UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA. Katedra biofyziky DIPLOMOVÁ PRÁCE. Možnosti genetických metod v identifikaci a charakterizaci

Transkript

1 UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Katedra biofyziky DIPLOMOVÁ PRÁCE Možnosti genetických metod v identifikaci a charakterizaci gramnegativních nefermentujících bakterií Vypracovala: Studijní obor: Vedoucí diplomová práce: Bc. Pavla Hlaváčková Molekulární biofyzika Ing. Magdaléna Röderová, Ph.D. Olomouc 2014 i

2 Děkuji vedoucí diplomové práce, Ing. Magdaléně Röderové, Ph.D., za její čas, ochotu a rady. Děkuji také doc. MUDr. Janu Bardoňovi, Ph.D., MBA ze Státního veterinárního ústavu Olomouc za vykonanou odbornou práci při identifikaci klinických izolátů pomocí MALDI-TOF MS a MUDr. Vladislavu Raclavskému, Ph.D a Mgr. Lucii Navrátilové za poskytnutí referenčních kmenů ze sbírky BCCM/LMG Ghent, Belgie. Diplomová práce vznikla za podpory grantu LF_2014_021 a projektu Operační program Výzkum a vývoj pro inovace (projekt CZ.1.05/2.1.00/ ). ii

3 Prohlašuji, že jsem předloženou diplomovou práci vypracovala samostatně pod vedením Ing. Magdalény Röderové, Ph.D., a že jsem použila zdrojů, které cituji a uvádím v seznamu použitých zdrojů. V Olomouci dne iii

4 SOUHRN Bakterie rodu Burkholderia a Stenotrophomonas řadíme mezi gramnegativní nefermentující tyčinky, patřící do čeledi Pseudomonadaceae. Jedná se o oportunní patogeny, které lze nalézt v půdě, mnohem častěji je však možné je izolovat z různých vodních zdrojů - stojatých, tekoucích či odpadních. Nebezpečí představují hlavně při výskytu v nemocničním prostředí. Infekce se objevují nejčastěji u imunokompromitovaných pacientů, nebo u pacientů se závažným základním onemocněním. Významnou vlastností těchto bakterií je jejich rezistence k řadě antibiotik a některým dezinfekčním prostředkům. V současnosti představuje druh Burkholderia cepacia skupinu vysoce diverzních bakterií a stejně tak druh Stenotrophomonas maltophilia vykazuje podle nejnovějších analýz velkou genetickou různorodost. Pro identifikaci se v běžné mikrobiologické praxi nejčastěji používají metody založené na mikroskopii, kultivaci a nejrůznějších biochemických testech. Problematickou fenotypovou detekci, kdy výsledkem je často záměna za jinou gramnegativní nefermentující bakterii, řeší přesnější genetické identifikační postupy. V rámci možností typizace je také na výběr z několika genetických postupů, které slouží k molekulární charakterizaci, stanovování příbuznosti klinických izolátů a sledování epidemiologie těchto bakterií. Cílem diplomové práce bylo využití vybraných genetických metod pro identifikaci a typizaci klinických izolátů bakterií Burkholderia cepacia complex a druhu Stenotrophomonas maltophilia. Ze 140 izolátů Burkholderia cepacia complex z celé České republiky, bylo identifikováno pomocí PCR, jako Burkholderia multivorans 97 % (136 izolátů), jeden izolát jako Burkholderia cepacia a jeden jako Burkholderia anthina. Zbylé dva byly nesprávně identifikovány standardními mikrobiologickými postupy, přičemž další analýzou bylo zjištěno, že se jedná o zástupce druhu Stenotrophomonas maltophilia. Typizací této bakteriální sbírky byl nejčastěji pozorován záchyt dvojic, trojic a čtveřic shodných izolátů u různých pacientů v rámci jednotlivých nemocnic, u vzorků z Fakultní nemocnice v Olomouci bylo dokonce blízce příbuzných až 29 izolátů. Tyto iv

5 vykazovaly vysokou míru podobnosti s epidemickým kmenem z předchozí studie realizované v této nemocnici. Také ve třech dalších případech byl potvrzen záchyt kmenů identických s tímto klonem (2 vzorky z Fakultní nemocnice Motol a 1 vzorek ze Vsetína). V případě druhu Stenotrophomonas maltophilia sestávala sbírka z 34 izolátů, přičemž pomocí PCR jich bylo určeno 32, což odpovídá 94 %, další dva izoláty (6 %) museli být vzhledem k negativním výsledkům dourčeny pomocí hmotnostní spektrometrie jako Acinetobacter baumannii. Většina kmenů Stenotrophomonas maltophilia se při typizaci metodou pulzní gelové elektroforézy ukázala jako sporadická. V jednotlivých nemocnicích, ze kterých byly izoláty bakterií poskytnuty, se v genetickém profilu ukázali tři dvojice izolátů, představující stejný bakteriální kmen. Při porovnávání dvou typizačních metod - pulzní gelové elektroforézy a náhodné amplifikace polymorfní DNA, jsme dosáhli shodných výsledků při určování genetické podobnosti izolátů Stenotrophomonas maltophilia. Metoda založená na analýze makrorestrikčních fragmentů však dosahovala většího rozlišení. v

6 SUMMARY Bacteria of the genus Burkholderia and Stenotrophomonas among nonfermentative Gram-negative rods belongs to the family Pseudomonadaceae. These are opportunistic pathogens, which can be found in soil, more frequently can be isolated from a different water resources - stagnant, flowing and waste. They are dangerous mainly in the hospital environment. Infections occur most frequently in immunocompromised patients, or in patients with serious basic diseases. An important featura of these bacteria is their resistance to many antibiotics and certain disinfectants. Currently represents Burkholderia cepacia a group of highly diverse bacterial species, Stenotrophomonas maltophilia shows according to the latest analysis high genetic diversity too. In routine microbiological practice are frequently used metods based on microscopy, cultivation and various biochemical tests for the identification. Problematic phenotyping detection, when the result is often mistaken for another Gramnegative non-fermenting bacteria, is solved by more accurate genetical identification methods. Within an options of typing there are some genetic approach which can by used to molecular characterization, to specify relations of clinical isolates and to monitor epidemiology of these bacteria. The aim of these thesis is exploitation of selected genetyping metods for the identifiaction and typing of clinical isolates of Burkholderia cepacia complex and Stenotrophomonas maltophilia. Of the 140 isolates of Bcc from the Czech republic has been 97 % (136 isolates) identified by PCR as Burkholdeia multivorans, one isolate as Burkholderia cepacia and one as Burkholderia anthina. The other two isolates were incorrectly identified by standard microbiological metods and additional analysis it was found that they are Stenotrophomonas matophilia. By using selected typing methods of this bacterial collection there was frequently observed twosome, treesome and foursome of identical isolates from different patients in the same hospital. Whithin samples from the vi

7 University Hospital in Olomouc there was found 29 isolates which were closely related. These samples showed a high degree of similarity with the epidemic strain from previous study carried out in this hospital. Also in another three cases was confirmed a collection of strains identical with this clone (2 samples from University hospital Motol and 1 sample from hospital in Vsetín). In the case of species Stenotrophomonas maltophilia collection consisted of 34 isolates and with PCR we confirmed 32, which corresponds to 94 %, the other two isolates (6 %) which were not identified had to be determined by mass spektrometry as a Acinobacter baumannii. Most strains of Stenotrophomonas maltophilia typed by pulse field gel electrophoresis proved to be sporadic. In individual hospitals from which were isolates of bacteria provided were found in genetic profil three pair of isolates representing the same bacterial strain. When comparing the two typing methods - pulsed field gel electrophoresis and random amplification of polymorphic DNA, we have achieved identical results in determining genetic similarity of Stenotrophomonas maltophilia isolates. However a method based on the analysis of macrorestriction fragments reached a higher resolution. vii

8 SEZNAM ZKRATEK A POUŽITÝCH SYMBOLŮ A Bcc bp BRIJ BSA C CF DNA dntps EDTA EGTA FNOL G HCl IKEM KCl LF UP MALDI-TOF MS adenin Burkholderia cepacia complex páry bazí polyoxyethylene (23) lauryl ether hovězí sérový albumin cytosin cystická fibróza deoxyribonukleová kyselina deoxyribonukleotid trifosfáty ethylendiamintetraoctová kyselina ethylenglykol-di-(2-aminoethylether)-tetraoctová kyselina Fakultní nemocnice Olomouc guanin kyselina chlorovodíková Institut klinické a experimentální medicíny v Praze chlorid draselný Lékařská fakulta Univerzity Palackého matrix assisted laser desorption/ionization massspektrometry, hmotnostní spektrometrie s analyzátorem doby letu a laserovou desorpcí/ionizací za účasti matrice viii

9 Mb MgCl2 MLST PCR PFGE RAPD rdna reca RFLP rrna T TBE TE Tris w/v mega bazí chlorid hořečnatý multi-locus sequence typing, multilokusová sekvenční analýza polymerase chain reaction, polymerázová řetězová reakce pulse-field gel electrophoresis, elektroforéza v pulzním poli random amplified polymorphic DNA, náhodná amplifikace polymorfní DNA ribozomální deoxynukletidová kyselina rekombináza A restriction fragment length polymorphism, polymorfismus délky restrikčních fragmentů ribozomální ribonukleotidová kyselina tymin Tris/Borát/EDTA pufr Tris/EDTA tris(hydroxymethyl)aminomethan wight/volume, hmotnostní zlomek ix

10 OBSAH 1 ÚVOD 1 2 TEORIE GENETICKÁ DIVERZITA DRUHU BURKHOLDERIA CEPACIA VÝSKYT A PATOGENITA BCC METODY IDENTIFIKACE A TYPIZACE BCC METODY IDENTIFIKACE BCC METODY TYPIZACE BCC GENETICKÁ DIVERZITA RODU STENOTROPHOMONAS VÝSKYT A PATOGENITA KMENŮ S. MALTOPHILIA METODY IDENTIFIKACE A TYPIZACE KMENŮ S. MALTOPHILIA METODY IDENTIFIKACE KMENŮ S. MALTOPHILIA METODY TYPIZACE KMENŮ S. MALTOPHILIA 16 3 CÍL PRÁCE 17 4 MATERIÁL A METODY SBĚR, IZOLACE A IDENTIFIKACE BAKTERIÍ BCC GENETICKÁ DETEKCE IZOLACE DNA PCR SEPARACE V AGARÓZOVÉM GELU 21 x

11 4.2.4 RAPD TYPIZACE SEPARACE V AGARÓZOVÉM GELU A VYHODNOCENÍ GENETICKÉ PŘÍBUZNOSTI IZOLÁTŮ SBĚR, IZOLACE A IDENTIFIKACE BAKTERIÍ DRUHU S. MALTOPHILIA GENETICKÁ DETEKCE IZOLACE DNA PCR SEPARACE V AGARÓZOVÉM GELU PFGE TYPIZACE Izolace DNA pro restrikční analýzu Restrikční analýza genomové DNA Separace metodou pulzní gelové elektroforézy RAPD TYPIZACE SEPARACE V AGARÓZOVÉM GELU A VYHODNOCENÍ GENETICKÉ PŘÍBUZNOSTI IZOLÁTŮ SEZNAM POUŽITÝCH LABORATORNÍCH PŘÍSTROJŮ 32 5 VÝSLEDKY GENETICKÁ IDENTIFIKACE BCC POMOCÍ PCR TYPIZACE KLINICKÝCH IZOLÁTŮ BCC POMOCÍ METODY RAPD GENETICKÁ IDENTIFIKACE S. MALTOPHILIA POMOCÍ PCR TYPIZACE KMENŮ S. MATOPHILIA METODOU RAPD TYPIZACE KMENŮ S. MATLOPHILIA METODOU PFGE 47 xi

12 6 DISKUZE IDENTIFIKACE A TYPIZACE BCC IDENTIFIKACE A TYPIZACE S. MALTOPHILIA 53 7 ZÁVĚR 56 8 SEZNAM LITERATURY 58 xii

13 1 ÚVOD Bakterie patřící do skupiny Burkholderia cepacia complex a druhu Stenotrophomonas maltophilia vykazují podle nejnovějších studii velkou genetickou diverzitu. V obou případech se jedná o oportunní patogeny běžně izolované z přírodního prostředí (půda nebo různé vodní zdroje), s rostoucí frekvencí je pak lze označit za původce infekcí u osob s oslabenou imunitou. Přesný zdroj infekce je často těžké určit, předpokládá se ale, že se jedná buď o přenos z pacienta na pacienta, nebo z nemocničního prostředí, zahrnující lékařské vybavení nebo kontaminované dezinfekční prostředky (Dongyou a kol., 2011). Obecně je patogenita jednotlivých představitelů těchto rodů nízká, bakterie však zvyšují své šance díky rezistenci k antibiotikům, v mnoha případech se dokonce jedná o tzv. multirezistenci k různým antimikrobiálním přípravkům nebo dokonce k dezinfekčním prostředkům, což v případě infekcí ještě zvyšuje procento morbidity a mortality (po prvním roce skoro až o 20 %, po pěti letech o 34 %) (Baldwin a kol., 2007, Jones a kol., 2014). Vzhledem k významné rezistenci těchto kmenů k řadě antibiotik, proto vyvstává potřeba jednoduché, rychlé a přesné identifikace získaných izolátů a zároveň jejich typizace pro sledování epidemiologie těchto bakterií v nemocničním prostředí (Whitby a kol., 2000). V běžné praxi se mikrobiologové spoléhají na výsledky fenotypové, tj. hodnotí se mikroskopický vzhled bakteriální kultury, dále pak výsledky kultivace a celé řady biochemických testů. V mnoha případech však může dojít k záměně s jinými gramnegativní bakteriemi, čímž se identifikace následně komplikuje. Naproti tomu metody genetické jsou přesnější a specifičtější a mohou potvrdit předpokládané výsledky fenotypové identifikace (Mahenthiralingam a kol., 2008, Dongyou a kol., 2011). 1

14 2 TEORIE Bakterie rodu Burkholderia a Stenotrophomonas řadíme mezi gramnegativní nefermentující bakterie čeledi Pseudomonadaceae (Obr. 1). Představitelé této čeledi jsou nejčastěji mírně zahnuté, štíhlé tyčinky schopné pohybu. Některé mohou produkovat řadu barevných pigmentů a vydávat specifickou vůni respektive zápach. Obrázek 1: Krevní agar s bakteriálním kmenem Burkholderia cepacia (vlevo) a Stenotrophomonas maltophilia (vpravo) Jedná se o oportunní patogeny členící se na mnoho podskupin, které lze hojně nalézt v půdě (nejčastěji v oblasti rhizosféry rostlin) nebo je možné je izolovat z různých vodních zdrojů. Nebezpečí představují hlavně při výskytu v nemocničním prostředí. Jejich patogenita je pro člověka poměrně malá a infekce vyvolávají pouze u lidí s oslabenou imunitou, jako jsou například pacienti s cystickou fibrózou (CF), nebo obecně s infekcemi dolních cest dýchacích. Také se mohou uplatnit jako původci urogenitálních infekcí či infekcí krevního řečiště. Rovněž je spojuje rezistence k řadě antibiotik, případně k některým dezinfekčním prostředkům a jejich problematická fenotypová detekce (Votava a kol., 2003). 2

15 2.1 Genetická diverzita druhu Burkholderia cepacia V roce 1950 William Burkholder jako první popsal bakterii způsobující hnilobu cibule, kterou následně nazval Pseudomonas cepacia. Díky fenotypové různorodosti byla původně zařazena mezi pseudomonady. Na základě molekulární taxonomie se však následně v roce 1992 pro P. cepacia vytvořil nový rod - rod Burkholderia. O pět let později pak bylo zjištěno, že Burkholderia cepacia představuje skupinu, skládající se nejméně z pěti geneticky rozdílných druhů, označovaných jako genomovary. Tento soubor genomovarů byl pojmenován Burkholderia cepacia complex (Bcc) (Mahenthiralingam a kol., 2008). Genomovar je taxonomická jednotka, která odpovídá bakteriálnímu druhu, jenž je definován pouze pomocí molekulárně genetických metod. Od blízce příbuzných druhů (tj. dalších genomovarů) nelze tuto jednotku odlišit běžnými fenotypovými metodami (zvláště testováním biochemických vlastností), a tak podle taxonomických pravidel nemá genomovar dvouslovné označení (Dřevínek, 2005, str. 1). Do roku 2002 bylo formálně popsáno devět genomovarů: Burkholderia cepacia, Burkholderia multivorans, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia stabilis, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia dolosa, Burkholderia ambifaria, Burkholderia anthina a Burkholderia pyrrocinia. Tyto genomovary jsou často označovány římskými číslicemi (I IX). V tentýž rok pak kolektiv autorů Vermis a kol. navrhl přidání dalšího genomovaru a nazvali jej Bulkholderia ubonensis (genomovar X) (Vermis a kol., 2002, Mahenthiralingam a kol., 2008). Sekvenační analýza reca genu v roce 2005 ukázala přítomnost čtyř nových reca typů označených jako Burkholderia cepacia skupina K, AW, BCC1 a BCC2. Pomocí multilokusové sekvenční analýzy (MLST), která vykazuje mnohem vyšší rozlišovací schopnost než analýza reca genu bylo kromě stávajících genomovarů ještě definováno 7 MLST skupin: skupina K, BCC1, BCC2, BCC3, BCC4, BCC5, BCC6 (Tab. 1) (Mahenthiralingam a kol., 2008). 3

16 Tabulka 1: Přehled genomovarů a jednotlivých MLST skupin Bcc Druh nebo MLST podskupina Burkholderia cepacia Burkholderia multivorans Burkholderia cenocepacia IIIA, IIIB, IIIC, IIID Burkholderia stabilis Burkholderia vietnamiensis Burkholderia dolosa Burkholderia ambifaria Burkholderia anthina Burkholderia pyrrocinia Burkholderia ubonensis Genomovar I II III IV V VI VII VIII IX X Skupina K - BCC1 - BCC2 - BCC3 - BCC4 - BCC5 - BCC6 - Využitím sekvenční analýzy reca genu, hybridizačních postupů a MLST metody byly v roce 2008 a 2009 identifikovány nové bakterie patřící do Bcc - Burkholderia latens, Burkholderia diffusa, Burkholderia arboris, Burkholderia seminalis, Burkholderia metallica a dále Burkholderia contaminans a Burkholderia lata, jako představitelé skupiny K. 4

17 V současnosti představuje Bcc skupinu vysoce diverzních bakterií, skládající se ze 17 odlišných druhů. Díky vysoké variabilitě v rámci genomu tento počet pravděpodobně ještě není konečný. Zástupci Bcc, máji poměrně velký genom o velikosti pohybující se mezi 6 a 9 Mb, který se skládá ze tří bakteriálních chromosomů a velkého počtu plasmidů. A právě takováto genetická kapacita, tvoří základ pro jejich mnohostrannost (Parke and Gurian-Sherman, 2001, Dongyou a kol., 2011, Hanulík a kol., 2012). 2.2 Výskyt a patogenita Bcc Zástupci Bcc se běžně vyskytují ve sladké vodě (stojaté, tekoucí nebo v odpadní) a v půdě, nejčastěji v oblasti rhizosféry rostlin, kde většinou jako symbionti osídlují kořeny (trav, pšenice, sóji, cukrové třtiny, kukuřice, rýže, hrachu nebo cibule) což ukazuje na to, že představitelé Bcc hodně kolonizují zemědělsky využívané plodiny. Některé genomovary se pak častěji nalézají na určitém druhu plodiny (Parke and Gurian-Sherman, 2001, Mahenthiralingam a kol., 2008). Výskyt Bcc byl také zaznamenán v kosmetických (zubní pasta, šampón, krém na ruce, opalovací krém, ústní voda) a farmaceutických přípravcích (tabletky na spaní, kapky proti nadýmání, lepidlo na protézy) nebo v řadě produktů využívaných v oblasti medicíny (gel pro ultrazvuk, heparin, chlorhexidin) (Jimenez and Smalls, 2000, Perry, 2001, Dongyou a kol., 2011). Bcc dokáže přežít a to i po dlouhou dobu v roztocích obsahujících látky, které působí antimikrobiálně (solné roztoky, benzalkonium chlorid) nebo které obsahují minimum živin (například v destilované vodě se zdrojem dusíku) (Payne a kol., 2005, Magenthiralingam a kol., 2006). U lidí se tato bakterie stává nebezpečným zdrojem nozokomiálních infekcí, kdy může způsobit různé druhy onemocnění včetně sepsí. Nejčastěji kolonizuje dvě skupiny osob jedince s umělými náhradami srdečních chlopní nebo s cévními implantáty a druhou skupinou lidí jsou pacienti s CF nebo chronickou granulomatózní chorobou, u nichž výrazně zhoršuje průběh onemocnění. Pacienti s CF jsou 5

18 nejstudovanějším zdrojem Bcc, protože už pouhá kolonizace jim zkracuje život (Votava a kol., 2003, Dongyou a kol., 2011). Před začátkem 80. let byl výskyt infekcí způsobených B. cepacia u člověka sporadický a soustřeďoval se na hospitalizované pacienty, kteří přišli do styku s kontaminovanými dezinfekčními prostředky nebo anestetiky. Na počátku 80. let pak došlo ke zvýšenému výskytu infekcí způsobených touto skupinou bakterií. V některých případech byly linie Bcc označeny za přenosné a virulentní, jindy jako nepřenosné a nevirulentní. Na CF pacienty však tato skupina bakterií působí individuálně a to v závislosti na několika faktorech - virulenci dané linie, výskytu tzv. cepacia syndromu (prudké zhoršení infekce s následkem smrti), účinku kolonizace jinými patogeny, věku pacienta, individuální imunitní odpovědi infikovaného člověka a závažnosti CF (Cunha a kol., 2007). K přenosu Bcc může docházet jednak mezi pacienty (během hospitalizace, pravidelného docházení do CF center, nebo kontaktu kolonizovaných jedinců mimo nemocniční zařízení) nebo získáním bakterií z okolního prostředí. Proto některé CF centra začali přecházet na protiepidemické režimy, tedy oddělení Bcc-pozitivních od Bcc-negativních pacientů (Pretto a kol., 2013). V posledních letech dochází ke zvyšování procenta infekcí způsobených B. multivorans a ke snižování procent u B. cenocepacia a to nejspíš v důsledku zavedených hygienicko-epidemiologických opatření v případě B. cenocepacia a soustavnému přenosu B. multivorans z prostředí (Govan a kol., 1996, Mahenthiralingam a kol., 1996, Mahenthiralingam a kol., 2008, Dongyou a kol., 2011). Bcc druhy exprimují řadu virulentních faktorů i když není stále jasné, které z nich jsou nejdůležitější během infekce. Vliv na patogenitu Bcc tak má hlavně jejich rezistence na řadu antibiotik, struktura jejich povrchu (kódují několik různých povrchových struktur, které se různí svou funkcí), a množství sekrečních produktů (proteázy, lipázy, ornibactin, katalázy, kataláz-peroxidázy, superoxid dismutázy nebo hemolysin). 6

19 Zástupci Bcc jsou rezistentní k mnohým antibiotikům, i když se citlivostí v rámci jednotlivých druhů liší. Faktory zodpovědnými za rezistenci jsou především exprese beta-laktamáz a přítomnost malého množství porinů (rezistence k beta-laktamovým antibiotikům), efluxní pumpy (rezistence ke chloramfenikolu, trimetoprimu a ciprofloxacinu), změny v dihydrofolát reduktáze (rezistence k trimetoprimu) či lipopolysacharidech (rezistence k aminoglykosidům a polymyxinu), případně produkce exopolysacharidů a tvorba biofilmů. Přirozeně rezistentní jsou k řadě antibiotik, včetně aminoglykosidů a polymixinu B. Kvůli velkému počtu mechanismů rezistence je léčba infikovaných pacientů složitá, často je potřeba podávat několik léčiv současně. Doporučuje se podávání ceftazidimu, kotrimoxazolu, ciprofloxacinu nebo jako alternatívní volba chloramfenikol a meropenem (Govan a kol., 1996, Lochmann a kol., 1998, Cunha a kol., 2004, Dongyou a kol., 2011). 2.3 Metody identifikace a typizace Bcc Správná diagnostika Bcc je důležitá kvůli nasazení časné a adekvátní antibiotické léčby a v rámci opatření prevence a kontroly infekcí. Problémem u Bcc je, že jsou často zaměňovány s jinými gramnegativní bakteriemi. Výskyt falešně pozitivních nálezů je 11 % a u falešně negativních je toto procento až trojnásobné (36 %). Identifikace Bcc je se tím komplikuje a vyžaduje kombinaci i několika molekulárně diagnostických postupů, čímž se omezuje na specializovaná pracoviště. Pro druhové rozlišení se využívá analýza sekvenace pomocí reca genu nebo MLST. V rámci identifikace Bcc selhává také mnoho komerčních biochemických kitů (McMenamin a kol., 2000, Mahenthiralingam a kol., 2008, Dongyou a kol., 2011) Metody identifikace Bcc Zástupci Bcc jsou při fenotypových metodách detekce nejčastěji zaměňováni s B. gladioli, Ralstonia pickettii, Alcaligenes spp., Pseudomonas spp., Stenotrophomonas maltophilia, Flavobacterium spp., a Chryseobacterium spp. Určení druhů Bcc pouze pomocí biochemické analýzy tak není zcela průkazné. Je však možno rozlišit druhy B. multivorans a B. stabilis od ostatních představitelů Bcc. Jako nejlepší fenotypové metody jsou doporučovány selektivní média, jako například B. cepacia 7

20 selektivní agar (BCSA od firmy Hardy Diagnostics), B. cepacia médium pro klinické izoláty (od firmy Mast Diagnostics), P. cepacia polycyklické hydrouhlíkaté médium (PCAT) a Trypan Blue Tetracycline (TB-T) pro vzorky z životního prostředí. Univerzální použití pro izolaci a identifikaci má Stewarsovo médium (OXOID, Biovendor). Mnohé komerční biochemické soupravy pro identifikaci Bcc selhávají, avšak při kombinaci s kultivací vzorků na BCSA a specifickými testy (dekarboxylace lysinu a ornithinu, oxidace sacharózy a adonitolu, pozitivní oxidáza, haemolýza a růst při 42 C) lze dosáhnout správné fenotypové identifikace. Méně časté metody v identifikaci Bcc jsou chemická analýza citlivosti na bakteriocin, sérotypizace, hmotnostní analýza, profilace proteinů a mastných kyselin nebo multilokusová enzymová elektroforéza. Naproti tomu metody genotypové jsou přesnější a specifičtější a mohou potvrdit předpokládané výsledky fenotypové identifikace. Z genetických identifikačních technik založených na detekci rdna můžeme jmenovat ribotyping, PCR ribotyping, fluorescenční in situ hybridizace (FISH), polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP), restrikční analýza amplifikované rdna (ARDRA), polymorfismus délky terminálních restrikčních fragmentů (T-RFLP), délkově hetorogenní PCR (LH-PCR), druhově specifické PCR nebo sekvencování. Všechny tyto metody mají své výhody i nevýhody. Společným problémem je však skutečnost, že malé podjednotky ribosomů (16S rdna) jsou si u jednotlivých představitelů Bcc sekvenčně velice podobné a to z více než 98 % (McMenamin a kol., 2000, Mahenthiralingam a kol., 2008, Dongyou a kol., 2011). Tento problém pak obchází některé další metody založené na identifikaci méně homologních genů - RNA polymerázy (rpod), hisa genu (kódující 1-(5-fosforibosyl)-5-[(5-fosforibosylamino)methylideneamino]imidazol-4-karboxamid isomerázu odpovědnou za biosyntézu histidinu), reca genu (gen rekombinázy A, což je protein zodpovědný za životně důležitou opravu a rekombinaci DNA), elongačních faktorů atd. Jako cílová sekvence pro identifikaci Bcc byl vybrán gen reca. Tato metoda se v různých studiích ukázala jako velice vhodná pro rozlišení úzce příbuzných bakterií a navíc je reca gen v rámci chromozomu Bcc diploidní, takže nám dává mnohem robustnější výsledky. Nevýhodou této metody je však její neschopnost udržet krok s neustále se měnící taxonomií Bcc. 8

21 Z identifikace reca genu vychází i metoda PCR využívající primery specifické pro daný genomovar. Využívá nukleotidových sekvencí šesti klastrů Bcc identifikovaných fylogenetickou analýzou. Páry primerů jsou navrhovány tak, aby nasedaly na sekvenci specifickou pro danou skupinu a nepárovaly se s reca sekvencemi jiných skupin (Mahenthiralingam a kol., 2000, Lambiase a kol., 2013). Metoda MLST je dnes považována za nejpřesnější molekulární techniku v rámci identifikace Bcc. Principem metody je sekvenování vnitřních úseků vybraných provozních genů (obvykle 6 až 8) o velikosti přibližně bp. Jednotlivým genetickým variacím uvnitř sekvenovaných fragmentů jsou přirazeny rozdílné alely. Kombinace alel z jednotlivých lokusů definují jako alelický profil tak sekvenční typ. Každý bakteriální izolát je tak charakterizován sérii celků, které korespondují s alelami v provozních lokusech (Maiden a kol., 1998, Jolley, 2001). Využití techniky MLST v identifikaci Bcc je založeno na porovnávání sekvence sedmi různých provozních genů lokalizovaných na prvním a druhém chromozomu: atpd (ATP syntáza, β řetězec), gltb (glutamát syntáza, velká podjednotka), lepa (GTP vazebný protein), phac (acetoacetyl-coa reduktáza), trpb (tryptofan syntáza, podjednotka B), reca (rekombináza A) a gyrb (DNA gyráza B). Na základě těchto sekvencí je tak každý bakteriální izolát Bcc schopen vytvořit unikátní profil pro identifikaci druhů a kmenů. Pro lepší přehlednost již charakterizovaných izolátů vznikla veřejná databáze sekvenčních dat MLST ( Výhodou MLST identifikace je, že se s ní dá provádět mnohem detailnější analýza, pomocí které lze následně identifikovat nové taxonomické skupiny. I díky této metodě byly v roce 2008 a 2009 identifikovány nové bakterie patřící do Bcc B. latens, B. diffusa, B. arboris, B. seminalis, B. metallica a déle B. contaminans a B. lata, jak bylo zmíněno již dříve. S ohledem na všechny výhody této metody se předpokládá, že se tato technika stane standardem v oblasti identifikace Bcc (Baldwin a kol., 2007, Mahenthiralingam a kol., 2008, Dongyou a kol., 2011). K novějším postupům, snažící se o přesnou identifikaci Bcc patří i metoda MALDI-TOF MS (Hmotnostní spektrometrie s analyzátorem doby letu a laserovou desorpcí/ionizací za účasti matrice). Jde o metodu, založenou na stanovení měření molekulové hmotnosti látek, přičemž v první fázi dochází k ionizaci vzorku v přítomnosti matrice a následně k měření doby průletu částic, v závislosti na hmotnosti 9

22 a náboji. Získané hmotnostní spektrum představuje poměr hmotnosti náboje příslušného iontu a relativní intenzity signálu. Většina píků v hmotnostním spektru bakterií odpovídá ribosomálním proteinům s tzv. provozní funkcí, které se vlivem vnějších podmínek mění minimálně, a proto jsou vhodné pro rutinní identifikaci bakterií. Rozvoj této techniky přišel až v posledních letech s rozvojem softwaru schopného párovat hmotnostní profily bakteriálních knihoven s neznámými bakteriemi. V porovnání s PCR metodami, kdy senzitivita metod je srovnatelná, je pořízení přístrojového vybavení mnohem nákladnější, ale následná cena analýzy jednotlivých vzorků levnější. Také rychlost analýzy je nesrovnatelně kratší. Výhodou MALDI-TOF MS je také jednoduchost provedení a možnost automatizace procesu (Croxatto a kol., 2011, Fernández-Olmos a kol., 2012, Wieser, 2012). Lambiase a kol. v roce 2012 a Fehlber a kol. (2013) o rok později použili tuto metodu v rámci porovnání s metodami používanými dnes mnohem častěji v laboratořích při identifikaci Bcc. Je vyzdvihována rychlost a přesnost metody MALDI-TOF MS, která následně vede k rychlejšímu nasazení terapie. Avšak při porovnávání metabolických cest, které mohou mít různé bakteriální kmeny stejné, nedokážeme na základě této metody rozlišit jednotlivé podskupiny (např. IIIA nerozlišíme od IIIB), také odlišení izolátů B. gladioli nebylo spolehlivé (Fehlberg a kol., 2012, Lambiase a kol., 2013) Metody typizace Bcc Za účelem stanovení příbuznosti kmenů Bcc je také možné využít několik moderních genetických technik. Nejvýznamnějšími pro typizaci komplexu Bcc se staly metoda RAPD (náhodná amlifikace polymorfní DNA), PFGE (elektroforéza v pulzním poli) a již výše popsaná metoda MLST. Jednotlivé analýzy nabízí profil zkoumaných izolátů Bcc, jejichž porovnáním lze odvodit příbuznost izolátů mezi sebou. Vysoká míra příbuznosti pak implikuje přítomnost epidemického klonu ( RAPD analýza využívá náhodně generované primery k amplifikaci fragmentů genomické DNA, takže pro provedení reakce není vyžadována znalost cílové sekvence studovaného genomu. Během analýzy se detekuje polymorfismus nukleotidových sekvencí v amplifikované DNA. Dalšími výhodami jsou rychlost a jednoduchost 10

23 provedení. Tato fakta vedla k rozšíření metody v mnoha oblastech genetického výzkumu. Bingen a kol. (1993) využili jako první metodu RADP pro typizaci bakterií P. cepacia. Mahenthiralingam a kol. navrhli v roce 1996 nový typizační systém založený na metodě RAPD, který na rozdíl od předchozího využívá několika různých náhodných primerů, pomocí kterých je možné zachytit stabilní a dobře rozlišitelný polymorfismus nukleotidových sekvencí v amplifikované DNA. Vůči metodě PCR ribotyping je tato technika mnohem přesnější a efektivnější a rozlišuje jednodušeji mezi jednotlivými typy, navíc je schopna porovnávat izoláty i bez znalosti epidemiologie. Metoda RAPD je levnější, rychlejší a také technicky jednodušší na použití. Avšak analýza DNA pomocí RAPD zaostává v reprodukovatelnosti nejenom v rámci jedné laboratoře ale také mezi různými laboratořemi (Bingen a kol., 1993, Penner a kol., 1993, Tingey a del Tufo, 1993, Micheli a kol., 1994, Barbier a kol., 1996, Mahenthiralingam a kol., 1996, Herschleb a kol., 2007). Metoda PFGE vychází z klasické elektroforézy DNA, kdy v konstantním elektrickém poli aplikovaném na agarózový gel, jsou malé molekuly DNA v podstatě prosívány na základě velikosti. Tento efekt síta selhává, když se jedná o velké molekuly a to kvůli jejich svinutí. Před průchodem matricí se musí rozvinout a tím selhává velikostní závislost na elektroforetické mobilitě. PFGE se tomuto zcela vyhne. V této metodě se elektrické pole periodicky mění, nutíc tak molekuly zaujmout novou orientaci pro efektivní průchod gelovou matricí. Čas nutný k reorientaci molekul je úměrný velikosti molekuly. Maximální elektroforetické mobility se docílí pouze při orientaci molekul do vnějšího pole. Elektroforetická mobilita tak koreluje nejen s velikostí, ale i s frekvencí změny elektrického pole. PFGE slouží k přímé analýze genomické DNA a je tedy důležitou součástí mnoha projektů zabývajících se charakterizací genomu. U typizace většiny bakteriálních druhů představuje jakýsi zlatý standard díky její výborné reprodukční a rozlišovací schopnosti. Podstatou typizace je analýza makrorestrikčních fragmentů celogenomové DNA pomocí PFGE. Rovněž byla tato metoda použita pro molekulární charakterizaci bakterií komplexu Bc, kde vykazuje vysokou diskriminační schopnost (Liu a kol., 1995, Barbier a kol., 1996, McDowell a kol., 2004, Allice a kol., 2006, Herschleb a kol., 2007). Jak již bylo popsáno výše v kapitole 2.3.1, metoda MLST je založena na sekvenování vnitřních úseků vybraných provozních genů. Na základě těchto 11

24 sekvencí je tak každý bakteriální izolát schopen vytvořit unikátní profil pro identifikaci druhů a kmenů. Výhodou této metody při studiu příbuznosti izolátů je její vysoká rozlišovací schopnost, jednoznačnost ale hlavně možnost mezilaboratorní komunikace a tím pádem dostupnost globálních epidemiologických dat. K nevýhodám patří zejména její finanční náročnost. Baldwin a kol. využili metodu MLST nejenom pro identifikaci Bcc na úrovni druhu ale také pro typizaci na úrovni kmenů (Maiden a kol., 1998, Baldwin a kol., 2005, Baldwin a kol., 2007). 12

25 2.4 Genetická diverzita rodu Stenotrophomonas Stenotrophomonas maltophilia byl prvním objeveným zástupcem rodu Stenotrophomonas. Tato bakterie byla získána Hugem v roce 1958 z orofaryngeálního výtěru pacienta s rakovinou dutiny ústní a nazvána Pseudomonas maltophilia. Kvůli podobnosti s bakteriemi rodu Xanthomonas, byl tento druh v roce 1981 zařazen do skupiny xanthomonád a přejmenována na Xanthomonas maltophilia. Následným porovnáváním s ostatními zástupci tohoto rodu (DNA-rRNA hybridizační studie, sekvenování 16S rrna genu) však vyvstaly rozdíly, proto byl tento druh nakonec v roce 1993 taxonomicky zařazen do nového vlastního rodu Stenotrophomonas. V následujících letech bylo popsáno dalších osm bakteriálních druhů S. nitritireducens, S. acidaminiphila, S. rhizophila, S. koreensis, S. terrae, S. humi, S. chelatiphaga a S. ginsengisoli. Dnes tak rod Stenotrophomonas čítá devět fylogeneticky rozdílných druhů. Genetická diverzita tohoto rodu byla intenzivně zkoumána a metoda AFLP (polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů) odhalila 10 odlišných genetických skupin, ze kterých nejméně sedm stále patří k S. maltophilia. Následně byla diverzita tohoto druhu potvrzena pomocí metody MLST (na základě analýzy genů atpd, gapa, guaa, mutm, nuod, ppsa a reca) a byly uznány genetické skupiny 1-7 a 9 (8 skupina byla přidělena k S. rhizophila) a navíc bylo popsáno pět nových skupin (A-E). Rod Stenotrophomonas tak v současnosti sestává z devíti rozdílných druhů, kde S. maltophilia představuje typický druh tohoto rodu. S. maltophilia navíc vykazuje velkou genetickou diverzitu s nejméně 13 rozeznatelnými genetickými skupinami (Hugh and Leifson, 1963, Denton and Kerr, 1998, Looney a kol., 2009, Dongyou a kol., 2011). 2.5 Výskyt a patogenita kmenů S. maltophilia Bakterie tohoto rodu jsou rozšířeny globálně s různým místem výskytu, kde ale preferují vlhká až vodná prostředí. S. maltophilia byla například izolována z drenáží fontán, kohoutků, v úpravnách pitné vody, rozvodných systémech, v tekoucí i v balené vodě. Zástupci tohoto rodu se vyskytují jak v odpadních vodách tak i přirozených 13

26 zdrojích vody. Nálezy byly hlášeny i u zvířat (ryby, želvy, sysli, hadi, krevety), některých jejich produktů (čerstvé mléko) a rostlin (lišejník, topol, orchidej, kosatce, rhizosféra pšenice, sóji, kukuřice, červené papriky, sezamu, rýže, salátu, tráva, cukrová třtina, palmy, kapusta, řepka, hořčice, řepy, banán, vlna, fazole, tabák). V prostředí nemocnic se mohou vyskytovat v rezervoárech vody, nebulizérech, umyvadlech, sprchách, přístrojích na výrobu ledu, dialyzačních a dýchacích přístrojích, monitorovacích stanicích krevního tlaku, provzdušňovačích a rezervoárech dezinfekce. Jak se ukazuje, S. maltophilia je jediným oportunně patogenním druhem rodu Stenotrophomonas. Může způsobit závažné nozokomiální infekce (nejčastěji pneumonie, infekce močových cest a infekce krevního řečiště) nebo se vyskytuje jako komenzál. Ohroženými skupinami jsou pacienti léčení širokospektrou antibiotickou terapií, se závažným základným onemocněním (CF, nebo pacienti po chemoterapii), s endokarditidou, infekcemi krevního řečiště, dlouhodobě hospitalizovaní nebo hospitalizováni na jednotkách intenzivní péče a pacienti se zavedenými umělohmotnými pomůckami. Pokud bychom se zaměřili na věk, jednalo by se o pacienty nad 40 let a předčasně narozené děti. Virulence kmenů je podmíněna schopností tvorby biofilmu, produkcí proteáz, lipáz a dalších extracelulárních enzymů. Kmeny S. maltophilia neprodukují žádné toxiny. S. maltophilia je rezistentní k řadě antibiotik k beta-laktamovým v důsledku produkce beta-laktamáz, k aminoglykosidům (kromě gentamicinu) kvůli produkci modifikujících enzymů, efluxních pump a změnám ve vnější membráně a dalším (makrolidům, tetracyklinu, chloramfenikolu a chinolonům) hlavně v důsledku přítomnosti tzv. multi-drug rezistentních efluxních systémů. K léčbě infekcí vyvolaných kmeny S. maltophilia se doporučuje kotrimoxazol. Léky druhé volby jsou tikarcilin v kominaci s inhibitorem beta-laktamáz nebo fluorochinolony (Denton and Kerr, 1998, Denton a kol., 1998, Lochmann a kol., 1998, Verweij a kol., 1998, Park a kol., 2005, Looney a kol., 2009, Dongyou a kol., 2011). 14

27 2.6 Metody identifikace a typizace kmenů S. maltophilia S. maltophilia, původně považována za neškodného komenzála, se postupně stává významným původcem nozokomiálních nákaz hlavně u imunokompromitovaných, hematoonkologických, pacientů po transplantaci a pacientů s probíhající peritoneální dialýzou. S narůstající prevalencí se také objevují problémy, týkající se přesné identifikace, kdy je problémem záměna identifikovaných izolátů S. maltophilia jako Bcc. Vzhledem k významné rezistenci těchto kmenů k řadě antibiotik, proto vyvstává potřeba jednoduché, rychlé a přesné identifikace získaných izolátů a zároveň jejich typizace pro sledování epidemiologie těchto bakterií v nemocničním prostředí (Whitby a kol., 2000) Metody identifikace kmenů S. maltophilia S. maltophilia roste na různých médiích včetně MacConkeyho a krevního agaru, je oxidása negativní a vykazuje zpožděnou nebo žádnou oxidaci glukózy. Pro její identifikaci je dostupná řada biochemických identifikačních testů a systémů (například VITEK2 a API 20NE od firmy biomérieux) a využívaná řada selektivních kultivačních půd (Xanthomonas maltophilia selective medium XMSM, Vancomycin-imipenemamphotericin B agar - VIA agar), vyvinuté autorskými kolektivy Juhnke a Kerr (Juhnke and des Jardin, 1989, Kerr a kol., 1996). Pro identifikaci pomocí genotypových metod bylo vyvinuto několik postupů, využívajících PCR, které však nebyly dostatečně specifické. Whitby a kol. navrhli druhově specifickou metodu, přičemž PCR primery byly navrženy pro gen kódující 23S rrna. Metoda vykazovala negativní výsledky pro rody Pseudomonas, Burkholderia, Klebsiella, Moraxella, Ralstonia a rod Alcaligenes. Práce autorů Foster a kol. však odhalila, že tato detekční technika není absolutně specifická pro S. maltophilia a že v některých případech může docházet ke zkřížené reakci s kmeny Xanthomonas spp. nebo jinými druhy rodu Stenotrophomonas. Podobný problém se specifickou detekcí je i při použití specifických oligonukleotidových sond u metody FISH s následnou aplikací epifluorescenčního mikroskopu a průtokové 15

28 cytometrie (Denton a Kerr, 1998, Whitby a kol., 2000, Foster a kol, 2008, Dongyou a kol., 2011) Metody typizace kmenů S. maltophilia S. maltophilia je významných nozokomiálních patogenem, který u hospitalizovaných pacientů způsobuje multirezistentní infekce. O epidemiologii tohoto patogena v nemocničním prostředí se moc neví a to také v důsledku toho, že neexistuje spolehlivá metoda typizace těchto klinických izolátů. Autobiogramy jsou pro typizaci nedostačující, protože zkoumané izoláty jsou často rezistentní k řadě antibiotik. Proto byly vyvinuty další typizační metody jako je sérologická typizace, enzymatická multilokusová elektroforéza a analýza DNA pomocí restrikčních endonukleáz. Problémem prvních dvou metod je, že nejsou všeobecně dostupné nebo jednoduše přizpůsobitelné v mnoha klinických mikrobiologických laboratořích, zatímco poslední metoda vytváří DNA restrikční profily, které jsou těžce interpretovatelné. Nejnověji pak byly pro vyšetření epidemií v důsledku různých nozokomiálních patogenů vyvinuty spolehlivé molekulárně typizační metody PFGE a náhodé PCR (AP-PCR), kdy PFGE byla prohlášena za dostatečně diskriminační metodu pro typizaci kmenů S. maltophilia. V nejnovějších studiích byly s PFGE porovnávány i jiné typizační metody jako jsou ribotyping nebo konzervativní enterobakteriální mezigenová repetitivní sekvence PCR (ERIC-PCR). Tyto metody jsou sice výhodnější v rámci rychlosti provedení, ale PFGE se ukazuje jako mnohem diskriminačnější. PFGE je tak používána za standardní metodu pro typizaci genomu S. maltophilia a navíc ještě i celých chromozomů řady dalších mikroorganismů. Její užitečnost spatřují vědci i ve stanovení genetické příbuznosti izolátů porovnáváním jejich makrorestrikčních profilů (Yao a kol., 1995, Valdezate a kol., 2004, Jumaa a kol., 2006). 16

29 3 CÍL PRÁCE Hlavní cíle diplomové práce lze charakterizovat následujícími body: 1. Genetická identifikace bakterií Burkholderia cepacia complex a stanovení příbuznosti klinických izolátů s využitím metody polymorfismu náhodně amplifikované DNA 2. Genetická identifikace bakterií druhu Stenotrophomonas maltophilia a stanovení příbuznosti klinických izolátů s využitím metody polymorfismu náhodně amplifikované DNA a metody pulzní gelové elektroforézy 17

30 4 MATERIÁL A METODY 4.1 Sběr, izolace a identifikace bakterií Bcc Do studie byly zařazeny bakterie Bcc izolované z klinického materiálu pacientů hospitalizovaných na různých klinikách po celé České republice. Klinický materiál byl zpracován standardními mikrobiologickými postupy. Získané izoláty Bcc byly z jednotlivých mikrobiologických pracovišť zasílány na pracoviště Ústavu mikrobiologie Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci (LF UP), kde byly zamraženy do kryozkumavek (ITEST plus s.r.o., Česká republika), uloženy do sbírky a uschovány při -80 C pro další zpracování. Ve Fakultní nemocnici Hradec Králové bylo odebráno 30, ve Fakultní nemocnici Královské Vinohrady 12, ve Fakultní nemocnici Plzeň 9, ve Fakultní nemocnici v Motole 8, v Nemocnici Nový Jičín 19, v Institutu klinické a experimentální medicíny v Praze (IKEM) 4, v Nemocnici Vsetín 3 izoláty, ve Fakultní nemocnici v Brně 6 a v Krajské nemocnice T. Bati 6 izolátů. Po jednom vzorku bylo zasláno z pracovišť mikrobiologie Nemocnice Prostějov, Nemocnice Strakonice a z nemocnice České Budějovice. Dále pak bylo sesbíráno celkově 40 izolátů Bcc z Fakultní nemocnice v Olomouci (FNOL). Celkově tak sbírka pozůstávala ze 140 izolátů Bcc. 4.2 Genetická detekce Izolace DNA Každý ze sledovaných izolátů byl vyočkován z kryozkumavky na krevní agar a kultivován při 37 C po dobu 24 hodin za účelem získaní čerstvé bakteriální kultury. Poté byly odebrány 1 až 2 kolonie zkoumaného izolátu, které byly následně rozsuspendovány ve 100 μl sterilní vody. Po 10 minutovém zahřívaní při teplotě 95 C, byl obsah zkumavky centrifugován při x g po dobu 2 minut. Odebraný supernatant obsahující DNA byl použit jako templát pro PCR. 18

31 4.2.2 PCR V první fázi byla pro detekci jednotlivých genomovarů připravena reakční směs, tzv. PCR master mix, obsahující PCR vodu (Top-Bio, Česká republika), 10 x koncentrovaný reakční pufr s hořčíkem skládající se z 10 mm Tris/HCl, 500 mm KCl, 1 % Triton X-100, 15 mm MgCl2 (Top-Bio, Česká republika), dntps (roztok obsahující směs datp, dctp, dttp, dgtp) (Promega, USA), Taq DNA polymerázu (Top-Bio, Česká republika) a sadu primerů (East Port, Česká republika) (Tab. 2). Množství jednotlivých složek a jejich výslednou koncentraci uvádí tabulka 3. Takto připravený master mix byl rozpipetován do jednotlivých PCR zkumavek. Následně byl k reakční směsi ve zkumavkách přidán 1 μl templátové DNA a výslední objem byl překryt PCR olejem (Top-Bio, Česká republika). Zkumavky byly poté vloženy do termocykleru (RoboCycler Gradient 96 Temperature Cycler), na němž byly nastaveny příslušné reakční podmínky, které jsou shrnuty v tabulce 4. Jako pozitivní kontroly jsme použili sbírkové kmeny B. cepacia, B. multivorans, B. cenocepacia, B. stabilis a B. vietnamiensis, které pocházely se sbírky Ústavu mirkobiologie LF UP a sbírky BCCM/LMG Ghent, Belgie. Pro kontrolu kvality PCR byla použita negativní kontrola (tj. bez obsahu bakteriální DNA). 19

32 Tabulka 2: Sekvence oligonukleotidových primerů použitých pro identifikaci vybraných genomovarů Bcc Identifikované genomovary Bcc Primer forward Primer reverse Zdroj Genomovar I 5 - CAGGTCGTCTCCACCGGGT CACGCCGATCTTCATACGA -3 Genomovar II 5 - CGGCGTCAACGTGCCGGAT TCCATCGCCTCGGCTTCGT -3 Genomovar IIIA 5 - GCTCGACGTTCAATATGCC TCGAGACGCACCGACGAG -3 Genomovar IIIB 5 - GCTGCAAGTCATCGCTGAA TACGCCATCGGGCATGCT -3 Mahenthiralingam a kol., 2000 Genomovar IV 5 - ACCGGCGAGCAGGCGCTT ACGCCATCGGGCATGGCA -3 Genomovar V 5 - GGGCGACGGCGACGTGAA TCGGCCTTCGGCACCAGT -3 Tabulka 3: Složení a koncentrace jednotlivých reagencí PCR master mixu PCR komponenty Množství jednotlivých složek (μl) Výsledné koncentrace PCR voda 20,7 PCR pufr + MgCl2 2,5 1 x + c(mg 2+ ) = 1,5 mm dntps 0,2 200 μm Primer forward 0,2 0,8 μm Primer reverse 0,2 0,8 μm Taq polymeráza 0,2 2 U 20

33 Tabulka 4: Průběh PCR jednotlivé kroky, počet cyklů a jejich trvání při dané teplotě Jednotlivé kroky reakce Počet cyklů Teplota/Čas Počáteční denaturace 1 95 C /7 min Denaturace Hybridizace primerů Extenze C /30 s 62 C/30 s 72 C/1 min Závěrečná extenze 1 72 C/7 min Separace v agarózovém gelu Po ukončení amplifikace byly získané amplikony podrobeny separaci v 1,5% (w/v) agarózovém gelu. Při jeho přípravě byla použita velká vanička (250 ml) a gel byl připraven podle rozpisu uvedeného v tabulce 5. Tabulka 5: Jednotlivé složky pro přípravu agarózového gelu a jejich množství Přísady Agaróza 10x TBE pufr Destilovaná voda Množství 1,8 g 12 ml 108 ml Přesně navážené množství agarózy (Serva, Německo) bylo rozpuštěno za tepla v 10 x zředěném TBE pufru (Biotech, Česká republika). Po mírném ochlazení (přibližně na teplotu 50 C) bylo přidáno 8 μl ethidium bromidu (1 μg/ml) (Sigma-Aldrich, Německo) a směs se nechala polymerizovat na vzduchu. Ztuhlý gel byl přelit dříve připraveným separačním pufrem 1x TBE (Biotech, Česká republika). 10 μl získaných 21

34 PCR produktů bylo smícháno s 2 μl nanášecího pufru (Top-Bio, Česká republika) a následně byly naneseny do gelu. Separace probíhala 90 minut při napětí 100 V. Výsledné amplikony byly vizualizovány v transiluminátoru pod UV světlem. Velikost zobrazených fragmentů byla stanovena pomocí DNA markeru s rozsahem fragmentů bp (Top-Bio, Česká republika). Velikosti sledovaných genomovarů komplexu B. cepacia jsou následující genomovar I 492 bp, genomovar II 714 bp, genomovar IIIA 378 bp a genomovar IIIB 781 bp, genomovar IV 647 bp a genomovar V 378 bp RAPD typizace Pro typizaci jednotlivých izolátů byla použita metoda polymorfismu náhodně amplifikované DNA (RAPD) s využitím 2 primerů (Tab. 6). Byly připraveny vždy dvě rekční směsi, sestávající z PCR vody (Top-Bio, Česká republika), 10 x koncentrovaného reakční pufru skládajícího se z 10 mm Tris/HCl, 500 mm KCl, 1 % Triton X-100 (Top-Bio, Česká republika), 25 mm roztoku hořčíku (Top-Bio, Česká republika), dntps (roztok obsahující směs datp, dctp, dttp, dgtp) (Promega, USA), Taq DNA polymerázy (Top-Bio, Česká republika) a jednoho z primerů (East Port, Česká republika). Množství jednotlivých složek a jejich výslednou koncentraci uvádí tabulka 7. Takto připravený master mix byl rozpipetován do jednotlivých PCR zkumavek. Následně bylo k reakční směsi ve zkumavkách přidáno 1 μl templátové DNA. Výsledný objem byl překryt PCR olejem (Top-Bio, Česká republika). Zkumavky byly vloženy do termocykleru (RoboCycler Gradient 96 Temperature Cycle) s reakčními podmínkami uvedenými v tabulce 8. Tabulka 6: Sekvence oligonukleotidových primerů použitých pro RAPD typizaci klinických izolátů Bcc Použité primery Sekvence primerů Zdroj TGCGCGCGGG -3 Mahenthiralingam AGCGGGCCAA -3 a kol.,

35 Tabulka 7: Složení a koncentrace jednotlivých složek mastermixu pro RAPD typizaci PCR komponenty Množství jednotlivých složek (μl) Výsledné koncentrace PCR voda 18,6 PCR pufr 2,5 1 x MgCl2 2 c(mg 2+ ) = 2 mm dntps 0, μm Primer 0,4 1,6 μm Taq polymeráza 0,25 2 U Tabulka 8: Průběh RAPD jednotlivé kroky, počet cyklů a jejich trvání při dané teplotě Jednotlivé kroky reakce Počet cyklů Teplota/Čas Počáteční denaturace 1 95 C /5 min Denaturace Hybridizace primerů Extenze C /1 min 36 C/2 min 72 C/1 min Závěrečná extenze 1 72 C/5 min Za účelem porovnání jednotlivých izolátů z prostředí České republiky s epidemicky se vyskytujícím kmenem B. multivorans z Fakultní nemocnice v Olomouci byla jeho vyizolovaná DNA použita jako pozitivní kontrola pro každou 23

36 PCR reakci. Pro kontrolu kvality byla použita negativní kontrola (tj. bez obsahu bakteriální DNA). Kvůli citlivosti RAPD metody byly vzorky vždy amplifikovány dvakrát, přičemž na základě výsledků z první amplifikace byly vybrány podobné nebo stejné izoláty a tyto byly amplifikovány společně v další reakci. V případě nejasností byla opakovaná amplifikace vybraných izolátů Separace v agarózovém gelu a vyhodnocení genetické příbuznosti izolátů Po ukončení reakce byla provedena separace amplifikované DNA v agarózovém gelu podle postupu popsaném v kapitole 4.2.3, kdy jedinou změnou byl pouze celkový čas prováděné separace, která trvala 3 hodiny. Získané výsledky byly zhodnoceny jednak vizuálně, jednak byl použit počítačový software GelCompare II, version 2.0 (Apllied Maths, Kotrijk, Belgicko). Koeficient podobnosti byl vypočítán použitím Dieceho algoritmu a analýza jednotlivých klastrů byla vykonána využitím UPGNA algoritmu. 24

37 4.3 Sběr, izolace a identifikace bakterií druhu S. maltophilia Do studie byly zařazeny izoláty získané z klinického materiálu pacientů hospitalizovaných ve Fakultní nemocnici Hradec Králové a ve FNOL. Klinický materiál byl zpracován standardními mikrobiologickými postupy. Získané izoláty byly z mikrobiologického pracoviště v Hradci Králové zasílány na pracoviště Ústavu mikrobiologie LF UP, kde byly zamraženy do kryozkumavek (ITEST plus s.r.o., Česká republika), uloženy do sbírky a uschovány při -80 C pro pozdější zpracování. Pro další analýzu bylo vybráno 16 izolátů z Fakultní nemocnice Hradec Králové a 18 izolátů z FNOL. Celkově tak sbírka pozůstávala z 34 izolátů druhu S. maltophilia. 4.4 Genetická detekce Izolace DNA Každý ze sledovaných izolátů byl vyočkován z kryozkumavky na krevní agar a kultivován při 37 C po dobu 24 hodin za účelem získaní čerstvé bakteriální kultury. Poté byla bakteriální DNA izolována podle postupu uvedeného v kap PCR V první fázi byla připravena reakční směs, tzv. PCR master mix pro detekci specifické nukleotidové sekvence 23S rrna, obsahující PCR vodu (Top-Bio, Česká republika), 10 x koncentrovaný reakční pufr s hořčíkem (10 mm Tris/HCl, 500 mm KCl, 1 % Triton X-100, 15 mm MgCl2) (Top-Bio, Česká republika), dntps (roztok obsahující směs datp, dctp, dttp, dgtp) (Promega, USA), Taq DNA polymerázu (Top-Bio, Česká republika) a sadu primerů (East Port, Česká republika) (Tab. 9). Množství jednotlivých složek a jejich výslednou koncentraci uvádí tabulka 10. Takto připravený master mix byl rozpipetován do jednotlivých PCR zkumavek, k reakční směsi byl přidán 1 μl templátové DNA a výslední objem byl překryt PCR olejem (Top- 25

38 Bio, Česká republika). Zkumavky byly poté vloženy do termocykleru RoboCycler a byly nastaveny příslušné reakční podmínky, tabulka 11. Jako pozitivní kontrolu jsme použili kmen S. maltophilia ze zbírky Ústavu mikrobiologie LF UP v Olomouci, který byl identifikován metodou MALDI-TOF MS. Pro kontrolu kvality PCR byla použita negativní kontrola (tj. bez obsahu bakteriální DNA). Tabulka 9: Sekvence oligonukleotidových primerů použitých při PCR pro identifikaci S. maltophilia Identifikovaná bakterie S. maltophilia Primer forward Primer reverse 5 - CAGCCTGCGAAAACTA TTAAGCTTGCCACGAACAG -3 Zdroj Whitby a kol., 2000 Tabulka 10: Složení a koncentrace jednotlivých reagencí PCR master mixu PCR komponenty Množství jednotlivých složek (μl) Výsledné koncentrace PCR voda 20,6 PCR pufr + MgCl2 2,5 1 x + c(mg 2+ ) = 1,5 mm dntps 0,2 200 μm Primer forward 0,25 0,8 μm Primer reverse 0,25 0,8 μm Taq polymeráza 0,2 2 U 26

39 Tabulka 11: Průběh PCR jednotlivé kroky, počty cyklů a jejich trvání při dané teplotě Jednotlivé kroky reakce Počet cyklů Teplota/Čas Počáteční denaturace 1 95 C /7 min Denaturace Hybridizace primerů Extenze C /30 s 57 C/30 s 72 C/1 min Závěrečná extenze 1 72 C/7 min Separace v agarózovém gelu Po ukončení amplifikace byly získané amplikony podrobeny separaci v 1,5% (w/v) agarózovém gelu. Při jeho přípravě byl použit postup uvedený v kapitole Velikost amplifikovaného fragmentu byla 531 bp PFGE typizace Pro typizaci izolátů S. matophilia byla použita metoda pulzní gelové elektroforézy, založená na separaci makrorestrikčních fragmentů celogenomové DNA bakteriálních kmenů Izolace DNA pro restrikční analýzu Jedna čistá bakteriální kolonie testované kultury byla naočkovaná do 20 ml Mueller-Hintonova tekutého bujonu a inkubována 24 hodin při mírném třepání při 37 C. Na druhý den byl bujon s pomnoženými bakteriemi zcentrifugován při 4 C, 3700 x g po dobu 10 minut. K peletu se přidalo 5 ml promývacího roztoku (10 mm Tris/HCl, 10 mm EDTA, 10 mm EGTA, 1 M NaCl, ph 7,5) (Sigma-Aldrich, 27

40 Německo), obsah se roztřepal na vortexu a centrifugoval při 4 C, 3700 x g, po dobu 10 minut. Promytí se opakovalo celkem 3x. Následně byly bakterie naředěny promývacím roztokem na optickou denzitu 0,2-0,3 při 600 nm na výsledný objem 10 ml a centrifugovány při 4 C, 3700 x g, po dobu 10 minut. Získaný pelet byl rozsuspendován ve 100 µl promývacího roztoku, smíchán se 100 μl 2% low melting agarózy (Bio-Rad, USA) a rozplněn do tvořítek pro bločky. Ztuhlé bločky byly vloženy do 1 ml lyzačního roztoku (6 mm Tris/HCl, 100 mm EDTA, 1 M NaCl, 0,5 % BRIJ, 0,2 % Na-deoxycholát, 0,5 % laurylsarkosin, ph 7,6) (Sigma-Aldrich, Německo) s lysozymem (0,5 mg/ml) (Sigma-Aldrich, Německo) a inkubovány při 37 C po dobu 24 hodin. Další den byly bločky přeneseny do deproteinizačního roztoku (25 mm EDTA, 20 mm EGTA, 1 % laurylsarkosin, ph 9,0) (Sigma-Aldrich, Německo) s 500 µg proteinasy K (Serva, Německo) a inkubovány 24 hodin při 55 C. Následovalo promytí v 10 ml TE pufru (10 mm Tris/HCl, 1 mm EDTA, ph 7,8) (Sigma-Aldrich, Německo), ve kterém byly bločky následně uchovány při teplotě 4 C Restrikční analýza genomové DNA Z každého bločku, obsahujícího vyizolovanou genomovou DNA testovaného izolátu, byl uříznutý proužek o velikosti cca 1-2 mm a opatrně přenesen do zkumavky obsahující restrikční roztok (10 mm Tris/HCl, ph 7,5, 10 mm MgCl2, 1 mm dithiothreitol, 50 mm NaCl, 0,01 % BSA) (Sigma-Aldrich, Německo) s 15 U restrikčního enzymu XbaI (Takara, Biotechnology, Japonsko). Zkumavky byla následně inkubovány při 37 C po dobu 24 hodin Separace metodou pulzní gelové elektroforézy Po ukončení restrikce byly získané fragmenty podrobeny separaci v 1,2% (w/v) agarózovém gelu. Při jeho přípravě byla použita vanička pro PFGE a gel byl připraven podle rozpisu uvedeného v tabulce

41 Tabulka 12: Jednotlivé složky pro přípravu agarózového gelu a jejich množství Přísady Pulsed Field Certified agaróza 10x TBE pufr Destilovaná voda Množství 1,2 g 5 ml 95 ml Přesně navážené množství Pulsed Field Certified agarózy (Bio-Rad, USA) bylo rozpuštěno za tepla v 0,5 x zředěném TBE pufru (Bio-Rad, USA). Směs byla přelita do vaničky a nechala se polymerizovat na vzduchu. Uříznutý proužek byl po restrikci opatrně přenesen do jamky ztuhlého 1,2% agarózového gelu, zalit 2% low melting agarózou a nechal se zatuhnout v ledničce při 4 C. Velikost fragmentů byla stanovena pomocí DNA markeru Pulse Marker TM kb (Sigma-Aldrich, Německo) o velikosti fragmentů od 48,5 do 1018,5 kb. Po zatuhnutí byl gel přenesen do vaničky přístroje CHEF-DRII Systém, přelit dříve připraveným separačním pufrem 0,5 x TBE (Bio-Rad, USA) a pro analýzu byly nastaveny následující parametry: teplota 14 C, celkový čas 24 h, pulzní časy 2-35 s, napětí 6 V/cm. Za použití třepačky se nechal získaný gel inkubovat 1 hodinu ve vodním roztoku ethidium bromidu (0,75 μg/ml) (Sigma-Aldrich, Německo). Po obarvení byly jednotlivé fragmenty vizualizovány v transiluminátoru pod UV světlem. Získané výsledky byly zhodnoceny jednak vizuálně, jednak byl použit počítačový software GelCompare II, version 2.0. (Applied Maths, Kotrijk, Belgium) RAPD typizace Pro typizaci jednotlivých izolátů S. maltophilia byla použita metoda RAPD s využitím primeru s následující sekvencí: 5 - CAGGCGGCGT -3 (Yao a kol., 1995). Reakční směs, sestávala z PCR vody (Top-Bio, Česká republika), 10 x koncentrovaného 29

42 reakčního pufru skládajícího se z 10 mm Tris/HCl, 500 mm KCl, 1 % Triton X-100 (Top-Bio, Česká republika), 25 mm roztoku hořčíku (Top-Bio, Česká republika), dntps (roztok obsahující směs datp, dctp, dttp, dgtp) (Promega, USA), Taq DNA polymerázy (Top-Bio, Česká republika) a vybraného primeru (East Port, Česká republika). Množství jednotlivých složek a jejich výslednou koncentraci uvádí tabulka 13. Takto připravený master mix byl rozpipetován do jednotlivých PCR zkumavek. Následně bylo k reakční směsi ve zkumavkách přidáno 1 μl templátové DNA. Výsledný objem byl překryt PCR olejem (Top-Bio, Česká republika). Zkumavky byly vloženy do termocykleru (RoboCycler Gradient 96 Temperature Cycler) s reakčními podmínkami uvedenými v tabulce 14. Pro kontrolu kvality byla použita negativní kontrola (tj. bez obsahu bakteriální DNA). Tabulka 13: Složení a koncentrace jednotlivých složek master mixu pro RAPD typizaci PCR komponenty Množství jednotlivých složek (μl) Výsledné koncentrace PCR voda 18,75 PCR pufr 2,5 1 x MgCl2 2 c(mg 2+ ) = 2 mm dntps 0, µm Primer 0,25 1 µm Taq polymeráza 0, U 30

43 Tabulka 14: Průběh RAPD jednotlivé kroky s počtem cyklů a jejich trvání při daných teplotách Jednotlivé kroky reakce Počet cyklů Teplota/Čas Počáteční denaturace 1 95 C /2 min Denaturace Hybridizace primerů Extenze C /30 s 35 C/35 s 72 C/1 min Závěrečná extenze 1 72 C/4 min Kvůli citlivosti RAPD metody byly vzorky vždy amplifikovány dvakrát. V případě nejasností byla opakovaná amplifikace vybraných izolátů Separace v agarózovém gelu a vyhodnocení genetické příbuznosti izolátů Po ukončení reakce byla provedena separace amplifikované DNA v agarózovém gelu podle postupu popsaném v kapitole Získané výsledky byly zhodnoceny jednak vizuálně, jednak byl použit počítačový software GelCompare II, version 2.0 (Apllied Maths, Kotrijk, Belgicko). Koeficient podobnosti byl vypočítán použitím Dieceho algoritmu a analýza jednotlivých klastrů byla vykonána využitím UPGNA algoritmu. 31

44 4.5 Seznam použitých laboratorních přístrojů Aparatura pro elektroforézu, Electrophoresis Power Supply ST 606T (Thermo Scientific, USA) Aparatura pro PFGE, CHEF DR II System (Bio-Rad, USA) Centrifuga, Hettich Rotina 46T Zentrifuge (Hettich Lab Technology, Německo) Centrifuga, Spectrafuge 24D (Labnet, USA) Flowbox, MSC-ADVANTAGE 1.8 Class II, Microbiological Sagety Cabinet (Thermo scientific, Německo) Minicentrifuga, Minicentrifuge C1201 (Labnet, USA) Termoblok, TS 100 Thermo Shaker (BioSan, Česká republika) Termocycler, RoboCycler Gradient 96 Temperature Cycler (Stratagene, Kanada) Termostat, Biological Thermostat BT 120 (Laboratorní přístroje Praha, Česká republika) Transiluminátor, Discovery TM (UltraLum, USA) Třepačka, KS 130 basic (IKA, Německo) Vortex, Vortex GENIE 2 (Scientific Industires, USA) Spektrometr, Spekol 11 (Karl Zeiss Jena, Německo) 32

45 5 VÝSLEDKY 5.1 Genetická identifikace Bcc pomocí PCR Z celkového počtu 140 izolátů identifikovaných standardními mikrobiologickými postupy jako izoláty Bcc, byl pomocí PCR a následné gelové elektroforézy identifikován genomovar II B. multivorans u 136 izolátů, což odpovídá 97,1 %. U jednoho vzorku byl detekován genomovar I B. cepacia. U zbývajících tří izolátů byla vzhledem k negativním PCR výsledkům provedena identifikace pomocí metody MALDI-TOF MS, kterou byly stanoveny dva izoláty jako S. maltophilia (jeden pocházející ze sbírky FNOL a jeden z Fakultní nemocnice Hradec Králové) a jeden jako B. anthina (vzorek z Krajské nemocnice T. Bati ve Zlíně), viz. graf 1. 1% 1% 1% B. multivorans 97% B. cepacia B. anthina S. maltophilia Graf 1: Výsledky identifikace Bcc pomocí PCR Nasledující obrázek 2 dokumentuje výsledky genetické detekce genomovaru II pomocí PCR u vybraných izolátů Bcc z Fakultní nemocnice Hradec Králové. 33

46 . Obrázek 2: Výsledky genetické detekce genomovaru II u izolátů Bcc z Fakultní nemocnice Hradec Králové; Legenda: 1 - DNA marker bp, 2-5 a pozitivní izoláty, 6 - negativní izolát identifikovaný pomocí MALDI-TOF MS jako S. maltophilia, 11 - pozitivní kontrola, 12 - negativní kontrola 5.2 Typizace klinických izolátů Bcc pomocí metody RAPD Genetická příbuznost 140 izolátů Bcc byla stanovena pomocí RAPD metody s využitím dvou různých primerů (270 a 272). Získané údaje byly zhodnoceny vizuálně a s použitím srovnávacího softwaru. Obrázky 3 a 4 uvádí výsledky RAPD analýzy pro vybrané izoláty z Fakultní nemocnice Hradec Králové a Fakultní nemocnice Královské Vinohrady. Je možné pozorovat výskyt identických kmenů jak u izolátů z jedné, tak i z druhé nemocnice. 34

47 Obrázek 3: Výsledek RAPD typizace u klinických izolátů z Fakultní nemocnice Hradec Králové a z Fakultní nemocnice Královské vinohrady pomocí primeru 270; Legenda: 1, 18 - DNA marker bp, izoláty z Fakultní nemocnice Hradec Králové (I-01, I-05, I-09, I-31, I-32, I-37, I-47), izoláty z Fakultní nemocnice Královské Vinohrady (III-20, III-21, III-22, III-24, III-26, III-27, III-28), 16 epidemický kmen z FNOL, 17 negativní kontrola 35

48 Obrázek 4: Výsledek RAPD typizace u klinických izolátů z Fakultní nemocnice Hradec Králové a z Fakultní nemocnice Královské vinohrady pomocí primeru 272; Legenda: 1, 18 - DNA marker bp, izoláty z Fakultní nemocnice Hradec Králové (I-01, I-05, I-09, I-31, I-32, I-37, I-47), izoláty z Fakultní nemocnice Královské Vinohrady (III-20, III-21, III-22, III-24, III-26, III-27, III-28), 16 epidemický kmen z FNOL, 17 negativní kontrola Údaje získané z RAPD analýzy byly porovnávány jednak v rámci jednotlivých nemocnic, jednak byla stanovena jejich podobnost s epidemicky se vyskytujícím kmenem B. multivorans z FNOL. Na závěr byla stanovena podobnost všech získaných izolátů v rámci celé České republiky. Obrázky 5 až 14 uvádí výsledné dendrogramy získané pomocí softwaru GelCompare pro jednotlivé nemocnice s použitím primeru 272. Tyto obrázky se vždy skládají ze tří částí, kdy v levém sloupečku je uveden 36

49 dendrogram, v prostředním výsledek gelové elektroforézy a vpravo je popis jednotlivých vzorků. U některých nemocnic byl pozorován záchyt dvojic nebo trojic stejných izolátů, představujících jeden kmen, který se šířil mezi různými pacienty (Fakultní nemocnice Královské Vinohrady, Fakultní nemocnice Motol, Fakultní nemocnice Nový Jičín, Nemocnice Vsetín, IKEM, Krajská nemocnice T. Bati ve Zlíně a FNOL). Čtveřice stejných izolátů byla zaznamenána například ve Fakultní nemocnici Královské Vinohrady, Fakultní nemocnici v Brně, pětice pak ve Fakultní nemocnici v Plzni. U izolátů z Fakultní nemocnice Hradec Králové byly nalezeny 3 epidemické a 4 sporadických kmenů. Tři epidemické kmeny zahrnovaly 15, 3 a 7 stejných izolátů. V rámci bakterií Bcc získaných z FNOL byla zaznamenána jedna velká skupina zahrnující 29 izolátů, které vykazovaly vysokou míru podobnosti navzájem a také s epidemickým kmenem z předchozí studie ve FNOL. I ve dvou dalších nemocnicích byl potvrzen záchyt kmenů identických s tímto klonem - 2 vzorky z Fakultní nemocnice Motol (III 45 a III 48) a 1 vzorek z Nemocnice Vsetín (III 05). Identita kmenů byla pozorována také mezi vzorky z Fakultní nemocnice Plzeň (III-33, III-35, III-36, III-37, III-39) a z Fakultní nemocnice v Motole (III-42, III-43, III-44). 37

50 Dice (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] CR studie 272 CR studie III-31. epidemicky. III-22. III-27. III-26. III-23. III-24. III-28. III-25. III-30. III-21. III-20 Obrázek 5: Celkový dendrogram kmenů Bcc z Fakultní nemocnice Královské Vinohrady; Legenda: osa x podobnost kmenů v procentech, osa y označení izolátů Dice (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] CR studie 272 CR studie III-48. epidemicky. III-45. III-46. III-47. III-41. III-42. III-43. III-44 Obrázek 6: Celkový dendrogram pro kmeny Bcc, Fakultní nemocnice Motol; Legenda: osa x podobnost kmenů v procentech, osa y označení izolátů 38

51 Dice (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] CR studie 272 CR studie III-07. III-58. III-11. III-12. III-56. III-10. III-09. III-13. III-14. III-06. III-57. III-18. III-59. III-55. III-17. III-08. III-54. epidemicky. III-19. III-16 Obrázek 7: Celkový dendrogram pro kmeny Bcc, Nemocnice Nový Jičín; Legenda: osa x podobnost kmenů v procentech, osa y označení izolátů Dice (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] CR studie 272 CR studie III-62. III-64. III-63. III III-65. epidemicky. III Obrázek 8: Celkový dendrogram pro kmeny Bcc, Fakultní nemocnice Brno; Legenda: osa x podobnost kmenů v procentech, osa y označení izolátů 39

52 Dice (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] CR studie 272 CR studie I-12. I-14. I-13. I-18. I-16. I-34. I-39. I-38. I-33. I-10. I-04. I-08. I-07. I-02. I-49. I-45. I-40. I-15. I-03. I-06. I-01. I-09. I-32. I-31. I-47. I-37. I-05. I-17. I-11. epidemicky Obrázek 9: Celkový dendrogram pro kmeny Bcc, Fakultní nemocnice Hradec Králové; Legenda: osa x podobnost kmenů v procentech, osa y označení izolátů 40

53 Dice (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] CR studie 272 CR studie epidemicky. III-05. III-04. III-03 Obrázek 10: Celkový dendrogram pro kmeny Bcc, Nemocnice Vsetín; Legenda: osa x podobnost kmenů v procentech, osa y označení izolátů Dice (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] CR studie 272 CR studie III-40. epidemicky. III-35. III III-37. III-39. III-36. III III-38. III Obrázek 11: Celkový dendrogram pro kmeny Bcc, Fakultní nemocnice Plzeň; Legenda: osa x podobnost kmenů v procentech, osa y označení izolátů 41

54 Dice (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] CR studie 272 CR studie III-51. III-53. III-52. epidemicky Obrázek 12: Celkový dendrogram pro kmeny Bcc, IKEM; Legenda: osa x - podobnost kmenů v procentech, osa y označení izolátů Dice (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] CR studie 272 CR studie III-68. III-69. epidemicky. III-67. III-71. III-1 Obrázek 13: Celkový dendrogram pro kmeny Bcc, Krajská nemocnice T. Bati ve Zlíně; Legenda: osa x podobnost kmenů v procentech, osa y označení izolátů 42

55 Dice (Tol 1.8%-1.8%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] CR studie 272 CR studie II-64. IV-28. II-07. II-49. II-52. II-50. II-53. EPIDEM. FNOL. II-59. II-72. II-63. II-80. II-14. II-01. II-13. II-11. II-39. II-36. II-42. II-40. II-25. II-61. IV-36. IV-48. IV-34. II-47. IV-20. II-62. IV-22. IV-02. IV-14. IV-33. IV-01. II-26. II-48. II-04. II-57. II-02. II-05. IV-09. IV-11 Obrázek 14: Celkový dendrogram pro kmeny Bcc z FNOL; Legenda: osa x podobnost kmenů v procentech, osa y označení izolátů 43

56 5.3 Genetická identifikace S. maltophilia pomocí PCR Standardními mikrobiologickými postupy bylo 34 bakteriálních izolátů identifikováno jako S. maltophilia. Z analýzy výsledků PCR a gelové elektroforézy vyplývá, že 32 izolátů bylo skutečně potvrzeno jako S. maltophilia, což odpovídá 94 % z celkového počtu zkoumaných izolátů. Zbývající dva izoláty (6 %) byly vzhledem k negativním PCR výsledkům identifikovány pomocí metody MALDI-TOF MS, která určila, že tyto dva patří k druhu Acinetobacter baumannii, což můžeme vidět v grafu 2. 94% S. maltophilia A. baumannii 6% Graf 2: Grafické a procentuální zobrazení zastoupení bakteriálních druhů při identifikaci S. maltophilia 44

57 5.4 Typizace kmenů S. matophilia metodou RAPD Genetická příbuznost 32 izolátů S. maltophilia byla stanovena pomocí RAPD metody. Získané údaje byly hodnoceny jednak vizuálně, jednak za použití softwaru. Na obrázku 15 lze vidět výsledky analýzy u vybraných izolátů z FNOL. Obrázek 15: Výsledek RAPD typizace u klinických izolátů z FNOL; Legenda: 1, 10 DNA marker bp, 2-8 izoláty z FNOL (II-29, II-23, II-22, II-21, II-19, II-18, II-15), 9 negativní kontrola Při porovnávání výsledků z RAPD analýzy pro FNOL bylo zjištěno, že u většiny izolátů se jedná o různé RAPD typy. Obrázek 16 udává výsledný dendrogram RAPD 45