody odlijeme (dále použijeme). V kalibrované nádobě s částí vody rozpustíme vzorek a po úpravě ph atd. doplníme po rysku destilovanou vodou. V biochemii často pracujeme jen s roztoky o malých objemech a nízkých koncentracích, kde zanedbáváme směšovací objem. Při práci s malým množstvím vzorku pak nejčastěji postupujeme tak, že navážíme (přesně) přibližnou hmotnost, nejlépe přímo do mikrozkumavky, a spočítáme jaký objem rozpouštědla je nutno přidat, aby vznikl roztok o přesné požadované koncentraci.

8 Základní techniky práce v laboratoři / 8 VYJADŘOVÁNÍ SLOŽENÍ ROZTOKŮ c Látková koncentrace, molarita (c) = látkové množství rozpuštěné látky A připadající na jednotku objemu roztoku. na V A = = ma V.M r( A) Hmotnostní koncentrace (c m) = hmotnost rozpuštěné látky A připadající na jednotku objemu roztoku. Hmotnostní zlomek (w) = podíl hmotnosti rozpuštěné látky A a hmotnosti roztoku. Objemový zlomek (φ) = podíl objemu rozpuštěné látky A a objemu roztoku. ma ma VA cm( A ) = wa =.100% ϕ A =.100% V m V [mol l -1 ] [ g l -1 ] [ %( w / v) ] [ %( w / w) ] [ %( v / v), obj. % ] Roztoky o stejné molaritě obsahují v jednom litru roztoku stejný počet molekul rozpuštěné látky neboli stejné látkové množství n [mol]. 1 mol jakékoliv látky obsahuje počet molekul rovný Avogadrově konstantě (6.023 x ). Hmotnost 1 molu látky označujeme jako molární hmotnost - např. M(NaOH) = 40 g/mol. Molekulová relativní hmotnost má stejnou hodnotu, ale je bez jednotky- např. M r (NaOH) = 40. Při rozpouštění pevných látek ve vodě se také běžně (nepříliš správně) uvádí podíl hmotnosti rozpouštěné látky a objemu roztoku jakožto %(w/v), tj. vlastně hmotnostní zlomek, kde uvažujeme hustotu roztoku rovnu jedné. Roztok o koncentraci 1%(w/v) odpovídá hmotnostní koncentraci 10 g l -1. Jednotky SI [mol m -3 ] pro molaritu nebo [kg m -3 ] pro hmotnostní koncentraci se v praxi nepoužívají. Při vyjadřování koncentrace látky pomocí objemového a hmotnostního zlomku je vždy nutné uvést, zda se jedná o objemová (v/v) či hmotnostní (w/w) procenta. Číslo a příslušnou jednotku v textu vždy oddělujeme mezerou (např. "0.1 mol/l"). Výjimku tvoří případy, kdy je jednotka použita jakožto přídavné jméno, tedy např. "50% EtOH" (= 50procentní vodný roztok ethanolu). Molarita se někdy označuje tak, že se vzorec látky uvede do hranaté závorky - koncentraci NaCl tak označujeme [NaCl]. "1molární vodný roztok" NaCl se také často zkracuje na "1M" NaCl. 6. Ředění roztoků, ředicí řady Při ředění roztoků se setkáváme s různými formami zápisu, v těchto skriptech se budeme držet tohoto: ředění zásobního roztoku v poměru 1 : 2 znamená totéž, co ředění 3x, tj. že ke 2 dílům rozpouštědla přidáme 1 díl zásobního roztoku. Výpočty ohledně mísení (či ředění) roztoků o známé molaritě je možno uskutečnit na principu zachování látkového množství dané složky v různých objemech: n 1 + n 2 = n 3 c 1V 1 + c 2V 2 = c 3V 3 Zcela analogicky postupujeme při ředění roztoků o známé hmotnostní koncentraci (na základě zachování hmotnosti dané složky v různých objemech). Při mísení dvou roztoků o známých hmotnostech m a hmotnostních zlomcích w (event. procentualitách) se používá směšovací rovnice: m 1w 1 + m 2w 2 = (m 1 + m 2) w 3 Hmotnostní zlomek čisté látky v pevném stavu se rovná jedné (resp. 100 %), hmotnostní zlomek čistého rozpouštědla je roven 0. Směšovací rovnice se často převádí na diagonální schéma křížového pravidla: Poměr (w 3 w 2 ) / (w 1 w 3 ) udává poměr mísení roztoků o složení w 1 a w 2. Pokud např. potřebujeme smísením 100% roztoku (= w 1 ) a 25% roztoku téže látky (= w 2 ) připravit roztok 50% (= w 3 ), je nutno smísit: w 3 w 2 = = 25 dílů 100% roztoku w 1 w 3 = = 50 dílů 25% roztoku - dle typu zlomku (% w / w či % w / v) se může jednat jak o díly hmotnostní, tak i objemové Potřebujeme-li připravit sérii roztoků s klesající koncentrací, nabízí se následující přístupy: Geometrická ředící řada Postup * ) (např. desítková řada o objemu 9 ml): ( serial dillution ) 1.do všech zkumavek odměříme stejný objem rozpouštědla odpovídající Koncentrace v každé následující požadovanému výslednému objemu (např. vždy 9 ml dest. vody) zkumavce je zlomkem (např. 2.do první zkumavky přidáme objem zásobního roztoku z pracovní kádinky tak, desetinou) koncentrace aby odpovídal požadovanému ředění (např. 1 ml roztoku) předchozí 3.obsah zkumavky důkladně promícháme a tentýž objem (tj. 1 ml ředěného roztoku) přeneseme do zkumavky následující 4.bod 3 opakujeme, dokud se nedostaneme až k poslední zkumavce 5.abychom získali stejný výsledný objem i v poslední zkumavce, je nutné z ní také odpovídající objem roztoku (tj. 1 ml) odebrat.

9 Základní techniky práce v laboratoři / 9 Aritmetická ředící řada Koncentrace v sérii zkumavek klesá lineárně. Postup * ): 1.do všech zkumavek odměříme příslušný vypočtený objem rozpouštědla (např. dest. vody) 2.do každé zkumavky přidáme příslušný objem zásobního roztoku z pracovní kádinky. * Při přípravě roztoků uvedeným postupem zanedbáváme směšovací objem. Pokud bychom požadovali přesné koncentrace, je třeba pracovat s odměrnými baňkami tj. např. při použití geometrické řady odebírat z baňky po jejím doplnění na požadovaný objem. Nevýhody obou metod: Použití aritmetické řady je omezeno malým rozsahem koncentrací a je časově náročnější na přípravu i praktické provedení. Ředění geometrickou řadou může být zatíženo systematickou chybou (např. při pochybení při přípravě prvního roztoku bude koncentrace odlišná ve všech roztocích). 7. Filtrace Filtrace je separační metoda, která umožňuje oddělit složky suspenze: pevná látka se zachytí na filtru, kapalina proteče jako filtrát. Nejjednodušší aparaturu pro filtraci představuje filtrační nálevka, do níž vkládáme vhodně složený filtrační papír: Filtr zhotovíme ze čtverce filtračního papíru, který složíme pravoúhle na čtvrtinu a okraje složeného papíru pak sestřihneme do kruhového výseku tak, aby jeho poloměr byl o 0.5 cm menší než výška nálevky. Hladký filtrační papír získáme tak, že jednu kapsu filtru rozevřeme a získaný kornout, jehož jedna strana je tvořena pouze jednoduchou stěnou filtru a druhá trojitou, vsuneme do nálevky, navlhčíme rozpouštědlem (nejčastěji vodou ze střičky) a přitiskneme na stěny. Pozor, neprotrhnout špičku! Tento tzv. hladký filtr filtruje zejména špičkou a poměrně pomalu. Používáme jej všude tam, kde je tuhé látky v suspenzi malé množství a jde nám o zužitkování právě tuhé látky na filtru zachycené. Rychleji pracuje filtr skládaný čili francouzský. Připravíme jej tak, že kruhový výsek filtračního papíru rozložíme v polokruh a překládáme vějířovitě od středu k obvodu střídavě po stranách v menší výseky, přičemž špička filtru musí být ostrá. Zároveň se však snažíme, aby se několikerým složením filtr nepoškodil ve špičce - proto při překládání dbáme na to, aby jednotlivé záhyby neprocházely jedním bodem, nýbrž byly od sebe poněkud vzdáleny. Doporučuje se složený filtr před vložením do nálevky rozevřít a obrátit tak, aby původní vnější stěna filtru tvořila stěnu vnitřní, poněvadž se plocha papíru obvykle v místě ohybu přímým stykem s prsty ruky může poškodit nebo i ušpinit; tak zabráníme znečištění filtrátu papírovými vlákny a jinými nečistotami. Skládaný filtr se opírá o nálevku jen hranami, čímž se zvětší filtrační plocha, takže filtrace francouzským filtrem je daleko rychlejší než filtrace hladkým filtrem téhož průměru.

10 Základní techniky práce v laboratoři / 10 Nálevku s filtrem vkládáme do kruhu železného stojanu a pod ni umisťujeme nádobu k zachycování filtrátu. Stonek nálevky se má při filtraci špičkou šikmo seříznutého konce dotýkat stěny nádoby - filtrát pak klidně stéká po stěně nádoby a nevystřikuje. Roztok naléváme na filtr po skleněné tyčince, kterou ve vhodném úhlu přiblížíme ke stěně filtru. Při použití hladkého filtru proud kapaliny řídíme vždy proti místu, kde je papírová vrstva trojitá, poněvadž jednoduchá stěna filtru by se mohla snadno protrhnout. Filtr plníme podle jeho velikosti nejvýše 10 až 15 mm pod jeho okraj. Rychlost filtrace závisí na ploše a vlastnostech filtračního prostředí - na počtu a velikosti pórů, na povaze sraženiny i na viskozitě a aciditě filtrované kapaliny. Chceme-li filtraci urychlit a použité látky to nepoškodí, filtraci můžeme provádět za horka či snížit odsáváním vzduchu tlak v prostoru pod filtrem. Filtrační materiál je určován chemickým charakterem filtrovaného roztoku vedle filtračního papíru se využívá např. vrstva vaty, pórovitá skleněná nebo porcelánová frita či různé typy membrán (ze smíšených esterů celulózy, teflonové, polykarbonátové) s různou velikostí pórů pracující v aparaturách založených na vakuovém nebo tlakovém principu. 8. Centrifugace Centrifugace neboli odstřeďování slouží k oddělení složek na základě rozdílných hustot. Vedle využití k rychlejšímu oddělení složek emulze při extrakci slouží centrifugace zejména k oddělení složek suspenze jako často výhodnější alternativa k filtraci; dále ke speciálním účelům jako např. k přípravě buněčných struktur (frakční či gradientová centrifugace) či stanovení relativních molekulových hmotností makromolekulárních sloučenin. V centrifugách se používají 2 typy rotorů: ve výkyvných rotorech jsou centrifugační zkumavky či kyvety uloženy v pouzdrech volně zavěšených na čepech vlastního rotoru a kyvety jsou během odstřeďování ve vodorovné poloze, naproti tomu v úhlových rotorech jsou kyvety fixovány v určitém úhlu (45-50 ) k ose otáčení. Protilehlé kyvety musí být vždy stejné (= stejná velikost, materiál), mít stejně umístěné těžiště (= musí být naplněny stejnou suspenzí) a stejnou hmotnost - protilehlé kyvety vždy vyvažujeme (u výkyvných rotorů včetně pouzder). Nikdy centrifugu nezapínejte bez rotoru! Centrifugaci charakterizujeme údajem o odstředivém zrychlení, které se uvádí nejčastěji relativně vůči zemskému gravitačnímu zrychlení (např g, kde g = 9.81 m s -2 ). Druhou možností je uvést rychlost otáčení jakožto počet otáček za minutu (= revolutions per min, RPM), pro jednoznačné vyjádření odstředivého zrychlení je nutné k tomuto údaji uvést ještě poloměr otáčení, což se v praxi řeší uvedením typu centrifugy a rotoru. Na sedimentující částici o hmotnosti m působí odstředivá síla P: P = m. a kde a je odstředivé zrychlení. Odstředivé zrychlení a vedle úhlové rychlostí otáčení ω [rad.s -1 ] závisí na poloměru otáčení r [cm]: a = r ω 2 Počet otáček za minutu [RPM] je v podstatě vyjádřením úhlové rychlostí ω: ω = (RPM) 2π 60 Tento údaj je tedy nutno uvést společně s údajem o poloměru otáčení r (případně typu centrifugy a rotoru) Relativní odstředivé zrychlení R je vyjádřením odstředivého zrychlení a vztaženého k zemskému gravitačnímu zrychlení g: R = a / g kde g = 9.81 m s -2 Pro přepočet mezi relativním odstředivým zrychlením R a počtem otáček za minutu (RPM) pak platí vztah: 2 R = r f (RPM ) 2 2π kde f = = s cm 60 g 1

11 Zpracování experimentálních dat / Zaokrouhlování a platné číslice Zpracování experimentálních dat Při každém měření je nutné si uvědomit, s jakou přesností měříme. Naměřená hodnota 4.00 opravdu není totéž, co naměřená hodnota 4. Experimentální hodnoty je nutno uvádět s příslušným počtem desetinných míst. Pojem platných číslic výsledku měření osvětlíme na příkladu délky změřené pravítkem: L = 3.0 cm = m = 30 mm tj. stále 2 platné číslice Při odečtu hodnoty jakékoli měřené veličiny ze stupnice lze poslední platné místo odhadnout, tj. v případě měření pravítkem je možno výsledek vyjádřit i přesněji: L = 3.05 cm = m = 30.5 mm tj. stále 3 platné číslice Výsledek jakéhokoli výpočtu musí být zaokrouhlen tak, aby obsahoval právě jen platné číslice. Počet platných cifer výsledku by měl respektovat nejméně přesnou hodnotu ze všech, jež do vzorce dosazujeme - např. je nutno zvážit, jak přesná byla koncentrace kalibračních roztoků, jak přesně byly pipetovány přídavky činidla a pod. Obvykle tak uvádíme výsledek na tři, maximálně na čtyři platné číslice. Pravidla při výpočtech: Na kalkulačce se počítá se všemi místy, zaokrouhlí se až výsledek, tj. nezaokrouhlují se mezivýsledky. Při sčítání, odčítání: počet desetinných míst ve výsledku = minimální počet desetinných míst čísel, z nichž počítám. např.: odměříme skleněnou pipetou 25.0 ml, k tomu přidáme automatickou pipetou 20 μl vzorku. Výsledný objem roztoku: V = 25.0 ml ml = ml správný výsledek je 25.0 ml (tj. 1 desetinné místo) Při násobení, dělení: počet platných číslic ve výsledku = minimální počet platných číslic čísel, z nichž počítám. např.: navážím g vzorku, přidám 300 μl destilované vody. Výsledná koncentrace roztoku: c m = 3.4 mg / ml = mg/ml správný výsledek je 11 mg/ml (tj. 2 platná místa) 2. Chyby měření, základy statistického zpracování výsledků NÁHODNÉ CHYBY vznikají při každém měření, mají nepravidelný charakter a jsou zpravidla malé s tendencí vzájemné kompenzace; ovlivňují tedy přesnost (reprodukovatelnost) výsledků. Jsou způsobeny fluktuací tlaku, teploty, vlhkosti, magnetického pole, drobnými nepřesnostmi při vážení nebo měření, nedokonalostí odečítání sledované veličiny (paralaxou při čtení na stupnici, nepřesným odhadem částí dílků stupnice) apod. CHYBY SYSTEMATICKÉ (SOUSTAVNÉ) zkreslují při opakovaném měření konaném za stejných podmínek hodnotu měřené veličiny stále stejným způsobem. Teoreticky je možné tyto chyby vyloučit, pokud je můžeme ohodnotit pomocí přesnějších přístrojů a/nebo zavést korekci na zpřesnění měřicí metody; v praxi je však tento úkon mnohdy těžko uskutečnitelný. Podle původu těchto chyb je třeba odlišit chyby způsobené nepřesností měřících přístrojů, chyby metody a chyby pozorovatele. Systematické chyby použité metody vznikají nedokonalostí použitého způsobu měření (zjednodušujícími podmínkami měřicí metody, přibližností použitých vztahů, nevhodností použitého způsobu měření). Systematické chyby pozorovatele vznikají např. reakční dobou při měření časových údajů, omezenou rozlišovací schopností oka atd. Tyto chyby způsobují, že ne vždy je využita přesnost měřicích přístrojů uváděná výrobcem a lze je vyloučit tím, že subjektivní měření nahradíme objektivním (pomocí přesného čidla spojeného s měřicím přístrojem). CHYBY HRUBÉ vznikají v důsledku omylů při provádění měření (analýzy) nebo při vyhodnocení výsledku, mají objektivní i subjektivní charakter. Velká hodnota chyby může způsobit nepřesnost a nesprávnost konečného výsledku, proto je nezbytné odlehlý výsledek vyloučit ze souboru hodnot. Statistické vyhodnocení odlehlosti výsledku (eliminace hrubé chyby) a testování správnosti výsledku (statistická významnost systematických chyb) se provádí pomocí různých typů testů a nebude náplní tohoto praktika. Rozdělení náhodných chyb, tj, závislost pravděpodobnosti výskytu chyb na jejich absolutní velikosti, představuje v grafickém vyjádření Gaussova křivka. U souboru konečného počtu měření je nejlepším odhadem nejpravděpodobnější hodnoty měřené veličiny (= polohy maxima křivky) ARITMETICKÝ PRŮMĚR naměřených hodnot: n kde x i je naměřená hodnota při i-tém měření xi n je počet měření i = 1 x = n Míru přesnosti série paralelních výsledků budeme vyjadřovat jako směrodatnou (standardní) odchylku σ ( sigma ), tj. ROZPTYL HODNOT okolo hodnoty aritmetického průměru (přesněji řečeno pološířka Gaussovy křivky v místě inflexního bodu). Čím je rozptyl hodnot menší, tím je křivka užší, symetričtější s velkou četností správných dat, tj. hodnocený soubor je přesnější. n 2 ( xi x) i= 1 σ = n 1 Aritmetický průměr i směrodatná odchylka mají stejný rozměr (jednotky) jako experimentální hodnoty, ze kterých byly určeny. Správnost výsledku budeme pro účely tohoto praktika vyjadřovat jako relativní chybu měření (t), tedy relativní odchylku [%] aritmetického průměru experimentálních hodnot x od správné (= teoretické) hodnoty (μ): x µ t = µ 100%

12 Zpracování experimentálních dat / Zásady pro sestrojování grafů Pokud je u úlohy uveden požadavek, aby byl graf vynesen ručně na milimetrový papír či na počítači, tento požadavek respektujte. Jeden graf vždy uvádějte na 1 papír A4. Grafy musí mít všechny potřebné náležitosti: název, z něhož je zřejmé, o jaké stanovení se jedná, jakou závislost vyjadřuje. souřadnicové osy s řádným popisem, tj. označení nanášené veličiny včetně příslušné jednotky na ose x je nezávisle proměnná veličina (= proměnná, na které závisí ta druhá), kterou experimentátor sám mění, tedy nenáhodná a (měla by být) přesná - např. koncentrace roztoku na ose y (svislá) je závisle proměnná, náhodná, zatížená chybou měření - např. absorbance, ph a pod. měřítko, tj. rovnoměrně vynesená stupnice v lineárním měřítku. Všechna čísla na stupnici musí mít stejný počet desetinných míst, který odpovídá přesnosti měření. Nikdy na osy neuvádíme přímo naměřené nebo vypočítané údaje jednotlivých měření, ty uvedeme v přiložené tabulce. Při sestrojování grafu zvolte na osách optimální rozsah (např. když pracujete v zásadité oblasti ph, tj. v rozsahu 7 až 11, je nesmyslné, aby osa začínala nulou), snažte se tedy využít co největší možnou plochu papíru pro vlastní výnos. Při vynášení grafu na mm papír však volte "rozumné" měřítko, kdy např. hlavním jednotkám či jednotlivým přídavkům odpovídají alespoň celé milimetry. viditelně vynesené experimentálně získané body nejlépe + (u grafů na mm papíře nepoužívejte ). Neuvádějte spojnice bodů k osám ty se uvádějí jen u hodnot odečítaných z kalibrační křivky. příslušnou funkční závislost - proloženou přímku (úloha 4, 8) nebo spojitou křivku (úloha 7). Vždy zvažte, zda přímka proložená vynesenými body (lineární regrese) má či nemá procházet bodem [0;0], tj. jaká je hodnota koeficientu b v rovnici přímky y = a x + b. Při zpracování dat v Excelu označte číselné řady hodnot (i se záhlavími) a vložte typ grafu XY-bodový. Po kliknutí na jeden z bodů pravým tlačítkem myši vyberte Přidat spojnici trendu", vyberte Lineární regresi a následně zvolte možnosti zobrazit rovnici přímky a také, zda má přímka procházet bodem [0;0] ( Hodnota Y = 0 ). Při sestrojování grafu na milimetrový papír budete v rámci těchto praktik prokládat přímku naměřenými body odhadem. Nespojujte první a poslední měřený bod, ale snažte se, aby přímka co nejlépe respektovala všechny naměřené hodnoty. Předpokládáme, že z grafu na milimetrovém papíře umíte rovnici přímky určit. Důležité pojmy: Kalibrace = určení závislosti mezi dvěma fyzikálními veličinami, kdy veličina přímo měřitelná (y např. absorbance) se mění v závislosti na druhé veličině, jejíž hodnoty nejsou přímo měřitelné (x např. koncentrace). K tomu potřebujeme standardy, u nichž známe hodnoty x a odpovídající hodnoty y změříme. Určíme kalibrační závislost tj. ve výsledku nepřímo měříme koncentraci stanovované látky. Lineární regrese je matematická metoda používaná pro proložení souboru bodů v grafu přímkou (či jinou funkcí). O bodech reprezentujících měřená data se předpokládá, že jejich x-ové souřadnice jsou přesné, zatímco ypsilonové souřadnice mohou být zatíženy náhodnou chybou. Pokud měřené body proložíme přímkou, tak mezi ypsilonovou hodnotou měřeného bodu a ypsilonovou hodnotou ležící na přímce bude odchylka. Podstatou lineární regrese je nalezení takové přímky, aby součet druhých mocnin ypsilonových odchylek všech bodů, tj. (y i (a x i + b)) 2, byl co nejmenší ( metoda nejmenších čtverců ). Interpolace = odhad hodnoty x na základě změřené hodnoty y v rámci rozsahu kalibračních standardů. Extrapolace = nalézání přibližné hodnoty mimo interval známých hodnot.

13 Zpracování experimentálních dat / Pracovní protokoly Protokoly budou v praktiku řešeny formou formuláře, vypracovává je každý student samostatně a odevzdává je vždy do týdne (před vypracováním další úlohy). Obecně je protokol nutno vypracovat na volné listy papíru formátu A4, přičemž na každém listu je uvedeno jméno, číslo pracovní skupiny, název úlohy a datum, kdy jste úlohu v laboratoři vypracovali. Pokud úloha sestává z více úkolů, je přehlednější uvést pro každý úkol samostatný protokol. Protokol by měl být stručný, výstižný a přehledný, bez zbytečných duplicit a měl by obsahovat následující části: 1.TEORETICKÝ ÚVOD = principy použitých metod 2.POUŽITÝ MATERIÁL, POMŮCKY A PŘÍSTROJE 3.VÝPOČTY navážek, ředění roztoků apod. nutné k postupu, a to včetně vztahů a vzorců nutných k početnímu zpracování. Výsledné hodnoty adekvátně zaokrouhlete (viz výše). 4.PRACOVNÍ POSTUP = podrobně vlastními slovy (v minulém čase) co a jak bylo opravdu uděláno včetně odchylek od návodu, přesných navážek (uveďte, zda jste použili diferenční vážení), použitých přístrojů, pomůcek, podmínek měření apod. - tedy tak, aby byl podle protokolu experiment přesně reprodukovatelný. Dodržujte počet platných míst - navážka 0.1 g není totéž co 0.10 g!!! 5.VÝSLEDKY (+ jejich vyhodnocení, grafy) = (pouze) to, co jste pozorovali či naměřili, případně co jste z naměřených hodnot vypočetli (tedy NE jak experiment měl vyjít, NE co z experimentu usuzujete obojí je součástí diskuze!). Počet platných cifer výsledku musí respektovat nejméně přesnou hodnotu ze všech, nejen přesnost měřících přístrojů, ale např. i přesnost pipetování. Obvykle tak uvádíme výsledek na tři, maximálně na čtyři platné číslice. Výsledky uvádějte co nejpřehledněji, nejlépe formou tabulky. Grafy uvádějte společně s tabulkou hodnot, ze kterých byly sestrojeny. Zásady pro sestrojování grafů jsou uvedeny v předcházející kapitole. 6.DISKUZE = zhodnocení dosažených výsledků s vysvětlením, co z výsledků vyplývá; porovnání naměřených nebo vypočítaných hodnot s údaji tabelovanými, teoreticky vypočítanými apod., porovnání výsledků získaných za použití různých metod - zdůvodnit přednosti i nedostatky každé metody. Pokud výsledek neodpovídá výsledku předpokládanému, zaměřte se na možné zdroje systematických chyb odrážejících správnost celého měření či metody, tedy chyby, které nelze odstranit opakovaným měřením za stále stejných podmínek - např. nevhodně zvolený postup (při určování koncentrace jedné látky může být stanovení rušeno současným stanovením příměsi apod.), špatnou kalibrací atd. 7.ZÁVĚR (= velice stručné shrnutí důležitých výsledků / poznatků).

14 Úloha 1. ODMĚŘOVÁNÍ OBJEMŮ, ŘEDĚNÍ ROZTOKŮ / 14 Úloha 1. ODMĚŘOVÁNÍ OBJEMŮ, ŘEDĚNÍ ROZTOKŮ K vypracování úlohy je nutná znalost následujících kapitol z úvodní části skript: Základní techniky práce v laboratoři kapitoly 1, 2, 3, 4A, 5, 6 Zpracování experimentálních dat kapitoly 1, 2, 4 Kontrolní otázky 1. Jaký objem je odměřen pomocí odměrného válce na obrázku? Jde přímo o objem vody přítomný v odměrném válci? 2. Jak byste postupovali při přípravě následujících ředicích řad o výsledném objemu 600 μl? a) šestkové (tj. ředění 1:5 - každý následující roztok má oproti předchozímu šestinovou koncentraci) b) desítkové (tj. každý následující roztok má oproti předchozímu desetinovou koncentraci) 3. Určete, zda jsou výsledky na jednotlivých obrázcích správné a přesné (správnou hodnotou je střed): 4. Na misku vah bylo vždy pipetováno 700 μl destilované vody. Vypočítejte a určete, která z následujících sérií měření byla měřena správně a která přesně. Uvedené hodnoty jsou v gramech: a) , , , b) , , , c) , , , určete správnou hodnotu μ, tedy jaká je teoretická hmotnost 700 μl destilované vody (uvažujte hustotu vody při laboratorní teplotě g/ml) vypočítejte aritmetický průměr x i z hodnot naměřených v rámci jednotlivých měření [g]. vyjádřete v procentech, jaká je správnost daného měření t, tedy odchylka hodnoty průměrné xi od hodnoty správné μ, a to relativně vůči μ. z jednotlivých naměřených hodnot vypočítejte směrodatnou odchylku σ i [g]. Výsledné hodnoty σ vyjádřete také v procentech relativně vůči x i. určete, která série měření je správná, přesná. Za správné resp. přesné považujte měření, kdy je příslušná odchylka 5 %. Pracovní postup Chemikálie a vzorky: zásobní roztok barviva o koncentraci 5 g/l, glycerol, ethylacetát Přístroje a pomůcky: automatické pipety + špičky (fixní 200 μl, nastavitelné 200 a 1000 μl), skleněné pipety (2, 5, 10 ml) + nástavec, odměrné baňky (10 ml) + zátky, kádinky (100 ml), zkumavky, stojánek na zkumavky, plastové mikrozkumavky (0.5 a 1 ml), mikrotitrační destička, váženky, analytické váhy, Vortex V následujících úkolech budete při ředění roztoků zanedbávat směšovací objem. 1. Ředění roztoků Do zkumavky připravte za pomoci skleněné pipety následující roztoky o objemu 5 ml. Při ředění roztoků vždy postupujte tak, že ředěný roztok přidáváme k alespoň malému objemu rozpouštědla (zde destilované vody). a) Připravte 3 x (tj. 1 : 2), 7 x respektive 12 x zředěný zásobní roztok barviva. Uveďte výsledné koncentrace roztoků. b) Z výše uvedeného 3 x naředěného roztoku (odlijte do kádinky) připravte ředěním v poměru 1 : 4 další roztok. Uveďte výsledné ředění a koncentraci roztoku.

15 Úloha 1. ODMĚŘOVÁNÍ OBJEMŮ, ŘEDĚNÍ ROZTOKŮ / Ředící řady a) Z výchozího roztoku barviva za pomoci automatické pipety připravte do stejných zkumavek aritmetickou ředící řadou roztoky s narůstajícím poměrem ředění roztok : rozpouštědlo, konkrétně v poměru 1 : 9, 2 : 8, 3 : 7 až 9 : 1 o celkovém objemu 1 ml. Nejdříve do všech zkumavek napipetujte požadovaný objem destilované vody. Pokud to rozsah pipety umožní a budete pipetovaný objem postupně zvyšovat, lze používat stále stejnou špičku. Následně přidávejte požadovaný objem zásobního roztoku barviva. Opět postupujte od nejmenšího objemu a pokud špičku neponoříte do kapaliny ve zkumavce, můžete ji používat opakovaně. b) Z výchozího roztoku barviva za pomoci skleněné pipety připravte 5 roztoků o objemu po 5 ml trojkovou ředicí řadou, tj. následující roztok bude mít vždy 3 x nižší koncentraci než roztok předchozí. Aby bylo dodrženo ředění 1 : 2, budeme mezi jednotlivými zkumavkami přenášet 2.5 ml roztoku barviva. Do všech zkumavek pipetujte 5 ml vody. Odeberte 2.5 ml zásobního roztoku barviva, přeneste do první zkumavky a důkladně promíchejte. Odměřte 2.5 ml z první zkumavky, přeneste do následující a důkladně promíchejte. Postup opakujte až k poslední zkumavce. Abyste získali 5 ml i v poslední zkumavce, je nutné z ní také 2.5 ml roztoku odebrat. c) Mikrotitrační destička. Do řady v mikrotitrační destičce připravte za pomoci automatické pipety ze zásobního roztoku barviva roztoky ředicí řadou dle zadání vyučujícího. Do protokolu uveďte koncentrace všech připravených roztoků. 3. Pipetování těkavých a viskózních kapalin automatickou pipetou U všech použitých kapalin je nutno odlít přiměřené množství do pracovní kádinky! a) Pipetování ethylacetátu Ethylacetát je těkavý, proto pracujte v digestoři a použijte pipetu vyhrazenou pouze k tomuto účelu, přičemž omezte setrvání ethylacetátu ve špičce pipety na minimum. Do jedné mikrozkumavky ("eppendorfky") každý samostatně pipetujte základní technikou 200 μl ethylacetátu a do druhé stejnou technikou stejný objem zásobního roztoku barviva. Vyzkoušejte bez i s přípravným opakovaným propláchnutím špičky, každý pokus zopakujte alespoň 2x. b) Pipetování glycerolu Do jedné mikrozkumavky pipetujte 200 μl glycerolu (nastavitelnou pipetou na objem μl) a do druhé stejný objem zásobního roztoku barviva. Vyzkoušejte základní i reverzní techniku pipetování. Pro glycerol vyzkoušejte pipetování s ustřiženou špičkou. Každý pokus zopakujte alespoň 2x. U obou úkolů porovnejte naměřené objemy, popište odlišnosti při pipetování těchto 3 kapalin a jejich příčiny. Výsledky diskutujte. Vedou změny v technice pipetování ke zlepšení předchozích výsledků? Zapamatujte si, že pro přesné odměření objemu těkavých a viskózních kapalin je nutné použít speciální automatické pipety, případně s gravimetrickým ověřením. 4. Přesnost pipetování automatickou pipetou, analytické váhy a) Určete přesnost a správnost při pipetování téhož objemu Na analytické váhy umístěte váženku, váhy vynulujte tlačítkem TARE a na váženku napipetujte 800 μl destilované vody (hustota vody při laboratorní teplotě je g/ml) automatickou pipetou opatřenou čistou špičkou. Váhy znovu vynulujte a na stejnou váženku přidejte v druhém kroku dalších 800 μl destilované vody. Zopakujte 5krát. Do protokolu uveďte, jaká je správnost (relativní chyba měření, t), tj. relativní rozdíl aritmetického průměru experimentálních hodnot od správné (= teoretické) hodnoty a také přesnost pipetování (rozptyl naměřených hodnot okolo hodnoty průměrné) pomocí směrodatné odchylky σ (uveďte v g a následně přepočítejte na %). b) Porovnejte správnost odměření objemu 200 μl pipetováním 10 x 20 μl a 1 x 200 μl Automatickou pipetou o rozsahu 20 až 200 μl na váženku (po vynulování vah) postupně pipetujte 10krát 20 μl destilované vody. Po každém přídavku odečtěte celkovou hmotnost dosud napipetované vody, z těchto údajů vypočítejte hmotnost i objem vody přidané v jednotlivých krocích. Jaká je správnost pipetování výsledného objemu? Porovnejte s pokusem, kdy napipetujte toutéž pipetou přímo 200 μl (v jednom kroku, 3x opakujte). Výpočty uveďte do protokolu. Diskutujte možné zdroje chyb a pokuste se určit, o jaké chyby se jedná.