KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL

Transkript

1 KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL NÁVODY KE CVIČENÍM VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I

2

3 KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL NÁVODY KE CVIČENÍM BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I ROZVOJ MODERNÍCH TRENDŮ V EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGII: VÝZNAM BIMOLEKULÁRNÍCH INTERAKCÍ PRO FUNKCI BUNĚČNÝCH STRUKTUR OPERAČNÍ PROGRAM VZDĚLÁVÁNÍ PRO KONKURENCESCHOPNOST ČÍSLO PROJEKTU: CZ.1.07/2.3.00/

4 KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL návody ke cvičením Václav Brázda Vydal: Biofyzikální ústav Akademie věd České republiky, v.v.i., Královopolská 135, Brno, Česká republika Brno 2015 Česká Republika První vydání ISBN:

5 Obsah Obsah... 5 Kapitola 1: Transfekce savčích buněk, detekce genové exprese pomocí reporterových genů... 7 Transfekce savčích buněk... 7 ELISA stanovení GFP... 9 Detekce luciferázy Kapitola 2: Polymerázová řetězová reakce... Chyba! Záložka není definována. Izolace mrna... Chyba! Záložka není definována. Reverzní transkripce... Chyba! Záložka není definována. qrt-pcr... Chyba! Záložka není definována. Kapitola 3: Transformace, selekce a kultivace bakterií, izolace plazmidové DNA restrikční analýza Transformace, selekce a kultivace bakterií Izolace plazmidové DNA a restrikční analýza Kapitola 4: Detekce strukturních přechodů v DNA pomocí CD spektroskopie I. B-A přechod II. B-Z přechod Kapitola 5: Aplikace elektrochemické analýzy v kombinaci s redox značením pro detekci specifických sekvencí a genové exprese

6 - 6 - OPVK Praktický kurz, 2015

7 Kapitola 1: Transfekce savčích buněk, detekce genové exprese pomocí reporterových genů Garant: Václav Brázda Transfekce savčích buněk Princip a cíl: Transfekcí je označován přenos cizorodého genetického materiálu do eukaryotických buněk. Existuje celá řada metodik transfekce, mezi nejstarší a nejčastěji používané patří chemická metodika transfekce fosforečnanem vápenatým. Použitá metodika transfekce fosforečnanem vápenatým je modifikací původní metodiky. Principem metody je vznik sraženiny fosforečnanu vápenatého s DNA, která je pohlcována endocytosou. Sraženina následně částečně uniká z endozomů nebo lysozomů a vstupuje do cytoplasmy, odkud prostupuje do jádra. Metoda transfekce fosforečnanem vápenatým je efektivní způsob zavedení DNA do buňky v mnoha systémech, nicméně v jiných může být zcela neefektivní. Nejlépe funguje v buněčných liniích, které rostou přisedlé, například u buněk Hela, U2OS, SAOS2, Ada a NPC-KT lze získat transfekční účinnost od 20% do 100% v závislosti na buněčné línii a podmínkách transfekce. Metoda funguje dobře pro vytváření jak tranzientní transformace, tak i pro generování stabilních buněčných linií. Metoda je citlivá na množství použitého plazmidu. Celkové množství transfekované DNA musí být cca 30 g (pro 100mm misky). Pro efektivní transfekci je vhodné použít jako nosič plazmid bez eukaryotického promotoru (například pbluescript). Pro typické transaktivační pokusy používáme mezi ng transfekovaného plazmidu a cca 29 µg nosičového plazmidu. Nicméně pro funkční tranfekci je někdy nutné poměr upravit až na 5-10 µg příslušného expresního vektoru a µg nosičové DNA. Je třeba mít na paměti několik důležitých aspektů. DNA přechází přes jadernou membránu pouze během mitózy. Nedojde tedy k expresi genu, dokud buňka neprojde mitózou. Po transfekci dochází k synchronizaci buněk, ty by se měli analyzovat nejméně 24 hodin po transfekci. Cílem je připravit buněčné línie 293F s reporterovými plazmidy a tak sledovat účinnost transformace: A) s luciferázovým expresním systémem pcna3wtp3 a pmdm2-app; B) s GFP proteinem pbrca-gfp

8 Pracovní postup: Pro tranfekci použijeme 6ti jamkové desky. 1. Den před transfekcí naředíme kulturu konfluentních buněk (70-90%) v poměru 1:10 do 1:15 (poměr závisí na buněčných liniích, které jsou transfekovány, rychleji rostoucí buněčné linie ředíme více, velmi pomalu rostoucí buněčné linie mohou být rozředěny méně než 1:10). 2. Druhý den ráno odlejte medium (DMEM (10% FBS, + pen / strep)) a přidejte 2ml čerstvého média. 3. Vlastní transfekce 5 g celkové DNA s různým množstvím efektorového plazmidu dle tabulky (dopočítejte množství plazmidu pro transfekci). A1 A2 A3 B1 B2 B3 Deska A1-A3 (plazmid s GPF) GFP plazmid Označení 2400 g/ml pbluescript A1 0 5 g A2 20 ng 5 g A ng 4 g Deska B1-B3 (plazmid s luciferázovým expresním systémem) pcna3wtp53 pmdm2-adp2 Označení 857 g/ml 51 g/ml pbluescript B ng 4,5 g B2 100 ng 500 ng 4,4 g B ng 500 ng 3,5 g - 8 -

9 4. Pro každou transfekci dejte 86 l 1X HBS do sterilní zkumavky. 5. Přidejte odpovídající množství DNA do každé zkumavky a promíchejte. 6. Přidejte do každé zkumavky 5 l 2,5M CaCl 2 a promíchejte. 7. Inkubujte 20 minut při pokojové teplotě. 8. Přidejte k buňkám transfekční směs po kapkách a mírně míchejte - nemixujte! 9. Vložte do CO2 inkubátoru. 10. Další den vyměňte médium. 11. Pro stadium transientní exprese jsou buňky použity po hodinách. Seznam chemikálií: 1X HBS 1 litr HEPES 5 g NaCl 8 g Dextróza 1 g KCl 3,7 g Na 2 HPO 4 (7H 2 O) 10 ml zásobního roztoku 1. Přidejte H 2 O do cca 900 ml. 2. Upravte ph na 7,1 přesně. 3. Přidejte H 2 O do 1 litru. 4. Přefiltrujte přes sterilní filtr (0.2 m. 5. Rozdějte na alikvoty do sterilních zkumavek a uložte na -20 C. Na 2 HPO 4 (7H 2 O) zásobní roztok = 0,94 g Na 2 HPO 4 (7H 2 O) v 50 ml H 2 O 2.5M CaCl2 100ml CaCl 2 27,75 g bezvodého CaCl 2 nebo CaCl 2 36,75 g CaCl 2 (2H 2 O) Rozdělte na alikvoty do sterilních zkumavek 15 ml (10 ml do každé) a uložte v mrazničce. ELISA stanovení GFP - 9 -

10 Pro stanovení účinnosti transfekce je možné využít citlivé měření na ELISA readeru. Fluorescence GFP je ale rychle zhášena, proto se pro citlivé stanovení používá zpravidla fluorescenčně značená monoklonální protilátka proti GFP. V našem případě se pokusíme změřit přímo fluorescenci buněk při 509 nm a srovnáme intenzity signálu se stanovením transformantů s luciferázovým expresním systémem. Pracovní postup: 1. Odstraň médium z kultury buněk. 2. Omyj buňky 1x PBS. 3. Přidej k buňkám 1x Trypsin 200 l na jednu jamku v 6-ti jamkové desce, (900 l na 100 mm misku 20 l na jamku v 96-ti jamkove desce) a nech působit cca 5 minut. 4. Odsaj buňky s 1 ml média do zkumavky a stoč (mikrocentrifuga rpm 5min.). 5. Resuspenduj buňky ve 100 l média a dej na 96-ti jamkovou ELISA desku. 6. Připrav blank (100 l média). 7. Změř fluorescenci na ELISA readeru. Seznam chemikálií a potřeb: PBS Trypsin Centrifuga ELISA reader s možností měření fluorescence

11 Detekce luciferázy Pro studium procesů spojených s genovou expresí se často používájí reporterové systémy. Dají se použít ke studiu expresní aktivity receptoru, intracelulární signální transdukce, skládání proteinů a studium interakcí. Luciferázový systém je používán zejména z následujích důvodů: Aktivita transfekovaného genu je k dispozici ihned po překladu do proteinu a nevyžaduje její posttranslační zpracování. Test je velmi citlivý a použité systémy nemají žádnou vnitřní luminiscenci. Test je rychlý, vyžaduje pouze několik sekund na vzorek. Světlo je produkováno přeměnou chemické energie oxidací luciferinu prostřednictvím elektronového přechodu při tvorbě oxyluciferinu. Luciferáza katalyzuje oxidaci luciferinu pomocí ATP a Mg2+. Promega systém pro detekci luciferázy obsahuje koenzym A pro zlepšení kinetiky, což umožňuje větší enzymatickou výtěžnost a zvýšení světlelné intenzity a stability signálu po dobu nejméně jedné minuty. Při optimálních podmínkách je možné detekovat okolo molů luciferázy. Cílem je změřit chemiluminiscenci u pokusných vzorků připravených transformací plazmidů s luciferázovým expresním systémem

12 Pracovní postup: 1. Odstraň médium z kultury buněk. 2. Omyj buňky 1x PBS (2ml). 3. Nalej na buňky 1x lysis reagent 200 l na jednu jamku v 6-ti jamkové desce (900 l na 100 mm misku 20 l na jamku v 96jamkove desce). 4. Seskřábni bunky z misky, přenes buňky do mikrozkumavky a odstraň debris (zbytky buněk na dně zkumavky) jemnou centrifugací (15s short spin). 5. Přenes 20 l supernatantu na ELISA desku. 6. Připrav blank (20 l 1x lysis reagent). 7. Přidej 100 l Luciferase Assay Reagent. 8. Změř intenzitu chemiluminiscence na ELISA readeru. Seznam chemikálií a potřeb: Promega E1500 Luciferase Assay Systém PBS Škrabka Centrifuga ELISA reader s možností měření chemiluminiscence

13 Kapitola 2: Polymerázová řetězová reakce Garant: Václav Brázda Princip a cíl úlohy Polymerázová řetězová reakce (PCR, Polymerase Chain Reaction) je enzymatická metoda umožňující zmnožení úseku DNA její replikací. PCR slouží k vytvoření až mnoha milionů kopií fragmentu DNA, což umožňuje provést analýzu DNA i z velmi malého vzorku. PCR probíhá v termocykleru, který dokáze během několika sekund zvýšit nebo snížit teplotu o několik desítek stupňů Celsia. Výsledkem PCR je obrovské množství kopií původní sekvence DNA. Metoda je tak citlivá, že dokáže v ideálním případě odhalit i jedinou molekulu DNA ve vzorku. Reverzní transkripční PCR (RT-PCR) se používá pro zmnožení DNA z RNA. Reverzní transkriptáza přepíše sekvenci RNA do cdna. Tato metoda je používaná pro stanovení exprese genů. Pokud je známa genomová sekvence, může se tato metoda použít také pro mapování exonů a intronů. Kvantitativní PCR (qpcr) slouží k měření množství cílové sekvence. Zpravidla se využívají fluorescenčně značené sondy nebo značení DNA fluorescenční barvou, například SYBR Green pro měření signalu DNA v reálném čase. Pracovní postup qpcr: Izolace mrna MagMAX-96 total RNA isolation kit AM1830 AB-Ambion Homogenizce vzorku 1. Připrav Lysis/Binding Solution -140 l na reakci (1 jamka na miske) - vždy čerstvý. Poměr LysisBinding Solution Concentrate: 100% izopropanolu 11:9). 2. Odstraň z buněk (2,5x10 2 2x10 6 ) médium a přidej 140 l Lysis/Binding Solution. 3. Míchej 1 minutu a poté dej zlyzované buňky do ELISA desky na izolaci. Purifikace nukleových kyselin 1. Připrav Bead mix smíchej 10 l RNA Binding Beads s 10 l Lysis/Binding Enhancer (množství na 1 reakci)

14 2. Přidej 20 l Mag-Bead Mix ke vzorku, míchej 5 min. 3. Vlož do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 2-3 minuty), poté odstraň opatrně supernatant. 4. Promyj 150 l Wash Solution 1, 1 minutu za míchání. 5. Vlož do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 2-3 minuty), poté opatrně odstraň supernatant. 6. Promyj 150 l Wash Solution 2 a dej míchat. 7. Dej do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 2-3 minuty), poté opatrně odstraň supernatant. 8. Připrav ředění TURBO DNase 49 l MagMAX TURBO DNase Buffer + 1 l TURBO DNase (množství na 1 reakci). Štepení DNA a čištění RNA 1. Přidej 50 l TURBO DNasy a míchej min. při pokojové teplotě (bez magnetu!). 2. Přidej 100 l RNA Rebinding Solution, míchej 3 minuty. 3. Dej do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 2-3 minuty), poté opatrně odstraň supernatant. 4. Omyj 2x 150 l Wash solution 2 a dej míchat. 5. Dej do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 2-3 minuty), poté opatrně odstraň supernatant. 6. Vysuš Beads mícháním 2 minuty. 7. Přidej 50 l Elution buffer a míchej 3 minuty. 8. Dej do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 2-3 minuty), poté supernatant s mrna přepipetuj do zkumavky pro další použití. 9. Změř vyizolovanou RNA na nanodropu

15 Reverzní transkripce High Capacity RNA-to-cDNA Kit (PN ) Použij až 2 g celkové RNA do 20 l reakce Nech kit rozmrznout na ledu, na reakci : 2x RT buffer 10 l 20x RT Enzyme mix 1 l Nuclease free H20 do 20 l Vzorek až 9 l 1. Rozpipetuj reakční směs do zkumavek. 2. Uzavři zkumavky. 3. Stoč a dej na led. 4. Naprogramuj thermal cycler: a. Krok 1 37 C 60min. b. Krok 2 95 C 5min. c. Krok 3 4 C do nekonečna 5. Nastav objem reakce na 20 l. 6. Vlož stripy do cykleru. 7. Spusť. 8. Po ukončení reverzní transkripce přečistíme cdna pomocí QIAquick Nucleotide Removal Kitu (Quiagene, 28306). 9. Změříme koncentraci cdna na nanodropu. Uložení do 24hod. 2-8 C, dlouhodobě -15 až -25 C PŘEČIŠTĚNÍ PRODUKTU reverzní transkripce pomocí kitu (15 minut)

16 qrt-pcr na AB 7300 Příprava PCR reakce SYBR Select Master Mix Připrav cdna, pro optimální q-pcr použij množství cdna do 100ng na 20 l vzorek. Promýchej SYBR Select Master Mix před použitím. Pro optimální výsledky je doporučeno provést reakci ve čtyřech opakováních. Reakce pro 96-ti jamkovou desku: SYBR Select Master Mix Primery ( nM) cdna template (10 a 100ng) Celkem 10 l 20 l Zamíchejte a opatrně stočte, aby byl vzorek bez bublin. Přeneste na PCR desku a uzavřete PCR vršky, lehce stočte, aby ve vzorcích nebyly bublinky (vlastní PCR by se měla jet do 72 hodin, vzorky uchovávejte ve tmě). Dejte do termocykleru AB Nastavte PCR reakci dle teploty tání (Tm) vašich primerů. 1. Aktivace - Hold 50 C 2 min. 2. Aktivace polymerázy Hold 95 C 2 min cyklů Denaturace 95 C 15 sec. 4. Anneal/Extend 60 C 1 min. Nastavte dissociační krok. Nastavte objem reakce na 20 l. Spusťte run

17 Kapitola 3: Transformace, selekce a kultivace bakterií, izolace plazmidové DNA restrikční analýza Garant: Petr Šebest Transformace, selekce a kultivace bakterií Princip úlohy: Transformace je přenos DNA (v našem případě se jedná o plazmidovou DNA) do hostitelských bakteriálních buněk. Bakteriální buňky musejí být nejprve uvedeny do stavu kompetence, ve kterém jsou schopny cizorodou DNA přijmout. Stav kompetence lze u buněk Escherichia coli navodit působením chloridu vápenatého za nízké teploty (0 C). Po přidání DNA a zahřátí na 42 C a následném ochlazení na 0 C (teplotní šok) přechází transformující DNA do buněk. Transformované buňky se selektují na agarových plotnách obsahujících příslušné antibiotikum. Vyselektované buňky se přeočkují do média s antibiotikem a inkubují se přes noc při teplotě 37 C. Úspešnost transformace je udávaná 1x10 9 cfu/µg superhelikální DNA. Pracovní postup: 1. den: 50 min. - 3 hod. přestavka 10 min. 2. den: 15 min. Po celou dobu pracujte sterilně a se sterilním materiálem (špičky, hokejky, ependorfky). 1. Kompetentní buňky E. coli TOP10 udržujte na ledu a napipetujte do ependorfky 10 µl. 2. Přidejte příslušnou DNA (500 ng) pbsk nebo ppgm1. 3. Nechejte 30 min. na ledu. 4. Rozehřejte termoblok na 42 C. 5. Transformace teplotním šokem: 45 sec. na 42 C a poté 5 min. na ledu. 6. Nechejte termoblok zchladnout na 37 C. 7. Přidejte 50 µl SOC média a nechejte kultivovat na termobloku 3 hod. při 37 C a 400 rpm

18 8. Vysejte na misky s Amp (napipetovat na misku a rozetřít hokejkou). 9. Inkubujte přes noc v termostatu při 37 C. 10. Z nejlepší kolonie odebrat špičkou buňky a přeočkovat do tekutého média s Amp, inkubujte na třepačce do druhého dne při 37 C

19 Izolace plazmidové DNA a restrikční analýza Princip úlohy: Plazmidy jsou mimochromozómové genofory tvořené kružnicovou dsdna. V bakteriálních buňkách se vyskytují v jedné až několika tisících kopií na buňku a jsou snadno dostupným zdrojem homogenní DNA. V přirozeném stavu v buňce mají plazmidy zpravidla negativní nadšroubovicové vinutí. Pro izolaci plazmidů pbluescript a ppgm1 použijeme metodu alkalické lýze s přídavkem SDS (Invisorb Spin Plazmid Mini Two kit), která vede k uvolnění vnitřního obsahu buněk. Plazmidová DNA, chromozomální DNA a proteiny jsou denaturovány a v dalším kroku dochází k jejich precipitaci kromě plazmidové DNA, která je renaturována a zůstává v roztoku. Následně je zachycena na koloně a nakonec uvolněna elučním pufrem. Pro další analýzy plazmidů použijeme restrikční endonukleázy. Restrikční endonukleázy jsou součástí tzv. restrikčně modifikačních mechanismů bakterií. Tento systém je zajišťován dvěma druhy enzymových aktivit metylační a restrikční. Enzymy s metylační aktivitou specificky modifikují (metylují) vlastní buněčnou DNA, čímž ji chrání před degradací restrikčními enzymy. Restrikční endonukleázy jsou bakteriemi využívány ke štěpení cizorodé DNA, která není v příslušných sekvencích metylována. Restrikční endonukleázy rozpoznávají krátké sekvence dvouřetězcové DNA a štěpí ji ve specifických místech nebo poblíž nich. V našem případě použijeme RE PvuII, která štepí námi izolovanou DNA ve 2 místech, takže získáme 2 fragmenty. Obr.: Plazmidy použité při transformaci

20 Pracovní postup: 3. den: 3 hod ml bakteriální kultury přenést do mikrocentrifugační zkumavky (ependorfky). 2. Centrifugujte v ependorfce 1 min rpm a odlijte supernatant. 3. Rozsuspendujte pelet v 250 µl roztoku A vortexováním nebo pipetováním, tak aby nebyly viditelné žádné shluky buněk. 4. Přidejte 250 µl roztoku B, a zamíchejte opatrně otočením ependorfky 5 krát (ne však déle než 5 minut). Nevortexovat! 5. Přidejte 250 µl roztoku C a zamíchejte jemně ale důkladně zatřepáním 4 až 6krát. Centrifugujte 5 minut při otáčkách rpm. Nevortexovat! 6. V průběhu centrifugace si připravte čisté ependorfky a umístěte do nich vazebnou kolonu. 7. Přelijte supernatant na kolonu a inkubujte 1 min. Centrifugujte 1 min. při rpm. 8. Vylijte filtrát a přidejte 750 µl promývacího roztoku (wash solution). Centrifugujte 1 min. při rpm. Vylijte filtrát. 9. Stočte 3 min. při rpm, aby došlo ke kompletnímu odstranění zbytkového etanolu. 10. Umístěte kolonku do nové ependorfky a přidejte µl elučního pufru. Inkubujte 1 min. (až 10 min.) při pokojové teplotě a nechejte centrifugovat 1 min rpm. 11. Změřte koncentraci DNA na nanodropu µg superhelikální DNA napipetujeme do čisté zkumavky. 13. Přidejte 1/10 objemu pufru z celkového výsledného objemu pro danou RE a 2U RE PvuII a vodu do výsledného objemu 20 µl. 14. Promýchejte a dejte na 37 C/1 hodinu. 15. V mezičase připravte 1,3% agarózový gel s 1x TAE pufrem. 16. Naneste vzorky na agarózový gel 10 µl + 1ul nanášecího pufru. 17. Zapněte elektroforézu na 100 V na 45 minut

21 Kapitola 4: Detekce strukturních přechodů v DNA pomocí CD spektroskopie Garant: Iva Kejnovská Princip a cíl: Spektroskopická metoda cirkulárního dichroismu (CD) je velmi citlivá ke vzájemné orientaci bazí ležících nad sebou ve šroubovici nukleových kyselin. Jednotlivé struktury poskytují charakteristická spektra CD. Postupným přidáváním činidel je možné vyvolat přechod z jedné uspořádané struktury do druhé. Kooperativnost přechodu spočívá v tom, že v úzkém rozmezí měnících se podmínek dojde ke změně natočení bazí a přitom je překonána energetická bariéra mezi lokálními enegetickými minimy. Příkladem kooperativního přechodu je přechod mezi dvoušroubovicí formy B do formy A působením dehydratačního účinku trifluoretanolu (TFE). V závislosti na primárním složení DNA, tedy na obsahu bazí, je možné vyvolat stejným činidlem přechod do jiné stuktury. Ve druhé úloze s DNA složenou z opakující se CG sekvence působením TFE dojde k přechodu do levotočivé formy Z. I. B-A přechod Pracovní postup: (120 minut) 1. Do křemenné kyvety s optickou dráhou 1 mm napipetujte 60 l připraveného heteroduplexu DNA: GCGGCGACTGGTGAGTACGC. GCGTACTCACCAGTCGCCGC a přidejte 90 l 100% TFE. Opatrně promíchejte a změřte CD spektrum. 2. V programu zadejte v General rozmezí vlnových délek nm, krok 0,5 nm, s rychlostí posuvu 100 nm/min, 3 akumulace. Dále zvolte Information a do Sample name vepište název ukládaného souboru, např. T

22 3. Během měření vypočítejte koncentraci přidaného TFE dle vzorečku: V 1 c 1 = V 2 c 2 : V 1 - přidaný objem TFE, c 1 - % koncentrace přidanéhotfe, V 2 - celkový objem v kyvetě c 2 - je koncentrace TFE v kyvetě 4. Pokračujte v přidávání TFE podle tabulky a měřte jednotlivá CD spektra s názvy Tn. Přídavek TFE Suma přidaného Celkový objem Koncentrace TFE Název CD spektra l] TFE l] v kyvetě l] [%] Výsledek 1: poslední CD spektra odpovídají DNA ve formě A, výchozí formě B. II. B-Z přechod Pracovní postup: (120 minut) 1. Do křemenné kyvety s roztoku oligonukleotidu (CG) 4 a přidejte 84 l 100% TFE. Opatrně promíchejte a změřte CD spektrum. 2. V programu zadejte v General rozmezí vlnových délek nm, krok 0,5 nm, s rychlostí posuvu 100 nm/min, 3 akumulace. Dále zvolte Information a do Sample name vepište název ukládaného souboru, např. Z

23 3. Během měření vypočítejte koncentraci přidaného TFE dle vzorečku: V 1 c 1 = V 2 c 2 : V 1 - přidaný objem TFE, c 1 - % koncentrace přidanéhotfe, V 2 - celkový objem v kyvetě c 2 - je koncentrace TFE v kyvetě 4. Pokračujte v přidávání TFE podle tabulky a měřte jednotlivá CD spektra s názvy Zn. Přídavek TFE Suma přidaného Celkový objem Koncentrace TFE Název CD spektra l] TFE l] v kyvetě l] [%] Výsledek 1: poslední CD spektra odpovídají DNA ve formě Z, výchozí formě B. Seznam potřebného vybavení a chemikálií: dichrograf křemenné kyvety oligonukleotidy trifluoretanol

24 Kapitola 5: Aplikace elektrochemické analýzy v kombinaci s redox značením pro detekci specifických sekvencí a genové exprese Garant: Jan Špaček Princip a cíl: Detekce hybridizace DNA (analýza nukleotidových sekvencí) a analýza genové exprese patří mezi důležité úkoly moderní molekulární diagnostiky. Elektrochemické metody mohou hrát významnou roli ve vývoji nových detekčních technik v této oblasti. DNA je elektroaktivní biopolymer poskytující na různých pracovních elektrodách řadu analyticky využitelných signálů. V některých případech se jeví jako výhodnější přístup využití značení DNA elektroaktivnímy značkami, které poskytují vlastní elektrochemické signály. Aplikace těchto značek v analýze nukleotidových sekvencí je zvláště výhodná, neboť umožňuje velmi selektivně detekovat cílovou DNA (specifickou DNA) v nadbytku ostatní (nespecifické DNA). Jednou z metod, jak připravit takto značenou DNA je inkorporace chemicky modifikovaných nukleotid trifosfátů do DNA pomocí Polymerázové řetězové reakce (PCR). Tato úloha bude zaměřena na přípravu DNA obsahující 7-deazaguanin (dg*) a 7-deazaguanin modifikovaný nitrofenylem v poloze 7 (dg NO2 ) pomocí PCR a jejich následnou elektrochemickou detekci. dg*tp H 2 N HN O N N dg NO2 TP H 2 N HN O N N NO 2 HO O P O - O O P O - O O P O - O O HO O P O - O O P O - O O P O - O O OH OH

25 Pro procvičení před začátkem úlohy doplňte obrázek pojmy z tabulky: 5 elongace templát 5 polymeráza dntp 3 annealing 3 primer PCR Každá skupina připraví dvě reakční směsi značenou DNA a kontrolu k ní: 1. skupina: Reakční směs: PCR s dg NO2 TP Reakční směs o celkovém objemu 100 µl bude obsahovat: 1 ng/µl templátové DNA (bluescript = plazmidová DNA) 3 U Pfu polymerázy 1x Pfu pufr 1 µm primery 0,2 mm datp, dctp, dttp 0,1 mm dgtp a 0,1 mm dg NO2 TP nebo 0,2 mm dgtp (kontrolní vzorek) 2. skupina: Reakční směs: PCR s dg*tp Reakční směs o celkovém objemu 100 µl bude obsahovat: 1 ng/µl templátové DNA (cdna připravená v předchozí úloze) 3 U Pfu polymerázy

26 1x Pfu pufr 1 µm primery 0,2 mm datp, dctp, dttp 0,1 mm dgtp a 0,1 mm dg*tp nebo 0,2 mm dgtp (kontrolní vzorek) Takto připravené směsi rozdělte do malých, PCR, zkumavek po 30 µl. Reakční směsi v PCR zkumavkách umístěte do thermocycleru a spusťte program: 30 cyklů: Denaturace: 94 C, 90 s Nasedání primerů: 60 C, 30 s Prodlužování řetězců: 72 C, 180 s Počítací úloha Spočítejte, kolik molekul datp je v každé PCR zkumavce (N A = 6, mol -1 ) a jakou hmotnostní koncentraci mají oba primery dohromady v 30 µl výše popsané reakční směsi (délka 20 bazí, průměrná hmotnost nukleosid monofosfátu je 330 g mol -1 ). datp = koncentrace primerů = Analýza PCR produktů na agarózovém gelu: Úspěšnost reakce zjistíme pomocí elektroforézy v 1 % agarózovém gelu (100 V / 30 min, 1x TAE pufr), následným obarvením gelu v ethidium bromidu a vyfocením po ozáření UV světlem

27 Přečištění produktů PCR Produkt PCR je po dokončení reakce stále ve směsi s přebytkem nukleotidů a primerů, které by znemožnily elektrochemickou analýzu. Proto je nutné provést přečištění. To provedeme PCR purification kitem od firmy Qiagen podle standardního protokolu, který je součástí kitu. Elektrochemické měření 1) PCR produkty značené dg* + kontrola: Analýza bude prováděna pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí square wave voltametrie na tužkové uhlíkové elektrodě v 0,2 M acetátovém pufru ph 5. Parametry měření: doba akumulace: 1 min počáteční potenciál: 0,3 V konečný potenciál: 1,5 V frekvence: 200 Hz 2) PCR produkty značené dg NO2 + kontrola: Analýza bude prováděna pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí cyklické voltametrie na visící rtuťové kapkové elektrodě ve 0,3 M fosfátovém pufru s mravenčanem amonným ph 7. Parametry měření: doba akumulace: 1 min počáteční potenciál: 0 V potenciál bodu obratu: -1,85 V a -0,75 V konečný potenciál: 0 V a 0,1 V rychlost posuvu potenciálu: 1 V/s

28 KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL návody ke cvičením Václav Brázda Vydal: Biofyzikální ústav Akademie věd České republiky, v.v.i., Královopolská 135, Brno, Česká republika Brno 2015 Česká Republika První vydání ISBN:

29

30

31 Labolatoř molekulárních komplexů chromatinu CEITEC a Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita 3. praktický Kurz pokročilých mikroskopických technik února 2015 Praktické seznámení s pokročilými mikroskopickými technikami, které jsou využitelné v laboratořích se zaměřením na experimentální biologii, biochemii a biofyziku. Budou představeny Pokročilé mikroskopické techniky FRAP, FLIM, FRET, FCS Účastníci se seznámí s konfokální mikroskopií a jejím využití pro in vivo experimenty a mikroskopii v reálném čase Místo konání Brno, Univerzitní kampus Bohunice, blok A2, seminární místnost 2.11 praktická výuka bude probíhat v laboratořích UKB Přihlášení Zájemci se přihlásí prostřednictvím u na hofr@sci.muni.cz Ctirad Hofr, Ph.D. Seminář je organizován v rámci projektu OP VK Rozvoj moderních trendů v experimentální biologii: význam biomolekulárních interakcí pro funkci buněčných struktur CZ.1.07/2.3.00/

32 Kurz pokročilých mikroskopických technik 9-10 Den 1 Úvodní přednáška metody konfokální mikroskopie a organizace kurzu Den2 Přednáška: Teoretické základy časově rozlišené mikroskopie (FLIM) oběd Praktické seznámení s konfokálním mikroskopem Tipy a triky pro optimální nastavení pozorování vzorků Úvod do analýzy obrazu v programu Photoshop Skupina A (5 osob) Photoshop Skupina B (5 osob) mikroskop Zeiss Pozorování vzorků in vitro za použití časově rozlišené mikroskopie mikroskop Zeiss Skupina A (5 osob) Vyhodnocení výsledků in vitro měření FLIM Výuka software na kvantifikaci doby dohasínání Skupina B (5 osob) záměna skupin A a B Základní nastavení pro FCS měření in vitro Příprava vzorků proměření za použití fluorescenční korelační spektroskopie mikroskop Zeiss Skupina A (5 osob) Pozorování vzorků in vivo za použití časově rozlišené mikroskopie mikroskop Zeiss Skupina A (5 osob) Analýza obrazu v programu Photoshop záměna skupin A a B Vyhodnocení výsledků in vivo měření FLIM Výuka software na kvantifikaci doby dohasínání Skupina B (5 osob) záměna skupin A a B

33 Kurz pokročilých mikroskopických technik 9-10 Den 3 Den 4 Přednáška: Teoretické základy rezonančního přenosu energie a aplikace ve fluorescenční mikroskopii (FRET) Přednáška: fluorescenční korelační spektroskopie FCS oběd Pozorování vzorků in vitro za použití rezonančního přenosu energie FRET Skupina A (5 osob) mikroskop Zeiss Skupina B (5 osob) mikroskop Olympus Vyhodnocení výsledků in vitro měření FRET Výuka software na kvantifikaci doby dohasínání Skupina B (5 osob) záměna skupin A a B Základní nastavení pro FCS měření in vitro Příprava vzorků proměření za použití fluorescenční korelační spektroskopie mikroskop Zeiss Skupina A (5 osob) Pozorování vzorků in vivo za použití kombinace FLIM a FRET Skupina A (5 osob) mikroskop Zeiss Vyhodnocení výsledků in vivo měření FRET Výuka software na kvantifikaci doby dohasínání Skupina B (5 osob) záměna skupin A a B Pozorování vzorků živých buněk metodou FCS mikroskop Zeiss Skupina A (5 osob) Vyhodnocení výsledků měření FCS Výuka software ImageJ Skupina B (5 osob) záměna skupin A a B

34 Autofluorescence an intrinsic property of cells arising from endogenous fluorophores (pyridinic and flavin coenzymes, aromatic amino acids, lipopigments) Specific fluorescence - fluorescent signals obtained by adding exogenous markers (fluorescent stains) Patrycja Klos, PhD pklos@mail.muni.cz 1

35 Patrycja Klos, PhD Patrycja Klos, PhD, LifeB Laboratory Autofluorescence an intrinsic property of cells arising from endogenous fluorophores (pyridinic and flavin coenzymes, aromatic amino acids, lipopigments) Specific fluorescence - fluorescent signals obtained by adding exogenous markers (fluorescent stains) Patrycja Klos, PhD, LifeB Laboratory Patrycja Klos, PhD, LifeB Laboratory Microscopy U Pinhole Photomultiplier tube Patrycja Klos, PhD, LifeB Laboratory Patrycja Klos, PhD, LifeB Laboratory 1

36 Fixation stabilization/preservation of cells as close to lifelike as possible. Cross-linking fixation chemical fixative (formaldehyde) binds to reactive groups on proteins and lipids and holds them in the same position as in living cells SpectraViewer Permeabilization to allow antibodies/dyes to penetrate inside the fixed cells (detergents: Triton X-100, non-ionic) Blocking to prevent the inappropriate binding of antibodies/compounds to nonspecific binding sites (BSA bovine serum albumine nonantigenic, binds charged sites) Patrycja Klos, PhD, LifeB Laboratory Patrycja Klos, PhD, LifeB Laboratory No fixation/permeabilization Using dyes that can enter the cells without killing them (no antibody conjugates!) Expression of fluorescently-tagged proteins (GFP, EGFP, RFP, mcherry, YFP, etc...) Similar spectral characteristics (358/461 vs. 346/460, when bound to DNA) UV-excited, minor groove-binding Hoechst can pass the cell membrane DAPI passes the membranes less effectively in live cells DAPI violet Hoechst cyan Patrycja Klos, PhD, LifeB Laboratory Patrycja Klos, PhD, LifeB Laboratory pklos@mail.muni.cz 2

37 Manual for a course in advanced microscopic techniques, February 2015: Lectures: introduction to confocal microscopy and other advanced microscopy techniques confocality differences between wide field and confocal microscopy advanced microscopy techniques (FRET, FLIM, FRAP, SPIM) fluorescence correlation and cross-correlation spectroscopy (FCS/FCCS) Practical session (Zeiss LSM 780 system): tips and tricks for optimal visualization of a sample laser power pinhole size PMT voltage (gain) offset digital offset averaging z-stack of Zygnema FCS single-color calibration experiment (Alexa Fluor 488 and Alexa Fluo 633, separately) Lectures: introduction to FCCS experiment in living cells Practical session (Zeiss LSM 780 system): two-color calibration (Alexa Fluor 488 and Alexa Fluo 633, mixed) FCCS experiment: visualization of telomeric protein interactions (TRF2-TIN2) in living HEK293T cells analysis of autocorrelation and cross-correlation curve interpretation of acquired data (diffusion coefficient and diffusion time, triplet state, structural parameter).