1. ÚVOD A PROBLEMATIKA

Rozměr: px
Začít zobrazení ze stránky:

Download "1. ÚVOD A PROBLEMATIKA"

Transkript

1 1. ÚVOD A PROBLEMATIKA 1.1. CYTOCHROMY P450 Cytochromy P450 (CYP) jsou biotransformační enzymy odpovědné za detoxikaci a eliminaci organických cizorodých látek (xenobiotik). Jsou zahrnuty v oxidativním metabolismu endogenních i exogenních molekul. Mezi endogenní substráty patří steroidy, mastné kyseliny, prostaglandiny, leukotrieny a biogenní aminy. Exogenní substráty zahrnují rostlinné toxiny, léčiva a karcinogeny. Enzymy CYP provádějí redukci, C-, N-, S- hydroxylaci, dealkylaci, dehalogenaci a deaminaci molekul substrátů (více na Účastní se první fáze metabolismu a eliminace endogenních a exogenních molekul a přijatých látek. Oxidací přeměňují tyto látky na elektrofilní meziprodukty, které jsou dále enzymy druhé fáze konjugovány na hydrofilní deriváty vylučované močí (OMIM ) Cytochrom P450 2D6 Cytochrom P450 2D6 (CYP2D6), tzv. debrisoquin 4-hydroxyláza, patří mezi nejvíce studované biotransformační enzymy. Je zahrnut v metabolismu asi 100 léčiv. Jedná se o některá antidepresiva, neuroleptika, beta blokátory, antiarytmika a další (Caraco, 2004). Aktivita enzymu se mezi jednotlivci liší. Populaci proto můžeme rozdělit do 4 hlavních skupin pomalí metabolizátoři (PM), intermedierní metabolizátoři (IM), efektivní metabolizátoři (EM) a ultrarychlí metabolizátoři (UM). PM nemají žádnou enzymovou aktivitu, IM sníženou, EM normální a UM mají extrémně zvýšenou enzymovou aktivitu. Frekvence jednotlivých fenotypů v kavkazské populaci je následující: UM 3-5%, EM 70-80%, IM 10-15%, PM 7-10% (Denson aj., 2005) Genetický polymorfismus CYP2D6 Rozdílná metabolická aktivita enzymu mezi jedinci je dána polymorfismem genu CYP2D6. Doposud bylo popsáno více než 100 alel. Jejich kompletní seznam je volně přístupný na adrese Systematická nomenklatura byla zavedena v r Alely, které sdílejí stejnou klíčovou mutaci, tj. sekvenční změnu s významným funkčním efektem nebo sekvenční změnu vedoucí ke změně aminokyseliny, se označují stejným číslem (např. *6). Písmeny jsou 1

2 rozlišeny další varianty alel, které mají stejnou klíčovou mutaci, ale různé doplňkové sekvenční změny s minoritním funkčním významem (např. *6A, *6B, *6C, *6D). U běžných alel je znám jejich vliv na fenotyp, který byl stanoven na základě korelace fenotypu s genotypem při studiích in vivo, při studiích vzorků z lidských jater nebo pomocí rekombinantního expresního systému (Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004). CYP2D6*1 je alela se standardní sekvencí genu, tzv. wild type (wt). Stejně jako některé další alely (*2, *33, *35) kóduje protein s normální enzymatickou funkcí, zatímco jiné alely kódují enzym buď s redukovanou aktivitou, neaktivní enzym nebo dokonce může výsledný produkt úplně chybět (Juřica, 2004). Přestože existuje velké množství alel, většina z nich se v lidské populaci vyskytuje vzácně. Nejčastější jsou alely *1, *2, *4, *5, *10, *17 a *41 (Ingelman-Sundberg, 2005). Gen CYP2D6 vykazuje značnou interetnickou variabilitu. Frekvence jednotlivých alel se mezi populacemi liší, existují dokonce alely typické jen pro určité populace (Bertilsson aj., 2002). Například CYP2D6*17 se prakticky vůbec nevyskytuje u bělochů a Asiatů, zato v Africe její frekvence dosahuje až 35% (Ingelman-Sundberg, 2005) Nulové alely Souhrnně jsou označovány jako CYP2D6*0. Kódují nefunkční protein. V homozygotním stavu způsobují fenotyp pomalého metabolizátora (fenotyp PM se tedy dědí jako autozomálně recesivní znak). Je známo několik mechanismů, které vedou ke ztrátě funkce proteinu: - bodové mutace (substituce, delece, inzerce), které narušují čtecí rámec, zasahují do správného sestřihu nebo vedou k předčasné terminaci translace (např. alely *3, *4, *6, *8, *11, *15, *19, *20, *38, *40, *42, *44). - velké chromozomové delece (alely *5, *13, *16). - mutace vedoucí ke ztrátě funkce proteinu přičemž jeho délka zůstává zachována (např. alely *7, *12, *14, *18) (Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004). V kavkazské populaci je nejčastější nulovou alelou *4 s frekvencí 12-21%. U Asiatů se vyskytuje s frekvencí 1% a v Africe s frekvencí 1-4% (Ingelman-Sundberg, 2005). Klíčovou mutací je zde 1846G>A. Tato tranzice změní konsensuální akceptorové místo GA na 3 konci intronu 3. Následkem je nesprávný sestřih, mrna s pozměněným čtecím rámcem a předčasná terminace translace (Kagimoto aj., 1990; Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004). 2

3 Alela *5 se ve všech populacích vyskytuje s frekvencí 2-7% (Ingelman-Sundberg, 2005). Je dána rozsáhlou delecí (asi 17,5 kb) v lokusu CYP2D, kdy dojde ke ztrátě celého genu CYP2D6 (Jong aj., 2005) (obr. 1). Obr. 1: Restrikční mapa lokusu CYP2D s delecí genu CYP2D6. B = BamHI; E = EcoRI; K = KpnI (podle Gaedigk aj., 1991). Alely *13 a *16 jsou 5 -CYP2D7P/CYP2D6-3 hybridní geny, které vzniknou delecí různých částí lokusu CYP2D. Alela *13 je hybrid CYP2D7P(exon 1)/CYP2D6(exony 2-9) (Panserat aj., 1995). Alela *16 je hybrid CYP2D7P(exony 1-7)/CYP2D6(exony 8-9) (Daly aj., 1996). Obě alely se vyskytují vzácně Alely spojené se sníženou enzymovou funkcí Tyto alely kódují enzym s redukovanou aktivitou. V homozygotním stavu nebo spolu s nulovou alelou v heterozygotním stavu způsobují fenotyp IM. Patří sem např. CYP2D6*9, *10, *17, *36, *41 (Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004). Nejběžnější alelou u Asiatů je *10 s frekvencí 50-70%. V kavkazské populaci se vyskytuje s frekvencí 1-5% a u Afričanů s frekvencí 3-9%. Klíčovou mutací je 100C>T, která vede k záměně prolinu v poloze 34 za serin. Tato mutace naruší důležité místo ve struktuře proteinu, které je nezbytné pro jeho sbalení. Enzym je proto velmi nestabilní a má sníženou afinitu k substrátu (Ingelman-Sundberg, 2005; Ji aj., 2002; Zhuge, Yu a Wu, 2004). Mutace 100C>T se vyskytuje i v jiných alelách jako doplňková mutace Alely spojené se zvýšenou enzymovou funkcí Molekulární podstatou vysokých hladin proteinu je zvýšený počet aktivních genových kopií. Zmnoženy bývají alely *1, *35, ale nejčastěji je to *2 (Steijns a Weide, 1998; Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004). Frekvence genové duplikace je v kavkazské populaci 1-5%, v Asii 0-2% a v některých oblastech Afriky dokonce 10-16% (Ingelman-Sundberg, 2005). 3

4 Vznik duplikace je spojen se vznikem delece. Následkem homologní nepravidelné rekombinace je vznik alely s duplikací CYP2D6 a alely s delecí CYP2D6 (obr. 2). V dalších generacích se duplikované a deletované alely dědí samostatně (Ledesma a Agúndez, 2005). Obr. 2: Mechanismus vzniku alel s duplikací a delecí genu CYP2D6. Při nerovnoměrném homologním crossing-overu se uplatňují 2,8 kb dlouhé přímé repetice (podle Løvlie aj., 1996) Klinické důsledky polymorfismu CYP2D6 Variabilita v aktivitě CYP2D6 vede k individuálním rozdílům v terapeutické účinnosti léčiv. PM nejsou schopni metabolizovat substráty CYP2D6, a proto při běžně podávané dávce mají ve srovnání s EM vyšší koncentrace léku v plasmě. To má za následek zvýšené riziko předávkování a výskytu vedlejších efektů. Na druhé straně, u UM je koncentrace léku v plasmě mnohem nižší než je terapeuticky účinná koncentrace, a proto u nich nedochází k žádné terapeutické odpovědi (obr. 3). Léčivo nemusí být vždy přijaté jako aktivní sloučenina, ale také jako tzv. prekurzor léku, který vyžaduje metabolickou aktivaci. Typickým příkladem je kodein. PM nejsou schopni aktivovat tato léčiva a naopak u UM dochází k extrémní aktivaci těchto léčiv. Individuální rozdíly v metabolismu léčiv mohou být částečně kompenzovány úpravou dávky léku. Výběr léku a dávkování by mělo být individuální a mělo by pomoci vyvarovat se nežádoucím reakcím nebo terapeutickému selhání. Nicméně, klinický význam polymorfismu pro konkrétní léky není vždy jasný a závisí na několika faktorech. Enzym nemusí vždy metabolizovat veškeré množství léku. Pokud metabolismus zprostředkovaný polymorfním enzymem hraje pouze minoritní roli v celkové eliminace léku nebo pokud existuje alternativní metabolická cesta, efekt polymorfismu je zanedbatelný. Problematické jsou léky s nízkým terapeutickým rozsahem. Na základě všech 4

5 těchto kritérií je polymorfismus CYP2D6 velmi důležitý u tricyklických antidepresiv, některých antipsychotik a kardiovaskulárních léčiv (Weide a Steijns, 1999). Obr. 3: Vztah genotyp fenotyp, farmakokinetika a klinické důsledky. Nulové alely jsou vyjádřeny prázdnými boxy, normální alely černými boxy a alely se sníženou funkcí šrafovanými boxy. Alela bez boxu představuje genovou deleci. Grafy znázorňují koncentraci léku v plazmě v závislosti na čase. Šedými boxy je v grafu znázorněna koncentrace léku odpovídající optimální terapeutické odpověďi (podle Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004) Struktura lokusu CYP2D Lokus CYP2D o délce asi 45 kb se u člověka nachází na dlouhém raménku chromozomu 22. Skládá se ze tří homologních genů - CYP2D8P, CYP2D7P (GenBank; accession number M33387) a CYP2D6 (GenBank; accession number M33388), uspořádaných v tandemu. CYP2D8P je pravý pseudogen. Jeho exony obsahují mnoho delecí a inzercí a terminační kodony. Nemá otevřený čtecí rámec (Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004; Panserat aj., 1995). Pseudogen CYP2D7P je velmi podobný genu CYP2D6, sekvenční homologie je 97% (Kagimoto aj., 1990). Leží mezi CYP2D8P a CYP2D6 (obr. 1). Jeho kódující sekvence obsahuje pouze jednu inaktivující mutaci, inzerci T138 v prvním exonu, která mění čtecí rámec a má za následek předčasnou terminaci translace (Panserat aj., 1995). Bylo zaznamenáno více variant pseudogenů, lze je dále rozlišovat na CYP2D7P1, CYP2D7P2, CYP2D8P1 a CYP2D8P2 (Denson aj., 2005). Gen CYP2D6 byl poprvé izolován v r z lidské cdna knihovny pomocí krysích protilátek a následně somatickou hybridizací lokalizován na chromozom 22. Přesná poloha na 5

6 chromozomu 22q13.1 byla určena v r metodami somatické hybridizace, in situ hybridizace a vazebné analýzy (OMIM ). Gen CYP2D6 se, stejně jako ostatní členové CYP2D lokusu, skládá z 9 exonů a 8 intronů. Je dlouhý bp (Kimura aj., 1989), mrna má 1655 bp (více na Gen CYP2D6 je lemován dvěma dlouhými přímými repeticemi délky 2,8 kb (CYP- REP). CYP-REP obsahuje Alu-element a tandemově uspořádanou 10 bp dlouhou přímou repetici, tj. sekvence, které se mohou uplatnit při homologní rekombinaci (Løvlie aj., 1996). V lokusu CYP2D byla také pozorována genová konverze, a to mezi CYP2D7P a CYP2D6 a mezi CYP2D8P a CYP2D7P (Kagimoto aj., 1990) Protein CYP2D6 Protein CYP2D6 je složený ze 497 aminokyselin. Patří do skupiny enzymů obsahujících železo. Trojrozměrná struktura byla odhalena v r (Rowland aj.). Substráty pro CYP2D6 jsou lipofilní báze s protonovaným atomem dusíku a s planární strukturou. Ve vzdálenosti 5 až 7 Å od dusíku dochází k hydroxylaci. Experimenty prováděné místně řízenou mutagenezí ukázaly, že za vazbu dusíku je zodpovědný negativně nabitý asparagin v poloze 301 (Ingelman-Sundberg, 2005; Rathbone aj., 2005; Rowland aj.,2006). CYP2D6 je exprimován v mozku, v plicích, v prsní tkáni, v močovém měchýři, v enterocytech, nejvíce však v jaterních hepatocytech, kde se uplatňuje při metabolismu přijatých sloučenin. Exprese CYP2D6 není regulována žádným environmentálním faktorem, není ani indukována žádným hormonem. Inhibice enzymu možná je. Mnoho léků, které slouží jako substráty pro CYP2D6, ale i léky, které nejsou metabolizovány CYP2D6, jsou jeho možnými kompetitivními inhibitory. Může dojít k interakci mezi léčivy a ke kompletní blokádě metabolismu některého léku. In vivo pak pozorujeme změnu fenotopu, např. z EM na PM. Tento jev se označuje jako fenokopie a byl pozorován u léčiv jako jsou quinidin, flecainidin, paroxetin, fluoxetin nebo fluvoxamin. Fenokopie představují velký problém hlavně v psychiatrii, protože mnoho antidepresiv a antipsychotik jsou zároveň možnými inhibitory CYP2D6 (Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004) STANOVENÍ FENOTYPU IN VIVO Metabolické schopnosti jedince se in vivo zjišťují po podání testovací látky na základě tzv. metabolického poměru (MR). Jako testovací látky se používají substráty pro CYP2D6, nejčastěji je to dextrometorfan (tzv. dextrometorfanový test). MR je definován jako poměr 6

7 koncentrace podaného léku (dextrometorfan) ke koncentraci jeho metabolitů (dextrorfan), které se objeví v moči během určité doby od podání testovací látky. Koncentrace obou látek se stanovují pomocí chromatografických metod. Zjištěný MR přiřadí testovaným osobám typ metabolismu (Zanger, Raimundo a Eichelbaum, 2004; Chou aj., 2003) MOLEKULÁRNĚ GENETICKÁ DETEKCE ALEL CYP2D6 Defektní alely byly zpočátku identifikovány metodou analýzy délky restrikčních fragmentů (RFLP) s následným Southernovým přenosem. Skoda aj. (1988) testovali DNA PM a EM. Nalezli asociaci některých restrikčních fragmentů s fenotypem PM. Změny byly následně stanoveny na sekvenční úrovni (Nobumitsu, 1990). Kagimoto aj. (1990) některé mutantní alely klonovali a sekvencovali a pomocí exprese chimerických genů studovali funkční význam jednotlivých mutací. RFLP využili i další autoři, někteří analýzu dále upravili na PCR-RFLP a rozšířili ji na více alel (Sachse aj., 1997). Broly aj. (1995) vyvinuli vyhledávací metodu jednovláknového konformačního polymorfismu (SSCP), pomocí které mohly být nalezeny známé i neznámé mutace v genu CYP2D6. Testováním této metody ve velké populaci objevili Marez aj. (1997) několik nových polymorfismů. K rychlé identifikaci sekvenčních změn zavedli Daly aj. (1995) alelově specifickou polymerázovou řetězovou reakci (AS-PCR) s použitím primerů tvořících na 3 konci mismatch. Hersberger aj. (2000) tuto metodu dále upravili na tetra-primer PCR assay. Nejdříve je specificky amplifikován gen CYP2D6, který slouží jako templát pro následnou AS-PCR. Obě reakce probíhají v jediné zkumavce. Výhodou této metody je minimální riziko kontaminace, falešně negativní výsledky jsou vyloučeny díky amplifikaci genu CYP2D6, který slouží i jako kontrolní fragment. Syntéza dlouhých úseků (long-pcr) se využila pro amplifikaci celého genu CYP2D6 (Sachse aj., 1997) a pro detekci strukturních přestaveb jako jsou delece (Daly a Steward, 1995), duplikace (Løvlie aj., 1996) a hybridní geny (Panserat aj., 1995; Daly aj., 1996). Mezi moderní metody DNA diagnostiky patří PCR v reálném čase. Stamer aj. (2002) využili PCR v reálném čase s následnou analýzou bodu tání fluorescenčně značených sond pro detekci pěti nulových alel (*3, *4, *6, *7 a *8). Ve své práci se také zaměřili na srovnání této metody s AS-PCR. PCR v reálném čase je rychlejší, nevyžaduje další procedury jako např. gelovou elektroforézu, odpadá práce s toxickými činidly (ethidium-bromid, akrylamid), riziko kontaminace vzorků je minimální. Nevýhodou je vyšší cena reagencií a potřeba nalézt 7

8 optimální podmínky reakcí pro jednotlivé sekvenční změny. AS-PCR vždy neposkytuje jasné výsledky, na gelu se někdy vyskytuje více nežádoucích produktů. Jako kvantitativní metodu využili Bodin, Beaune a Loriot (2005) PCR v reálném čase s TaqMan sondami. Jako referenční použili gen pro ribonukleázu P, který amplifikovali společně s genem CYP2D6. Na základě relativního poměru těchto dvou produktů stanovili počet kopií genu CYP2D6. James aj. (2004) využili k detekci alel CYP2D6 přímé sekvencování. Nejdříve ve dvou reakcích syntetizovali 2 úseky zahrnující exony 3-6 a tyto úseky následně sekvencovali. Hlavní výhody jsou podle autorů zachycení všech sekvenčních změn ve vybraných úsecích, jednoduchost, spolehlivost a snadná interpretace. Sekvencování je považováno za referenční metodu, která nevyžaduje kontrolní materiál a je vhodná pro analýzu jednoho ale i několika vzorků. Sistonen aj. (2005) navrhli nový způsob detekce mutací genu CYP2D6 založené na kombinaci PCR a mnohonásobné extenze primerů s fluorescentně značenými ddntp (SNaPshot ; Applied Biosystems). Metoda je přesná, rychlá a snadná na provedení. Výhodou je detekce několika mutací současně v jediné reakci a dále možnost zvyšování počtu detekovaných mutací. V roce 2004 byl na evropský trh uveden testovací přístroj AmpliChip CYP450 (obr. 4). Jedná se o první farmakogenetický čip na světě určený pro využití v běžné lékařské praxi. Byl vytvořen ve spolupráci Roche a Affymetrix. Čip umožňuje detekci 29 známých polymorfismů genu CYP2D6, včetně genové duplikace a genové delece, a dvou hlavních polymorfismů genu CYP2C19. Výsledkem analýzy je počítačově zpracovaný protokol s předpokládaným fenotypem pacienta (více na Heller aj. (2006) porovnali výsledky analýzy pomocí AmpliChip CYP450 s jinými metodami. Zjistili, že analýza pomocí čipu je rychlá a spolehlivá. Nevýhodou čipu je však jeho vysoká cena. 8

9 obr. 4: Struktura čipu ( OBLASTI VYUŽITÍ Léčba rakoviny N-desmethyltamoxifen je hlavní primární metabolit tamoxifenu, využívaného při léčbě rakoviny prsu. Reakcí zprostředkovanou CYP2D6 je dále hydroxylován na endoxifen, který má značnou antiestrogenní aktivitu. Koncentrace endoxifenu v plasmě je výrazně nižší u PM ve srovnání s EM a také u EM, kteří užívají léky inhibující aktivitu CYP2D6. CYP2D6 metabolismus a jeho inhibitoři tedy ovlivňují výsledek léčby u žen užívajících tamoxifen v časných stádiích rakoviny prsu (Borges aj., 2006; Goetz aj., 2007). Také působení některých antiemetik je závislé na CYP2D6 genotypu. Žádný léčebný efekt nebyl pozorován u pacientů nesoucích více aktivních kopií genu (Ingelman-Sundberg, 2005) Psychiatrie Metabolismus asi 50% běžně užívaných antipsychotik je závislý na CYP2D6 genotypu. Počet nepříznivých efektů je vyšší u PM než u EM. Při užívání antipsychotik se objevují vedlejší efekty spojené s kardiovaskulárním systémem, např. arytmie nebo prodloužení QT intervalu. U PM jsou tudíž větší náklady na léčbu a doba trvání léčby je také delší (Dorado aj., 2006; Ingelman-Sundberg, 2005). 9

10 Při léčbě schizofrenie byla pozorována závislost sedativního účinku léků na genotypech pacientů. Ukázalo se, že odbourávání haloperidolu je spojeno s počtem aktivních genových kopií (Ingelman-Sundberg, 2005). Vztah PM a pseudoparkinsonismu byl vyšetřován v několika studiích. Riziko vzniku parkinsonismu jako vedlejšího efektu při léčbě antipsychotiky je u PM vyšší než u EM (Ingelman-Sundberg, 2005). Asi polovina antidepresiv je metabolizována prostřednictvím CYP2D6. U PM bývají vlivem předávkování pozorovány vedlejší efekty. Častým problémem při léčbě antidepresivy jsou pacienti nereagující na léčbu. Nedostatek odpovědi je typickým jevem UM (Ingelman- Sundberg, 2005) Kardiovaskulární onemocnění Monohydroxylace perhexilinu, léku na anginu pectoris, je zprostředkována CYP2D6 s aktivitou 100x nižší u PM než u EM. Perhexilin způsobuje v závislosti na jeho koncentraci v plasmě hepatotoxicitu a periferní neuropatii. Na základě znalosti genotypu lze pacientům stanovit optimální dávky a vyloučit tak riziko toxicity (Ingelman-Sundberg, 2005). Metoprolol patří do skupiny beta blokátorů metabolizovaných CYP2D6. U skupiny pacientů, kterým byl podáván tento lék a objevily se u nich závažné vedlejší efekty, byl při retrospektivní studii stanoven genotyp. U těchto pacientů se ukázala 5x vyšší frekvence PM ve srovnání s kontrolní skupinou (Ingelman-Sundberg, 2005). Ismail a Teh (2006) studovali význam CYP2D6 polymorfismu při dlouhodobém užívání metoprololu u pacientů s onemocněním kardiovaskulárního systému. Koncentrace léku v plasmě se mezi pacienty výrazně lišila, nejvyšší byla u PM. Autoři uvádějí, že znalost genotypu je obzvlášť důležitá pro počáteční dávkování. Pro další sledování průběhu léčby je možné využít MR Rekreační drogy MDMA (3,4-methylendioxymethamphetamin, extáze) je prostřednictvím CYP2D6 demetylován na HHMA (3,4-dihydroxymethamphetamin). HHMA způsobuje neurotoxicitu v CNS. Torre aj. (2005) srovnali metabolismus MDMA u PM a EM. Farmakokinetika MDMA a HHMA se liší podle genotypů a má vliv na rozvoj akutní a dlouhodobé toxicity. 10

11 Molekulární epidemiologie CYP2D6 genotyp bývá vyšetřován s ohledem na riziko vzniku rakoviny a různých onemocnění. PM jsou delší dobu vystaveni toxickým efektům přijatých sloučenin než EM. Předpokládá se, že jsou proto náchylnější ke vzniku rakoviny. Naopak při metabolické aktivaci prokarcinogenů jsou většímu riziku vystaveni EM a UM. Jong aj. (2005) vyšetřovali polymorfismy několika genů ve vztahu s rakovinou prsu. Pro CYP2D6 nalezli u PM vyšší riziko vzniku rakoviny prsu. U EM byla také nalezena vyšší incidence rakoviny plic, jater a močového měchýře (Lavandera aj., 2006). Někteří autoři předpokládají vliv CYP2D6 na vzniku Parkinsonovy nemoci. Bialecka aj. (2007) však při asociační studii Parkinsonovy nemoci a polymorfismů 4 kandidátních genů tuto hypotézu nepotrvrdili. Lavandera aj. (2006) se zabývali CYP2D6 polymorfismem u pacientů s porfyrií, dědičnou poruchou metabolismu porfyrinu. Při testování alel *3 a *4 se ukázalo, že mohou být spojeny se vznikem nemoci. Genotyp CYP2D6 se ukázal být dobrým prediktorem metabolických schopností jedinců, a je proto spojen s vedením farmakoterapie či s odhadováním kancerogeneze. Znalost genotypu CYP2D6 může vysvětlit individuální metabolické rozdíly a předejít terapeutickému selhání. Genetický polymorfismus CYP2D6 je proto středem zájmu mnohých farmakogenetiků a jeho znalost směřuje k individualizované medicíně. 11

12 2. CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE Cílem diplomové práce bylo zavedení vyšetření alel CYP2D6 pomocí přímého sekvencování a long PCR u pacientů s depresivními a úzkostnými poruchami (ve spolupráci s LF MU Brno a Psychiatrickou klinikou FN Brno) s následnou možností porovnání výsledků získaných dextrometorfanovým testem a molekulárně genetickou detekcí. Molekulárně genetická detekce alel CYP2D6 bude mít do budoucna velký význam pro úpravu dávek aplikovaných léčiv u pacientů. Úspěšné zpracování diplomové práce předpokládá: - umět pracovat s dostupnými zahraničními literárními údaji k danému tématu. - zvládnout molekulárně genetické metody, potřebné pro uvedenou diagnostiku. - na základě nalezených sekvenčních změn v jednotlivých exonech genu a na základě nalezených strukturních variant genu CYP2D6 přiřadit správně popsané alely a stanovit genotyp pacienta. - správně interpretovat získané výsledky. 12

13 3. MATERIÁL A METODY 3.1. PŘÍSTROJE Automatické sekvenátory: ABI PRISM 310 ABI PRISM 3100 Centrifugy: Eppendorf mini Spin plus Eppendorf 5410 Jouan MR 22i Heraus SEPATECH Varifuge 20RS Mikrocentrifuga MiroGene Labnet International, Inc.Minicentrifuge C-1200 Elektroforetické aparatury: Hoefer Scientific Instrument Scie-Plas Spektrofotometr: UV/VIS Perkin Elmer Lambda Bio Termocyklery: Perkin Elmer Gene Amp PCR System 2400 Techne Touchgene Gradient Techne Termocycler Flexigene Tc-412 GeneAmp PCR System 9700 PTC-220 DNA Engine Dyad Peltier Thermal cycler Termostat: BT-120 EKOM Třepačky: Eppendorf Thermomixer Comfort 5355 Vortex MiroGene Heidolph Microshaker ML BIOLOGICKÝ MATERIÁL Jako biologický materiál byla použita periferní krev 66 pacientů s depresivními a úzkostnými poruchami. Pacienti byli léčeni antidepresivy, která jsou metabolizována CYP2D6. Koncentrace izolované DNA se pohybovala v rozmezí 0,1-0,6 µg/µl (množství max. 800 µl). DNA pacienta s genotypem *1/*16 (koncentrace 1 µg/µl, množství 10 µl) jsem získala na základě korespondence s A. K. Daly (Department of Pharmacological Sciences, University of Newcastle). Veškerá DNA se uchovávala při 4 C. 13

14 3.3. METODY Izolace DNA DNA byla izolována z lymfocytů periferní krve. A. Lyze erytrocytů a odstranění hemoglobinu ml krve + 0,3 ml 0,5 M EDTA protřepat a ředit sterilní vodou (1:1) 2. inkubovat při 20 C přes noc 3. pomalu rozmrazit při pokojové teplotě 4. centrifugace g, 5 min, 4 C 5. odstranit supernatant a přidat 1 2 objemy sterilní destilované vody, řádně protřepat 6. centrifugace g, 5 min, 4 C 7. odstranit supernatant a přidat 1 objem fyziologického roztoku, řádně protřepat 8. centrifugace g, 5 min, 4 C B. Lyze leukocytů 9. odstranit supernatant 10. sediment rozpustit v 0,5 ml fyziologického roztoku 11. přidat 3 ml roztoku Fasano A a 5 µl proteinázy K (Serva, 20 mg/ml) 12. protřepat a inkubovat při 50 C přes noc C. Deproteinace DNA 13. buněčný lyzát temperovat při pokojové teplotě 14. přidat 1,4 ml 5 M NaCl a promíchat 15. přidat 1 objem chloroformu (LACHEMA), promíchávat 30 min 16. centrifugace g, 10 min, 10 C D. Srážení DNA 17. horní vodnou fázi odebrat do čisté zkumavky 18. přidat 1 objem izopropylalkoholu (LACHEMA), promíchávat min 19. vysráženou DNA přenést do čisté zkumavky, přidat 1 ml vychlazeného 70% etanolu a 10 min promíchávat 20. krátce centrifugovat 21. odstranit supernatant, přidat 1 ml 96% etanolu 22. vysušit DNA 23. DNA rozpustit ve µl 10 mm TE pufru (ph 7,8) Po izolaci se spektrofotometricky stanoví koncentrace DNA. Hodnota A 260 = 1, měřená v 1 cm kyvetě, odpovídá koncentraci DNA 50 µg/ml. 14

15 Použité roztoky: 0,5 M EDTA, ph 8,0: EDTA Na 2.2H 2 O (LACHEMA)...186,1 g NaOH (LACHEMA)...20 g destilovanou vodou doplnit do ml Roztok Fasano A: 5 M NaCl (LACHEMA)...4 ml 0,5 M EDTA, ph 8,0 (LACHEMA)...4 ml 1 M Tris, ph 7,8 (MERCK)...4 ml 20% SDS (SERVA)...2,5 ml destilovaná voda...85,5 ml Fyziologický roztok: NaCl (LACHEMA)...4,38 g destilovanou vodou doplnit do ml TE pufr: 0,5 M EDTA (LACHEMA)...0,4 ml 1 M Tris, ph 7,6 (MERCK)...2,0 ml destilovaná voda...197,6 ml PCR Primery Primery jsem navrhla pomocí programu Primer3 ( nebo jsem je převzala od jiných autorů (tab. 1). 15

16 Tab. 1: Primery použité pro detekci alel CYP2D6 Primer P1 P2 71F IN6-7 JM3 9F 9R 8F 9R-new 1F 1R 2D7-1R 2D7/2D6-1R 207F 17F 32R 13F 24R 1A 4A 1C 2G 7R CYP2D6-F CYP2D6-R 2R Sekvence primeru (5 3 ) CGT GAC AGC TTT GAG GCT CA CCC GGG TCC CAC GGA AAT CT TCC GAC CAG GCC TTT CTA CCA C TGG GGC CCA AGG CAG GGA CT TGC TCA GCC TCA ACG TAC CCC GGA GTC TTG CAG GGG TAT CA GGA CCC GAG TTG GAA CTA CC GAG GCC GTC TGG GAG AAG CCT CAA CGT ACC CCT GTC TC GCA CAG TCA ACA CAG CAG GT TTC TGG TAG GGG AGC CTC AG TGG TGG TGG GGC ATC CTC AG ATG GCT GCC TCA CTA CCA AC CCC TCA GCC TCG TCA CCT TCC CCC ACT GCA CCA ACT CT CAC GTC CAG GGC ACC TAG AT ACC GGG CAC CTG TAC TCC TCA GCA TGA GCT AAG GCA CCC AGA C TGC TAA CTG AGC ACA GGA TG CCA AAG CGC TGC ACC TCA TG CTGGAATCCGGTGTCGAAGT CTCGGTCTCTCGCTCCGCAC TAC CTT AGG GAT GCG GAA GC CCA GAA GGC TTT GCA GGC TTC A ACT GAG CCC TGG GAG GTA GGT A GTC CCA CGG AAA TCT GTC TC Panserat aj., 1995 Panserat aj., 1995 Daly aj., 1996 Daly aj., 1996 Daly aj., 1996 Primer3 Primer3 Primer3 Primer3 Primer3 Primer3 Primer3 Primer3 Løvlie aj., 1996 Løvlie aj., 1996 Løvlie aj., 1996 Daly a Steward, 1995 Daly a Steward, 1995 Daly aj., 1995 Daly aj., 1995 Daly aj., 1995 Daly aj., 1995 Primer3 Sistonen aj., 2005 Sistonen aj., 2005 Primer Zásobní roztoky Zde uvádím pouze koncentrace zásobních roztoků použitých kitů. Výsledné složení reakčních směsí, které bylo třeba optimalizovat, bude popsáno v kapitole Výsledky. 16

17 AmpliTaq Gold PCR Kit (Applied Biosystems) AmpliTaq Gold DNA polymeráza (5 U/µl) 10x PCR Gold pufr bez MgCl 2 10 mm směs dntp (2,5 mm každý dntp) 25 mm MgCl 2 DyNAzyme EXT PCR Kit (Finnzymes) DyNAzyme EXT DNA polymeráza (1 U/µl) 10x EXT pufr s 15 mm MgCl 2 10x EXT pufr bez MgCl 2 50 mm MgCl 2 100% DMSO Expand Long Template PCR Kit (Roche) Expand Long Template Enzyme mix (Taq a Tgo DNA polymeráza, 5 U/µl) 10x pufr 1 se 17,5 mm MgCl 2 (pro délky 0,5 9 kb) 100 mm datp, 100 mm dctp, 100 mm dgtp, 100 mm dttp (Roche) GeneAmp XL PCR Kit (Applied Biosystems) rtth DNA polymeráza, XL (2 U/µl) 3.3x XL pufr II 25 mm Mg(OAc) 2 GeneAmp 10 mm směs dntp (2,5 mm každý dntp) Kontrolní DNA fága λ (0,1 µg/100 µl) Primer SC1011 (5 3 GCTGAAGTGGTGGAAACCGC) (1,25 nmol/50 µl) Primer SC1002 (5 3 GCCTCGCATATCAGGAAGCAC) (1,25 nmol/50 µl) HotStarTaq PCR Kit (Qiagen) HotStarTaq Master Mix (2x koncentrovaný) obsahuje HotStarTaq DNA polymerázu (5 U/µl) pufr s 3 mm MgCl µm každý dntp 25 mm MgCl 2 17

18 Taq PCR Kit (Fermentas) Taq DNA polymeráza (5 U/µl) 10x Taq pufr s KCl 25 mm MgCl 2 10 mm směs dntp (2,5 mm každý dntp) PCR exonů 1, 3+4 a Primery: 1F, 1R...exon 1 (1. PCR) 1C, 2G...exony 3+4 (2. PCR) 1A, 4A... exony (3. PCR) Syntéza: HotStarTaq PCR (Qiagen) Složení reakční směsi: 1x HotStarTaq Master Mix 0,2 µm každý primer ng genomové DNA Celkový objem: 25 µl Program: 1x 95 ºC 15 min 40x 95 ºC 1 min 55 ºC 1 min 72 C 1 min 1x 72 ºC 7 min exony 3+4 a x 95 ºC 15 min 30x 95 ºC 1 min 60 ºC 1 min 72 C 1 min 30 s 1x 72 ºC 7 min exon Detekce alely *13 Primery: P1, P2 Syntéza: Taq PCR (Fermentas) Složení reakční směsi: 0,5 U Taq DNA polymerázy 1x Taq pufr s KCl 2,5 mm MgCl 2 0,125 mm každý dntp 0,2 µm každý primer ng genomické DNA Celkový objem: 25 µl 18

19 Program: 1x 94 ºC 5 min 30x 94 ºC 30 s 58 ºC 30 s 72 C 2 min 1x 72 ºC 7 min PCR genu TACI Primery: 3A (5 3 TGG TCA AAC CCA GAG TTC CTG CTA GT) 3B (5 3 TCC CAC GCT TTC TCA CCC TGC) Syntéza: HotStarTaq PCR (Qiagen) Složení reakční směsi: 1x HotStarTaq Master Mix 0,2 µm každý primer ng genomové DNA Celkový objem: 25 µl Program: 1x 95 ºC 15 min 35x 95 ºC 30 s 60 ºC 30 s 72 C 1 min 1x 72 ºC 7 min Štěpení restrikčními enzymy Štěpení NcoI NcoI (Takara) 8 U 10x pufr K 2 µl 0,1 % BSA 1 µl H 2 O 1 µl DNA 15 µl Celkový objem µl Štěpení při 37 C, přes noc Štěpení BamHI BamHI (BioLabs) 12 U 10x pufr pro BamHI 2 µl H 2 O 2 µl DNA 15 µl Celkový objem µl Štěpení při 37 C, přes noc. 19

20 Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (PAGE) Složení 5% polyakrylamidového gelu (PAG) s poměrem akrylamidu (AA) ku N,N metylenbisakrylamidu (bisaa) 19:1: 40% AA (BioRad)...3,75 ml 2% bisaa...3,75 ml 5x TBE pufr...6 ml destilovaná voda...18,2 ml persíran amonný (APS) (100 mg/ml, SERVA) µl N, N, N, N - tetrametylendiamin (TEMED) (SIGMA) µl - všechny složky smíchat, aplikovat mezi dvě skla - polymerizace v horizontální poloze při pokojové teplotě alespoň 30 min - do jamek nanášet 1-2 µl produktu PCR spolu s nanášecím pufrem (bromfenolová modř a xylen cyanol) - elektroforéza v elektroforetické vaně s 1x TBE pufrem Jako hmotnostní standard jsem používala pbr322/alui (Fermentas) (příloha č. 1). 5x TBE pufr: Tris (MERCK)...54 g kyselina boritá (PENTA)...27,5 g 0,5 M EDTA, ph 8 (LACHEMA)...20 ml destilovanou vodou doplnit do ml Barvení PAG stříbrem 1. gel nechat sklouznout ze skla pod proudem destilované vody do skleněné vany, promýt destilovanou vodou a vodu odsát vývěvou 2. fixovat 2x 5 min v roztocích 15% metanolu a 0,5% kyseliny octové v poměru 1:1 3. 2x krátce promýt destilovanou vodou 4. barvit 30 min v 0,1% AgNO 3 (ve tmě, na třepačce) 5. promýt destilovanou vodou 2x 10 s 6. krátce propláchnout v 1,5% NaOH 7. gel vyvolat v 1,5% NaOH, 0,08% Na 2 B 4 O 7 a 0,16% formaldehydu (1:1:1) min 8. promýt destilovanou vodou 20

21 9. stabilizovat proužky v 0,75% Na 2 CO 3 5 min 10. pro uchování použít 2% kyselinu octovou 11. gel zatavit do fólie a skladovat v lednici Elektroforéza v agarózovém gelu Příprava 1% agarózového gelu: ml 0,5x TAE pufru + 0,3 g agarózy 2. krátce povařit, zchladit na 50 C 3. přidat 1-2 µl ethidium-bromidu (zásobní roztok: 10 mg/ml H 2 O) 4. polymerace na nosiči v horizontální poloze alespoň 30 min 5. nosič umístit do elektroforetické vany s 0,5x TAE pufrem 6. do jamek nanést 4-8 µl produktu PCR + zatěžovací směs Orange G 7. elektroforéza v horizontální poloze Detekce segmentů po elektroforetické separaci se provede na transiluminátoru ozářením UV světlem vlnové délky 312 nm. Jako hmotnostní standardy jsem používala Lambda/HindIII (Fermentas), 1 kb DNA Ladder (New England BioLabs), 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen), MassRuler DNA Ladder High Range (Fermentas) a MassRuler DNA Ladder Low Range (Fermentas) (příloha č. 1). 50x TAE pufr: Tris (MERCK) g kyselina octová...57,1 ml 0,5 M EDTA, ph 8, ml destilovanou vodou doplnit do ml Orange G: 20% glukóza (LACHEMA) µl 0,5x TAE µl akridinová oranž (SIGMA)... do zabarvení Izolace produktů PCR z gelu K izolaci produktů PCR z gelu se použije QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Postupuje se podle doporučení výrobce. 21

22 Přečištění produktů PCR K přečištění produktů PCR se použije MinElute PCR Purification Kit (Qiagen). Postupuje se podle doporučení výrobce Příprava vzorků na sekvencování Pro sekvenační reakci se použije ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, verze 1.1 nebo 3.1. Složení reakční směsi: Terminator Ready Reaction Mix... 8,0 µl Primer... 0,5 µl Deionizovaná voda... 9,5 µl Produkt PCR... 2,0 µl Celkový objem: 20 µl Program: 25x 96 C/10 s 50 C/5 s 60 C/4 min K přečištění vzorků po sekvenační reakci se použije DyeEx 2.0 Spin Kit (Qiagen). Postupuje se podle doporučení výrobce. Následně se vzorky nechají sušit v exsikátoru. Po vysušení se přidá 15 µl deionizovaného formamidu. Vzorky se denaturují 3 min při 95 C a pak rychle zchladí v ledové lázni. Sekvencování probíhá na automatickém kapilárním sekvenátoru ABI PRISM 310 nebo ABI PRISM

23 4. VÝSLEDKY 4.1. PCR EXONŮ 1, 3+4 a Při určování alel CYP2D6 jsem vycházela z exonů 3-7. Tyto úseky byly pro diagnostiku vybrány jako základní, protože se zde nachází nejvíce sekvenčních změn (obr. 5). V laboratoři již byla PCR exonů 3-7 zavedena (kap ). Používaly se primery navržené Daly aj. (1995). První PCR zahrnovala exon 3 a exon 4, druhá PCR zahrnovala část exonu 5, exon 6 a část exonu 7. Na základě zachycených změn v těchto úsecích lze jednoznačně stanovit alely *3, *4, *6, *7, *8, *9, *14 a *41. Jako doplňující byla navržena PCR exonu 1, která může odhalit další alely nebo pomoci upřesnit základní vyšetření (obr. 6). Obr. 5: Schéma hlavních úseků genu CYP2D6, kde se nachází nejvíce sekvenčních změn. Jednotlivé sekvenční změny, běžné v kavkazské populaci, jsou znázorněny hvězdičkami (podle James aj., 2004) Obr. 6: Exony 1, 3+4 a Dráha 1: exon 1 (410 bp); dráha 2: exony 3+4 (722 bp); dráha 3: exony (813 bp); dráha 4: pbr322/alui (5% PAG, 8 V/cm, 2 hod) AMPLIFIKACE KONTROLNÍ DNA FÁGA λ Long-PCR, kterou jsem využila při diagnostice alel CYP2D6, je založena na syntéze dlouhých úseků (několik kb). rtth DNA polymeráza, XL (GeneAmp XL PCR Kit, Applied Biosystems) je enzym určený pro amplifikaci sekvencí DNA dlouhých až 40 kb. Součástí kitu 23

24 jsou primery SC1011 a SC1002 a DNA fága λ, která slouží ke kontrole kvality polymerázy. Lze tak amplifikovat produkt délky 20,8 kb (obr. 7). 1 2 Obr. 7: Amplifikace kontrolní DNA fága λ. Dráha 1: Lambda/HindIII; dráha 2: 20,8 kb DNA fága λ (1% agaróza, 8 V/cm, 2 hod) AMPLIFIKACE GENU CYP2D6 Amplifikace genu CYP2D6 je doporučována pro zabránění nespecifické amplifikace sekvencí psedogenů. Primery, které jsem použila, jsou navrženy tak, že dochází k amplifikaci produktu délky 5,1 kb (příloha č. 5). Pro syntézu jsem vybrala dva různé kity, které jsou určeny pro syntézu dlouhých oblastí. V obou případech docházelo k efektivní amplifikaci bez nespecifických produktů. Gen CYP2D6 jsem následně využila jako templát pro nested PCR některých exonů (kap. 4.9 a 4.14) a pro objasnění strukturních změn v genu CYP2D6 (kap. 4.11). Primery: CYP2D6-F, CYP2D6-R Syntéza 1: GeneAmp XL PCR (Applied Biosystems). Při optimalizaci koncentrací reakčních složek jsem vycházela z protokolu navrženém Sistonen aj. (2005). Amplifikace však byla za našich laboratorních podmínek úspěšná až po úpravě koncentrací Mg(OAc) 2 a primerů (obr. 8). Program PCR je navržen Sistonen aj. (2005). Složení reakční směsi: 1,5 U rtth DNA polymerázy, XL 1x XL pufr II 1,1 mm Mg(OAc) 2 0,2 mm každý dntp 0,2 µm každý primer ng genomové DNA Celkový objem: 50 µl Program: 1x 94 ºC 1 min 10x 94 ºC 30 s 68 ºC 10 min 25x 94 ºC 30 s 68 ºC 10 min + 15 s na každý další cyklus 1x 72 ºC 30 min 24

25 1 2 Obr. 8: Amplifikace genu CYP2D6 pomocí GeneAmp XL PCR. Dráha 1: 1 kb Plus DNA Ladder; dráha 2: gen CYP2D6 (5,1 kb) (1% agaróza, 8 V/cm, 1 hod). Primery: CYP2D6-F, CYP2D6-R Syntéza 2: Expand Long Template PCR (Roche). Při optimalizaci koncentrací reakčních složek a při návrhu programu PCR jsem postupovala podle pokynů společnosti Roche. Složení reakční směsi: 3,75 U Expand Long Template Enzyme mix 1x pufr 1 (1,75 mm MgCl 2 v reakci) 0,35 mm každý dntp 0,15 µm každý primer ng genomové DNA Celkový objem: 50 µl Program: 1x 93 ºC 2 min 10x 93 ºC 10 s 68 ºC 30 s 68 ºC 4 min 25x 93 ºC 15 s 68 ºC 30 s 68 ºC 4 min + 20 s na každý další cyklus 1x 68 ºC 7 min V protokolu dodávaném spolu s polymerázou se doporučuje před přípravou reakční směsi zahřát pufr na teplotu ºC, popř. přidat do reakce aditiva. PCR s přidaným 1% DMSO a pufrem zahřátým na 50 ºC jsem porovnala s PCR probíhající bez DMSO a pufrem rozpuštěným při pokojové teplotě. DMSO ani zahřátí pufru neměli na průběh syntézy vliv (obr. 9). 25

26 Obr. 9: Amplifikace genu CYP2D6 pomocí Expand Long Template PCR. Dráha 1: 1 kb Plus DNA Ladder; dráha 2: PCR s 1% DMSO, pufr zahřátý na 50 ºC; dráha 3: PCR s 1% DMSO, pufr bez zahřátí; dráha 4: PCR bez DMSO, pufr zahřátý na 50 ºC; dráha 5: PCR bez DMSO, pufr bez zahřátí (1% agaróza, 8 V/cm, 1 hod) KONTROLA SPECIFICKÉ AMPLIFIKACE GENU CYP2D6 Pro další postup bylo nezbytné vědět, zda dochází k amplifikaci pouze genu CYP2D6 nebo je také amplifikován blízký homolog CYP2D7P. Kontrolu jsem provedla na základě analýzy délky restrikčních fragmentů. Restrikční enzymy jsem vybrala pomocí programu DNA Star (dostupný na tak, aby byly schopny štěpit gen i pseudogen na fragmenty odlišných délek. Vybrala jsem enzymy NcoI a BamHI. Jako templát pro štěpení jsem použila produkt syntézy podle kap Na základě vzniklých fragmentů jsem mohla zjistit, jestli dochází k nespecifické amplifikaci pseudogenu CYP2D7P (obr. 10 a 11). Restrikční enzym NcoI: Délky produktů štěpení CYP2D bp, 4500 bp Délky produktů štěpení CYP2D7P bp, 4750 bp Obr. 10: Gen CYP2D6 štěpený NcoI. Dráha 1: Mass Ruler DNA ladder High Range; dráha 2: neštěpený produkt PCR; dráha 3: štěpený produkt PCR; dráha 4: MassRuler DNA Ladder Low Range (1% agaróza, 6 V/cm, 1,5 hod). 26

27 Vzhledem k nepřítomnosti fragmentu délky 340 bp jsem usoudila, že k amplifikaci pseudogenu CYP2D7P nedochází. Restrikční enzym BamHI: Délky produktů štěpení CYP2D bp, 3400 bp Délky produktů štěpení CYP2D7P bp, 3900 bp Obr. 11: Gen CYP2D6 (genotyp *1/*1) štěpený BamHI. Dráha 1: MassRuler DNA Ladder High Range; dráha 2: štěpený produkt PCR; dráha 3: MassRuler DNA Ladder Low Range (1% agaróza, 6 V/cm, 1,5 hod). Vzhledem k nepřítomnosti fragmentu délky 1200 bp jsem usoudila, že k amplifikaci pseudogenu CYP2D7P nedochází. Jako templáty pro štěpení enzymy NcoI a BamHI jsem použila vždy dvě různé DNA: DNA standardního genotypu (*1/*1) a DNA genotypu *1/*4. Po štěpení DNA genotypu *1/*4 enzymem BamHI se objevily fragmenty typické pro CYP2D6 (1700 bp) i pro CYP2D7P (1200 bp), ale vznikl i fragment nový (2200 bp), který neodpovídal štěpení genu ani pseudogenu (obr. 12). Tento nečekaný restrikční profil byl způsoben sekvenční změnou 843T>G v intronu 1 alely *4, čímž vzniklo nové cílové místo pro BamHI. Místo fragmentu délky 3400 bp vznikly dva nové fragmenty o délce 1200 bp a 2200 bp. O nespecifickou amplifikaci pseudogenu CYP2D7P se tedy nejednalo. 27

28 Obr. 12: Gen CYP2D6 (genotyp *1/*4) štěpený BamHI. Dráha 1: MassRuler DNA Ladder High Range; dráha 2: neštěpený produkt PCR; dráha 3: štěpený produkt PCR; dráha 4: Mass Ruler DNA ladder Low Range (1% agaróza, 6 V/cm, 2 hod) DETEKCE ALEL S DUPLIKACÍ GENU CYP2D6 Pro detekci duplikovaných alel jsem použila primery navržené Løvlie aj. (1996). Vycházela jsem ze znalosti nejčastěji duplikovaných alel. Při testování jsem se zaměřila pouze na alely *1 a *2, tj. aktivní formy genu, které v duplikovaném stavu způsobují fenotyp UM. Dále jsem k testování použila DNA pacientů, kteří byli dextrometorfanovým testem stanoveni jako UM. Primery: 17F a 32R PCR 207F a 32R PCR Syntéza: Expand Long Template PCR (Roche). Při optimalizaci koncentrací reakčních složek a při návrhu programu PCR jsem postupovala podle pokynů společnosti Roche. Složení reakční směsi: 2,5 U Expand Long Template Enzyme mix 1x pufr 1 (1,75 mm MgCl 2 v reakci) 0,1 mm každý dntp 0,2 µm každý primer ng genomové DNA Celkový objem: 25 µl Program: 1x 94 ºC 2 min 10x 94 ºC 10 s 65 ºC 30 s 68 ºC 4 min 20x 94 ºC 10 s 65 ºC 30 s 68 ºC 4 min + 20 s na každý další cyklus 1x 68 ºC 7 min Primery 17F a 32R jsou navrženy tak, že v případě genové duplikace dojde k amplifikaci CYP2D6-CYP2D6 mezigenové oblasti délky 3,6 kb. Navíc je s těmito primery 28

29 u každého vzorku amplifikována kontrolní CYP2D7P-CYP2D6 mezigenová oblast délky 5,2 kb (obr. 13) (příloha č. 2). Primery 207F a 32R slouží pro kontrolní reakci. U duplikovaných alel dochází k syntéze CYP2D6-CYP2D6 mezigenové oblasti délky 3,2 kb, zatímco u duplikacenegativních vzorků je výsledek PCR negativní (obr. 14) Obr. 13: PCR s primery 17F a 32R pro detekci duplikace genu CYP2D6. Dráha 1: 1 kb Plus DNA Ladder; dráha 2-6: duplikace-negativní vzorky (3,6 kb); dráha 7: duplikace-pozitivní vzorek (5,2 kb a 3,6 kb) (1% agaróza, 8 V/cm, 1 hod) Obr. 14: Kontrolní PCR s primery 207F a 32R pro detekci duplikace genu CYP2D6. Dráha 1-5: duplikace-negativní vzorky; dráha 6: duplikace-pozitivní vzorek (3,2 kb); dráha 7: 1 kb DNA Ladder (1% agaróza, 8 V/cm, 1 hod) DETEKCE ALEL S DELECÍ GENU CYP2D6 Pro detekci genové delece (alela *5) jsem jako základní použila primery 13F a 24R. Tyto primery jsou navrženy tak, že v případě delece dojde k amplifikaci produktu délky 3,5 kb (příloha č. 3). Do reakce jsem navíc přidala primer 207F, který spolu s primerem 24R umožní syntézu kontrolního úseku délky 3,0 kb (obr. 15). Primery: 13F, 207F, 24R Syntéza: DyNAzyme EXT PCR (Finnzymes). Při optimalizaci koncentrací reakčních složek jsem vycházela z protokolu navrženém Sistonen aj. (2005). Výsledek amplifikace však byl za našich laboratorních podmínek optimální až po úpravě koncentrací primerů. 29

30 Složení reakční směsi: 1 U DyNAzyme EXT DNA polymerázy 1x EXT pufr bez MgCl 2 1 mm MgCl 2 0,2 mm každý dntp (Roche) 0,25 µm primer 207F 0,25 µm primer 24R 0,35 µm primer 13F ng genomové DNA Celkový objem: 50 µl Program: Navržen Sistonen aj. (2005), stejný jako pro amplifikaci genu CYP2D6 pomocí GeneAmp XL PCR (kap. 4.3) Obr. 15: Detekce delece genu CYP2D6. Dráha 1: 1 kb Plus DNA Ladder; dráha 2-4: delecepozitivní vzorky (3,5 kb a 3,0 kb); dráha 5 a 6: delece-negativní vzorky (3,0 kb) (1% agaróza, 4 V/cm, 2 hod) DETEKCE ALELY *16 Alela *16 je hybridní gen CYP2D7P (exony 1-7)/CYP2D6(exony 8-9). Její detekce je založena na dvou paralelních reakcích. S primery 71F a 24R dochází k amplifikaci produktu délky 8 kb, s primery IN6-7 a JM3 vzniká produkt délky 1,4 kb (příloha č. 4). Jako kontrolní jsem použila DNA genotypu *1/*16 (obr. 16). Primery: 71F a 24R PCR IN6-7 a JM PCR Syntéza: GeneAmp XL PCR (Applied Biosystems). Při optimalizaci koncentrací reakčních složek jsem postupovala podle pokynů společnosti Applied Biosystems. Program PCR je navržen Daly aj. (1996). 30

31 Složení reakční směsi: 2 U rtth DNA polymerázy, XL 1x XL pufr II 1 mm Mg(OAc)2 0,2 mm každý dntp 0,2 µm každý primer ng genomické DNA Program: 1 x 93 C 1 min 35 x 93 C 1 min 64 C 2 min 68 C 8 min 1 x 72 C 5 min.primery 71F a 24R 1 x 93 C 1 min 30 x 93 C 1 min 67 C 1 min 30 s 68 C 5 min 1 x 72 C 5 min.primery IN6-7 a JM Obr. 16: Detekce alely CYP2D6*16 u kontrolní DNA. Dráha 1: MassRuler DNA Ladder High Range; dráha 2: PCR s primery IN6-7 a JM3 (1,4 kb) ; dráha 3: PCR s primery 71F a 24R (8 kb) (1% agaróza, 6 V/cm, 1,5 hod). V případě delece genu CYP2D6 vzniká při PCR s primery 71F a 24R produkt délky 9,5 kb (obr. 17) Obr. 17: PCR s primery 71F a 24R u alel *5 a *16. Dráha 1: MassRuler DNA Ladder High Range; Dráha 2: DNA - genotyp *1/*16 (8 kb); dráha 3: DNA - genotyp *5/*41 (9,5 kb) (1% agaróza, 6 V/cm, 1,5 hod). 31

32 4.8. DETEKCE ALELY *13 Alela *13 je hybridní gen CYP2D7P(exon 1)/CYP2D6(exony 2-9). K její detekci jsem použila primery P1 a P2 a postupovala jsem podle protokolu navrženém Panserat aj. (1995) (příloha č. 4). U žádného vzorku však nebyl výsledek PCR pozitivní PCR A SEKVENCOVÁNÍ EXONU 9 Syntéza: HotStarTaq PCR (Qiagen) Složení reakční směsi: 1x HotStarTaq Master Mix 0,2 µm každý primer 0-5 mm MgCl 2 max. 600 ng genomové DNA Celkový objem: 25 µl Program: 1x 95 ºC 15 min 30x 95 ºC 1 min T a 1 min 72 C 1 min 1x 72 ºC 7 min Pro exon 9 jsem nejdříve navrhla primery 9F a 9R (příloha č. 5). Očekávaný produkt má délku 324 bp. Při PCR (T a = 60 C) se však syntetizoval také delší nespecifický produkt. Množství vstupní DNA jsem snížila 3x a testovala koncentraci MgCl 2 (1,5-5 mm) (termocykler Perkin Elmer). Nespecifický produkt se nepodařilo odstranit. Pro exon 9 jsem tedy vytvořila teplotní gradient v rozmezí 56,2-63,8 C (termocykler Techne) (obr. 18) T a ( C): 60,0 56,2 57,0 57,9 58,7 59,6 60,2 61,2 62,2 63,0 63,8 Obr. 18: Optimalizace PCR exonu 9 s primery 9F a 9R. Dráha 1: pbr322/alui; dráha 2: T a = 60 C, 5 mm MgCl 2, termocykler Perkin Elmer; dráha 3-12: teplotní gradient 56,2-63,8 C, 5 mm MgCl 2, termocykler Techne (5% PAG, 8 V/cm, 2 hod). 32

33 Přestože PCR probíhala na obou termocyklerech za stejných reakčních podmínek, při PCR na přístroji Techne Touchgene Gradient žádné nespecifické produkty nevznikaly. Vzorky z dráhy 2 a 8 (stejné T a ) jsem sekvencovala. Výsledky byly srovnatelné. Porovnáním se sekvencí pseudogenů jsem zjistila, že primery se připojují i na exon 9 pseudogenu CYP2D7P a u obou vzorků byl tedy amplifikován i pseudogen. Na základě výsledků sekvencování nebylo možné odečíst případné sekvenční změny. Pro zabránění amplifikace pseudogenu jsem využila nested PCR. Templátem byl místo genomové DNA gen CYP2D6 (2 µl, podle kap. 4.3). PCR probíhala za těchto podmínek: T a = 60 C, 5 mm MgCl 2, termocykler Perkin Elmer. Opět vznikal nespecifický produkt, který se ani přečištěním přes kolonku Min Elute nepodařilo odstranit. Při sekvencování se však ukázalo, že je amplifikován pouze gen CYP2D6. Protože tato syntéza byla zdlouhavá a nákladná, navrhla jsem pro přímou amplifikaci exonu 9 primer 8F, který na 6. pozici od 3 konce tvoří mismatch (příloha č. 5). Tento primer se připojuje k exonu 8 a lze tak zachytit i případné sekvenční změny v části exonu 8 a v intronu 8. Jako zpětný primer jsem použila 9R. Očekávaný produkt má délku 461 bp. PCR probíhala při T a = 60 C, testovala jsem různé koncentrace MgCl 2 (1,5-5 mm). Opět se tvořily nespecifické produkty. Sekvencovala jsem produkt PCR s 5 mm MgCl 2, při které se tvořilo nejmenší množství nespecifických produktů. Ukázalo se, že rozdíl sekvence primerů pouze v jedné bázi v tomto případě nestačí, amplifikoval se i pseudogen CYP2D7P. K primeru 8F jsem tedy navrhla primer 9R-new. Tento primer se připojuje k sekvenci intronu 9, která se od pseudogenu CYP2D7P liší přítomností dvou bází navíc (příloha č. 5). Očekávaný produkt má délku 569 bp. Testovala jsem 1,5 mm a 3 mm MgCl 2 a pro obě tyto koncentrace jsem vytvořila teplotní gradient v rozmezí 54,3-60,0 C (obr. 19) T a : 54,3 56,0 57,4 58,4 59,1 60,0 54,3 56,0 57,4 58,4 59,1 60,0 ( C) Obr. 19: Optimalizace PCR exonu 9 s primery 8F a 9R-new. Dráha 1-6: 1,5 mm MgCl 2 ; dráha 7: Mass Ruler DNA ladder Low Range; dráha 8-13: 3 mm MgCl 2 (1% agaróza, 6 V/cm, 1 hod). 33

34 Produkt PCR s 1,5 mm MgCl 2, T a = 58,4 C (dráha 4) jsem sekvencovala. Kombinace těchto primerů byla dostatečná pro specifickou amplifikaci genu CYP2D6 (příloha č. 6) PŘÍPADY PCR EXONU 1 S NEGATIVNÍM VÝSLEDKEM U devíti vzorků DNA pacientů se syntéza exonu 1 nedařila ani po opakovaném nasazení. Předpokládala jsem, že může jít o změnu v místě nasedání jednoho z primerů nebo o deleci exonu 1. Pro objasnění, o jakou změnu se jedná, jsem amplifikovala 2 oblasti kolem exonu 1. Pro 1. PCR jsem použila primery CYP2D6-F a 1R (příloha č. 5). Při této reakci by se měl amplifikovat exon 1 spolu s 5 oblastí genu, kde má svou komplementární cílovou sekvenci primer 1F. Výsledný produkt by měl mít délku 575 bp. Jako templát jsem použila 2 µl produktu syntézy podle kapitoly 4.3. PCR probíhala za stejných podmínek jako PCR pro exon 1 (kap ). Teploty tání těchto dvou primerů se lišily o 4 C (T m primeru CYP2D6- F je 68 C, T m primeru 1R je 64 C). Vytvořila jsem proto teplotní gradient v rozmezí C. Při PCR vzniklo mnoho nespecifických produktů. Podle očekávání vznikl i produkt délky 575 bp. Z toho jsem usoudila, že se o deleci exonu 1 nejedná. Produkt PCR s T a = 67 C jsem přečistila a sekvencovala. Sekvence však nebyla čitelná. Pro 2. PCR jsem použila primery 1F a 2R (příloha č. 5). Při této reakci by mělo dojít k amplifikaci exonu 1 spolu s intronem 1, kde má primer 1R svou cílovou komplementární sekvenci. Teploty tání obou primerů jsou stejné (62 C). Očekávaný produkt má délku 1255 bp. Pro syntézu jsem použila DyNAzyme EXT PCR kit. 50 µl reakce obsahovala 1 U DyNAzyme EXT DNA polymerázy, 1x EXT pufr s MgCl 2, 0,05 mm každý dntp, 0,1 µm každý primer a 5 % DMSO. Jako templát jsem do reakce přidala 2 µl produktu PCR podle kap Syntéza probíhala za těchto podmínek: počáteční denaturace 93 C 1 min, 30 cyklů 93 C 1 min, 62 C 2 min a 68 C 10 min, závěrečná extenze 68 C 10 min. Při PCR vznikl kromě produktu délky 1255 bp i jeden kratší nespecifický produkt. Po přečištění jsem vzorek sekvencovala. Tento postup jsem zopakovala i pro DNA se standardní syntézou exonu 1. Porovnáním těchto dvou sekvencí jsem zjistila, že u DNA s neúspěšnou PCR exonu 1 není v intronu 1 CYP2D6-specifická sekvence, kam se komplementárně připojuje primer 1R, ale je tu sekvence pseudogenu CYP2D7P (přílohy č. 7 a 8). Pro odlišení této varianty od falešně negativní PCR jsem k primerům 1F a 1R (produkt délky 410 bp) přidala primer 2D7/2D6-1R (0,2 µm). Tento primer se komplementárně připojuje k sekvenci před exonem 1 pseudogenu CYP2D7P a v kombinaci s primerem 1F 34

Mgr. Eva Flodrová FN Brno,Oddělení lékařské genetiky Laboratoř molekulární diagnostiky.

Mgr. Eva Flodrová FN Brno,Oddělení lékařské genetiky Laboratoř molekulární diagnostiky. Mgr. Eva Flodrová FN Brno,Oddělení lékařské genetiky Laboratoř molekulární diagnostiky eflodrova@fnbrno.cz enzymy katalyzující oxidativní metabolické reakce xenobiotik provádějí redukci C-, N-, S-, hydroxylaci,

Více

Polymerázová řetězová reakce

Polymerázová řetězová reakce Polymerázová řetězová reakce doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu.cz Přírodovědecká fakulta MU, 2013 Obsah přednášky 1) Co je to PCR, princip, jednotlivé kroky 2) Technické provedení PCR 3) Fyzikální

Více

USING OF AUTOMATED DNA SEQUENCING FOR PORCINE CANDIDATE GENES POLYMORFISMS DETECTION

USING OF AUTOMATED DNA SEQUENCING FOR PORCINE CANDIDATE GENES POLYMORFISMS DETECTION USING OF AUTOMATED DNA SEQUENCING FOR PORCINE CANDIDATE GENES POLYMORFISMS DETECTION VYUŽITÍ AUTOMATICKÉHO SEKVENOVÁNÍ DNA PRO DETEKCI POLYMORFISMŮ KANDIDÁTNÍCH GENŮ U PRASAT Vykoukalová Z., Knoll A.,

Více

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální

Více

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální

Více

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE. 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR)

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE. 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR) MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR) Náplň praktik 1. Izolace DNA z buněk bukální sliznice - izolační kit MACHEREY-NAGEL 2. PCR polymerázová řetězová reakce (templát gdna) 3. Restrikční

Více

Molekulární genetika IV zimní semestr 6. výukový týden ( )

Molekulární genetika IV zimní semestr 6. výukový týden ( ) Ústav biologie a lékařské genetiky 1.LF UK a VFN, Praha Molekulární genetika IV zimní semestr 6. výukový týden (5.11. 9.11.2007) Nondisjunkce u Downova syndromu 2 Tři rodokmeny rodin s dětmi postiženými

Více

Autoindex nad DNA sekvencemi

Autoindex nad DNA sekvencemi Autoindex nd DNA sekvenemi do. Ing. Jn Holub, Ph.D. ktedr teoretiké informtiky Fkult informčníh tehnologií České vysoké učení tehniké v Prze ENBIK 2014 10. 6. 2014 ENBIK 2014, 10. 5. 2014 J. Holub: Autoindex

Více

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální choroby

Více

Polymerázová řetězová reakce. Základní technika molekulární diagnostiky.

Polymerázová řetězová reakce. Základní technika molekulární diagnostiky. Polymerázová řetězová reakce Základní technika molekulární diagnostiky. Kdo za to může? Kary Mullis 1983 Nobelova cena 1993 Princip PCR Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction PCR) umožňuje

Více

Využití DNA markerů ve studiu fylogeneze rostlin

Využití DNA markerů ve studiu fylogeneze rostlin Mendelova genetika v příkladech Využití DNA markerů ve studiu fylogeneze rostlin Ing. Petra VESELÁ Ústav lesnické botaniky, dendrologie a geobiocenologie LDF MENDELU Brno Tento projekt je spolufinancován

Více

MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII. Martina Nováková, VŠCHT Praha

MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII. Martina Nováková, VŠCHT Praha MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII Martina Nováková, VŠCHT Praha MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE V BIOREMEDIACÍCH enumerace FISH průtoková cytometrie klonování produktů PCR sekvenování

Více

Izolace nukleových kyselin

Izolace nukleových kyselin Izolace nukleových kyselin Požadavky na izolaci nukleových kyselin V nativním stavu z přirozeného materiálu v dostatečném množství požadované čistotě. Nukleové kyseliny je třeba zbavit všech látek, které

Více

Návrh směrnic pro správnou laboratorní diagnostiku Friedreichovy ataxie.

Návrh směrnic pro správnou laboratorní diagnostiku Friedreichovy ataxie. Návrh směrnic pro správnou laboratorní diagnostiku Friedreichovy ataxie. Připravila L.Fajkusová Online Mendelian Inheritance in Man: #229300 FRIEDREICH ATAXIA 1; FRDA *606829 FRDA GENE; FRDA Popis onemocnění

Více

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP)

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) ÚSTAV LÉKAŘSKÉ BIOCHEMIE A LABORATORNÍ DIAGNOSTIKY 1. LF UK Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) Praktické cvičení z lékařské biochemie Všeobecné lékařství Martin Vejražka 2017/18 Obsah POLYMORFISMUS

Více

Analýza DNA. Co zjišťujeme u DNA DNA. PCR polymerase chain reaction. Princip PCR PRINCIP METODY PCR

Analýza DNA. Co zjišťujeme u DNA DNA. PCR polymerase chain reaction. Princip PCR PRINCIP METODY PCR o zjišťujeme u DN nalýza DN enetickou podstatu konkrétních proteinů Mutace bodové (sekvenční delece nebo inzerce nukleotidů), chromosomové aberace (numerické, strukturální) Polymorfismy konkrétní mutace,

Více

SDS-PAGE elektroforéza

SDS-PAGE elektroforéza SDS-PAGE elektroforéza Příprava gelu... 1 Recept na 0.75 mm gel (1 gel/2 gely)... 2 Recept na 1.5 mm gel (1 gel/2 gely)... 2 Příprava vzorku... 3 Elektroforéza... 3 Barvení gelů Blue Silver... 4 Chemikálie

Více

α-globin StripAssay Kat. číslo 4-160 10 testů 2-8 C

α-globin StripAssay Kat. číslo 4-160 10 testů 2-8 C α-globin StripAssay Kat. číslo 4-160 10 testů 2-8 C Popis stripů: Pracovní postup Izolace DNA Doporučujeme použít následující kit pro izolaci DNA z plné krve nebo jiných typů vzorků: Spin Micro DNA Extraction

Více

Opravný list k diplomové práci ERRATA

Opravný list k diplomové práci ERRATA Opravný list k diplomové práci ERRATA Str. 36 (kapitola 3.1.8, první řádek): Chybně: (kavkazská populace) Správně: (česká populace) Str. 45 Chybně: Tab. 11: Složení směsi pro jednu Real Time PCR reakci

Více

Bi5130 Základy práce s lidskou adna

Bi5130 Základy práce s lidskou adna Bi5130 Základy práce s lidskou adna Mgr. et Mgr. Kristýna Brzobohatá pizova@sci.muni.cz Laboratoř biologické a molekulární antropologie, ÚEB, PřF, Mu Bi5130 Základy práce s lidskou adna PCR polymerase

Více

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Inovace studia molekulární a buněčné biologie Inovace studia molekulární a buněčné biologie I n v e s t i c e d o r o z v o j e v z d ě l á v á n í reg. č. CZ.1.07/2.2.00/07.0354 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním

Více

Praktické cvičení: Izolace a purifikace rekombinantního proteinu

Praktické cvičení: Izolace a purifikace rekombinantního proteinu Praktické cvičení: Izolace a purifikace rekombinantního proteinu Toto blokové praktické cvičení spočívá v teoretickém i praktickém seznámení s rekombinantními proteiny, jejich izolací, purifikací a využitím.

Více

Využití rep-pcr v bakteriální taxonomii

Využití rep-pcr v bakteriální taxonomii Využití rep-pcr v bakteriální taxonomii Pavel Švec Česká sbírka mikroorganismů Přírodovědecká fakulta MU rep-pcr založeny na shlukové analýze PCR produktů získaných s primery komplementárními k rozptýleným

Více

Mgr. Veronika Peňásová vpenasova@fnbrno.cz Laboratoř molekulární diagnostiky, OLG FN Brno Klinika dětské onkologie, FN Brno

Mgr. Veronika Peňásová vpenasova@fnbrno.cz Laboratoř molekulární diagnostiky, OLG FN Brno Klinika dětské onkologie, FN Brno Retinoblastom Mgr. Veronika Peňásová vpenasova@fnbrno.cz Laboratoř molekulární diagnostiky, OLG FN Brno Klinika dětské onkologie, FN Brno Retinoblastom (RBL) zhoubný nádor oka, pocházející z primitivních

Více

TESTOVÁNÍ GMO Praktikum fyziologie rostlin

TESTOVÁNÍ GMO Praktikum fyziologie rostlin Teoretický úvod: TESTOVÁNÍ GMO Praktikum fyziologie rostlin 1 Teoretický úvod: TESTOVÁNÍ GMO Obecně na úvod Určitě jste už slyšeli pojem geneticky modifikovaný organismus (GMO). Úprava vlastností přirozeně

Více

POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR)

POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR) POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR) Polymerázová řetězová reakce (PCR, z anglického Polymerase Chain Reaction) je metoda rychlého zmnožení (amplifikace) vybraného úseku DNA. Množený (amplifikovaný) úsek

Více

Genetický polymorfismus

Genetický polymorfismus Genetický polymorfismus Za geneticky polymorfní je považován znak s nejméně dvěma geneticky podmíněnými variantami v jedné populaci, které se nachází v takových frekvencích, že i zřídkavá má frekvenci

Více

Určeno pro obecné laboratorní užití. Není určeno pro použití v diagnostických postupech. POUZE PRO POUŽITÍ IN VITRO.

Určeno pro obecné laboratorní užití. Není určeno pro použití v diagnostických postupech. POUZE PRO POUŽITÍ IN VITRO. Určeno pro obecné laboratorní užití. Není určeno pro použití v diagnostických postupech. POUZE PRO POUŽITÍ IN VITRO. PCR Nucleotide Mix Předem připravený roztok ultračistých PCR deoxynukleotidů (datp,

Více

Analýza DNA. Co zjišťujeme u DNA

Analýza DNA. Co zjišťujeme u DNA Analýza DNA Co zjišťujeme u DNA Genetickou podstatu konkrétních proteinů Mutace bodové (sekvenční delece nebo inzerce nukleotidů, záměny), chromosomové aberace (numerické, strukturní) Polymorfismy konkrétní

Více

Molekulární biotechnologie č.9. Cílená mutageneze a proteinové inženýrství

Molekulární biotechnologie č.9. Cílená mutageneze a proteinové inženýrství Molekulární biotechnologie č.9 Cílená mutageneze a proteinové inženýrství Gen kódující jakýkoliv protein lze izolovat z přírody, klonovat, exprimovat v hostitelském organismu. rekombinantní protein purifikovat

Více

Co zjišťujeme u DNA ACGGTCGACTGCGATGAACTCCC ACGGTCGACTGCGATCAACTCCC ACGGTCGACTGCGATTTGAACTCCC

Co zjišťujeme u DNA ACGGTCGACTGCGATGAACTCCC ACGGTCGACTGCGATCAACTCCC ACGGTCGACTGCGATTTGAACTCCC Analýza DNA Co zjišťujeme u DNA genetickou podstatu konkrétních proteinů mutace bodové, sekvenční delece/inzerce nukleotidů, chromosomové aberace (numerické, strukturální) polymorfismy konkrétní mutace,

Více

Seznam použitých chemikálií

Seznam použitých chemikálií PŘÍLOHY Tabulky Tabulka č. 1. Přehled výsledků teplot tání pro amplifikáty primeru G3010A. Testování teplot tání rozředěného zásobího roztoku o koncentraci ndna 1ng / 1μl, ředění uvedeno v tabulce. Tabulka

Více

MagPurix Blood DNA Extraction Kit 200

MagPurix Blood DNA Extraction Kit 200 MagPurix Blood DNA Extraction Kit 200 Kat. č. ZP02001-48 Doba zpracování: 50-60 minut pro MagPurix 12S 50-70 minut pro MagPurix 24 Použití Souprava MagPurix Blood DNA Extraction Kit 200 je určena pro izolátor

Více

Braf 600/601 StripAssay

Braf 600/601 StripAssay Braf 600/601 StripAssay Kat. číslo 5-560 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup Kit umožňuje detekci 9 mutací v genu BRAF (kodón 600 a 601) Další informace najdete v OMIM Online Mendelian Inheritance

Více

DETEKCE A IDENTIFIKACE FYTOPATOGENNÍCH BAKTERIÍ METODOU PCR-RFLP

DETEKCE A IDENTIFIKACE FYTOPATOGENNÍCH BAKTERIÍ METODOU PCR-RFLP DETEKCE A IDENTIFIKACE FYTOPATOGENNÍCH BAKTERIÍ METODOU PCR-RFLP Polymerázová řetězová reakce (PCR) je in vitro metoda pro enzymatickou syntézu definované sekvence DNA. Reakce využívá dvou oligonukleotidových

Více

Seminář izolačních technologií

Seminář izolačních technologií Seminář izolačních technologií Zpracoval: Karel Bílek a Kateřina Svobodová Podpořeno FRVŠ 2385/2007 a 1305/2009 Úpravy a aktualizace: Pavla Chalupová ÚMFGZ MZLU v Brně 1 Lokalizace jaderné DNA 2 http://www.paternityexperts.com/basicgenetics.html

Více

Příprava vektoru IZOLACE PLASMIDU ALKALICKÁ LYZE, KOLONKOVÁ IZOLACE DNA GELOVÁ ELEKTROFORÉZA RESTRIKČNÍ ŠTĚPENÍ. E. coli. lyze buňky.

Příprava vektoru IZOLACE PLASMIDU ALKALICKÁ LYZE, KOLONKOVÁ IZOLACE DNA GELOVÁ ELEKTROFORÉZA RESTRIKČNÍ ŠTĚPENÍ. E. coli. lyze buňky. Příprava vektoru IZOLCE PLSMIDU LKLICKÁ LYZE, KOLONKOVÁ IZOLCE DN E. coli plasmidová DN proteiny proteiny + + vysrážená plasmidová lyze buňky + snížení ph chromosomální DN centrifugace DN chromosomální

Více

CYCLER CHECK. Test pro validaci teplotní uniformity cyklérů. Připraveno k použití, prealiquotováno. REF 7104 (10 testů) REF (4 testy)

CYCLER CHECK. Test pro validaci teplotní uniformity cyklérů. Připraveno k použití, prealiquotováno. REF 7104 (10 testů) REF (4 testy) CZ Návod k použití CYCLER CHECK Test pro validaci teplotní uniformity cyklérů Připraveno k použití, prealiquotováno REF 7104 (10 testů) REF 71044 (4 testy) Obsah 1. Popis výrobku... 2 2. Materiál... 3

Více

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Inovace laboratorních úloh genetických předmětů metodikami pracujícími s ribonukleovými kyselinami pšenice Metodické návody pro laboratorní

Více

Hybridizace nukleových kyselin

Hybridizace nukleových kyselin Hybridizace nukleových kyselin Tvorba dvouřetězcových hybridů za dvou jednořetězcových a komplementárních molekul Založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA. Denaturace DNA oddělení komplementárních

Více

Molekulární genetika II zimní semestr 4. výukový týden ( )

Molekulární genetika II zimní semestr 4. výukový týden ( ) Ústav biologie a lékařské genetiky 1.LF UK a VFN, Praha Molekulární genetika II zimní semestr 4. výukový týden (27.10. 31.10.2008) prenatální DNA diagnostika presymptomatická Potvrzení diagnózy Diagnostika

Více

Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování

Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování Protein Gel Electrophoresis Kit obsahuje veškerý potřebný materiál provádění vertikální polyakrilamidové gelové elektroforézy. Experiment provádějí

Více

MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY:

MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY: MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY: POKROČILÉ PRAKTICKÉ VZDĚLÁVÁNÍ V EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGII Operační program Vzdělávání pro konkurenceschopnost Číslo projektu: CZ.1.07/2.3.00/09.0046 Praktický kurz pokročilých

Více

SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE)

SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE) SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE) Princip SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza slouží k separaci proteinů na základě jejich velikosti (molekulové hmotnosti). Zahřátím vzorku za

Více

Braf V600E StripAssay

Braf V600E StripAssay Braf V600E StripAssay Kat. číslo 5-570 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup 1. Izolace DNA Pro izolaci čerstvých nebo mražených biopsií použijte soupravy Qiagen QIAmp DNA Mini nebo Micro. Pro izolaci

Více

Terapeutické klonování, náhrada tkání a orgánů

Terapeutické klonování, náhrada tkání a orgánů Transfekce, elektroporace, retrovirová infekce Vnesení genů Vrstva fibroblastů, LIF Terapeutické klonování, náhrada tkání a orgánů Selekce ES buněk, v nichž došlo k začlenění vneseného genu homologní rekombinací

Více

DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová

DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH Michaela Nesvadbová Význam identifikace živočišných druhů v krmivu a potravinách povinností každého výrobce je řádně a pravdivě označit

Více

Farmakogenetika. Farmakogenetika

Farmakogenetika. Farmakogenetika Farmakogenetika Farmakogenetika 28.5.28 Cíle: na základě interdisciplinárního integrace znalostí farmakologie a genetiky popsat vliv dědičnosti na odpověď organismu na různé léky Farmakogenomika Farmakodynamika:

Více

EGFR XL StripAssay. Kat. číslo 5-630. 20 testů 2-8 C

EGFR XL StripAssay. Kat. číslo 5-630. 20 testů 2-8 C EGFR XL StripAssay Kat. číslo 5-630 20 testů 2-8 C Popis stripu Pracovní postup 1. Izolace DNA Pro izolaci DNA použijte vhodný izolační kit. Doporučené kity jsou následující: Pro izolaci čerstvých nebo

Více

Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci. reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/

Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci. reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/ Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/28.0088 Hybridizační metody v diagnostice Mgr. Gabriela Kořínková, Ph.D. Laboratoř molekulární

Více

Lékařská chemie a biochemie modelový vstupní test ke zkoušce

Lékařská chemie a biochemie modelový vstupní test ke zkoušce Lékařská chemie a biochemie modelový vstupní test ke zkoušce 1. Máte pufr připravený smísením 150 ml CH3COOH o c = 0,2 mol/l a 100 ml CH3COONa o c = 0,25 mol/l. Jaké bude ph pufru, pokud přidáme 10 ml

Více

Projekt FR-TI2/075 MPO příklad spolupráce farmaceutů s komerčním sektorem. Milan Bartoš. Forum veterinarium, Brno 2010

Projekt FR-TI2/075 MPO příklad spolupráce farmaceutů s komerčním sektorem. Milan Bartoš. Forum veterinarium, Brno 2010 Projekt FR-TI2/075 MPO příklad spolupráce farmaceutů s komerčním sektorem Milan Bartoš Forum veterinarium, Brno 2010 Vývoj farmakogenetické diagnostické soupravy pro stanovení genetických polymorfismů

Více

Western blotting. 10% APS 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl

Western blotting. 10% APS 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl Western blotting 1. Příprava gelu složení aparatury hustotu gelu volit podle velikosti proteinů příprava rozdělovacího gelu: 10% 12% počet gelů 1 2 4 1 2 4 objem 6 ml 12 ml 24 ml 6 ml 12 ml 24 ml 40% akrylamid

Více

NRAS StripAssay. Kat. číslo 5-610. 20 testů 2-8 C

NRAS StripAssay. Kat. číslo 5-610. 20 testů 2-8 C NRAS StripAssay Kat. číslo 5-610 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup 1. Izolace DNA Pro izolaci DNA musí být použita vhodná metoda vzhledem k typu tkáně vzorku. Pro doporučení vhodné metody kontaktujte

Více

Xenobiotika a jejich analýza v klinických laboratořích

Xenobiotika a jejich analýza v klinických laboratořích Xenobiotika a jejich analýza v klinických laboratořích BERÁNEK M., BORSKÁ L., KREMLÁČEK J., FIALA Z., MÁLKOVÁ A., VOŘÍŠEK V., PALIČKA V. Lékařská fakulta UK a FN Hradec Králové Finančně podporováno programy

Více

Column DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202)

Column DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202) Column DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202) Popis Column DNA Lego Kit je základ moderní stavebnicové (Lego) soupravy pro izolaci čisté DNA různého

Více

Popis výsledku QC1156/01/2004 Identifikace projektu:

Popis výsledku QC1156/01/2004 Identifikace projektu: Popis výsledku QC1156/01/2004 Identifikace projektu: ČÍSLO PROJEKTU QC1156 PROGRAM TÉMA PRIORITA Program I B) Zlepšování biologického potenciálu rostlin a zvířat a jeho efektivní využívání 3) Metody charakterizace

Více

Detekce Leidenské mutace

Detekce Leidenské mutace Detekce Leidenské mutace MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE 3. Restrikční štěpení, elektroforéza + interpretace výsledků Restrikční endonukleasy(restriktasy) bakteriální enzymy štěpící cizorodou dsdna na kratší úseky

Více

Obsah 1 Úvod 2 Variabilita lékové odpovědi 3 Klinické využití určování koncentrace léčiv

Obsah 1 Úvod 2 Variabilita lékové odpovědi 3 Klinické využití určování koncentrace léčiv Obsah 1 Úvod... 11 2 Variabilita lékové odpovědi... 14 2.1 Faktory variability... 14 2.2 Vliv onemocnění... 17 2.2.1 Chronické srdeční selhání... 17 2.2.2 Snížená funkce ledvin... 18 2.2.3 Snížená funkce

Více

Mgr. et Mgr. Lenka Falková. Laboratoř agrogenomiky. Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Mendelova univerzita

Mgr. et Mgr. Lenka Falková. Laboratoř agrogenomiky. Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Mendelova univerzita Mgr. et Mgr. Lenka Falková Laboratoř agrogenomiky Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Mendelova univerzita 9. 9. 2015 Šlechtění Užitek hospodářská zvířata X zájmová zvířata Zemědělství X chovatelství

Více

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN Fragmenty nukleových kyselin lze dle jejich velikosti rozdělit elektroforézou. Elektroforéza využívá rozdílné pohyblivosti jednotlivých fragmentů, danou právě

Více

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Inovace praktických cvičení molekulárně-biologických předmětů o sekvenční úlohy PRACOVNÍ PROTOKOL PRO PŘEDMĚT GENETCKÁ DIVERZITA Vypracováno

Více

ACTIVATION OF DEHYDRIN GENES OF GERMINATE PLANTS OF BARLEY TO DROUGHT AND COLD AKTIVACE DEHYDRINOVÝCH GENŮ KLÍČNÍCH ROSTLIN JEČMENE SUCHEM A CHLADEM

ACTIVATION OF DEHYDRIN GENES OF GERMINATE PLANTS OF BARLEY TO DROUGHT AND COLD AKTIVACE DEHYDRINOVÝCH GENŮ KLÍČNÍCH ROSTLIN JEČMENE SUCHEM A CHLADEM ACTIVATION OF DEHYDRIN GENES OF GERMINATE PLANTS OF BARLEY TO DROUGHT AND COLD AKTIVACE DEHYDRINOVÝCH GENŮ KLÍČNÍCH ROSTLIN JEČMENE SUCHEM A CHLADEM Dokoupilová Z., Holková L., Chloupek O. Ústav pěstování

Více

NGS analýza dat. kroužek, Alena Musilová

NGS analýza dat. kroužek, Alena Musilová NGS analýza dat kroužek, 16.12.2016 Alena Musilová Typy NGS experimentů Název Materiál Cílí na..? Cíl experimentu? amplikon DNA malý počet vybraných genů hledání variant exom DNA všechny geny hledání

Více

Izolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD..

Izolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD.. Izolace RNA doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD.. Metodiky izolace RNA celková buněčná RNA ( total RNA) zahrnuje řadu typů RNA, které se mohou lišit svými fyzikálněchemickými vlastnostmi a tedy i nároky na jejich

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Národní referenční laboratoř Strana KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ GENETICKÝCH MODIFIKACÍ METODOU qpcr POMOCÍ ROTOR-GENE PROBE PCR KITU Účel a rozsah Postup slouží ke kvantitativnímu stanovení genetických modifikací

Více

Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ

Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Ivo Frébort 5. Metody molekulární biologie II DNA footprinting hledání interakcí DNA s proteiny Polymerázová řetězová reakce (Polymerase chain reaction PCR) Malé

Více

Konečná zpráva hodnocení různých způsobů přípravy vzorků pro AMPLICOR HPV test firmy Roche

Konečná zpráva hodnocení různých způsobů přípravy vzorků pro AMPLICOR HPV test firmy Roche Konečná zpráva hodnocení různých způsobů přípravy vzorků pro AMPLICOR HPV test firmy Roche Charakteristika testu: Set AMPLICOR HPV vyráběný firmou Roche je určený pro detekci vysoko-rizikových typů lidských

Více

Yi TPMT. Diagnostická souprava. Návod k použití. Haasova 27 Brno Česká republika. tel.:

Yi TPMT. Diagnostická souprava. Návod k použití. Haasova 27 Brno Česká republika. tel.: Yi TPMT Diagnostická souprava Návod k použití Výrobce: YBUX s.r.o. Haasova 27 Brno 616 00 Česká republika IČ 63487951 tel.: +420 541 423 710 e-mail: ybux@ybux.eu Název: Yi TPMT Popis: Diagnostická souprava

Více

Genotypování markerů užitkovosti a zdraví u skotu

Genotypování markerů užitkovosti a zdraví u skotu Mezinárodní odborný seminář Využití chovatelských dat onemocnění skotu pro management stád, šlechtění a pro racionální užívání antimikrobik. Genotypování markerů užitkovosti a zdraví u skotu Jitka Kyseľová

Více

Základní pojmy obecné genetiky, kvalitativní a kvantitativní znaky, vztahy mezi geny

Základní pojmy obecné genetiky, kvalitativní a kvantitativní znaky, vztahy mezi geny Obecná genetika Základní pojmy obecné genetiky, kvalitativní a kvantitativní znaky, vztahy mezi geny Doc. RNDr. Ing. Eva PALÁTOVÁ, PhD. Ing. Roman LONGAUER, CSc. Ústav zakládání a pěstění lesů LDF MENDELU

Více

Tkáňový homogenizátor MagNA Lyser od společnosti Roche

Tkáňový homogenizátor MagNA Lyser od společnosti Roche Izolace RNA Pracovní postup Homogenizace: Pozn. Postup homogenizace platí pouze pro izolaci RNA z nativní tkáně, v případě izolace z buněčné suspenze je tento krok vynechán a začíná se přídavkem homogenizačního

Více

1. Definice a historie oboru molekulární medicína. 3. Základní laboratorní techniky v molekulární medicíně

1. Definice a historie oboru molekulární medicína. 3. Základní laboratorní techniky v molekulární medicíně Obsah Předmluvy 1. Definice a historie oboru molekulární medicína 1.1. Historie molekulární medicíny 2. Základní principy molekulární biologie 2.1. Historie molekulární biologie 2.2. DNA a chromozomy 2.3.

Více

Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie

Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie IZOLACE GENOMOVÉ DNA Deoxyribonukleová kyselina (DNA) představuje základní genetický materiál většiny

Více

Diagnostika retrovirů Lentiviry - HIV. Vladislava Růžičková

Diagnostika retrovirů Lentiviry - HIV. Vladislava Růžičková Diagnostika retrovirů Lentiviry - HIV Vladislava Růžičková VI. Třída RNA-viry se zpětnou transkriptázou RT Čeleď: Retroviridae (hostitelé: Obratlovci) Rody: Alpharetrovirus Betaretrovirus Gammaretrovirus

Více

IZOLACE DNA (KIT DNeasy Plant Mini)

IZOLACE DNA (KIT DNeasy Plant Mini) 17.1 Izolace DNA (kit DNeasy Plant Mini) Strana 1 IZOLACE DNA (KIT DNeasy Plant Mini) 1 Účel a rozsah Postup slouží k získání deoxyribonukleové kyseliny (DNA) ze vzorku pomocí komerčního kitu DNeasy Plant

Více

OBSAH. PP Master Mixy... 11 PPP Master Mix 12 Plain PP Master Mix 13 Combi PPP Master Mix 14

OBSAH. PP Master Mixy... 11 PPP Master Mix 12 Plain PP Master Mix 13 Combi PPP Master Mix 14 OBSAH DNA polymerázy pro PCR a pufry.................. 3 Taq DNA polymeráza 4 Taq DNA polymeráza Unis 5 TaqPurple DNA polymeráza 6 Taq DNA polymeráza 1.1 7 Combi Taq DNA polymeráza 8 LA DNA Polymerases

Více

Genetický polymorfismus jako nástroj identifikace osob v kriminalistické a soudnělékařské. doc. RNDr. Ivan Mazura, CSc.

Genetický polymorfismus jako nástroj identifikace osob v kriminalistické a soudnělékařské. doc. RNDr. Ivan Mazura, CSc. Genetický polymorfismus jako nástroj identifikace osob v kriminalistické a soudnělékařské praxi doc. RNDr. Ivan Mazura, CSc. Historie forenzní genetiky 1985-1986 Alec Jeffreys a satelitní DNA 1980 Ray

Více

2. Z následujících tvrzení, týkajících se prokaryotické buňky, vyberte správné:

2. Z následujících tvrzení, týkajících se prokaryotické buňky, vyberte správné: Výběrové otázky: 1. Součástí všech prokaryotických buněk je: a) DNA, plazmidy b) plazmidy, mitochondrie c) plazmidy, ribozomy d) mitochondrie, endoplazmatické retikulum 2. Z následujících tvrzení, týkajících

Více

Některé vlastnosti DNA důležité pro analýzu

Některé vlastnosti DNA důležité pro analýzu Některé vlastnosti DNA důležité pro analýzu Spiralizace Denaturace Záporný náboj Syntéza Ligace Rekombinace Mutabilita Despiralizace Reasociace Štěpení Metody používané k analýze DNA Southern blotting

Více

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů Polymorfismus délky restrikčních fragmentů Princip: Chemikálie: PCR produkt z předchozího praktického cvičení Endonukleáza KpnI 10 U μl -1 Pufr pro KpnI 10 koncentrovaný (Tris-HCl 100 mmol l -1 ph 7,5,

Více

ANALYSIS OF SERPINE1 GENE VARIABILITY IN PIGS

ANALYSIS OF SERPINE1 GENE VARIABILITY IN PIGS ANALYSIS OF SERPINE1 GENE VARIABILITY IN PIGS Weisz F., Knoll A. Department of Animal Morphology, Physiology and Genetics, Faculty of Agronomy, Mendel University of Agriculture and Forestry in Brno, Zemedelska

Více

INTRODUCING OF SNAPSHOT METHOD FOR POLYMORPHISM DETECTION ZAVEDENÍ SNAPSHOT METODIKY PRO DETEKCI POLYMORFISMŮ

INTRODUCING OF SNAPSHOT METHOD FOR POLYMORPHISM DETECTION ZAVEDENÍ SNAPSHOT METODIKY PRO DETEKCI POLYMORFISMŮ INTRODUCING OF SNAPSHOT METHOD FOR POLYMORPHISM DETECTION ZAVEDENÍ SNAPSHOT METODIKY PRO DETEKCI POLYMORFISMŮ Civáňová K., Knoll A. Ústav genetiky, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělská a lesnická

Více

Crossing-over. over. synaptonemální komplex

Crossing-over. over. synaptonemální komplex Genetické mapy Crossing-over over v průběhu profáze I meiózy princip rekombinace genetického materiálu mezi maternálním a paternálním chromosomem synaptonemální komplex zlomy a nová spojení chromatinových

Více

TECHNICKÁ SPECIFIKACE Vybavení genetické laboratoře pro projekt EXTEMIT-K část B

TECHNICKÁ SPECIFIKACE Vybavení genetické laboratoře pro projekt EXTEMIT-K část B TECHNICKÁ SPECIFIKACE Vybavení genetické laboratoře pro projekt EXTEMIT-K část B OBSAH Sestava pro vertikální elektroforézu... 2 Jednotka pro elektroforézu... 3 Termocykler... 4 Elektrický zdroj pro elektroforézu...

Více

cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2

cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2 cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2 Obsah soupravy a její skladování Tato souprava pro reverzní transkripci obsahuje reagencie potřebné k provedení reverzní transkripce (RT)

Více

Suchá krevní skvrna (Suchá krevní kapka, Dried Blood Spot)

Suchá krevní skvrna (Suchá krevní kapka, Dried Blood Spot) Suchá krevní skvrna (Suchá krevní kapka, Dried Blood Spot) Kapka kapilární krve nanesena na testovací kartičku filtračního papíru a vysušena odběr z prstu ušního lalůčku z patičky (u novorozenců) odběrová

Více

Kras XL StripAssay. Kat. číslo 5-680. 20 testů 2-8 C

Kras XL StripAssay. Kat. číslo 5-680. 20 testů 2-8 C Kras XL StripAssay Kat. číslo 5-680 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup 1. Izolace DNA Musí být použity vhodné metody extrakce DNA, v závislosti na typu vzorku, který má být vyšetřován. Doporučení

Více

Genetický kód. Jakmile vznikne funkční mrna, informace v ní obsažená může být ihned použita pro syntézu proteinu.

Genetický kód. Jakmile vznikne funkční mrna, informace v ní obsažená může být ihned použita pro syntézu proteinu. Genetický kód Jakmile vznikne funkční, informace v ní obsažená může být ihned použita pro syntézu proteinu. Pravidla, kterými se řídí prostřednictvím přenos z nukleotidové sekvence DNA do aminokyselinové

Více

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin Metody používané v MB analýza proteinů, nukleových kyselin Nukleové kyseliny analýza a manipulace Elektroforéza (délka fragmentů, čistota, kvantifikace) Restrikční štěpení (manipulace s DNA, identifikace

Více

Amplifikační metody v molekulární diagnostice mikroorganismů. doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D.

Amplifikační metody v molekulární diagnostice mikroorganismů. doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. Amplifikační metody v molekulární diagnostice mikroorganismů doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu.cz Přírodovědecká fakulta MU, 2012 Doporučená literatura 1) Persing et al. (1993): Diagnostic Molecular

Více

Crossing-over. Synaptonemální komplex. Crossing-over a výměna genetického materiálu. Párování homologních chromosomů

Crossing-over. Synaptonemální komplex. Crossing-over a výměna genetického materiálu. Párování homologních chromosomů Vazba genů Crossing-over V průběhu profáze I meiózy Princip rekombinace genetického materiálu mezi maternálním a paternálním chromosomem Synaptonemální komplex Zlomy a nová spojení chromatinových řetězců

Více

Optimalizace metody PCR pro její využití na vzorky KONTAMINOVANÝCH PITNÝCH VOD

Optimalizace metody PCR pro její využití na vzorky KONTAMINOVANÝCH PITNÝCH VOD Optimalizace metody PCR pro její využití na vzorky KONTAMINOVANÝCH PITNÝCH VOD Dana Vejmelková, Milan Šída, Kateřina Jarošová, Jana Říhová Ambrožová VODÁRENSKÁ BIOLOGIE, 1. 2. 2017 ÚVOD Sledované parametry,

Více

GENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI

GENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI GENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI INDUKOVANÉ PŮSOBENÍM ORGANICKÝCH LÁTEK Z PRACHOVÝCH ČÁSTIC V OVZDUŠÍ Kateřina Hanzalová Oddělení genetické ekotoxikologie Ústav experimentální medicíny AV ČR v.v.i.

Více

NÁVOD K POUŽITÍ PRO HER2 DNA QUANTIFICATION KIT

NÁVOD K POUŽITÍ PRO HER2 DNA QUANTIFICATION KIT IČ: 80 DIČ: CZ80 sales@intellmed.eu NÁVOD K POUŽITÍ PRO HER DNA QUANTIFICATION KIT IČ: 80 DIČ: CZ80 sales@intellmed.eu OBSAH Návod k použití pro HER DNA QUANTIFICATION KIT.... Úvod.... Označení.... Rozsah

Více

velké fragmenty střední fragmenty malé fragmenty

velké fragmenty střední fragmenty malé fragmenty velké fragmenty střední fragmenty malé fragmenty Southern 1975 Northern Western denaturace DNA hybridizace primerů (annealing) (mají délku kolem 20 bází) syntéza nové DNA termostabilní polymerázou vstup

Více

RIGORÓZNÍ OTÁZKY - BIOLOGIE ČLOVĚKA

RIGORÓZNÍ OTÁZKY - BIOLOGIE ČLOVĚKA RIGORÓZNÍ OTÁZKY - BIOLOGIE ČLOVĚKA 1. Genotyp a jeho variabilita, mutace a rekombinace Specifická imunitní odpověď Prevence a časná diagnostika vrozených vad 2. Genotyp a prostředí Regulace buněčného

Více

Sure-MeDIP I. with magnetic beads and MNase. www.krd.cz

Sure-MeDIP I. with magnetic beads and MNase. www.krd.cz Sure-MeDIP I with magnetic beads and MNase www.krd.cz 1 Obsah soupravy a skladování MeDIP souprava obsahuje reagencie na provedení 25 reakcí. Souprava je rozdělen do dvou částí, jedna je distribuována

Více

Jan Hodek, Jaroslava Ovesná, Lucie Pavlátová. METODIKA DETEKCE GENETICKY MODIFIKOVANÉ PAPÁJI LINIÍ 55-1 a 63-1 METODIKA PRO PRAXI

Jan Hodek, Jaroslava Ovesná, Lucie Pavlátová. METODIKA DETEKCE GENETICKY MODIFIKOVANÉ PAPÁJI LINIÍ 55-1 a 63-1 METODIKA PRO PRAXI Jan Hodek, Jaroslava Ovesná, Lucie Pavlátová METODIKA DETEKCE GENETICKY MODIFIKOVANÉ PAPÁJI LINIÍ 55-1 a 63-1 METODIKA PRO PRAXI Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008 Metodika byla vypracována pracovníky

Více

Pulzní gelová elektroforéza Při konvenční gelové elektroforéze je rozdělení molekul je podmíněno rychlejším průchodem menších molekul pórovitou

Pulzní gelová elektroforéza Při konvenční gelové elektroforéze je rozdělení molekul je podmíněno rychlejším průchodem menších molekul pórovitou Pulzní gelová elektroforéza Při konvenční gelové elektroforéze je rozdělení molekul je podmíněno rychlejším průchodem menších molekul pórovitou strukturou gelové matrice. Tento princip separace se uplatňuje

Více