Univerzita Karlova v Praze Matematicko-fyzikální fakulta DIPLOMOVÁ PRÁCE

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Rozměr: px
Začít zobrazení ze stránky:

Download "Univerzita Karlova v Praze Matematicko-fyzikální fakulta DIPLOMOVÁ PRÁCE"

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Matematicko-fyzikální fakulta DIPLOMOVÁ PRÁCE Barbora Hošková Vnitřní ph kvasinek a vliv transportu draselných iontů na jeho regulaci Fyzikální ústav Univerzity Karlovy Vedoucí diplomové práce: RNDr. Eva Urbánková, Ph.D. Studijní program: Biofyzika a chemická fyzika 2009

2 Ráda bych na tomto místě poděkovala vedoucí mé diplomové práce RNDr. Evě Urbánkové, Ph.D. za ochotu a trpělivost, při vysvětlování metod, teorií a při pečlivé revizi textu. Stejně tak se na zaučení podílel konzultant RNDr. Roman Chaloupka Ph.D a laborantka Ivana Benešová. Za značnou část teoretických znalostí jsem vděčna doc. RNDr. Daně Gáškové, CSc. a jejím lidsky podaným přednáškám. Za přístup do laboratoří Akademie věd ČR vděčím oddělení Membránového transportu vedenému RNDr. Hanou Sychrovou, DrSc., stejně tak za příjemnou atmosféru a pomoc při zvládání nových technik. Za všechny jmenuji Mgr. Lýdii Marešovou, PhD., která mě zasvětila do značné části metod využitých k získání výsledků do diplomové práce a zastala i roli konzultanta, a Mgr. Silvii Petrezsélyovou Ph.D., která mě přijala do svého projektu. Samozřejmě nemohu opomenout rodinu, která mě při mém sepisování podporovala. Prohlašuji, že jsem svou diplomovou práci napsala samostatně a výhradně s použitím citovaných pramenů. Souhlasím se zapůjčováním práce. V Praze dne Barbora Hošková

3 Obsah OBSAH... 1 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ÚVOD PŮVOD A ZAŘAZENÍ KVASINEK HISTORICKÝ ÚVOD SOUČASNÉ VYUŽITÍ CHARAKTERISTIKA KVASINEK TAXONOMIE FYZIOLOGIE A STAVBA KVASINEK RŮST KULTURY Růstová křivka Podmínky růstu Saccharomyces cerevisiae METABOLISMUS KVASINEK STAVBA KVASINKOVÉ BUŇKY TRANSPORT PŘES BUNĚČNÉ MEMBRÁNY TRANSPORTNÍ MECHANISMY Transport důležitých látek v kvasinkách MEMBRÁNOVÝ POTENCIÁL U KVASINEK VÝZNAMNÉ TRANSPORTNÍ PROTEINY KVASINEK PMA1 H + -ATPÁZA NHE Nha Nhx KHA ENA TOK TRK NÍZKO AFINITNÍ TRANSPORTNÍ SYSTÉMY PRO K MALÉ GTPÁZY PH U ŽIVÝCH BUNĚK VÝZNAM REGULACE PH ZMĚNY VNITROBUNĚČNÉHO PH KVASINEK Vysvětlení změn ph po glukózovém pulsu PH ORGANEL U KVASINEK ZPŮSOBY MĚŘENÍ PH Pyranin phluorin PUFRAČNÍ KAPACITA METODY POUŽITÉ KMENY KVASINEK KULTIVACE KVASINEK

4 7.3 MĚŘENÍ OPTICKÉ HUSTOTY RŮSTOVÁ MÉDIA TRANSFORMACE KMENŮ KAPKOVÝ TEST ZAMRAZOVÁNÍ KULTUR PH OPTIMUM RŮSTU MĚŘENÍ FLUORESCENCE Příprava vzorků pro měření fluorescence KALIBRAČNÍ PUFRY CITRÁT-FOSFÁTOVÉ PUFRY SEZNAM POUŽITÝCH CHEMIKÁLIÍ VÝSLEDKY A DISKUZE U 8.1 TRANSFORMACE KAPKOVÉ TESTY STANOVENÍ PH OPTIMA RŮSTU RŮST KULTUR MĚŘENÍ FLUORESCENCE PHLUORINU V MIKROTITRAČNÍCH DESTIČKÁCH OPTIMALIZACE METODY Výběr kultivačního média pro experimenty na readeru MĚŘENÍ CYTOSOLICKÉHO PH Měření fluorescence phluorinu a kalibrace na ph cyt CYTOSOLICKÉ PH V ZÁVISLOSTI NA EXTERNÍCH PODMÍNKÁCH KONTROLA LYZE BUNĚK V PH EXT 8, VLIV GLUKÓZY A PUFRACE EXTERNÍHO PROSTŘEDÍ BUNĚK CYTOSOLICKÉ PH U DELEČNÍCH MUTANTŮ Buňky kultivované v YNB Buňky kultivované v AP médiu Výsledky z readeru SROVNÁNÍ ZÍSKANÝCH VÝSLEDKŮ S LITERATUROU A JEJICH DISKUZE ph vnitrobuněčné (nerozlišující organely) ph cytosolické Měření ph cyt u kmenů s deletovanými geny pro transportéry alkalických kovů Faktory ovlivňující změřenou hodnotu ph cyt MĚŘENÍ REAKCE BUNĚK NA OKYSELOVÁNÍ VNĚJŠÍHO PROSTŘEDÍ MĚŘENÍ PUFRAČNÍ KAPACITY ZÁVĚR LITERATURA

5 Název práce: Vnitřní ph kvasinek a vliv transportu draselných iontů na jeho regulaci Autor: Barbora Hošková Katedra (ústav): Fyzikální ústav UK, Biofyzika a chemická fyzika Vedoucí diplomové práce: RNDr. Eva Urbánková, Ph.D. vedoucího: : Abstrakt: Cytosolické ph kvasinek je regulováno a udržováno na stálé hodnotě součinností mnoha transportních proteinů. V této diplomové práci bylo využito fluorescenčního proteinu phluorinu citlivého k ph okolí pro studium cytosolického ph v Saccharomyces cerevisiae. Většina měření byla prováděna na spektrofluorimetru, ale pro možné budoucí měření byla optimalizována i metoda měření na readeru (možnost měřit více vzorků zároveň) a bylo využito arginin-fosfátového kultivačního média. Zprostředkovaně byl sledován vliv konkrétních delecí proteinů na regulaci a stabilitu ph cytosolu. Některé proteiny s regulací cytosolického ph souvisí přímo, jako např. Pma1 H + -ATPáza, jiné nepřímo např. Ypt6. Bylo prokázáno, že samotná hodnota ph cyt závisí nejen na použitém kmeni kvasinek, ale i na kultivačních a experimentálních podmínkách. Žádná ze studovaných delecí neovlivnila regulaci ph výrazně, buňky si zachovaly schopnost regulace i v případě okyselení vnějšího prostředí kyselinou sírovou. Pufrační kapacita, měřená metodou přidání slabé zásady k suspenzi buněk, se pohybovala v rozmezí mm v případě kultivace buněk v YNB médiu. Při kultivaci v AP médiu byla pufrační kapacita větší. Klíčová slova: kvasinky, cytosolické ph, transportní proteiny, phluorin Title: Intracellular ph of yeast and its regulation by transport of potassium ions Author: Barbora Hošková Department: Institute of Physics of Charles University Supervisor: RNDr. Eva Urbánková, Ph.D. Supervisor's address: : Abstract: Cytosolic ph of yeast is regulated and maintained by cooperation of many transport proteins. A fluorescent protein phluorin was used in this thesis to evaluate cytosolic ph of yeast Saccharomyces cerevisiae. phluorin is sensitive to ph of its surrounding. The experiments were mostly carried out using spectrofluorometer, however also a method which enables using reader was improved and optimalized for future use. As well a specific arginin-phosphate growth medium was used. An influence of certain proteins on the ability to regulate cytosolic ph was also studied. Some proteins are connected with the regulation directly e. g. Pma1 ATPase, some of them in an indirect way e. g. Ypt6. It was proved, that the value of cytosolic ph depends on yeast strain and cultivation and experimental conditions. None of the gene deletions studied in this thesis changed regulation of ph cyt much, the cells were able to adjust ph cyt even in situation, when the external medium is acidified by sulphuric acid. Buffering capacity was measured with addition of weak base to the cell suspension. The values varied in range from 30 to 60 mm if the cells were cultivated in YNB growth medium. Cells cultivated in arginin-phosphate medium had higher buffering capacity. Keywords: yeast, cytosolic ph, transport proteins, phluorin 3

6 Seznam použitých zkratek HLL HLM BSM SIGMA CP AP YNB YPG TGN TMS MPM pb GFP R I410/I480 ph cyt ph in ph ext ph vac ph mit wt ARL1 KHA1 NHA1 NHX1 PMA1 TRK1,2 YPT6 aminokyseliny: histidin, leucin, lysin aminokyseliny: histidin, leucin, methionin komerčně vyráběná směs aminokyselin bez uracilu, výrobcem je Formedia komerčně vyráběná směs aminokyselin s výjimkou Uracilu, výrobcem je SIGMA citrát-fosfátový arginin-fosfátový Yeast Nitrogen Base (minimální médium) Yeast Peptone Glucose (plné médium) Trans Golgi Network transmembránový segment dva transmembránové segmenty spojené vlásenkovou strukturou určující selektivitu k iontům páry bazí green fluorescent protein poměr intenzit zaznamenaných na λ = 410 nm a λ = 480 nm ph cytosolu vnitrobuněčné ph ph vně buněk ph vakuoly ph mitochondriální wild type - divoký kmen gen kódující zástupce malých GTPáz, učastní se signálních drah gen kódující antiportní K + /H + vnitrobuněčný protein gen kódující antiportní Na + (K + )/H + protein z plazmatické membrány gen kódující antiportní Na + (K + )/H + protein z vnitrobuněčných membrán gen kódující H + -ATPázu geny kódující protein tranportující K + do buňky gen kódující zástupce malých GTPáz, učastní se signálních drah arl1δ deletovaný gen ARL1 další geny analogicky Arl1 protein kódovaný genem ARL1 další proteiny analogicky 4

7 1. Úvod Živé buňky potřebují účinně regulovat své vnitrobuněčné ph, protože jeho velikost ovlivňuje mnoho důležitých biochemických procesů. Faktory, které mohou vnitrobuněčné ph vychylovat z optimálních mezí jsou jak vnitřní (např. některé metabolické reakce), tak vnější (např. přítomnost slabých kyselin atd.). Mezi nejčastěji využívané regulační mechanismy, kterými se buňky důsledkům těchto procesů brání, patří i membránový transport, a to jak přes plazmatickou membránu, tak přes membrány organel (v případě eukaryotních buněk). Transportní proteiny zprostředkující membránový transport se liší specifitou přenášené látky, způsobem regulace i svou důležitostí. U většiny proteinů je možné jejich činnost regulovat na základě změn ve vnějším prostředí. Kvasinky Saccharomyces cerevisiae jsou modelovým eukaryotním organismem, jehož genom je již znám. V důsledku toho je možné připravit požadované mutace či delece konkrétních genů. Mnoho genů má své homology i ve vyšších organismech, z analogie jejich chování se pak dá usuzovat na roli dosud málo zkoumaného proteinu v konkrétním jiném organismu. Cílem této práce bylo určit cytosolické ph a studovat vliv delece několika vybraných proteinů (především transportérů alkalických kovů) na jeho regulaci. Mezi další cíle patřilo zavést metodu, která by dovolovala efektivně využít fluorescenčního readeru a optimalizovat podmínky pro tato měření. Pro měření v readeru se používá mikrotitračních destiček s 96 jamkami, což je výhodné díky možnosti současně měřit kalibraci i jednotlivé vzorky a úspoře materiálu. K určení cytosolického ph bylo použito fluorescenčního proteinu phluorinu (Miesenbock et al., 1998), který je citlivý na ph svého okolí. Několik kvasinkových kmenů bylo proto transformováno plasmidem obsahující gen pro phluorin. Cytosolické ph těchto kmenů bylo potom fluorescenčně měřeno za různých experimentálních podmínek. Byly zkoumány dva typy kultivačního média, různé způsoby manipulace s buňkami (promývání pufrem nebo přímé ředění z růstového média do pufru) a různá vnější ph pufrů při měření. Dále byla zkoumána reakce na rychlé okyselení vnějšího prostředí a pomocí chloridu amonného byla měřena pufrační kapacita cytosolu. Dalším z cílů bylo zjistit, jak jednotlivé delece ovlivní stabilitu cytosolického ph při změnách vnějších podmínek. Jednou ze změn bylo rychlé okyselení okolí zhruba o jednotku ph. Dále se pozorovala reakce na přidání slabé zásady NH 4 Cl. S její pomocí měla být změřena pufrační kapacita buněk. Na základě pozorovaných rozdílů se mělo usoudit na funkci deletovaných proteinů v procesu udržení ph. Jak práce ukazuje, pro výslednou hodnotu ph hraje významnou roli i způsob kultivace a způsob měření. Teoretická část práce shrnuje současné poznatky o vnitřním ph kvasinek S. cerevisiae, používaných způsobech jeho měření a o faktorech, které jeho hodnotu 5

8 ovlivňují. Dále přináší přehled dostupných znalostí o jednotlivých proteinech, jejichž vliv na cytosolické ph byl zkoumán. Experimentální část práce se zabývá provedenými experimenty, od transformace a kontroly používaných kmenů až po výsledná měření ph a pufrační kapacity. Ze série měřených kmenů byly vybrány ty, které vykazovaly odlišné vlastnosti od rodičovského kmene. Vliv odpovídajících proteinů na regulaci ph cyt je dále diskutován. Jedná se hlavně o transportér draslíku Trk1 a dále o malé GTPázy (Arl1 a Ypt6), jejichž vliv na transport draslíku byl již dříve popsán (Munson et al., 2004). Dále jsou získané výsledky diskutovány vzhledem k již publikovaným pracím. Ukazuje se, že vliv experimentálních podmínek na hodnotu ph cyt může být tak velký, že výrazně ztěžuje interpretaci výsledků a jejich srovnání s již publikovanými daty. 6

9 2. Původ a zařazení kvasinek 2.1 Historický úvod Kvašení bylo známo mnohem dříve, než jeho vlastní původci, kvasinky. Jejich činnosti lidstvo využívá zřejmě už od neolitu, další důkazy pochází z doby okolo 6000 let př. n. l., kdy Babyloňané vařili první pivo a polévky z naklíčeného obilí. Později se stalo běžným pekařství a pivovarnictví. První pozorování samotných kvasinek souvisí s objevem mikroskopu Antonie van Leeuwenhoekem. Tehdy však nebyly považovány za organismy, ale za neživé kulovité útvary. Tento postoj změnili až T. Schwan, Caguiard de la Tour a F. Kützing, nezávisle na sobě (Barnett, 2003), když postupně odhalovali zákonitosti kvašení především z chemické stránky věci. Definitivní důkaz, že kvasinky jsou živé organismy způsobující kvašení podal roku 1857 L. Pasteur, který studoval výrobu piva. Navíc prokázal i negativní vliv přítomnosti kyslíku na jeho průběh (tzv. Pasteurův jev) (Barnett, 2003). Tento objev vedl k izolaci jednotlivých buněčných kultur. Na přelomu 20. století již byly kvasinky kultivovány v pekařství a pivovarnictví záměrně, začaly být používány pro výzkum. Roku 1996 byl sekvenován genom kvasinky Současné využití V současné době jsou kvasinky nejlépe známy z potravinářského, farmaceutického, krmivářského průmyslu a jsou často využívány v biologickém výzkumu. V potravinářském průmyslu se podílí na výrobě piva, vína, lihu, či mléčných výrobků, známe je především ve formě droždí. Zemědělský průmysl využívá kvasinky jako zdroj biologicky cenných látek - především bílkovin (příp. jednotlivých aminokyselin lysinu) do krmiv. Farmaceutické využití najdou v produkci cholinu (jaterní choroby), vitaminu B (nemoci nervů, záněty,..) apod. V neposlední řadě jde o použití kvasinek ve vědě jako modelového eukaryotního organismu. Mezi kvasinkami se ale vyskytují i patogenní druhy způsobující rozličná onemocnění, případně kontaminující potraviny nebo vodu (Janderova and Bendova, 1999). 2.3 Charakteristika kvasinek Kvasinky jsou nejjednodušší, převážně jednobuněčné eukaryotní organismy. Vyskytují se v různých prostředích od půd po mořskou vodu. Lze mezi nimi najít i parazitující druhy, známá je například Candida albicans (Janderova and Bendova, 1999)

10 Většina kvasinek má protáhlý elipsoidní tvar s rozměry 3-15 μm na délku a 3 4 μm na šířku. Tvar obecně závisí na rodu buňky, na její funkci a na vnějších podmínkách. Mezi těmi je podstatný druh kultivační půdy (pevná, kapalná), její složení, ph okolí, množství živin v médiu a další. Tvar není stálý mění se se změnou ploidie, s množstvím buněk v kultuře, s koncentrací důležitých živin v médiu apod. Většina kvasinek se množí pučením. Na mateřské buňce se vytvoří pupen dceřinná buňka, která je zásobována látkami směrovanými do místa pupene. Ve chvíli, kdy je dceřinná buňka dostatečně velká, dojde k jejímu oddělení vytvořením septa. Po oddělení zůstanou na kvasinkách jizvy po pučení (jizva zrodu a jizva po pučení - dobře barvitelná např. calcofluorem White) (Hošková, 2007). Buňka po oddělení nemá velikost mateřské buňky, proto musí dorůst do určitých rozměrů, než sama začne pučet. Jiné druhy kvasinkovitých organismů se množí přehrádečným dělením i tvorbou pseudomycelií, případně mycelií. Jde o řetězce protáhlých buněk, které se neoddělují (u některých druhů je patogenním stadiem) (Janderova and Bendova, 1999). Saccharomyces cerevisiae jsou typickým modelovým organismem. Dobře se kultivují, práce s nimi je usnadněna standardizovanými postupy. U kvasinek najdeme jak haploidní, tak diploidní buňky. Proto není velkým problémem upravit buňkám jejich genetickou výbavu, ke které přispívá i přirozený 2 μm plasmid (6000 pb) (Janderova and Bendova, 1999). 2.4 Taxonomie V systému hub patří kvasinky mezi Eumycota. Nejznámějšími zástupci kvasinek je rod Saccharomyces, člen čeledi Saccharomycetaceae. Rod Saccharomyces zavedl roku 1838 Mayen, který jej popsal jako kvasinky využívané k výrobě piva a odlišil je tím od kvasinek zkvašujících ovocné mošty. Roku 1870 tento rod definoval Rees, detailněji upřesnil Hansen. Buňky kvasinek spadajících do rodu Saccharomyces mají převážně kulatý, elipsoidální či cylindrický tvar, nebo multilaterárně pučí. Sedimentují a zkvašují cukry. Během vegetativní fáze převažuje diploidní, případně polyploidní stav. Během následujících let docházelo k třídění kvasinek do různých skupin a jejich opětovnému sjednocování. V dnešní době se používá dělení dle A. Kockové-Kratochvílové (Kocková-Kratochvílová, 1982). 8

11 3. Fyziologie a stavba kvasinek 3.1 Růst kultury Růstem kultury se rozumí rychlost rozmnožování kvasinek resp. rychlost znásobení biomasy. Měřítkem je počet buněk, množství biomasy či množství určité látky nejčastěji dusíku, fosforu nebo bílkovin. Růst je posuzován vzhledem k době kultivace, k počátečnímu množství buněk a s ohledem na vnější podmínky. Nepřímo je růst popsatelný především měřením absorbance buněčných suspenzí Růstová křivka Závislost růstu kultury na čase se nazývá růstová křivka a dělí se na několik fází: 1) Lagfáze neboli počáteční stacionární fáze je fází, kdy se buňky přidané do čerstvého růstového média přizpůsobují novému prostředí a syntetizují potřebné enzymy apod. Délka lagfáze závisí především na stáří zaočkovaných buněk a na jejich fyziologickém stavu buňky přeočkované ze zamražené kultury budou mít lagfázi delší než buňky zaočkované z tekutého média. V této fázi nedochází k množení buněk, ale k hromadění živin a tím k růstu buněk na maximální možnou velikost. Na konci této fáze začínají pučet. 2) Exponenciální fáze (taktéž nazývaná logfáze) buňky se intenzivně množí (pučí), ale nedorůstají velikosti, jakou měly na konci lagfáze. V souvislosti s dělením se urychluje metabolismus. V druhé polovině exponenciální fáze již pučení oslabuje v živném médiu postupně dochází potřebné látky, hromadí se metabolity. Nastává zpomalení růstu. 3) Diauxická fáze u Saccharomyces cerevisiae rostoucích v médiu s glukózou dochází k diauxickému přechodu ve chvíli, kdy buňky vyčerpají glukózu. V té fázi buňky přetvářejí metabolismus pro zpracování jiných zdrojů uhlíku. Následně dochází k dočasnému zrychlení růstu (postdiauxický růst). 4) Stacionární fáze dochází zdroje uhlíku a živiny obecně, vznikají volné radikály, hromadí se metabolity a buňky v procesu stárnutí dojdou až k odumírání buněk Charakteristickou vlastností každé růstové křivky je generační doba, tzn.doba, za kterou se počet buněk v kultuře zdvojnásobí. Tato veličina není konstantou po celou dobu růstu, mění se během jednotlivých fází a nepatrně i v jejich průběhu. Pro většinu kmenů pěstovaných v minimálním médiu, se kterými se v průběhu diplomové práce pracovalo, byla generační doba dlouhá dvě hodiny. Vnější podmínky ovlivňující růst kultury jsou teplota, ph, složení média dostupnost potřebných látek. V kapitole 7.2 jsou uvedeny podmínky kultivace buněk pro experimenty popsané v této práci. 9

12 3.1.2 Podmínky růstu Saccharomyces cerevisiae V každém kultivačním médiu ať živné půdě a nebo v tekutém médiu, musí mít buňka dostatek živin potřebných k biosyntéze (C, N, S, O, P, H, Mg, oligobiogenní prvky, vitamíny, růstové látky). Zdroji uhlíku a dusíku jsou organické sloučeniny, což odpovídá chemoheterotrofnímu způsobu výživy. Dalším podstatným prvkem je fosfor, který se v buňce ukládá anorganicky vázaný. Pro správné fungování určitých enzymů je nezbytný hořčík funguje například jako kofaktor fosfatáz (získává se z MgSO 4 ). U oligobiogenních prvků je důležitý správný poměr, jinak jsou toxické (Kocková-Kratochvílová, 1982). Pro kvasinky Saccharomyces cerevisiae je vhodná teplota kultivace 30 C, v případě divokého kmene je možné interval teplot rozšířit, kultury mutantních kmenů již mohou být za vyšších teplot stresovány. Pro aerobní růst je nezbytný i přístup vzduchu proto se buňky kultivují v třepačkách, kde jsou vzdušněny, ale je zamezeno kontaminaci např. buničitou zátkou. 3.2 Metabolismus kvasinek Pro kvasinky jsou nejsnáze využitelným zdrojem energie a uhlíku cukry, především monosacharidy. Základní metabolická dráha cukrů je glykolýza. Nejčastěji katabolizovaným sacharidem je glukóza, využitelné jsou i další monosacharidy (např. maltóza zvláště u pivovarských kmenů). Disacharidy jsou štěpeny vně buňky enzymem invertázou. U kvasinek může probíhat jak respirace, tak kvašení. Výběr procesu závisí na vnějších podmínkách (přístup O 2, množství glukózy v médiu), na druhu i na kmeni. Každý proces zaměstnává jiné enzymy. S. cerevisiae spadají mezi fakultativní anaeroby, tj. dokáží respirovat i fermentovat. Přednostně fermentují a po vyčerpání glukózy (nebo jiného fermentovatelného zdroje) z média začnou zpracovávat meziprodukty ethanol či glycerol respirují (je-li dostupný O 2 ). Fermentace není energeticky tolik výhodná. Přepínáním se mezi těmito dvěma procesy se zabýval Pasteur. Po něm je pojmenován Pasteurův jev, kdy po zavedení kyslíku do kultury je fermentace omezena ve prospěch respirace. 3.3 Stavba kvasinkové buňky Kvasinky jakožto eukaryotní organismy mají pravé jádro, s dvojitou jadernou membránou. Během karyokinese se nerozpouští jaderný obal probíhá tzv. uzavřená mitóza. Před mechanickými vlivy jsou chráněny buněčnou stěnou, některé druhy (většinou ty patogenní) navíc disponují buněčným pouzdrem. Buněčná stěna pomáhá udržovat i tvar buňky. Z 80 % je tvořena z polysacharidů, dále jsou zastoupeny proteiny, lipidy, fospolipidy a glukosamin. 60 % z polysacharidů zastupuje β-glukan. 10

13 Zbylých 40 % připadá na manan, bohatě větvený řetězec manosy. V malé, avšak významné míře se vyskytuje chitin. Vyskytuje se především v jizvách po pučení. Díky molekulám, které ji tvoří, má buněčná stěna záporný náboj. Propouští pouze menší molekuly, ale i u těch záleží na náboji, polaritě a tvaru molekul. Vlastní selekci molekul, které procházejí do buňky, obstarává cytoplazmatická membrána. Cytoplazmatická membrána je semipermeabilní, umožňuje tím transport látek do buňky a utváří osmotickou bariéru. Cytoplazmatická membrána je tvořena dvojitou vrstvou fosfolipidů a bílkovinami, vnější a vnitřní vrstva se navzájem liší. Mezi fosfolipidy jsou nejzastoupenější fosfatidylcholin a fosfatidyletanolamin. Menší podíl obsahu membrány představují steroly, volné mastné kyseliny, lysofosfolipidy, polyisoprenoidní lipidy, mono- a diacyl-glyceridy. Tvorbu ATP, energetického oběživa, stejně jako u jiných buněk zajišťují mitochondrie, přeměňují energii přes respirační proces z oxidace NADH do vázané energie v ATP. U kvasinek však nejsou mitochondie nezbytné v případě anaerobní fermentace, kdy buňky využívají pouze ATP vzniklé při glykolýze. Endoplazmatické retikulum je místem syntézy proteinů a lipidů. Lipidy jsou tvořeny na vnitřní membráně endoplazmatického retikula, proteiny jsou syntetizovány ribosomy přisedlými na jeho vnější membráně. Nasyntetizované proteiny (případně i částečně glykosylované) jsou dopravovány do dalších částí buňky pomocí sekrečních měchýřků. Ty putují ke Golgiho aparátu a odtud dál, aby splynuly s cílovou membránou. V Golgiho aparátu probíhá glykosylace proteinů. Samotná organela má také vztah k růstu buněčné stěny. Sekreční měchýřky jsou v sekreční dráze směrovány za pomoci gradientu ph. Sekreční dráha má rozpětí ph od 7,2 v Endoplazmatickém retikulu po 5,2 v sekrečních granulích. To je důležité i pro správné třídění proteinů a jejich modifikace (Paroutis et al., 2004), schématické znázornění je na původní ilustraci viz Obrázek 1. Kvasinkové buňky disponují i vakuolou, která vzniká zpravidla splynutím několika menších vzniklých v počáteční fázi pučení. Ve vakuole se shromažďují metabolické intermediáty, kofaktory a buněčné rezervy (aminokyseliny, polyfosfáty, lipidy, Ca 2+ ). Dále slouží k odbourávání proteinů, i celých mitochondrií či bakterií. Cytoskelet usnadňuje vnitrobuněčný transport především během růstu pupene. 11

14 4. Transport přes buněčné membrány Jak již vyplynulo z textu předchozí kapitoly, v buňce jsou mimo cytoplazmatické membrány i membrána jaderná, mitochondriální, Golgiho aparátu, endoplazmatického retikula a v neposlední řadě i membrána vakuoly. Ve všech těchto membránách jsou zabudovány proteiny umožňující transport vybraných látek. Některé jsou integrované, jiné jen periferní. O umístění rozhodují hydrofobní interakce, které se velkou měrou podílí na správné konformaci proteinu. Mimo transportních proteinů jsou v membráně zastoupeny i proteiny s dalšími funkcemi - např. enzymy (příkladem je ATPáza). Transport přes membránu je možné studovat několika způsoby. Jedním z nich je přímé pozorování živých buněk. Ty ovšem reagují na transportovaný substrát a mohou tím pozorování ovlivňovat. Z tohoto důvodu se používají různě upravené buňky či samotné organely. Další možností je vytvoření lipozomů váčků z lipidové dvojvrstvy, do které jsou uměle začleněny vybrané proteiny. 4.1 Transportní mechanismy Transportní mechanismy se dělí na aktivní a pasivní. Při pasivním transportu látky procházejí přes membránu pouze ve směru svého elektrochemického gradientu. Proces tedy nevyžaduje žádnou dodanou energii, děje se spontánně. Některé látky (např. H 2 O, mastné kyseliny, ethanol aj.) mohou difundovat přímo membránou. Jiné látky díky nízké rozpustnosti v lipidové části membrány procházet nemohou a ty potom mohou využívat tzv. "usnadněnou difuzi", kdy průchod skrz membránu umožňuje protein, bez dodání energie. Příkladem takových proteinů jsou kanály (u kterých β-barely nebo svazek α-helixů tvoří transportní cestu, většinou hydrofilní pór). Otevírání a zavírání kanálů (tzv. hradlování) může být ovládáno různými podněty (např. napětím). Aktivní transport je spojen s exergonickou reakcí. Příkladem jsou protony transportované H + -ATPázou, která hydrolyzuje ATP a na úkor této energie buduje protonový gradient na membráně. Tento typ transportu se nazývá primárně aktivní transport. Alkalickými kovy je hojně využíván sekundárně aktivní transport, kdy jsou ionty přepravovány díky spřažení s látkou jdoucí po svém elektrochemickém gradientu (H + ). Dle vzájemného směru transportovaných látek odlišujeme symport od antiportu. Některé proteiny disponují jak možností uniportu, tak symportu. U proteinů, které transportují přednostně spřaženě, mluvíme v případě uniportu o odpřažení Transport důležitých látek v kvasinkách Pro hojně zastoupené ionty K + a Na + je přes plazmatickou membránu nastaven velký koncentrační gradient. Koncentrace Na + je vně buňky mnohem vyšší, než je toxická mez pro vnitrobuněčnou koncentraci. Naopak K + je vně buněk v mnohem menší 12

15 koncentraci, než je ho v buňce zapotřebí. K+ je potřebný pro udržení osmotického tlaku, iontové síly, k syntéze proteinů a aktivaci enzymů (Serrano and Rodriguez-Navarro, 2001). O jeho transport se starají transportéry Trk1,2 a Tok1 a Tok2. Obrázek 1: Sekreční a endocytická dráha. Po dráze se mění ph jednotlivých oddílů buňky, což umožňuje správné směrování vesikul ve vnitrobuněčném transportu. Ilustrace byla převzata z (Paroutis et al., 2004) Vzhledem k tomu, že je sodík ve vyšších koncentracích toxický pro některé metabolické reakce, buňky pro udržení správné koncentrace sodíku v buňce používají tři strategie. První z nich je eliminace vstupujících iontů do buňky, další je cílený tok iontů z buňky 13

16 a posledním je uskladnění iontů v buněčných organelách (Sychrova, 2004) Tyto funkce plní několik transportních systémů, např. Na + -ATPáza (Haro et al., 1991) či Na + /H + antiportery (Nha1 a Nhx1) (Prior et al., 1996). Základní stavební prvky jako je uhlík a dusík jsou do buněk dopravovány především v podobě glukózy a amoniaku (či aminokyselin). Glukóza je do buněk transportována usnadněnou difúzí, pro amoniak existují v buňce specifické aktivní přenašeče s různou kapacitou a afinitou. Nicméně využívá i transportních systémů pro draslík (CONWAY and DUGGAN, 1958). Aminokyseliny mohou být transportovány specificky nebo přenašeči s obecnou afinitou. Transport aminokyselin je pouze jednosměrný směrem do buňky a jejich transport je regulován zpětnou vazbou. Odlišná je situace na vnitrobuněčných membránách, kde např. v membráně vakuoly funguje reverzibilní, usnadněná difúze. V případě kultivace buněk např. v argininfosfátovém médiu (AP médium) viz Metody (Brett et al., 2005; Rodriguez-Navarro and Ramos, 1984) slouží jako zdroj dusíku arginin. 4.2 Membránový potenciál u kvasinek Jednou z hlavních vlastností membrán je membránový potenciál, rozdíl elektrického potenciálu mezi dvěmi stranami biologické membrány. Membrána kvasinek je stejně jako u jiných organismů elektricky nabita tak, že je záporná uvnitř. Hlavním iontem tvořícím membránový potenciál je H +. Membránový potenciál je životně důležitý pro příjem živin a regulaci vnitrobuněčného ph, je hnací silou pro pohyb mnohých iontů přes membránu a reguluje funkci některých proteinů (Ambesi et al., 2000). Proto buňky na udržení membránového potenciálu vynakládají značné množství energie. Pokud regulace selže, dochází k hyperpolarizaci nebo k depolarizaci. V případě hyperpolarizace dochází k nespecifickým tokům mnohých iontů a toxických látek přes membránu (Madrid et al., 1998). Často se proto používá k odhadu membránového potenciálu zkouška citlivosti na hygromycin B. Jak ale Marešová a kol. ukázali, membránový potenciál není jediným rozhodujícím prvkem, určujícím citlivost k hygromycinu B (Maresova et al., 2006). Vlastní velikost membránového potenciálu je dána relativní aktivitou Pma1 H + - ATPázy a Trk1, Trk2 draselnými transportéry. Pma1 buduje gradient 2 4 jednotek ph, Trk proteiny využívají nabudovaného potenciálu k transportu K + proti koncentračnímu gradientu do buněk a potenciál tak snižují (Lopez and Pena, 1999). Hladovění na K + a na dusík zároveň vede k hyperpolarizaci i u divokého typu, což vede k domněnce, že existuje ještě nějaký jiný systém regulující membránový potenciál (Madrid et al., 1998; Bihler et al., 1999). Rodríguez-Navarro&Serrano uvádí, že ač na membránový potenciál kvasinek nebylo provedeno žádné elektrofyziologické měření, jeho velikost se odhaduje mezi 100 mv a 250 mv (Serrano and Rodriguez-Navarro, 2001). 14

17 5. Významné transportní proteiny kvasinek V předchozích kapitolách byly uvedeny některé látky, které buňka potřebuje transportovat. Jejich optimální vnitrobuněčná koncentrace je udržována sloučením směrů transportu ve směru z buňky a do buňky a jejich ukládání v zásobních organelách (Sychrova, 2004). O různé směry transportu a různé substráty se starají rozličné proteiny. O primární transport H + přes plazmatickou membránu se stará Pma1 (P-typ ATPázy), na vnitřních membránách nalezneme Vma1 (V-typ ATPázy) taktéž transportující H + na úkor hydrolýzy ATP. Další ATPázou P-typu je řada enzymů Ena, hlavní transportéry Na + z buňky ven. Doplňují je členy rodiny antiporterů NHE, transportérů draslíku TRK, kanály TOK a další. V následujících podkapitolách jsou popsána jejich umístění, specifita a charakteristiky transportu. 5.1 PMA1 H + -ATPáza Gen PMA1 kóduje enzym Pma1, který je členem P-typu transportních ATPáz (tj. takových, které tvoří fosforylovaný intermediát). Jak bylo uvedeno v Kapitole 4.2, Pma1 H + -ATPáza obstarává elektrogenní transport H + (Pena et al., 1995; Calahorra et al., 1998), díky němuž buduje membránový potenciál. Pma1 je ovlivňována vnějšími podmínkami, příkladem faktoru regulujícího aktivitu Pma1 je napětí na membráně, které určuje, kolik ATP je H + -ATPázou hydrolyzováno (Seto-Young and Perlin, 1991). Předpokládá se, že právě membránový potenciál může ovlivnit rychlost přechodu mezi fosforylovanými stavy E1-P a E2-P a rychlost následného uvolnění H + (Seto-Young and Perlin, 1991). Aktivace enzymu je zprostředkována glukózou, která indukuje fosforylaci (Lecchi et al., 2007), dále nízkým ph cytosolu (Eraso and Gancedo, 1987) i vysokým externím ph (Pena et al., 1972; Pena et al., 1995). Aktivace spojená s ph ext i ph cyt je pravděpodobně důležitá pro udržení ph cyt v malém rozpětí hodnot, které by bylo relativně nezávislé na ph ext (Martinez-Munoz and Kane 2008). Zmíněné způsoby ovlivňují i výslednou velikost membránového potenciálu. Se snižováním membránového potenciálu hl. transportem K + pomocí Trk proteinů se zrychluje činnost Pma1. Perlin a kol. popsali únik protonů z kmenu nesoucího mutaci v PMA1, který byl limitován membránovým potenciálem - bez současného transportu K + by únik H + neměl dostatečnou hnací sílu (byl by nastaven příliš vysoký elektrochemický potenciál). Tato skutečnost poukazuje na propojení transportu H + a K + (Perlin et al., 1988). Obdobný systém byl pozorován i in vitro. (Calahorra et al., 1987). Z pozorovaných výsledků bylo vyvozeno, že existuje buď ne zcela účinný H + /K + transportér (Ramirez et al., 1996; Camarasa et al., 1996) nebo napětím hradlovaný kanál (Boxman et al., 1984; Gustin et al., 1986; Ramirez et al., 1989). Rozlišení usnadnilo pozorování, že hydrolýza ATP a transport H + dosahují V max při nepřítomnosti K + z čehož plyne, že transport H + a K + není propojen striktně (za předpokladu, že pozorovaná elektroneutralita není důsledkem mutace) (Seto-Young and Perlin, 1991). 15

18 Pro ověření předpokládané funkce enzymu (např. udržení membránového potenciálu) je možné připravit buňky s mutantními enzymy. Enzym není možné deletovat, protože buňky bez něj nepřežívají (Ambesi et al., 2000). Proto se připravuje řada mutantních enzymů, jejichž činnost je změněna. Jeden ze způsobů přípravy mutantů je ozařování UV zářením. U kmenů obsahujících mutantní enzym se vyskytuje různé fenotypové chování od citlivosti na hygromycin B, na nízké ph, na slabé kyseliny, na vysokou iontovou sílu média, na osmotický tlak až po citlivost k NH 4 + (Perlin et al., 1988), pravděpodobně z důvodu odlišné tvorby membránového potenciálu, nebo depolarizace membrány. Perlin a kol. (Perlin et al., 1988) ukázali, že právě depolarizace membrány způsobuje rezistenci k hygromycinu B. Jedním konkrétním ze známých mutantních enzymů rezistentních k hygromycinu B je pma Substituce jednoho aminokyselinového rezidua (Ser -> Phe) blízko místa fosforylace mění chování enzymu tak, že mutant je méně citlivý ke změně napětí na membráně (Perlin et al., 1989), což souvisí právě s neschopností udržet membránový potenciál (Perlin et al., 1988). U mutantů navíc došlo ke změně kinetiky k výraznému poklesu v K m i V max. (Perlin et al., 1989). Ale i přes snížení aktivity (hydrolýza ATP) enzymu není tranport H + u mutantních kmenů v důsledku výrazně změněn (Perlin et al., 1988). Nejnovější poznatky ukazují (Maresova et al., 2009), že v nepřítomnosti glukózy se o membránový potenciál nestará Pma1, ale soubor proteinů Ena, Tok1 a Nha1. Jak vyplynulo, činnost kvasinkové H + -ATPázy může být sledována nepřímo, a to měřením membránového potenciálu celých buněk (případně membránových vesikulů a nebo rekonstituovaných liposomů) (Borst-Pauwels and Peters, 1981). Mnoho takových experimentů pomohlo objasnit funkce i dalších proteinů, nejenom Pma NHE Rodina antiportních přenašečů Na + /H + označovaná jako NHE zahrnuje proteiny spojené s regulací ph v buňkách (Orlowski and Grinstein, 2004). V současnosti je známo 9 isoform NHE proteinů vyskytující se od bakterií po savce (Brett et al., 2005). Zástupci rodiny NHE se vyskytují buď v plazmatické membráně - takové regulují ph cytoplazmy, starají se o udržení objemu buňky a Na + homeostáze (Nass and Rao, 1998) (savčí formy NHE1 až NHE5 souvisí s vysokým krevním tlakem, epilepsií, zeleným zákalem atd. (Orlowski and Grinstein, 2004)). Další z proteinů rodiny NHE lze nalézt ve vnitrobuněčných membránách, kde zprostředkovávají uskladnění Na + do lumen endocytických oddělení buňky (odpovídající savčí isoformy jsou NHE6 až NHE9 (Brett et al., 2005)). Zatímco savčí buňky mají zástupce NHE rodiny i ve vnitřní membráně mitochondrií, u kvasinek nebyl Na + /H + antiport nalezen (pozorována byla pouze neselektivní forma K + /H + transportu (Welihinda et al., 1993; Nass and Rao, 1998). NHE proteiny se navzájem podobají primární i sekundární strukturou, tvoří je 12 transmembránových segmentů a dlouhý C-konec sahající do cytoplazmy. Na základě Hillovy analýzy kinetik transportu se předpokládá existence jednoho vazebného místa pro Na + a dvou allostericky se ovlivňujících vazebných míst pro H + (Tse et al., 1993). 16

19 Funkčně se navzájem liší selekcí iontů, kinetickými vlastnostmi, citlivostí k inhibitorům i ve fyziologické funkci (Brett et al., 2005). Na + /H + antiportní systémy zajišťují většinou elektricky neutrální antiport (pozorováno i v savčích isoformách (Orlowski and Grinstein, 1997; Nass and Rao, 1998)), čímž regulují pohyb solí, vody, slabých kyselin či zásad přes plazmatickou membránu. Proteiny kódované geny NHE z plazmatické membrány jsou regulovány druhými posly signálních drah a interakcí s cytoskeletem buňky (Putney et al., 2002). Interakce je zprostředkována C-koncem NHE proteinů (Wakabayashi et al., 1997) Nha1 Důležitým zástupcem rodiny NHE v kvasinkách je Na + (K + )/H + antiportní protein kódovaný genem NHA1 a integrovaný v plazmatické membráně. Nha1 je typický sekundárně aktivní transportér, který využívá protonový gradient nastavený Pma1 jako zdroj energie pro transport Na +, K + ; v menší míře transportuje i Li + a Rb + (Prior et al., 1996; Sychrova et al., 1999). Nha1 hraje důležitou roli v kontrole vnitrobuněčného ph (Banuelos et al., 1998; Sychrova et al., 1999; Brett et al., 2005), účastní se regulace buněčného cyklu (Simon et al., 2001) i okamžité reakce na osmotický šok (Kinclova et al., 2001). Protein Nha1 přispívá v buňce mimo jiné k udržení homeostáze, což umožňuje buňkám růst i za vysokých koncentrací KCl, NaCl, nebo v nízkých hodnotách ph ext (Sychrova, 2004). Delece nebo poškození NHA1 vede k citlivosti k iontům Na + a Li + (Prior et al., 1996). Strukturně jde o protein se 12 transmembránovými doménami, krátkými kličkami, velmi krátkým N-koncem (12 aminokyselinových reziduí) a dlouhým C- koncem - více jak polovina proteinu (Sychrova, 2004). Dříve se předpokládalo, že Nha1 je elektricky neutrální transporter, ale (Ohgaki et al., 2005) dokázal, že na 1 Na + je transportováno více H + (1Na + na 2H + ). Protein Nha1 je tak výjimkou mezi eukaryotními Na + /H + antiportery a podobá se více antiporterům bakteriálním (Padan et al., 2001; Banuelos et al., 1998). Mechanismus navázání přenášených iontů stále není objasněn, ale je známo, že pro funkci antiporteru je důležité přesné umístění některých polárních reziduí (např. Asp-266) (Ohgaki et al., 2005). Vzhledem k povaze Nha1 (Prior et al., 1996; Banuelos et al., 1998) by jeho aktivita měla být vyšší v buňkách s vyšší protonmotivní silou např. v buňkách v kyselém médiu. Tato skutečnost se prokázala v pokusu, kdy bylo pozorováno ph in buněk resuspendovaných v pufrech o různém ph ext. V nejkyselejším prostředí (ph ext 3,5) byl rozdíl vnitrobuněčného ph mezi mutantem nha1 a wt největší (Sychrova et al., 1999), aktivita proteinu Nha1 je tedy závislá na ph ext. Jakmile je NHA1 gen deletován, cytoplazmatické ph u buněk resuspendovaných ve vodě či kyselých pufrech se zvýší zhruba o 0,2 jednotky ph oproti divokému kmenu (Sychrova et al., 1999; Banuelos et al., 1998). V opačném případě, v zásaditém prostředí je stimulována Pma1 17

20 (Pena et al., 1995) a buňka ztrácí protony. A tak buňky využívají funkce Nha1 k tomu, aby pomocí určitých zásob K + či Na + v buňce transportovaly protony zpět do buňky a zamezily tak přílišnému zvýšení vnitrobuněčného ph Nhx1 Protein Nhx1 je endosomální člen všudypřítomné rodiny NHE Na + /H + antiporterů. Pomocí fluorescenčního značení bylo ověřeno, že Nhx1 se nachází v membráně vakuol, v prevakuolárním prostoru a v pozdních endosomech. Vyskytuje se v bipolárním rozložení u protilehlých pólů vakuoly (Nass and Rao, 1998). V prevakuolárním prostoru se setkávají biosyntetické, antagonistické a endosomální dráhy. Úkolem Nhx1 je regulovat luminální i cytosolické ph, a to jeho zvyšováním. Je možné, že dokonce slouží jako ph-sensor změnou konformace C-konce v odpovědi na velikost luminálního ph (Ali et al., 2004) C-konec Nhx1 je výrazně kratší, než u jiných isoform proteinu (Nass and Rao, 1998). Ztráta NHX1 vede k okyselení vakuoly a s tím souvisejícímu zhoršení růstu v nízkém ph ext (Brett et al., 2005). Nhx1 transportuje H + v opačném směru než V-typ H + -ATPázy (Vma) (Nass and Rao, 1998). Tato skutečnost je zřejmě velmi významná pro regulaci gradientu ph v buněčných oddílech, aby bylo zamezeno přílišnému okyselení vakuolární H + -ATPázou Vma - je hojně rozšířena v Golgiho aparátu, TGN a na endosomálních membránách (Ali et al., 2004) Změny vnitrobuněčného ph vedou ke změnám v morfologii organel a poruchám ve vnitrobuněčném transportu vesikulů mezi jednotlivými odděleními buňky (Heuser, 1989). Právě protein Nhx1 je velmi důležitý pro udržení přirozeného gradientu ph v buňce a tedy pro správný směr vnitrobuněčného transportu od endosomů k povrchu buňky (Brett et al., 2005; Paroutis et al., 2004) viz Obrázek 1. Dále Nhx1 přispívá k toleranci buněk k solím tak, že Na + ukládá do vnitrobuněčných oddělení výměnou za H + (Nass et al., 1997; Nass and Rao, 1998). Proto je nhx1 mutant citlivý k Na + v kyselém prostředí (nikoliv v neutrálním nebo zásaditém) a ke sníženému množství K + v okolí buňky (Nass et al., 1997). Ali a kol. uvádí, že nhx1δ deleční mutant je hyperpolarizován (Ali et al., 2004) a je citlivý na hygromycin B (Gaxiola et al., 1999) - zřejmě kvůli silné roli Pma1 a kvůli chybnému rozdělování toxických iontů do vakuol (Brett et al., 2005). Další z možných funkcí Nhx1 je podílení se na biogenezi vakuol - regulací jejich objemu a ph (díky pohybu solí a vody). Gradient H + (tvořený V-typem H + -ATPázy) pohání akumulaci Na + (přes Na + /H + antiportní systém) a Cl - (přes chloridové kanály). Jak je osmotickým tlakem hnána voda do vesikul, vakuoly nabývají a hydrostatický tlak pomáhá příp. destabilizaci membrány a fúzi vakuol. Podobného principu je využíváno u exocytózy (Nass and Rao, 1998). 5.3 KHA1 Kha1 byl původně považován za K + /H + antiportní systém v cytoplazmatické membráně transportující K + z buňky, ale Marešová & Sychrová ukázaly, že se Kha1 vyskytuje 18

21 uvnitř buňky (Maresova and Sychrova, 2005; Flis et al., 2005). V Saccharomyces cerevisiae se Kha1 transportní systém účastní regulace cytosolického ph (Maresova and Sychrova, 2005; Flis et al., 2005), protonmotivní síly a pufrační schopnosti (Pena and Ramirez, 1991; Ramirez et al., 1996; Camarasa et al., 1996). Delece genu KHA1 vede k citlivosti na vysoké ph okolí (jak bylo potvrzeno i v této práci - viz Kapitola 42) a na hygromycin B (Maresova and Sychrova 2005). 5.4 ENA Proteiny Ena (v S. cerevisiae najdeme 4 isoformy Ena 1-4) patří stejně jako Pma1 mezi ATPázy P-typu, je tedy charakterizována fosforylovaným intermediátem. Jeho hlavním úkolem je transportovat Na + z buňky, ale částečně funguje i jako nespecifický přenašeč pro další jednomocné ionty alkalických kovů (Serrano, 2004). Díky tomu mohou kvasinky růst i při vysokých koncentracích NaCl a KCl při vysokém ph ext (Banuelos et al., 1998). Geny ENA2 až ENA4 jsou exprimovány konstitutivně, exprese ENA1 je indukována právě přítomností Na +, Li + v médiu nebo vysokými hodnotami ph okolí. (Garciadeblas et al., 1993). V podmínkách vysokého obsahu solí je transkripce ENA1 zprostředkována calcineurinem. Calcineurin ovlivňuje několik kvasinkových genů včetně ENA1 regulací přímo v jádře, je antagonistou negativní regulace camp dependentní protein-kinázy (Hirata et al., 1995). Hladovění na glukózu a osmotický stres též vedou ke zvýšení transkripce ENA1. Protože Ena1 transportuje ionty při vysokých hodnotách ph, předpokládalo se, že v buňkách existuje ještě transportér fungující při nízkých hodnotách ph pravděpodobně kation/h + antiporter. Později se ukázalo, že jde o již zmíněný Nha TOK1 Kanály pro K + tvoří jedinou rodinu Tok od bakterií po savce. Řada těchto draselných kanálů je hradlována napětím (Ketchum et al., 1995; Bertl et al., 1993), mechanicky, nebo jsou řízené vazbou ligandu. Již dříve bylo známo (Bertl et al., 1992), že hradlování Tok1 se mění se změnou E k Nernstova potenciálu pro průchozí ionty. Snížení externí koncentrace K + by tedy mělo zvýšit pravděpodobnost otevření kanálu za různých hodnot napětí (Ketchum et al., 1995). Dále je Tok1 aktivován depolarizací membrány (otevírá se při kladném (Ketchum et al., 1995) nebo nízkém záporném membránovém potenciálu (Bertl et al., 1993)), tehdy uvolňuje ionty K + akumulované v buňce, aby byl membránový potenciál vyrovnán na běžnou hodnotu (Maresova et al., 2006). V důsledku je hradlování Tok1 precizní kombinací regulace napětí na membráně, koncentrací K + v buňce i vně, i koncentrací Ca 2+ v buňce (Bertl et al., 1992; Bertl et al., 1993). K uzavření kanálu může dojít při poklesu externí koncentrace K + pod 10 μm podle nepotvrzených údajů (Bihler et al., 1999). Tok1 je asi obecně uzavírán při určitém elektrochemickém gradientu, neb nebyl pozorován žádný únik K + z buňky, když buňky byly inkubovány v bezdraselném pufru (Maresova et al., 2006). 19

22 Jsou-li buňce odstraněny ostatní transportní systémy pro K +, sám Tok1 je schopen membránový potenciál udržet. Dále bylo zjištěno, že delece TOK1 způsobuje depolarizaci plazmatické membrány, ale nikoliv citlivost k hygromycinu B (Maresova et al., 2006). 5.6 TRK Mimo Pma1 H + -ATPázu membránový potenciál udržují proteiny kódované geny TRK1 a TRK2 (viz výše 14). Proteiny Trk1 a Trk2 jsou si z velké části podobné, Trk2 oproti Trk1 postrádá asi 50 % z velké hydrofilní části proteinu (Ko and Gaber, 1991). Mimo onen chybějící úsek spolu proteiny sdílí asi 53 % sekvence (Ko and Gaber, 1991; Ramos et al., 1994). Z podobnosti s primitivními K + -kanály byla navržena podoba Trk proteinů - 4 MPM sekvence, M-transmembránové α-helixy a P-smyčky zanořené částečně do membrány (Durell et al., 1999a; Zeng et al., 2004). Navrhovaný model předpokládá složení proteinu z tetrameru membránou procházejících dvojic α-helixů, které jsou spojené kličkami. C-konec Trk2 leží na vnitřní straně cytoplazmatické membrány. Předpokládaný pór nebo iontový kanál skrz Trk proteiny nejspíše není přímý (Durell et al., 1999b). Dříve se předpokládala struktura 12 TMS motivu (Gaber et al., 1988; Ko and Gaber, 1991). Trk proteiny transportují K + do buňky a díky jejich funkci dokáží kvasinky růst ve velmi širokém rozmezí mimobuněčných koncentrací draslíku, cca od 2 μm do 2 M (Rodriguez-Navarro and Ramos, 1984). V celém tomto intervalu udržují stálou koncentraci iontů v buňce (Ramos and Rodriguez-Navarro, 1986; Rodriguez-Navarro and Ramos, 1984), což poukazuje na precizní regulaci tohoto transportu. Při nedostatku K + přestávají buňky růst. Kvasinky vykazují zhoršený růst od té chvíle, kdy vnitrobuněčná koncentrace K + poklesne na 80 % své původní hodnoty (300 nmol mg -1 ) (Rodriguez-Navarro and Ramos, 1984). Rodríguez-Navarro & Ramos uvádí vnitrobuněčnou koncentraci 380 nmol mg -1, Ramos a kol. publikují hodnoty 500 nmol na mg suché váhy (buňky pěstované v AP médiu) a 250 nmol mg -1 u buněk hladovějících na draslík (Ramos et al., 1994; Rodriguez-Navarro and Ramos, 1984). Trk proteiny je možné aktivovat zvýšenou koncentrací Na +, která aktivuje calcineurinovou dráhu. Stejně tak mohou být aktivovány prostřednictvím protein kináz Hal4 a Hal5, v případě hladovění na K + (Serrano, 2004). Kinetika transportu K + závisí na podmínkách pěstování a způsobu měření (Rodriguez-Navarro and Ramos, 1984), ale základní dělení je jasně dáno. Trk1 je jednoznačně zahrnut ve vysoce afinitním transportu K + do buňky. Důkazem je, že trk1 mutantní buňky na rozdíl od divokého kmene nerostou v médiích s μm obsahem K +. Trk2 zastává středně afinitní transport, jeho činnost je regulována především koncentrací draselných iontů vně buňky a vnitrobuněčným ph (Ramos et al., 1994). V případě kmene, u nějž je TRK1 gen deletovaný a TRK2 exprimovaný v nadbytku, pozorujeme v podstatě stejné chování jako u divokého typu. Naopak v případě přítomnosti Trk1 se zdá být Trk2 postradatelný (Ramos et al., 1994). Ukázalo se, že 20

23 existuje i nízko-afinitní složka, neboť transport v trk1δ delečních mutantech a v trk1 se zvýšenou expresí TRK2 (hladovějících na K + ) vykazoval dvě složky nízko a středně afinitní. Proto pro dvojité trk1δtrk2δ mutanty potřeba K + výrazně vzrůstá, příjem je u nich zajišťován pouze nízko afinitním tranportem, viz níže. Mutantní kmeny trk1δ a trk1δtrk2δ jsou hyperpolarizované, trk1δ tvoří určitý stupeň mezi divokým kmenem a dvojitým mutantem (Madrid et al., 1998; Bihler et al., 1999). Navíc je hyperpolarizace odpovědí na hladovění na K +. Účinnost, jaké dosahují Trk transportéry - zajišťují násobně vyšší koncentrace K + oproti vnějšku mohou vysvětlit dvě teorie 1) Saccharomyces cerevisiae by mělo velký záporný membránový potenciál < 200 mv. Tato možnost není vyloučena, neboť jak je uvedeno v Kapitole 4.2, membránový potenciál ještě nebyl u kvasinek spolehlivě určen. 2) S K + je transportován další iont. Tato možnost byla odvozena přímo z podobnosti Trk s transportérem z Neurospora, pro nějž je kotransport dobře popsán (Ramos and Rodriguez-Navarro, 1986). Ale jak v bakteriích, tak v rostlinách se kotransportu s K + účastní Na + (Rubio et al., 1995; Tholema et al., 1999). V kyselém prostředí u Saccharomyces cerevisiae byl jako druhý iont kotransportu odhadnut proton v poměru 1:1 s K +. Obecně u S. cerevisiae mají Trk proteiny dvě vazebná místa, jedno specifické pro K + a druhé je dostupné pro takřka libovolné jednomocné kationty (H +, K +, Na +, Cs +,..) (Haro and Rodriguez-Navarro, 2002; Derks and Borst-Pauwels, 1980). Níže jsou zaznamenány dva výstupy experimentů zaměřujících se na kotransport zajišťovaný proteiny Trk a na jejich funkci kanálu. Bihler a kol. (Bihler et al., 1999) zaznamenal silnou závislost proudů H + zprostředkovaných TRK na ph ext. Některá pozorování (Madrid et al., 1998; Bihler et al., 1999) přinesla teorii, že Trk2 (nikoliv Trk1) transportuje H + směrem do buňky, což se projevuje detekovatelným proudem měřeným metodou patch-clamp za nepřítomnosti K +. Proud do buňky skrz přenašeč Trk2 byl při změně ph ext k nižším hodnotám několikanásobně zesílen jako log[h + ] out (po přeškálování na únik H + ). Změna ph ext neměla vliv na proudy v opačném směru - ven z buňky (Bertl et al., 1998). Překvapením bylo, že proudy směrem do buňky nejsou závislé na externí koncentraci K +, zřejmě ani na koncentraci Ca 2+, Mg 2+, Cl - vně (Bihler et al., 1999). Za podmínek, za kterých se Trk2 chová jako K +, H + symporter, jde Trk2 proti činnosti Pma1 nejen snižováním membránového potenciálu, ale i snižováním koncentračního gradientu H +. Serrano (Serrano, 2004) uvádí, že dokonce oba Trk2 i Trk1 jsou H +, K + symportery (Rios et al., 1997). Navíc se vyskytly i experimenty, které ukazovaly Trk proteiny jako kanály. Při měření metodou patch-clamp byl pozorován skrz Trk proteiny kvasinek rodu Saccharomyces cerevisiae tok chloridových iontů ve směru z buňky. Naměřené proudy Cl - daly vzniknout modelu napětím hradlovaného kanálu s dvojicí aktivačních energií. Dle modelu se zdá, že chloridy prochází skrz centrální pór tvořený symetrickou agregací čtyř Trk monomerů viz výše (tedy jinou cestou než K + ). Tok Cl - oběma proteiny Trk1 i Trk2 je skoro stejný - za přítomnosti K +. Součet proudů u trk1δ a trk2δ je srovnatelný s proudy zaznamenanými v divokém kmenu 21

24 (měřeno na buňkách). Kinetika transportu je stejná pro oba proteiny Trk1 i Trk2 a je nezávislá na jejich aktivitě, či míře exprese (Kuroda et al., 2004). Různé artefakty v podobě iontů Cl - prostupujících membránou mohou být vyloučeny, neboť tok Cl - je z 90 % omezen, jsou-li oba Trk proteiny deletovány. Souhrnně Trk proteiny propouští Cl -, ale neobstarávají jejich transport - bez ohledu na vnitrobuněčnou koncentraci chloridů (Rivetta et al., 2005). Proud chloridů funguje na základě interakce iontu chloridu s proteinem na rozdíl od regulace velikostí ph apod. (Rivetta et al., 2005). Je nejspíš možné, že každý přenašeč může fungovat za určitých podmínek jako kanál (Kettner et al., 2003). 5.7 Nízko afinitní transportní systémy pro K + Nízko-afinitní systém zprostředkovává transport K + ve dvojitém mutantu trk1δtrk2δ. Testy (s inhibitory) ukazují na to, že na Trk nezávislý transport K + do buňky je zprostředkováván více transportéry, ač kinetická měření ukazovala na jeden systém (Madrid et al., 1998; Bihler et al., 1999). Z pokusů se zvýšenou expresí rozličných genů byli vybráni kandidáti z proteinů, které dokázaly částečně potlačit fenotyp trk1δtrk2δ, tedy mohou zprostředkovávat nízko-afinitní složku transportu. Takové geny kódují transportéry aminokyselin a inositolu (Madrid et al., 1998; Bihler et al., 1999) a neselektivní kationtový kanál NSC1, inhibovaný v nízkém ph (Bihler et al., 2002; ARMSTRONG and ROTHSTEIN, 1964). Navíc bylo zjištěno, že nízko-afinitní transportéry pro K + jsou inhibovány amonnými nebo dvojmocnými ionty (Madrid et al., 1998;Bihler et al., 1999). K další inhibici dochází při nedostatku K +, kdy nastupuje u divokého kmene vysoce afinitní transport (Rodriguez-Navarro and Ramos, 1984). Aktivace nízko-afinitního transportu je možná glukózou (Ramos et al., 1992). 5.8 Malé GTPázy Malé GTPázy jsou proteiny hydrolyzující GTP, většinou činné v signálních drahách. V této práci byli zkoumáni jejich zástupci: Arl1 a Ypt6. Arl1 je členem podrodiny ARF podobných proteinů. ARL1 je velmi podobný u všech eukaryotních organismů, zachováno je cca 60 %. Např. pro Drosophily je esenciální, u kvasinek nikoliv. (Lee et al., 1997; Rosenwald et al., 2002). Gen ARL1 kóduje regulátor vnitrobuněčného transportu mezi membránami, který interaguje s proteiny z okolí Golgiho aparátu (Rosenwald et al., 2002). Je zahrnut v regulaci samotného Golgiho aparátu, jeho funkce (Lu et al., 2001) a dále v regulaci transportu mezi TGN ( trans-golgi network ) a endosomálním systémem v savčích buňkách (Lu et al., 2004). Podílí se na transportu GPI-kotvených proteinů z Golgiho aparátu do plazmatické membrány příkladem je Gas1. Gas1 je glykoprotein nejčastěji zastoupený na vnější straně plazmatické membrány. Stará se o celistvost buněčné stěny (Liu et al., 2006). arl1 mutant trpí špatně fungujícím vnitrobuněčným vesikulárním transportem (Love et al., 2004). 22

25 Munson a kol. (Munson et al., 2004) ukázal, že Arl1 je podstatným členem v regulaci příjmu K + buňkou a tím zprostředkovaně i v regulaci membránového potenciálu. arl1 mutant je hyperpolarizován podobně jako trk1δ trk2δ mutant. Mutanti arl1δ nedokážou růst při kyselém ph ext, navíc jsou citliví na některé kationické inhibitory translace, například na hygromycin B (Lee et al., 1997). Toto fenotypové chování lze potlačit přítomností K + v médiu (Munson et al., 2004). Za hyperpolarizaci arl1δ zodpovídá právě zhoršený vtok K + do buňky, nikoliv transport protonů ven (Munson et al., 2004). Způsob regulace příjmu K + přes Arl1 je spjat s proteiny Trk. Ukázalo se, že ztráta ARL1 neovlivní množství Trk1 v plazmatické membráně, ani jeho lokalizaci, tj. zjevně Arl1 působí v novém smyslu regulace transportu K + do buňky, pravděpodobně prostřednictvím ovlivnění aktivity Trk1 (Munson et al., 2004). Geny ARL1 a TRK1 fungují na stejné signální dráze spolu s HAL4 a HAL5 (kódují Hal4 a Hal5 Ser/Thr proteinkinázy), Arl1 i Hal4 a Hal5 jsou součástí signální dráhy směřující k Trk1 a Trk2 a regulují jejich činnost (Mulet et al., 1999; Munson et al., 2004). Ukazuje se, že pro bezchybnou regulaci vnitrobuněčného transportu musí být Arl1 funkční plně, tj. že musí fungovat navázání GTP, jeho hydrolýza, a protein se musí vyskytovat v blízkosti Golgiho aparátu. Ač se zdá, že arl1δ mutant se podílí na transportu proteinů, které jsou vázány na lipidové rafty, neovlivňuje Pma1. Ten právě je na lipidové rafty vázán (Liu et al., 2006). Mimo K + reguluje Arl1 obdobně i koncentraci Ca 2+ a Zn 2+ (Love et al., 2004) Dalším zde zmíněným zástupcem malých GTPáz je Ypt6. V kvasinkách existuje 11 členů rodiny Ypt. Ypt6, homolog savčí Rab6 GTPázy hraje roli v návratu proteinů z endosomů do Golgi (Luo and Gallwitz, 2003), je přidružen ke Golgiho aparátu. Ypt6 s vázaným GTP je nezbytný pro splývání vesikulů s pozdním Golgi (Lewis et al., 2000). Oproti předpokladu je aktivní v jiné dráze, než Arl1 (Liu et al., 2006). Ali a kol. (Ali et al., 2004) dokazují propojení mezi ději závislými na Nhx1 a Ypt6 (a Ypt7) regulovanou fúzí vesikul. Z výsledků plyne, že Ypt6 a Nhx1 fungují podél jedné a té samé signální dráhy a jsou negativně regulovány proteinem Gyp6 (Ali et al., 2004). Oba případní mutanti ypt6δ i nhx1δ jsou citliví na hygromycin B. Z rozdílů v citlivosti mutantů na hygromycin B v souvislosti s velikostí membránového potenciálu plyne, transport z Golgi do vakuoly zřejmě hraje roli i v citlivosti k hygromycinu B. nhx1δ mutant je citlivější než například trk1δ navzdory větším změnám v membránovém potenciálu u trkδ (Ali et al., 2004). Delece YPT6 způsobuje citlivost na teplotu, zvýšená míra exprese ARL1 tento fenotyp ruší. Případný dvojitý mutant arl1δ ypt6δ nepřežívá (Liu et al., 2006). 23

26 6. ph u živých buněk 6.1 Význam regulace ph Vzhledem k tomu, že ph hraje významnou roli v regulaci metabolismu a v signálních drahách, je snahou všech buněk udržet ho na potřebné hodnotě. V živých buňkách se na regulaci vnitrobuněčného ph podílí několik procesů. Zpětně zase téměř všechny buněčné procesy jsou pomocí ph regulovány a mnoho transportních procesů závisí na gradientu elektrochemického potenciálu H +2. ph přímo ovlivňuje redoxní stav v buňce upravováním NAD + /NADH rovnováhy (Veine et al., 1998) a ustavený ph-gradient je nezbytný pro transport mezi jednotlivými buněčnými membránami viz Obrázek 1 (Paroutis et al., 2004). Dále je vliv ph velmi významný pro enzymovou aktivitu. Jednak přímo, kdy H + slouží jako substrát nebo produkt a tím mění aktivní poměr produktu a substrátu v enzymové reakci. Nebo nepřímo, kdy H + mění náboj substrátu, čímž mění jeho schopnost navázat se na enzym, nebo ph ovlivňuje ionizaci kyselých a zásaditých aminokyselinových postranních řetězců enzymů a tím ovlivňuje jejich strukturu, rozpustnost a aktivitu (Donald Voet and Judith Voet, 1995). 6.2 Změny vnitrobuněčného ph kvasinek Pma1 H + -ATPáza je u kvasinek hlavním proteinem tvořícím elektrochemický gradient protonů přes plazmatickou membránu aktivním pumpováním H + ven z buňky. Není proto překvapující, že při stimulaci její aktivity jsou pozorovány změny vnitrobuněčného ph. Příkladem takových vlivů jsou přítomnost glukózy, depolarizace membrány spojená s přenosem K + do buňky nebo i vysoké externí ph. (Pena et al., 1995; Martinez-Munoz and Kane, 2008). Vzhledem k tomu, že transport jednomocných iontů (např. K + ) je spjat (ať už přímo, či nepřímo) s transportem H +, pak se dá při jeho aktivaci změna vnitrobuněčného ph předpokládat. Příkladem za všechny takové transportní systémy buď NHE rodina antiportních proteinů. Externí ph ovlivňuje vnitrobuněčné ph stejným směrem, vnitrobuněčné ph (ph in ) je obecně vyšší u buněk pěstovaných ve vyšším ph. Příklad tohoto trendu prezentuje Peña a kol. (Pena et al., 1995). U buněk bez substrátu (glukózy a KCl) byl popsán větší vliv vysokých hodnot ph ext (7,0 a 8,0), změny v nízkých ph ext (4,0 a 6,0) velikost ph in příliš nezměnily hodnoty byly téměř shodné. Závěrem je, že ph in je v nižších ph ext necitlivé na jeho velikost. 2 S elektrochemickým potenciálem H + je spjat sekundárně aktivní transport přes membrány jak plazmatickou, tak vnitrobuněčné. 24

27 Přítomnost glukózy v médiu způsobuje díky aktivaci Pma1 nárůst ph in (Pena et al., 1972), ale opět ale jen ve vyšších hodnotách ph ext, kdy se zvětšily rozdíly mezi jednotlivými vzorky (v závislosti na ph ext ) (Pena et al., 1995). Přidání K + dokáže zvýšit ph i u buněk inkubovaných v nízkém ph ext, protože je transportován do buňky, čímž zmenšuje membránový potenciál. Tato změna je buňkou kompenzována dalším pumpováním protonů z buňky ven a tak zvyšuje ph in i v nižších hodnotách ph ext (Pena et al., 1995) Vysvětlení změn ph po glukózovém pulsu Změny ph in pozorované po přidání glukózy mají dvě fáze, rychlý pokles ph in po dobu několika sekund po glukózovém pulsu a následující nárůst ph in (Ramos et al., 1989; Kresnowati et al., 2008). Fyziologické zdůvodnění snížení ph in je popsáno níže. Předpokládáme, že koncentrace enzymů v buňce se nemění v řádu stovek sekund od změny vnějšího prostředí. Proto změny metabolitů v závislosti na vnějším podnětu mohou být po tuto dobu považovány za interakce jen mezi metabolity vzájemně. Dočasný pokles ph zjevně souvisí s rychlým uvolněním H +. Ve fyziologicky rozumném ph je produkce H + zastoupena např. fosforylací glukózy hexokinázou, či akumulací CO 2 v buňce. Ale ukazuje se, že zvýšení fosforylace glukózy a hromadění intermediátů citrátového cyklu může vysvětlit pokles ph in jen částečně (Ramos et al., 1989). Dále využití H + v metabolických reakcích souvisí s výskytem nabitých metabolitů v buňce (organické i anorganické fosfáty, nukleotidy, aminokyseliny, slabé kyseliny,...) (Kresnowati et al., 2007; Donald Voet and Judith Voet, 1995; Wu et al., 2006), přičemž největší příspěvek z nich k poklesu ph in dává fruktóza-1,6-bisfosfát. Nicméně největším dílem přispívá kyselina octová, která zajišťuje 63 % ze všech protonů podílejících se na změně ph in (Kresnowati et al., 2008). Druhá fáze odpovědi na glukózový puls, pomalé zvýšení vnitrobuněčného ph je připisováno zvýšení aktivity Pma1, která transportuje H + z buňky s důsledkem zvýšení ph in (viz výše, kapitola 5.1). 6.3 ph organel u kvasinek Každá buněčná organela má své vlastní specifické ph, které souvisí s její funkcí. U vakuol bylo pozorováno kyselé ph (Brett et al., 2005), u peroxisomů ještě kyselejší (van Roermund et al., 2004). ph mitochondrií je zásaditější, jak plyne z charakteru dýchacího řetězce. Hodnoty ph organel nejsou neměnné, stejně jako ph cytosolu je lze ovlivnit nejsnáze přidáním glukózy, nebo KCl. Zřejmě se změny v ph organel (ukázáno na příkladu vakuoly) dějí nezávisle na změnách ph cytoplazmy (Calahorra et al., 1998) - mohou se třeba souhlasně okyselit, nebo také změnit své ph v opačném smyslu. Jako zástupci buněčných organel byly měřeny vakuoly a mitochondrie 25

28 Mitochondriální ph Hodnoty ph mit dalo měření s phluorinem, který byl pomocí signální sekvence nasměrován do mitochondrií. Mitochondrie obecně mají zásadité vnitřní prostředí (související s dýchacím řetězcem), naměřené hodnoty byly 7,5 ± 0, 2, za podmínek, kdy byly buňky nestresované (Orij et al., 2009) Po hladovění bylo naměřeno ph mit 5,7, tedy výrazně nižší Přidáním glukózy k suspenzi buněk se mitochondriální ph zvedlo na 8,4, případně na 7,4 opět v případě hladovění. Dále byly srovnávány hodnoty ph mit u buněk, které fermentovaly vs. respirovaly (ph mit 7,26 7,5) (Orij et al., 2009). Vakuolární ph Vakuolární ph bylo měřeno dvěmi různými metodami: pomocí sondy BCECF- AM (Brett et al., 2005, Calahorra et al., 1998; Ali et al., 2004; Martinez-Munoz and Kane, 2008) a pomocí pyraninu, který po delší době inkubace (30 min) buněk s glukózou vstupuje do vakuol a v cytosolu se již nevyskytuje (Calahorra et al., 1998). Po hladovění naměřili Martínez-Muňoz & Kane ph vac 6,6 u buněk pěstovaných v ph ext 5,0 a po 3 až 4 hodiny inkubovaných v ph ext 7,5. Po přidání glukózy tato hodnota poklesla na 6,5, po přidání KCl se opět zvýšila, a to na 6,7 (Martinez-Munoz and Kane, 2008). V těchto podmínkách byl interval hodnot velmi úzký pouhé 0,3 jednotky ph při odlišných složeních média, v němž byly buňky měřeny. Výrazně jiné hodnoty ph vac jsou získány, jsou-li buňky kultivovány v nižších ph ext např. 5,0, případně 6,0 (ale stále hladověny) (Martinez-Munoz and Kane, 2008; Calahorra et al., 1998). Pak ph vac dosahovalo hodnot 6,07 až 6,15, po přidání glukózy 5,61 až 6,1 a po dalším přidání KCl na 5,75 až 6,3. Nutno podotknout, že hodnoty byly získány různými metodami (pyranin a BCECF-AM) a přesto jsou velmi dobře sronatelné. Na rozdíl od předchozích, Brett a kol. a Ali a kol. (Brett et al., 2005; Ali et al., 2004) buňky nijak nehladověli a po kultivaci v AP médiu byly buňky po promytí resuspendovány v čerstvém AP médiu s 2 % glukózou. Pak zaznamenali ph vac 4,8 a 4,7 (obě hodnoty za obdobných podmínek). ph vac bylo měřeno i u delečních mutantů. U mutanta nha1δ se při měření s phluorinem dosáhlo hodnoty ph vac 4,8 (Brett et al., 2005). U delečního mutanta nhx1δ bylo dosaženo 3,95 a 4,0 (Brett et al., 2005) a (Ali et al., 2004). Dvojitý mutant nhx1δnha1δ 3,85. Mimo tyto kmeny byl měřen i kmen s deletovaným proteinem ze signální dráhy ypt6δ a jeho ph vac dosahovalo hodnoty 4,2 (Ali et al., 2004). 6.4 Způsoby měření ph Měřit ph u kvasinek je poměrně složitější než například u bakterií nebo u větších buněk vyšších organismů (kde lze použít mikroelektrody). Kvasinky disponují organelami, které mohou studovanou charakteristiku transportu H + ovlivňovat obtížně kontrolovatelnými transporty například do vakuol apod. 26

29 Dříve byly k měření ph používány nešetrné metody jako je vaření či mražení buněk a následné použití skleněné elektrody (CONWAY and DOWNEY, 1950). Současnější metody pro měření ph používaly 31 P NMR (Gillies et al., 1981; Castle et al., 1986) (tato metoda je však náročná a drahá), ph-citlivé sondy (Slavik, 1982) (Slavík poprvé použil fluorescenční sondu, jejíž excitační spektra závisí na ph okolí) (Bracey et al., 1998) nebo radioaktivně značené slabé kyseliny nebo báze (CONWAY and DOWNEY, 1950), např. rovnovážné rozložení kyseliny benzoové (Kresnowati et al., 2007). Žádná z těchto technik neurčí specificky ph pro konkrétní organely. Pravděpodobně tak bylo ph měřeno jako průměr ph všech organel - tedy především snížené o ph vakuoly. Částečně uspokojující je použití pyraninu více v Kapitole V současnosti hojně využívanou metodou je exprese genu pro fluorescenční protein phluorin (Kapitola 6.4.2), která byla použita i v této práci Pyranin Pyranin je fluorescenční barvivo s ionizovatelnou OH-skupinou (8-hydroxypyrene- -1,3,6-trisulfonate, HPTS), je hydrofilní a tudíž špatně prochází přes buněčné membrány. Proto byl zaveden průnik pyraninu do buňky elektroporací (Pena et al., 1995). Jak uvádí Peña a kol. není nutné kontrolovat množství pyraninu, odvozená hodnota vnitrobuněčného ph se se změnou množství pyraninu nezmění. Hodnota pk a 7,2 pyraninu je vhodná pro ph pozorovaná u kvasinek i u buněk jiných organismů. Navíc fluorescenční spektra ionizované a neionizované formy se příliš nepřekrývají, neionizovaná forma nemá na části pozorovaného intervalu vlnových délek (460 až 520 nm) dokonce žádný signál, ionizovaná tam naopak disponuje maximem. Poprvé pyranin použili Kano & Fendler (Kano and Fendler, 1978). Zprvu se používal obecně pro určení vnitrobuněčného ph. Později se ukázalo, že pyranin zůstává po dobu asi 15 minut od elektroporace v cytosolu (buňky byly preinkubovány s glukózou), hodí se tedy k měření cytosolického ph (Pena et al., 1995). Po delší inkubaci buněk s glukózou (po dobu 30 minut od elektroporace) vstupuje pyranin i do vakuol a posléze zcela opouští cytosol (Calahorra et al., 1998) phluorin phluorin je protein, který vznikl mutací GFP (Green Fluorescent Protein) (Miesenbock et al., 1998). Krystalová struktura GFP zaznamenaná rentgenovou strukturní analýzou je k dispozici v databázi PDB 3 např. pod kódem 1emb (protein s jednobodovou mutací) (Brejc et al., 1997). Klasické GFP má excitační spektrum se dvěma maximy na 395 nm a 475 nm odpovídajícími protonovanému a deprotonovanému stavu Tyr66 (Heim et al., 1994) (Brejc et al., 1997). Nicméně spektrum se v rozsahu 5,5 až 10 jednotek ph příliš nemění. Miesenböck a kol. (Miesenbock et al., 1998) nalezli mutaci, která vykazovala

30 vhodnější vlastnosti, protein nazvali phluorin. Autoři uvádějí, že provedená mutace usnadňuje přechod mezi protonovanou a ionizovanou formou a protein díky tomu snáze reaguje na vnější ph (Obrázek 2). ph se pak dá měřit pomocí poměrového měření fluorescence, autoři sami měřili při poměru intenzit u excitačních vlnových délek 410 nm a 470 nm (R 410/470 ) (Miesenbock et al., 1998). S pomocí phluorinu (Miesenbock et al., 1998) je možné měřit přímo ph cytosolu kvasinek v reálném čase. Na kvasinkách bylo ozkoušeno a popsáno v následujících článcích: (Brett et al., 2005; Martinez-Munoz and Kane, 2008; Ali et al., 2004). Orij (Orij et al., 2009) ukázal, že exprese genu pro phluorin neovlivní fyziologii buňky (co se týče dýchacího řetězce apod.). Každý nasyntetizovaný protein disponuje signální sekvencí, která udává místo jeho určení (Alberts et al., 2002). Je možné uměle připojit signální sekvenci proteinu (zde právě phluorinu) a ten pak směrovat např. do mitochondrií (Calahorra et al., 1998). Protein je možné získat expresí genu pro phluorin umístěného na plasmidu, který lze do buněk vpravit elektroporací, jak bylo použito i v této práci. Alternativou je inzerce genu přímo do jaderné DNA. intenzita [10 6 r.j.] ph 5,5 ph 6,0 ph 6,5 ph 7,0 ph 7,5 ph 8, λ exc [nm] Obrázek 2: Excitační spektra phluorinu pro různá ph. Spektra byla zaznamenávána při λ em = 520 nm, což umožňuje měřící software DataMax příslušející fluorimetru FluroMax-2. Měřeny byly buňky nesoucí plasmid pro phluorin v kalibračních pufrech složení viz Metody. 6.5 Pufrační kapacita Schopnost pufrovat (tj. udržet přibližně konstantní ph při náhlém přidání či odebrání volných protonů) mají jak živé organismy, tak některé roztoky. Z pohledu fyzikální chemie se pod pojmem pufr rozumí konjugovaný pár kyseliny a nebo zásady, který je 28

31 schopen udržet stabilní ph v určitém rozmezí hodnot po přidání silné kyseliny nebo zásady do systému. Pufrační kapacita (β) je míra této schopnosti, uvádí se jako množství přidané silné kyseliny nebo zásady, které je potřebné ke změně ph o jednotku. Největší pufrační schopnost nastává, když je disociační konstanta pufrující látky shodná s koncentrací protonů. Kvantitativně vyjadřujeme pufrační kapacitu β následujícím vztahem dle Michaelise: ΔB β =, (1) ΔpH kde B je množství silné kyseliny nebo zásady. Pufrační kapacita v přejatém slova smyslu je míra schopnosti buňky nebo jejích organel udržet si stabilní ph při přidání nebo odebrání protonů. Porozumění pufrační schopnosti buněk je podstatné pro kvalitativní hodnocení regulace ph v buňkách a transportu H + a dalších iontů (v rámci kotransportu s H + ). Pokud se ph změní, pak je výsledkem uvolňování a navazování H + v rámci rozličných metabolických reakcí a transportních procesů. V buňce v souvislosti se změnou koncentrace H + nebo jiných iontů působí jak "chemická" pufrace, tak i metabolické procesy. K jejich odlišení pomáhá jejich časová odezva zlomky sekund vs. sekundy. Další možností jejich rozpoznání je jeden z procesů inhibovat. Případně můžeme uvažovat i vliv organel a jejich příspěvek k pufraci. Roos & Boron (Roos and Boron, 1981) navrhovali zavést pufraci buněk jako takovou, včetně metabolismu a vlivu organel, ale vyloučit transmembránový transport, neb tím by se do problému vnesla časová závislost a závislost na ph ext. Tato definice odpovídá časové škále i způsobu provedení technik používaných při většině měření pufrační kapacity buněk. Pro měření pufrační kapacity se používají převážně dvě techniky. Jednou z nich je titrace buněčných homogenátů v jednom z pokusů byla vzala cytoplazma obřího axonu olihní a pufrační kapacita byla měřena přímo na získaném vzorku již mimo buňku. Další způsob je založen na přidání slabých kyselin a zásad k suspensi kvasinek. Nenabité molekuly mohou projít difúzí přes membránu, kde v závislosti na vnitrobuněčném ph disociují na ionty. V případě kyselin tak v cytosolu získáváme větší množství protonů způsobujících změnu ph cyt. (analogicky u zásad získáme větší množství iontů OH - a tudíž "úbytek" protonů). Pufrační kapacita se pak získá z rovnice: Δ[ A ] β = in, (2) ΔpH pokud [A - ] in je koncentrace disociované kyseliny v buňce po ustavení rovnováhy. Používá se také CO 2 které se rozpouští v buňkách za vzniku iontu kyseliny uhličité a H +. Skoro všechny protony jsou eliminovány vnitrobuněčnými pufry a jen velmi malé množství přispěje ke snížení ph. Pufrování studované pomocí CO 2 lze popsat vztahem (3). 29

32 [ HCO ] Δ = ΔpH 3 in β, (3) in Tento vztah (3) i předchozí (2) uvádí pufrační kapacitu, která zahrnuje jak fyzikálněchemické, tak buněčné pufrování (pufrování organel). Obrázek 3: Schématické znázornění cesty NH 4 Cl. Jednou ze zásad, které je vhodné pro určení pufrační kapacity použít, jsou amonné ionty, např. ve formě chloridu amonného. Obrázek 3 schématicky znázorňuje proces disociace NH 4 Cl a postup vzniklých iontů.u NH 4 Cl je předpokládáno, že všechny molekuly disociují. Pak se vně vyskytuje kation NH + 4 a anion Cl -. Disociační konstanta pk a NH + 4 je 9,24, takže při ph ext 8 se nachází v pufru 5,4 % molekul v disociované formě (NH 3 ), která může volně přecházet přes membránu a její koncentrace na obou stranách se tak vyrovná. Uvnitř buňky je však ph jiné, přibližně 6,5. V takovém prostředí opět dochází k nastavování rovnováhy mezi amoniakem a amonnými ionty. Z průchozí nenabité formy zůstává 0,2 %, zbytek se spojí s protonem v NH + 4. Tím pádem dochází ke zvyšování cytosolického ph, které je možné zaznamenat. Odpovídající vztah pro výpočet β je potom analogicky vztahu (2): + [ NH ] Δ = ΔpH 4 in β, (4) + kde se předpokládá, že [ NH ] kde K a = 5,7 10 in 10 + [ NH ] 10 phin 4 out 4 = (5) in phout K a + 10 pro NH 4 +. A [NH 4 + ] out je celková koncentrace přidané soli, která je známa, v našich experimentech byla 9,9 mm. Roos & Boron shrnuli hodnoty získané touto metodou a průměrná hondota se pohybovala okolo β 33 mm (buňky svalů svijonožce). Další hodnoty uváděné v literatuře se pohybují od 9 do 118 mm (bez ohledu na použitou metodu a druh buněk, resp. organismu) (shrnuto v (Roos and Boron, 1981)). 30

33 7. METODY 7.1 Použité kmeny kvasinek Pro experimenty byly použity kvasinky kmene BY4741 (MATa his3 leu3 met15 ura3, divoký kmen zakoupen od firmy EUROSCARF 4 ) a BY4742 (MATα his3 leu2 lys2 ura3, nahrazení příslušného genu KanMX kazetou, zakoupeno od firmy Invitrogen 5 ). Oba kmeny byly transformovány plasmidem pvt-100u, který byl získán od RNDr. Aleše Holoubka, Ph.D. z Přírodovědecké fakulty UK. Od obou kmenů byl používán divoký kmen a několik delečních mutantů, detailně popsáno v Kapitole Kultivace kvasinek Kvasinky byly kultivovány v Erlenmayerových baňkách o objemu 50 ml nebo 100 ml v příslušném růstovém médiu, v třepačce na vodní nebo vzduchové bázi, při teplotě 30 C. Buňky pro experimenty byly odebírány v první polovině exponenciální fáze růstu, nejdříve po proběhnutí dvou dělení (sledováno pomocí optické hustoty). 7.3 Měření optické hustoty Růstové křivky byly zaznamenávány metodou měření optické hustoty (O.D.). Pro jejich zaznamenání bylo použito kultivačního readeru Biotek EL808 s odečtem optické hustoty (O.D.) při λ = 595 nm v hodinových intervalech. Se znalostí růstových křivek kvasinek pak bylo snadné určit fázi růstu jednorázovým odečtem O.D. Pro takové účely byla O.D. stanovována na spektrofotometrech Novaspec II, Novaspec III., Amersham Biosciences Ultrospec 10 Cell density meter a Eppendorf BioPhotometer. Eppendorf Amersham Novaspec II reader Eppendorf x 0,82 x 0,4 x 0,08 x Amersham 1,22 x x 0,5 x 0,1 x Novaspec II 2,4 x 2 x x 02 x reader 12,5 x 10 x 5 x x Tabulka 1: Vzájemný přepočet O.D. mezi různými přístroji. Komerčně dostupné přístroje se často liší ve výstupní hodnotě O.D., proto je nutné mezi nimi zavést převodní vztahy. Když definujeme, že přístroj v prvním sloupci měří hodnotu x, pak další přístroje měří viz další sloupce. Ačkoliv je O.D. dobře definovaná veličina, komerční přístroje se ve výstupních hodnotách liší a je třeba mezi nimi utvořit převodní vztahy. Vzájemný přepočet výše uvedených přístrojů je uvádí Tabulka 1. Převodní vztah mezi Novaspec II a Novaspec III (oba používány na MFF) je složitější: 4 mikro/euroscarf/

34 O. D. NovaspecIII 2 = 0,9843 x + 3,0142 x 0,0687, kde x je hodnota naměřená na Novaspec II. O.D. (mimo kultivaci v Biotek EL808) byla zaznamenávána při λ = 578 nm, případně při λ = 600 nm, značeno O.D. 578 či O.D Růstová média Kvasinky byly kultivovány v různých růstových médiích dle specifik daného experimentu. V Tabulkách 2 až 6 jsou uvedena používaná růstová média, množství látek je uvedeno pro objem 1 litr. Do minimálních médií byly přidávány i auxotrofní přídavky, které jsou uvedeny samostatně viz Tabulka 7. Pevné agarové půdy na Petriho miskách obsahovaly agar v koncentraci 2 %. Pro většinu kultivací bylo používáno minimální médium YNB, které umožňuje selekci buněk nesoucích gen pro Ura3 (tj. současně pro phluorin). Před samotnou transformací buněk bylo proto možné použít plného média (YPG). YPG (YPD) plné médium látka množství výsledná koncentrace YPD 50 g 5 % glukóza 20 g 2 % (agar) 20 g 2 % Tabulka 2: Příprava YPG média. Uvedené složky se smísily s destilovanou vodou a zautoklávovaly. YNB minimální médium látka množství výsledná koncentrace YNB 1,7 g 0,17 % ammonium sulfát 5 g 0,5 % glukóza 20 g 2 % (agar) 20 g 2 % Tabulka 3: Příprava YNB. Jednotlivé položky byly rozmíchány do 1 litru destilované vody a zautoklávovány, auxotrofní přídavky byly přidány sterilně po vychladnutí média. YNB (yeast nitrogen base, Difco) bylo používáno buď bez amonnium sulfátu a nebo s ním (pak bylo odváženo 6,7 g do výsledné koncentrace 0,67 %) SDF minimální médium látka množství výsledná koncentrace SDF Formedium 1,75 g 0,175 % síran amonný 4 g 0,4 % (30 mm) glukóza 20 g 2 % (KCl) 3,73 g 0,37 % (50 mm) hydroxid amonný --- pro úpravu ph na 5,8 (agar) 20 g 2 % Tabulka 4: Příprava SDF média. Pro SDF médium se nejprve rozmíchalo SDF, síran amonný a glukóza s deionizovanou vodou. Tato směs je poté upravena pomocí hydroxidu amonného na požadované ph. V našem případě na ph 5,8. Případný agar se přidá po úpravě ph, před zautoklávováním. 32

35 SDF minimální médium se používalo pro kultivace nebo kapkové testy s definovaným obsahem draslíku. KCl se do SDF média přidával buď před zautoklávováním (3,73 g na 1 litr média) a nebo zfiltrovaný přímo ve chvíli potřeby do výsledné koncentrace 50 mm. AP médium AP médium se používalo pro měření, kde by přispíval parazitní fluorescenční signál od minimálního média YNB. Ve svých experimentech jej využíval i Brett a spol. (Brett et al., 2005). Obecně se AP média používá u médií, kde je zapotřebí vyloučit možnost kompetice mezi K + a NH 4 + při transportu do buňky (CONWAY and DUGGAN, 1958). Při porovnávání růstu na argininovém a na amonném médiu došli Rodríguez- Navarro&Ramos k závěru, že v médiu amonném je zapotřebí asi 50-krát vyšší koncentrace K + než v argininovém médiu, aby byl růst buněk srovnatelný (Rodriguez- Navarro and Ramos, 1984). látka Kyselina fosforečná množství koncentrace zásobního roztoku výsledná koncentrace 550 μl % Arginin CaCl 2 2 ml 0,1 M 0,2 mm MgSO 4 2 ml 1 M 2 mm KCl 10 ml 0,1 M 1 mm Glukóza 20 g % poznámky titrace pro dosažení požadovaného ph Tabulka 5: Příprava AP média. Na 1 litr média: 550 μl kyseliny fosforečné se rozmíchá v 600 ml destilované vody a směs se upraví na požadované ph pomocí argininu (v případě měření s BY4741 na ph 5,8, pro BY4742 na ph 5,0). Poté se doplní do objemu 1 litru destilovanou vodou s přidáním zbývajících látek. Po zautoklávování se přidá 1 ml směsi vitamínů a 1 ml směsi stopových prvků viz Tabulka 6. Vitamíny (objem 10 ml) stopové prvky (objem 100 ml) Niacin 4 mg H 3 BO 3 5 mg Pyridoxin 4 mg MnSO 4 4 mg Thiamin 4 mg ZnSO 4.7H 2 O 4 mg Panthotenát 4 mg FeCl 3.6H 2 O 2 mg Biotin 2 mg MoO 4.2H 2 O 2 mg Inositol 5 mg KI 1 mg CuSO 4.5H 2 O 0,4 mg kyselina citrónová 10 mg Tabulka 6: Složení směsi vitamínů a stopových prvků pro AP médium. Směsi byly sterilizovány filtrací (filtry MILLEX GP, Millipore Express, 0,22 μm uchovávány byly v mrazničce při -5 C). 33

36 Druh výsledná koncentrace typ média typ experimentu kmen kvasinek HLL 30 μg/ml YNB FluoroMAX-2 BY4742 SIGMA 1,92 mg/ml YNB reader, FluoroMAX-2 BY4742 BSM 1,535 mg/ml AP, SDF reader, FluoroMAX-2 BY4741, BY4742 CPMB 1,235 mg/ml YNB ph-optima růstu BY4742 Tabulka 7: Seznam používaných směsí aminokyselin. Zkratky jsou vysvětleny v seznamu použitých zkratek. Média se autoklávovala při 121 C po dobu 20 minut, případně filtrovala za pomoci filtrů MILLEX GP, Millipore Express s velikostí pórů 0,22 μm většinou v případě malých objemů, nestability chemikálií za vyšších teplot (konkrétně např. při potřebě zachování bezbarvé tekutiny). Směsi aminokyselin byly na základě své rozpustnosti skladovány v koncentrované podobě (BSM, HLL, CPMB) nebo přidávány k médiu a autoklávovány (SIGMA). Jak je uvedeno níže (kapitola Výsledky), buňky kultivované v médiu se směsí aminokyselin SIGMA rostly nejlépe. 7.5 Transformace kmenů Pro fluorescenční měření bylo zapotřebí připravit buňky, které si samy budou fluorescenční protein syntetizovat. Transformovaly se tedy plasmidem phl-pvt100u nesoucím gen pro phluorin fluorescenční protein. Pro transformaci kmenů byly buňky rodičovského typu a delečních mutantů kultivovány přes noc v YPG médiu do O.D. 0,6 až 0,8 na Amersham Biosciences Ultrospec 10 Cell density meter. Pro každou transformaci bylo vzato 10 ml narostlé kultury, stočilo se a promylo sterilní destilovanou vodou. Následně byly kvasinky resuspendovány do 1 ml 25 mm DTT v H 2 O. Směs se nechala po dobu 15 minut stát při pokojové teplotě, poté se stočila a promyla jedenkrát ledovou destilovanou vodou a jednou ledovým TpEB (viz Tabulka 8). Nakonec se v 200 μl ledového TpEB resuspendovala. Mezi jednotlivými úkony se nádoby s buňkami vkládaly do ledu, aby kvasinky neaktivovaly své opravné mechanismy. Takto připravené buňky se po 100 μl napipetovaly do elektroporačních kyvet (0,2 cm) a k nim se přidalo 1,27 μl zásobního roztoku plasmidu nesoucího gen pro phluorin do konečné koncentrace 1 μg/ml. Tyto kyvety se následně vložily do elektroporátoru GHT 1287-B Jouan a bylo použito napětí 625 V s délkou pulsu 25 ms. Ihned se přidalo 100 μl ledové sterilizované destilované vody a buňky se nechaly po dobu asi 15 min stát při pokojové teplotě. Poté byly buňky vysety na agarovou půdu (YNB s aminokyselinami Histidin, Leucin, Lysin) pomocí sterilních skleněných kuliček. Příprava elektroporačního pufru TpEB látka množství koncentrace [M] Výsledná koncentrace [mm] Tris 1,5 ml 1 10 MgCl 2 7,5 μl 2 0,1 sacharóza 13,86 g

37 Tabulka 8: Složení elektroporačního pufru TpEB. 1 M roztok Tris byl pomocí HCl upraven na ph 7,6. 1 M roztok Tris byl pomocí HCl upraven na ph 7,6. Jednotlivé položky (viz Tabulka 8) byly rozpuštěny do výsledného objemu 150 ml v destilované vodě. 7.6 Kapkový test Transformované buňky byly vysety na pevné půdy a nechaly se inkubovat při 30 C. Z kolonií narostlých po 2 až 3 dnech byly vybrány čtyři takové, které se nepřekrývaly, rostly odděleně, a byly přeneseny na novou misku (YNB CPMB). Pro kontrolu udržení si fenotypu transformovaných buněk bylo použito kapkového testu, byly tak testovány tři ze čtyř kultur z Petriho misky na známý (nebo předpokládaný) fenotyp. Pomocí aplikátoru typu ježek se přenesla na agarovou půdu se specifickým složením (dle fenotypu) suspenze kvasinek z mikrotitrační destičky. V destičce byly rozmíchány kvasinky ve sterilizované destilované vodě v jamkách o 100 μl objemu, s klesající hustotou buněk (viz ilustrační Obrázek 4). Nanesené suspenze buněk se nechaly zaschnout a kultury se nechaly narůst v inkubátoru při 30 C, případně 37 C. Obrázek 4: Znázornění uspořádání kapkových testů. Divoký kmen slouží jako reference. Ve spodním řádku je naznačena hustota suspenze, která byla následně nanášena aplikátorem typu "ježek" na agarové půdy. 7.7 Zamrazování kultur Vybraní zástupci úspěšně transformovaných delečních mutantů byli vyseti na samostatnou misku (YNB CPMB). Narostlé kolonie byly sterilním párátkem staženy z misky a resuspendovány ve 20 % glycerolu a zamraženy v 80 C. Tak byly uchovávány i kmeny, které byly transformovány dříve. 7.8 ph optimum růstu Pro vybrané kvasinkové mutantní kmeny bylo stanoveno ph optimum růstu. K tomuto experimentu bylo připraveno dvanáct médií (YNB) o různých hodnotách ph (orientačně od 2,5 do 8,0) viz Tabulka 9. Do mikrotitrační destičky vhodné pro 35

38 kultivace byly připraveny suspenze buněk o definované O.D. ve 12 4 jamkách (4 jamky od každé hodnoty ph). Na jedné destičce tak bylo možné současně měřit dva mutantní kmeny. Pro odečet pozadí byl vzat průměr O.D. z jamek v prvních hodinách kultivace, kdy kvasinky procházely lag-fází. Buňky byly v readeru Biotek EL808 kultivovány po dobu 24 hodin (odečet O.D. při λ = 595 nm). základ: 0,67 % YNB 2 % glukóza aminokyseliny (CPMB) pro pufrační schopnosti bylo přidáno: ph 2,5 až 5,0 bez přidání čehokoliv ph 5,5 až 6,5 20 mm MES ph 7,0 a 7,5 20 mm MOPS ph 8,0 20 mm BICINE pro úpravu ph: ph 2,5 až 6,5 titrace 10 % HCl ph 7,0 až 8,0 titrace 1 M KOH Tabulka 9: Složení pufrů pro test ph optima. 7.9 Měření fluorescence Měření cytosolického ph probíhalo na buňkách nesoucích plasmid s genem pro fluorescenční protein phluorin. Fluorescence byla měřena dvěma způsoby na dvou různých přístrojích. Jedním byl fluorometr FluoroMAX-2 s monochromátory pro emisi i excitaci, vzorky se měřily v polymetylmetakrylátových kyvetách o rozměrech 1 1 cm, vhodných pro objem 3 ml. Druhým používaným přístrojem byl HT Synergy reader, který signál omezuje pásovými filtry. Do readeru se vkládá mikrotitrační destička s 12 8 jamkami vhodnými pro objem 100 μl Příprava vzorků pro měření fluorescence Buňky pro měření cytosolického ph na spektrofluorimetru FluoroMAX-2 byly přes noc kultivovány buď v YNB nebo v AP médiu jako inokulum. Buňky rostlé v YNB byly ráno přímo z inokula přeočkovány do čerstvého média na O.D. 578 ~ 0,2 (Novaspec II). Když kultury dosáhly O.D. 578 ~ 1,0 (Novaspec II), což je hodnota odpovídající první polovině exponenciální fáze, byly buňky stočeny, promyty destilovanou vodou a resuspendovány do kyvet s pufry tak, aby výsledné O.D. 578 ~ 0, 2 na Novaspec II) viz Metody. Buňky narostlé v AP médiu se přeočkovávaly na O.D. 578 ~ 0,1 (Novaspec II) a nechaly se dorůst do O.D. 578 ~ 0,8 (Novaspec II). Buňky nebyly stáčeny, ale suspenze kvasinek byla přímo přidávána k pufrům v poměru 1:10 (objem suspenze : celkový 36

39 objem v kyvetě). Toto ředění odpovídalo hodnotám O.D ,6 až 0,8 (Novaspec II). Ukázalo se, že rozdíly v O.D. vzorku ve zmíněném rozmezí nijak výsledky neovlivňují. Tak byla připravena sada kyvet s kalibračními pufry a s citrát-fosfátovým pufrem o ph 6,0 a 8,0 pro každý kmen zvlášť. Buňky v citrát-fosfátových pufrech byly inkubovány za stálého míchání asi 2 minuty, aby se vyrovnaly se svým prostředím a z míchátka se odpojily bublinky vzduchu. Poté byly vloženy do kyvetového prostoru fluorimetru FluoroMAX-2 a byla měřena fluorescence (za stálého míchání). Fluorimetr FluoroMAX-2 Pro měření na fluorimetru FluoroMAX-2 bylo nutné buňky stočit a promýt, aby se zbavily růstového média a odpadních látek. Bylo tak činěno na centrifuze MPW-350R, při 3000 otáčkách za minutu po dobu 4 minut, při teplotě 21 C. Buňky byly stočeny celkem třikrát a dvakrát promyty destilovanou vodou. Po posledním stočení a slití supernatantu byly buňky resuspendovány v 0,5 ml destilované vody. Suspenze kvasinek byla přidávána k jednotlivým kalibračním a citrát-fosfátovým pufrům či destilované vodě tak, aby výsledná optická hustota byla podobná pro vzorky jednoho typu měření. Měření na spektrofluorimetru vyžaduje kalibraci excitačních i emisních vlnových délek. Pro účel kalibrace excitačního spektra je využíván mód měření kontrolující polohu hlavního maxima spektra xenonové lampy λ exc = 467nm a pro kalibraci emisního spektra měření polohy maxima ramanova pásu vody (při excitační λ exc = 350 nm ) λ em R = 397 nm. Software DataMax příslušející k fluorimetru umožňuje měření a zobrazování excitačních a emisních spekter a časově závislá měření libovolného množství definovaných signálů. Pro samotné měření bylo využito současného zobrazování dvou poměrů intenzit I odpovídajících vlnovým délkám λ exc (Tabulka 10, položka 3) a 4)), při emisní vlnové délce λ em = 520 nm. Jeden z nich ( I 410 / I 470 ) byl použit samotnými autory fluorescenčního proteinu (Miesenbock et al., 1998), ten druhý v článku (Brett et al., 2005) i (Martinez-Munoz and Kane, 2008). Mimo poměry byly zaznamenávány časové vývoje intenzit na dvou λ exc, taktéž viz Tabulka 10. Signál 1) I 410 2) I 405 3) I 410 / I 470 4) I 405 / I 485 Tabulka 10: Využívané výstupy softwaru při měření fluorescence na fluorimetru FluoroMAX-2 Při měřeních sledujících reakci buněk na okyselení vnějšího prostředí, bylo nutné přidat k měřeným suspenzím buněk kyselinu sírovou (do konečné koncentrace 9,9 mm). Suspenze v kyvetě byla zároveň míchána pomocí magnetického míchátka s funkcí míchání ve spektrofluorimetru. Sice se tak zvyšuje šum měření, ale je zaručena 37

40 rovnoměrná distribuce kyseliny v kyvetě. Stejným způsobem se postupovalo, byl-li k buňkám přidáván chlorid amonný - v konečné koncentraci 9,9 mm při pokusech s měřením pufrační kapacity, viz vztah (4). vzorky vzorek 1 vzorek 2 vzorek 3 vzorek 4 vzorek 5 vzorek 6 kalibrační pufry ph 5,25 ph 5,50 ph 5,75 ph 6,00 ph 6,25 ph 6,50 ph 6,75 ph 7,00 ph 7,25 ph 7,50 ph 7,75 ph 8,00 Tabulka 11: Schématické znázornění mikrotitrační destičky používané pro měření v readeru. Jednotlivé jamky jsou záměrně sloučeny ve čtveřici (kalibrace), případně osmici (vzorky). HT Synergy Reader Pro měření na Readeru HT Synergy se používaly průhledné mikrotitrační destičky s 96 jamkami. Do jamek se napipetovalo dávkovacími pipetami (Eppendorf Research Pro) 100 μl pufru (ať už kalibračního nebo citrát-fosfátového) a 5 μl suspenze kvasinek o dané optické hustotě (O.D ,0 - Amersham). Na každou destičku se pipetoval právě jeden kmen. Polovinu destičky zabírají kalibrační pufry, od každé hodnoty ph čtyři jamky. Schématicky destičku znázorňuje Tabulka 11. Pomocí softwaru Gen 5 byla definována sekvence měření destičkou bylo po vložení zatřeseno, byl odečten signál na 400 nm (pás o šířce 30 nm) a následně signál na 485 nm (pás o šířce 20 nm). Při λ em 516 nm (o šířce 20 nm). Software umožňuje automatické zpracování dat, kdy se předdefinuje, které jamky obsahují buňky pro kalibrační křivku a které jsou samotnými vzorky. Kalibrační křivka je automaticky prokládána polynomem 3. stupně Kalibrační pufry Kalibrační pufry byly připravovány dle (Brett et al., 2005); ze složení, které článek uvádí byly záměrně vypuštěny ionofory 6. Tabulka 12 uvádí seznam chemikálií použitých k přípravě kalibračních pufrů. Kalibrační pufry byly skladovány v chladničce. Kalibrováno bylo proložením sigmoidy závislostí R 410/470 na ph. Pomocí funkce Řešitel v programu EXCEL byly minimalizovány kvadratické odchylky závislosti od fitu. Použita byla rovnice sigmoidy analogická Hillově rovnici (6): nh I max ph R410 / 470 = + konst, (6) nh nh K + ph 0,5 kde n H, I max, K 0,5 a I max jsou parametry fitu (z konst a Imax lze určit extrémní hodnoty R 410/470, K 0.5 má vztah k poloze inflexního bodu sigmoidy a n H je analogií Hillova 6 Jejich přidání neovlivňuje měřený fluorescenční poměr, ph ext a ph in lze tedy považova za vyrovnané i bez ionoforů. 38

41 koeficientu). Zpětně lze z kalibrace pro daný kmen získat jenotlivé hodnoty ph cyt daného kmene ze vztahu: ph R konst 470 = K nh 410 / 0,5. (7) I max + konst R410 / 470 chemikálie koncentrace [mm] množství [g/l] MES 50 mm 10,66 HEPES 50 mm 11,9 ammonium acetát 200 mm 15,4 KCl 50 mm 3,73 NaCl 50 mm 2,92 2-deoxy-D-glukóza 10 mm 1,64 azid sodný 10 mm 0,65 Tabulka 12: Složení kalibračních pufrů. Látky uvedené v tabulce se rozpustily v destilované vodě. Pro některá měření bylo místo destilované vody použito přímo růstové médium. Po rozpuštění všech složek roztoku bylo upravováno ph na požadované hodnoty pomocí NaOH a HCl Citrát-fosfátové pufry Pro měření cytosolického ph byly použity 30 mm fosfátové pufry, jejichž ph bylo přidáváním kyseliny citrónové upravováno na ph 6,0 a 8,0. Připraveny byly dvě varianty: sodný Na 2 HPO 4 a draselný K 2 HPO 4. Skladovány byly v chladničce při 4 C Seznam použitých chemikálií účel látka výrobní název, výrobce Pro pěstování Yeast Synthetic Drop out Medium Supplement aminokyseliny BY4742 Without Uracil, SIGMA médium chudé na Formedium, Yeast Nitrogen base without amino Pro pěstování draslík (SDF) acids, ammonium sulfate and potassium BY4741 BSM Ura BSM Ura, Formedium, UK ammonium acetát Ammonium acetát, SigmaUltra, minimum 98 %, SIGMA Kalibrační HEPES HEPES 99,5 %, SIGMA pufry MES MES, low moisture content, SIGMA azid sodný Sodium azide, SigmaUltra, SIGMA deoxyglukóza 2- Deoxy-D-glucose, Grade II, min 98 %, SIGMA případně 2 -Deoxy -D -glucose, FLUKA Pro Tris Trizma Base, SIGMA transformaci DTT dithiothreitol, SIGMA MES MES, low moisture content, 99 %, SIGMA MOPS (3 [N Morpholino] - propanosulfonic Pro testy ph MOPS acid, minimum 99,5 %, SIGMA optima BICINE, SigmaUltra, minimum 99 % titration, BICINE SIGMA Tabulka 13: seznam použitých látek. 39

42 8. Výsledky a diskuze Jak je uvedeno v Kapitole 7.1, k měření byly použity kvasinky Saccharomyces cerevisiae kmeny BY4742 a BY4741 v různých mutačních formách. V rámci diplomové práce byly vybrané mutantní kmeny rodičovského typu BY4742 transformovány plasmidem phl-pvt100u nesoucím gen pro phluorin. Poté bylo nutné zkontrolovat, zda transformované kmeny skutečně nesou plasmid a zda si udržely svůj fenotyp. Kvasinky pozorovány pod mikroskopem, zda je fluorescence lokalizována pouze v cytoplazmě, a dle známých fenotypů se prováděly kapkové testy. Pro každý ověřený mutantní kmen pak byly proměřeny další charakteristiky jako je růstová křivka a ph-optimum růstu. Samotná měření cytosolického ph probíhala nejen na kmenech, které byly transformovány v rámci diplomové práce, ale i na dalších kmenech transformovaných v předchozích letech. rodičovský typ BY4742 chybějící protein funkce umístění v buňce wt kha1 K + /H + antiport u Golgiho aparátu ypt6 malá GTP-áza u Golgiho aparátu trk1 K + (H +?) do buňky plazmatická membrána arl1 malá GTP-áza v cytosolu tok1 K + kanál plazmatická membrána trk2 K + (H +?) do buňky plazmatická membrána vnx1 K +, Na + /H + antiport vakuola Na + - K + - C1 ybr235w kotransport plazmatická membrána mkh1 K + /H + antiport vnitřní membrána mitochondrií BY4741 nha1 K +, Na + /H + antiport plazmatická membrána nhx1 Na + /H + antiport vakuola wt Tabulka 14: Seznam použitých kmenů. Kmeny, které jsou zvýrazněny šedě jsou ty, které byly transformovány v rámci diplomové práce. Kmeny zvýrazněné tučným písmem byly dále používány v experimentech, u ostatních kmenů se nepodařilo ověřit fenotyp. Tyto kmeny byly zamraženy, více výše, v kapitole Metody. 8.1 Transformace Transformace kmenů plasmidem nesoucím gen pro phluorin probíhala tak, jak je popsáno v Kapitole 7.5. Plasmid pvt100u (se silným konstitutivním promotorem ADH1) nese nejen gen pro fluorescenční protein, ale i pro Ura3, na jehož základě jsme schopni selektovat buňky nesoucí plasmid od buněk plasmid postrádající - v médiích 40

43 a na půdách bez uracilu. Tabulka 14 uvádí seznam používaných mutantních variant rodičovských kmenů. 8.2 Kapkové testy Po transformaci bylo nutné ověřit, zda si buňky udržely svůj vlastní fenotyp, zda nedošlo ke kontaminaci apod. Kapkové testy byly provedeny tak, jak je uvedeno v kapitole 7.6. Testované fenotypy pro jednotlivé kmeny uvádí Tabulka 15. testovaný fenotyp literatura uvádějící fenotyp horší růst při ph 8,0 ústní sdělení Mgr. Lýdie Marešová arl1δ (nepufrované) Ph.D. horší růst při vyšší teplotě 37 C nebylo publikováno kha1δ horší růst při ph 7,0, pufrováno MES (Maresova and Sychrova 2005) horší růst s glycerolem jako zdrojem C mkh1δ horší růst při vyšší teplotě 37 C nebylo publikováno horší růst při ph 7,5 (nepufrované) trk1δ horší růst na 2 mm KCl oproti 50 mm (Ramos et al., 1994) horší růst s glycerolem jako zdrojem C vnx1δ horší růst při vyšší teplotě 37 C nebylo publikováno horší růst při 2 mm KCl horší růst při ph 7,5 (nepufrované) horší růst s glycerolem jako zdrojem C ybr235wδ horší růst při vyšší teplotě 37 C nebylo publikováno horší růst při ph 7,5 (nepufrované) ypt6δ horší růst při vyšší teplotě 37 C (Liu et al., 2006; Ali, 2004) Tabulka 15: Seznam testovaných fenotypů a jejich úspěšnost ( ). Kontrolní miska byla připravena z YNB (bez úpravy ph) a byla kultivována při 30 C. Při testu trk1δ obsahovala kontrolní miska 50 mm KCl. U těch transformovaných mutantních kmenů, kde fenotyp znám nebyl, byly kapkové testy provedeny na všechny testované fenotypy viz Tabulka 15. Za všech podmínek rostly mutantní kmeny bez známého fenotypu srovnatelně s divokým kmenem. I přes neznalost fenotypu daného kmene, nelišil-li se žádný ze tří zástupců kolonií, byl jeden z nich zamražen (pro budoucí zkoumání). 41

44 Např. u trk1δ mutantů je fenotyp dobře znám, při nedostatku K + v médiu trpí horším růstem (Ramos et al., 1994). V kapkových testech provedených právě na trk1δ se potvrdilo, že při 50 mm KCl se buňkám daří výrazně lépe, než při 2 mm (Obrázek 5). trk1δ: kontrolní miska, 50 mm KCl trk1δ: miska s 2 mm KCl Obrázek 5: Příklad kapkového testu zde proveden na delečním mutantu trk1δ kmene BY4742. Oranžově orámovaný je divoký kmen jako vzor. V dalších třech řádcích jsou tři zástupci z transformovaných mutantů, spořádání odpovídá schímatu v Kapitole 7.6. Mimo to byly všechny transformované kmeny zkontrolovány pod mikroskopem. (Olympus AX70). Ve všech kmenech se fluorescenční protein vyskytoval mimo vakuoly. Obrázek 6: Vybraný pár z mikroskopu Olympus AX70 prezentuje přítomnost phluorinu mimo vakuoly (vakuoly jsou zřetelně viditelné i v nomarského zobrazení) trk2δ kmene BY4741. A) Nomarského zobrazení B) Fluorescenční zobrazení, excitace nm, emise bariérovým filtrem nad 515 nm. U obou zobrazení byl dodatečně upraven kontrast. 8.3 Stanovení ph optima růstu Většina transformovaných kmenů byla testována na své ph optimum. Experimenty byly prováděny dle protokolu popsaného v kapitole 7.8. Tento test ukazuje na optimální ph, kdy se danému kmenu daří nejlépe a naopak v jakém rozmezí ph neroste vůbec. Ukazuje se, že růst všech testovaných kmenů v YNB je limitován zhruba hodnotami 2,5 a 7,7 ph (Obrázek 7). Při vyšších hodnotách ph (nad 6,5) je zhoršen růst kmene kha1δ, což se shoduje s již publikovanými výsledky (Maresova and Sychrova 2005) i s výsledky provedených kapkových testů (viz Kapitola 8.2). Další mírný pokles 42