MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE. Rigorózní práce

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE Rigorózní práce Brno 2014 Iva Slámová

2 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE CELOGENOMOVÁ ANALÝZA BUNĚK TROFEKTODERMU POMOCÍ TECHNIKY ARRAY KOMPARATIVNÍ GENOMOVÉ HYBRIDIZACE Rigorózní práce Iva Slámová Brno 2014

3 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Mgr. Iva Slámová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Celogenomová analýzy buněk trofektodermu pomocí array komparativní genomové hybridizace Biologie Obecná genetika a molekulární biologie Akademický rok: 2014/2015 Počet stran: Klíčová slova: Preimplantační genetický screening; PGS; preimplantační genetická diagnostika; PGD; komparativní genomová hybridizace na čipech; acgh; in vitro fertilizace; IVF; proces IVF; úspěšnost IVF cyklu

4 Bibliographic Entry Author Title of Thesis: Degree programme: Iva Slámová, MSc. Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology. The whole genome analysis of trophectoderm cells with use of array comparative genomic hybridization Biology Field of Study: Genetics and molecular biology Academic Year: 2014/2015 Number of Pages: Keywords: Preimplantation genetic screening; PGS; preimplantation genetic diagnosis; PGD; array comparative genomic hybridization; acgh; in vitro fertilization; IVF; IVF process; succes rate of IVF cycle

5 Abstrakt Tato rigorózní práce je věnována celogenomovým analýzám buněk trofektodermu. Chromozomové aberace jsou nejčastější příčinou neuchycení embrya v děloze a také spontánních potratů v raném stádiu těhotenství. Jejich počet se v oocytech zvyšuje s věkem ženy. Preimplantační genetické analýzy umožňují genetickým vyšetřením buněk odebraných z vyvíjejícího se embrya odhalit genetické abnormality budoucího plodu. K transferu do dělohy lze tedy vybrat embrya bez genetické zátěže. Velkou úlohu hrají metody molekulární cytogenetiky a to především technika array komparativní genomové hybridizace. V předložené práci byly pomocí techniky acgh s využitím platformy BAC mikročipů BlueGnome vyšetřeny buňky trofektodermu z 857 embryí od 527 pacientek. Celkem bylo nalezeno 517 embryí bez aberace (65 %) a 281 (35 %) s aberací, dále pak z celkového počtu 366 aberací bylo 165 (45 %) se ziskem celých chromozomů, 21 (6 %) se ziskem části chromozomů, 101 (28 %) se ztrátou celých chromozomů a 55 (15 %) se ztrátou části chromozomů. Případy 3 a více změn byly nalezeny ve 24 (7 %) embryích. Zisky chromozomů celkem byly nalezeny ve 186 (51 %) embryích a ztráty ve 156 (42 %). Nejčastěji se trizomie vyskytovaly u chromozomů 6, 15, 16, 19, 21 a 22; monozomie pak u chromozomů 16, 21, 22 a X; komplexní aneuploidie byly nalezeny u 24 embryí. Parciální změny byly nalezeny ve smyslu zisku genetického materiálu u chromozomu 9 a ztrát genetického materiálu pak u chromozomů 1, 2, 5, 6, 7, 11, 12, 13. Žádné parciální změny nebyly nalezeny u chromozomů 3, 17, 18, 22 a Y. Nejvyšší podíl změn v genomu celkově se týkal chromozomů 16, 21, 22. Úspěšnost IVF cyklu vzrostla po transferu vyšetřených embryí ze 43 % na 67 %. Druhou skupinou zájmu bylo 659 embryí od 352 pacientek. V této studii byly ženy rozděleny dle věku a to na ženy mladší 35 let včetně a ženy starší 35 let. U žen mladších 35 let bylo nalezeno 31 % embryí s aberací a u starších 35 let pak 45 % s aberací. Díky vyšetřením embryí pomocí acgh, vzrostla úspěšnost IVF cyklu u žen starších 35 let z 26 % na 66 %. Byl prokázán jasný vzestup počtu genetických abnormalit korelující s věkem ženy a vyhodnocen jejich negativní dopad na úspěšnost IVF cyklu. Na straně druhé pak bylo zjištěno, že vyloučením těchto embryí z procesu IVF, je možné vliv věku ženy zcela eliminovat.

6 Posledním souborem bylo 39 embryí pocházejících z IVF cyklů přenašečů translokací. Embrya s nebalancovanou translokací byla nalezena ve 42 % případech. Z procesu IVF bylo vyloučeno celkem 23 (58 %) embryí s aberacemi spojenými s translokací a jinými aberacemi. U všech embryí byl stanoven segregační mód. Výsledky předložené práce prokázaly, že celogenomové analýzy nabízí solidní nástroj pro determinaci chromozomálních aberací v buňkách trofektodermu. Výběrem embrya bez aberace se zvyšuje pravděpodobnost otěhotnění a možnost narození zdravého potomka. Zcela zásadní úlohu v celogenomových analýzách hraje technika acgh, která je pro účely PGS a PGD nejčastěji využívána.

7 Abstract This study is specifically concerned with whole genome analyses of trophectoderm cells of embryos. Chromosomal aberrations are major cause of embryo implantation failure and miscarriages in early pregnancy. Aneuploidy rates increase in oocytes with age. Preimplantation genetic analyses can determine genetic abnormalities in cells taken from the developing embryo. Major role play methods of molecular cytogenetics and in particular, array comparative genomic hybridization. In this study the trophectoderm cells of 857 embryos from 527 women were analysed by the acgh technique with using BlueGnome BAC microarrays platform. Total rate of chromosomal aberrations and their individual representation in abnormalities was evaluated. It was found 65% of the embryos without aberration and 35% with aberrations. In 366 aberrations were found 165 (45 %) with gain of whole chromosome, 21 (6 %) with gain of partial change, 101 (28 %) with loss of whole chromosome a 55 (15 %) with loss of partial change. In 24 (7 %) embryos were found complex aneuplidies (3 and more). The gains were found in 186 (51 %) embryos and losses were found in 156 (42 %) embryos. Trisomies were found in chromosomes 6, 15, 16, 19, 21 a 22 the most frequently; monosomies in chromosomes 16, 21, 22 a X; complex aneuploidy were foun in 24 embryos. The segmental gain was found in chromosome 9 the most frequently and segmental losses were foud in chromosomes 1, 2, 5, 6, 7, 11, 12, 13. A share of partial changes was 21 % in the overall. Any partial changes were found in chromosomes 3, 17, 18, 22 a Y. The biggest ratio of chromosomal changes involves chromosomes 16, 21 and 22. The chromosomes 16, 21 and 22 were mostly involved in aberrations. After transfer of analysed embryos the success of IVF cycle increased from 43% to 67%. The second group of interest were 659 embryos from 352 patients. In this study, women were divided according to age - women younger than 35 years and women older than 35 years. In embryos of younger women there were 31% with aberrations and in embryos of women older than 35 years there were 45% with aberrations. Thanks examination of embryos using acgh, the success of IVF cycle increased in women older than 35 years from 26% to 66%. Clear increase was proven in the number of genetic abnormalities correlated with advanced maternal age and their negative impact on the

8 success of IVF cycle was evaluated. On the other hand, it was found out that the exclusion of these embryos from IVF process, it is possible the effect of advanced maternal age eliminated entirely. The final sample consisted of 39 embryos derived from IVF cycles translocation carriers. Embryos with unbalanced translocation were found in 42% of cases, in 50 % there were achieved pregnancy in the first IVF cycle. It was excluded 23 (58 %) of embryos with abnormalities associated with rearangement, either alone or in combination with other chromosomal abnormalities from the IVF process. Segergation mode was determined in all embryos. The results of whole genome analysis of trophectoderm cells should serve as a supporting tool for the determination of chromosomal aberrations in embryos. Probability of pregnancy and birth of healthy child improves the selection of embryos without aberrations. PGS and PGD are principally new approaches for the prevention of genetic disorders by selecting of embryos without chromosomal abnormalities within the scope of IVF cycle. Array comparative genomic hybridization play a major role in analysis of trophectoderm cells and this method is most frequently used.

9 Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat prim. MUDr. Pavlu Texlovi za umožnění vypracování této rigorózní práce. Dále děkuji RNDr. Kateřině Okénkové za rady a zkušenosti z oblasti embryologie, Bc. Evě Matejičkové za pomoc při statistickém zpracování embryologických souborů, Mgr. Soně Kloudové, Ph.D. za uvedení do andrologické problematiky, MUDr. Mojmíru Fisherovi za objasnění stimulačních protokolů a také všem spolupracovnicím a spolupracovníkovi z Laboratoře IVF a Laboratoře lékařské genetiky. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji rigorózní práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno Iva Slámová

10 OBSAH 1. ÚVOD TEORETICKÁ ČÁST Genetická vyšetření zárodečného genomu Indikace genetických laboratorních vyšetření zárodečného genomu, legislativa Chromozomové aberace a jejich role v IVF Mozaicismus Preimplantační genetický screening (PGS) Preimplantační genetická diagnostika (PGD) Monitorování embryí v čase Metody IVF Intracytoplazmatická injekce spermie (ICSI) Intracytoplazmatická injekce předvybrané spermie (PICSI) Asistovaný hatching (AH) Biopsie Kryokonzervace Transfer embrya a počet transferovaných embryí Dárcovství gamet či embryí Náhradní (surogátní) mateřství Biologický materiál Vajíčka (oocyty) Spermie (spermatozoa) Pólová tělíska Embrya Metody analýzy pro PGS/PGD Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) Celogenomová amplifikace (WGA) Array komparativní genomová hybridizace (acgh) Polymerázová řetězová reakce (PCR) Karyomapování Sekvenování nové generace - Next Gene Sequencing (NGS) Etické aspekty IVF CÍLE PRÁCE... 57

11 4. MATERIÁL METODY EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST - VÝSLEDKY Celogenomová analýza počtu a typu chromozomových aberací v buňkách trofektodermu Srovnání počtu aberací u žen mladších 35 let včetně a žen starších 35 let, vliv věku ženy na úspěšnost IVF cyklu Celogenomová analýza embryí přenašečů balancované translokace v rámci PGD DISKUSE SHRNUTÍ SUMMARY LITERATURA PŘÍLOHY

12 SEZNAM ZKRATEK acgh ADO AH AR BAC array comparative genomic hybridization; komparativní genomová hybridizace na čipech allele dropout; alelový dropout assisted hatching; narušení zóny pellucidy assisted reproduction; asistovaná reprodukce bacterial arteficial chromosome; umělý chromozom bakteriálního původu CEQAS Common External Quality Assessment System; Mezinárodní systém pro kontrolu kvality CVS DET E2 ESHRE FET FISH FSH HCG HLA ICM ICSI chorionic villus; choriové klky double embryo transfer estradiol European Society for Human Reproduction and Embryology; Evropská společnost pro lidskou reprodukci a embryologii fresh embryotransfer; čerstvý embryotransfer fluorescnence in situ hybridization; fluorescenční in situ hybridizace folikulostimulační hormon choriogonadotropní hormon human leukocyte antigen; hlavní histokompatibilní komplex inner cell mass; vlastní buňky budoucího plodu intracytoplasmatic sperm injection; intracytoplazmatická injekce spermie ISCN An International System for Human Cytogenetic Nomenclature; mezinárodní systém cytogenetických zápisů

13 IVF KET LH LLG MDA MESA NGS in vitro fertilizace, umělé oplodnění kryoembryo transfer; transfre embrya po rozmražení luteinizační hormon Laboratoř lékařské genetiky multiple dispalcement amplification; amplifikace násobným vytlačováním řetězce microsurgical epididimal sperm aspiration; tyo odběru spermií z nadvarlete next gene sequencing; sekvenování nové generace oacgh oligonukleotidová komparativní genomová hybridizace OHSS PA PCR PEP PESA PGD PGS PICSI SET SNP STR TE TESA ovarian hyperstimulation syndrome; hyperstimulační syndrom preference amplification; prefernční amplifikace polymerasa chain reaction; polymerázová řetězová reakce primer extension preamplification; preamplifikace prodlužováním primerů percutaneous epididymal sperm aspiration; typ odběru spermií z nadvarlete preimplantation genetic diagnosis; preimplantační genetická diagnostika preimplantation genetic screening; preimplantační genetický skríning preselective intracytoplasmatic injection sperm; intracytoplazmatická injekce vybrané spermie single embryo transfer; transfer jednoho embrya single nucleotide polymorphism; jednonukleotidový polymorfismus short tandem repeat; krátká tandemová repetice trophectoderm; trofektoderm testicular sperm aspiration; typ odběru spermií z varlete

14 TESE UPD WGA WHO testiculaat sperm extraction; typ odběru spermií z varlete uniparental disomy; uniparentální dizomie whole genome amplification; celogenomová amplifikace World Health Organization; Světová zdravotnická organizace

15 1. ÚVOD Žijeme v době, kdy početí dítěte nemusí být takovou samozřejmostí jako dříve. Mateřství je často odkládáno na dobu, kdy jsou partneři schopni se o dítě materiálně postarat, stále častěji se také setkáváme s velkou neochotou vzdát se vlastního pohodlí a individuality na úkor nového člena rodiny. Z ekonomického hlediska je vyčkávání na finanční soběstačnost skutečně tou nejlepší volbou, bohužel se však populace vyspělých zemí do budoucna vystavuje riziku snížení svého stavu z důvodu nemožnosti otěhotnět, menšího počtu potomků a větší potřeby využívat umělého oplodnění, které nemusí být nápomocno ve všech případech. Z genetického hlediska totiž začínají s reprodukcí jedinci starší, u kterých je velká pravděpodobnost, že budou potřebovat asistenci reprodukčního centra. U obou partnerů je větší riziko výskytu chromozomálních aberací v zárodečných buňkách. Není již pravdou, že lví podíl na neúspěchu otěhotnět mají ženy. Tento mýtus byl zcela překonán. Existují jasné důkazy, že stejný podíl na reprodukčním neúspěchu mají také muži. S touto problematikou je pak spojena stále větší potřeba genetických vyšetření embryí před přenosem do dělohy. V České republice se po IVF v roce 1996 narodilo asi 4000 dětí, o 10 let později pak už dětí a jejich počet stále stoupá. S reprodukcí má problém asi 30 % párů. Celosvětově přesáhl počet dětí narozených po IVF v roce 2012 hranici 5 milionů. V Sanatoriu Helios je provedeno ročně IVF léčebných cyklů, výsledkem je narození odhadem dětí ročně. Dnes je běžnou součástí každého moderního centra in vitro fertilizace (IVF) genetická laboratoř, skýtající celou škálu vyšetření genetického materiálu embrya. Genom embryí je možné analyzovat jak v rámci preimplantačního genetického screeningu (PGS), tak v rámci cílené preimplantační genetické diagnostiky (PGD). Za dvacetiletou historii genetického vyšetřování embryí bylo dosaženo velkého pokroku jak v oblasti kultivace embryí in vitro a jejich kryokonzervace tak v oblasti využití molekulárně cytogenetických a molekulárně biologických metod, díky kterým je možné genom embrya zkoumat. Od 90. let minulého století byla pro účely preimplantačních genetických analýz využívána metoda fluorescenční in situ hybridizace (FISH), která umožňuje vyšetřit omezený počet chromozomů. Technika byla v uplynulých 10 letech téměř zcela nahrazena modernější a výtěžnější metodou array komparativní genomové hybridizace (acgh), často také nazývanou technologií DNA čipů, díky níž je možné v jedné analýze vyšetřit všechny chromozomy. Další techniky, které rychle zaujímají místo v genetické analýze embryí, jsou pak karyomapování a sekvenování nové generace, s nimiž lze z jediné buňky odhalit aberace na genové úrovni. 14

16 Velice důležitou součástí získávání genetického materiálu z embryí je práce embryologů. Pouze kvalitní embrya je možné podrobit biopsii a získat tak buňky pro analýzu. Dříve používané buňky blastomer třetí den kultivace embryí, jsou nahrazovány buňkami z blastocyst odebranými pátý nebo šestý den kultivace, tím je možné získat více buněk a také větší množství DNA pro analýzu, snížit riziko alelického dropoutu (ADO) a preferenční amplifikace (PA). Odběrem buněk z blastocysty se také snižuje riziko poškození embrya a v neposlední řadě se transferem embrya v tomto stádiu vývoje přibližíme co nejvíce přirozenému cyklu. Neméně zásadní je pak uchování embrya do doby transferu do dělohy. Embrya mohou být vitrifikována a transfer probíhá v dalším přirozeném cyklu ženy. Úspěšnost celého IVF cyklu také ovlivňuje počet transferovaných embryí. Tato práce byla vypracována v Laboratoři lékařské genetiky, která je akreditována dle normy ISO ČSN EN a je součástí reprodukčního centra SANATORIUM Helios, s r.o. v Brně. 15

17 2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1 Genetická vyšetření zárodečného genomu Indikace genetických laboratorních vyšetření zárodečného genomu, legislativa Pro indikace ke genetickým vyšetřením existují určitá pravidla. Preimplantační genetická vyšetření jsou rozdělena na preimplantační genetický screening (PGS), který se využívá pro odhalování nově vzniklých chromozomových změn (aneuploidií) a preimplantační genetickou diagnostiku (PGD), díky které je možné snížit riziko přenosu závažné monogenní choroby nebo chromozomové vady (strukturní aberace). Z připravovaného doporučení Společnosti lékařské genetiky jsou indikace k PGS následující: opakovaně neúspěšné cykly asistované reprodukce opakované spontánní potraty po vyloučení ostatních příčin početní aberace gonozomů (např. 47,XXX, 47,XYY) a malé mozaiky gonozomů věk ženy nad 37 let zvýšený podíl získaných chromozomových aberací závažný andrologický faktor (např. oligoastenospermie, fragmentace DNA spermií, spermie získané chirurgickým zákrokem) porod nebo potrat dítěte (plodu) s chromozomovou aberací chemoterapie nebo radioterapie jednoho či obou partnerů Indikace pro PGD: přenašečství strukturní chromozomové aberace (balancované reciproké či Robertsonovské translokace, závažné inverze) monogenně podmíněné nemoci - autozomálně recesivní choroby (např. spinální muskulární dystrofie, cystická - fibróza, fenylketonurie) - autozomálně dominantní choroby s časným nástupem onemocnění (např. - neurofibromatóza, Marfanův syndrom, achondroplazie) nebo s pozdním - nástupem onemocnění (např. Huntingtonova chorea, polycystóza ledvin, - hereditární kolorektální karcinom, hereditární karcinom prsu a vaječníků) choroby vázané na pohlaví (např. hemofilie, Duchenova/Beckerova muskulární dystrofie, syndrom fragilního X) 16

18 HLA typizace embrya v přísně indikovaných případech (např. leukémie dítěte v rodině, kdy je třeba dárce s maximální shodou v HLA znacích, tedy sourozence) Celý proces je řízen Zákonem 372/2011 Sb. a 373/2011 Sb., kde je jasně uvedeno, za jakých podmínek jsou tato vyšetření prováděna. Jedná se zejména o klinické vyšetření lékařem s příslušnou specializační zkouškou z klinické genetiky (odbornost 208), následované laboratorním genetickým vyšetřením zárodečného genomu v akreditované laboratoři dle normy ISO ČSN EN (odbornost 816). Zárodečný genom je pak definován jako genom příslušníků více generací na ose zygota somatické buňky organismu. Vyšetření se tak může týkat i jiných členů rodiny (Šantavý a kol., 2014). Vysvětlení a podepsání přesně definovaného informovaného souhlasu s genetickým vyšetřením, který je formulován na základě doporučení Společnosti lékařské genetiky. V tomto souhlase, který má několik částí, je stručně vysvětlen obsah a šíře vyšetření, účel vyšetření, předpokládaný prospěch pro pacienta, prohlášení lékaře, prohlášení vyšetřované osoby, způsob nakládání s DNA po analýze a podpis pacienta/ky, že s uvedenými skutečnostmi souhlasí. Bez podpisu takto připraveného informovaného souhlasu, nelze žádnou genetickou analýzu provádět. Základem preimplantačních genetických analýz zůstává vyšetření karyotypu obou partnerů. Dle současné legislativy lze provést jakoukoliv formu umělého oplodnění ženě do 49 let včetně. 17

19 2.1.2 Chromozomové aberace a jejich role v IVF Chromozomové abnormality jsou v % nejčastější příčinou spontánních potratů. Z hlediska IVF jsou pak častou příčinou špatného vývoje embrya in vitro a také neuchycení v děloze matky. Je známo, že počet chromozomových abnormalit rapidně stoupá s věkem ženy (Graf 1). Graf 1: Vzrůstající počet chromozomálních aberací v závislosti na věku ženy (Zdroj: upraveno). aneuploidie živě narození potraty Věk ženy Až 5 % klinicky rozpoznaných gravidit je trizomických nebo monozomických. Mnoho z nich končí in utero tj. následným spontánním potratem, některá těhotenství mohou končit narozením dítěte s vrozenou vývojou vadou spojenou s mentální retardací (Hassold et al., 2007). 18

20 Z výzkumu vyplývá, že více jak 50 % embryí získaných při procesu IVF obsahuje aneuploidní buňky (Rabinowitz et al., 2011). Nejčastější formou aneuploidií jsou trizomie a monozomie, asi jedno z 300 narozených dětí má aneuploidní sadu chromozomů, jedná se nejčastěji o aneuploidie týkající se gonozomů a chromozomu 21. Asi jeden ze 3 spontánních potratů je způsoben monozomií chromozomu X a trizomií chromozomu 16. Většina trizomií vzniká chybou v meióze I v oocytu, tímto způsobem vznikají nejčastější trizomie týkající se chromozomů 15, 16, 18, 21 a gonozomů. V případě chyb v paternální meióze I vznikají trizomie 21 a konstituce pohlavních chromozomů XXY. Abnormální rekombinace může způsobovat trizomie chromozmů 16 a 21. Se zvýšeným počtem aneuploidií je spojen vyšší věk matky. Vliv věku není dosud zcela objasněn, je však spojován také s abnormální rekombinací chromozomů (Hassold et al., 2001). Chromozomové aberace jsou ve vetšině případů maternálního původu. Vznikají v obou meiotických děleních. Klasické nondisjunkce v meióze tvoří pouze 3 % aberací, hlavní příčinou většiny genetických abnormalit je předčasné oddělení sesterských chromatid. Vznik trizomií je spojován s redukcí počtu crossingoverů v anafázi I, např. trizomie chromozomu 16, která reprezentuje nejčastější aberaci v embryích žen stařších 35 let, je spojována s absencí crossingoverů v koncovích částech obou ramen chromozomu. V mitóze je mechanismem vzniku aneuploidií také nesprávné oddělení chromatid. Bylo prokázáno, že hladina kohezinu, jehož úkolem je spojení a také separace sesterských chromatid v meióze I, klesá s věkem ženy. S věkem ženy také klesá množství proteinu Rec8, který je důležitý při rekombinaci mezi nesesterskými chromatidami. (Handyside, 2012). Proces správné segregace chromozomů je zcela závislý na organizaci mitotického vřeténka a proteinech a faktorech signální dráhy buněčného cyklu. Velkou roli hrají kinetochory, které jsou důležité pro oddělení sesterských chromatid. Špatné načasování oddělování chromatid v anafázi I je zcela zásadní pro vznik aneuploidií. Hovoříme o vlivu tzv. předčasné separace chromatid (Compton et al., 2011). Diskutován bývá i vliv procesu asistované reprodukce (AR) na zvyšování počtu chromozomálních aberací. Huang a kolektiv (2009) však prokázali, že pravděpodobnost vzniku mozaicismu tedy i chromozomálních aberací u pacientů s poruchou fertility, je stejná jako u přirozeně koncipujících jedinců. Ve studiích je také na chromozomální aberace pohlíženo z hlediska hormonální stimulace. Výsledky ukazují, že hormonální stimulace jako taková nepřispívá ke zvýšení jejich počtu. 19

21 Největší roli v množství a typu chromozomálních aberací hraje věk ženy, kvalita spermií a post-zygotické abnormality jako je například mozaicismus (Verpoest et al., 2008) Mozaicismus O mozaicismu hovoříme jsou-li nalezeny dvě nebo více rozdílných buněčných linií u jedince či ve vzorku biologickém materiálu (Obr. 1). Bylo zjištěno, že až 80 % blastomer je aneuploidních (Compton et al., 2011). Obrázek 1: Vývoj lidského embrya do stádia blastocysty, buňky bez aneuploidie (zeleně), buňky s aneuploidiemi (oranžová, červená, modrá a hnědá); a) buňky s aneuploidiemi byly ztraceny během buněčného dělení; b) buňky s aneuploidiemi jsou pouze součástí trofektodermu; c) buňky s aneuploidiemi jsou součástí trofektodermu i vnitřní buněčné hmoty (Zdroj: Dle Liu (2012) jsou mozaiky v blastocystách nalézány v 69,23 % a lze je rozdělit do několika skupin (Obr. 2): Typ I: euploidní vnitřní buněčná hmota (inner cell mass; ICM) i trofektoderm (TE), normální blastocysta; Typ II: aneuploidní ICM i TE, abnormální blastocysta; Typ III: euploidní ICM a aneuploidní TE nebo euploidní i aneuploidní TE obě mají mozaiku v TE a euploidní ICM; Typ IV: euploidní a aneuploidní TE nebo mozaika v TE obě mají aneuploidní ICM. Vzhledem k tomu, že je možné v rámci mozaicismu najít abnormality 20

22 v TE a ICM, může být embryo euploidní či naopak, nemůžeme s jistotou určit, zda embryo má či nemá chromozomovou aberaci a to je problém při správné interpretaci výsledku (Liu et al., 2012). Ve studii Jannie van Echten-Arends (2011) bylo analyzováno 815 embryí. Výsledkem bylo zjištění, že 22 % embryí je diploidních, 73 % s mozaikou a 5 % s jinou chromozomovou abnormalitou. Z embryí s mozaikou je pak 59 % embryí s uspořádáním mozaiky diploidní - aneuploidní buňky. Embrya vzniklá pomocí přístupů IVF jsou mozaikou zatížena ve vetšině případů (van Echten-Arends et al., 2011). Euploidní ICM i TE Aneuploidní ICM i TE Aneuploidní TE a euploidní ICM Euploidní a aneuploidní TE a euploidní ICM Euploidní a aneuploidní TE a aneuploidní ICM Aneuploidní ICM i TE s více aberacemi Abnormální buňky Euploidní buňky Obrázek 2: Typy mozaicismu v blastocystách (Zdroj: Liu et al, 2012; upraveno). 21

23 Vyšetření TE pomocí acgh může přinést informaci o stavu genomu v ICM, ale memusí odhalit mozaiku či skutečný stav genomu. Není možné rozlišit dva typy mozaicistních embryí: 1) embrya s euploidním TE a aneuploidní ICM transfer takového embrya může zapřičinit vznik patologického těhotensví s narozením dítěte s vrozenými vadami; 2) embrya s aneuploidním TE a euploidní ICM v tomto případě jsou tato embrya, která by se mohla normálně vyvíjet, vyřazena z transferu. S ohledem na případ 2) by bylo vhodné tato embrya uchovat zamražená a posoudit individuální situaci pacientky (př. vyšší věk, poslední cyklus IVF, opakované reprodukční ztráty), dále k nim přistupovat jako k transferovatelným. Byly srovnávány nálezy mozaiek v TE a ICM u stejných embryí a bylo prokázáno, že mnoho embryí s mozaikou v TE má euploidní ICM (Liu et al., 2012). Efekt mozaicismu, ve smyslu vývoje nového jedince, bývá různý. Některá embrya se vyvíjí bez problémů, u jiných se v pozdějším stádiu těhotenství projeví porucha růstu v děloze nebo nastane spontánní potrat. V nejhorším případě se narodí postižené dítě (Robberecht et al., 2010). V literatuře je popsán případ, kdy bylo transferováno euploidní embryo po analýze pomocí acgh. Vzhledem k anamnéze a ukončení předešlého těhotenství pacientka absolvovala odběr choriových klků (CVS), kde byla nalezena trizomie 21 ve všech buňkách, následný odběr plodové vody pak ukázal, že plod nenese žádnou chromozomální aberaci a narodilo se zdravé dítě (Haddad et al., 2013). Mozaicismu jako takový představuje velký problémem při správném hodnocení výsledků a je velkou výzvou pro genetické poradenství a analýzy Preimplantační genetický screening (PGS) Preimplantační genetický screening je zaměřen na vyhledávání aneuploidií popř. větších segmentálních změn na chromozomech. Jako biologický materiál pro genetické vyšetření lze využít pólová tělíska, blastomeru nebo blastocysty (resp. trofektoderm). Nyní také probíhají pokusy s analýzou tekutiny z vnitřního prostoru blastocysty. V rámci PGS se nejčastěji využívají techniky FISH a acgh. Pro techniku FISH jsou při analýze využívány DNA sondy zobrazující jen několik chromozomů, běžně lze určit pouze početní změny v genomu a to pro 5 12 chromozomů. K odhalení strukturních aberací je nutné u metody FISH vytvářet speciální kombinace DNA sond. Technika FISH je pro tyto účely využívaná jen zřídka. Nejvíce využívaná pro celogenomové analýzy je v současné době 22

24 technika acgh. Pomocí acgh je možné vyšetřit všechny chromozomy a to jak početní tak i nebalancované strukturní aberace. Tato metoda nabízí párům s problémy s reprodukcí vybrat pro transfer embryo bez chromozomální aberace, tím je možné zvýšit pravděpodobnost otěhotnění, snížit čas potřebný k dosažení těhotenství a snížit počet spontánních potratů, způsobených ve většině případů chromozomálními aberacemi. Významem PGS pro odhalování chromozomých aberací se zabývá mnoho studií. Byla zkoumána pólová tělíska, blastomery i blastocysty a srovnávána výtěžnost analýz u jednotlivých stádií vývoje embrya (Tab. 1). Některé studie pak srovnávaly rozdíl mezi genetickým statutem embrya ve stádiu blastomery a následně blastocysty. Jiné se zabývaly analýzou všech buňek embrya, což bylo důležité pro zjištěná míry mozaicismu. Srovnání jednotlivých dostupných technologií pro PGS a využitím různých stádií embrya se zabýval Handyside (Handyside, 2013). 23

25 Tabulka 1: Výhody a nevýhody analýzy všech chromozomů u jednotlivých stádií vývoje (Zdroj: upraveno). Pólové tělísko Výhody - není odebírán žádný materiál z vlastního embrya - poskytuje dostatek času pro analýzu před transferem - v mnoha zemích je legislativně povoleno pouze vyšetření pólového tělíska - použitelné prakticky ve všech případech Nevýhody - nelze vyšetřit paternální genom - nelze detekovat mitotické chyby - je testováno mnoho oocytů Blastomera - nejčastěji používáno - analýza maternálního i paternálního genomu - poskytuje dostatek času pro analýzu před transferem - použitelné pro většinu případů - nejčastější výskyt mozaicismu - v některých případech může být narušena další životaschopnost embrya - vyšetření pouze 1-2 buněk Blastocysta (trofektoderm) - nižšší mozaicismus než ve stádiu blastomery - testování více buněk, redukce falešně pozitivních či negativních výsledků a zvýšení pravděpodobnosti odhalení případného mozaicismu - analýza maternálního i paternálního genomu - nízké riziko pro poškození embrya - časová tíseň pro analýzu při čerstvém embryotransferu - nelze použít pro pacientky, u kterých embrya nedozrávají do stádia blastocysty 24

26 2.1.5 Preimplantační genetická diagnostika (PGD) Pomocí PGD lze určit konkrétní zděděné změny v zárodečném genomu, což umožňuje transfer geneticky nepostiženého embrya rodičům, u nichž byla prokázána konkrétní chromozomová aberace (např. reciproká či Robertsonovská translokace) nebo monogenně dědičná dominantní, recesivní či X-vázaná choroba. V případě odhalování nebalancovaných strukturních aberací (např. u pacientů s translokacemi) je využívána technika acgh, která odhalí nebalancované formy translokací. Balancované chromozomové aberace (translokace, inverze) řadíme do genetických abnormalit, které jsou nalézány až v dospělém věku, kdy se jedinci snaží o potomstvo. Nejsou většinou provázeny žádným fenotypovým projevem, o to záludnější je pak jejich projev. Nositelé balancovaných translokací, ať už reciprokých nebo Robertsonovských, mají vysoké procento nebalancovaných gamet. Hrozí u nich s velkou pravděpodobností abnormální segregace chromozomů v meióze a následně vznik embryí s nebalancovanou formou aberace (Munné et al., 2000; Verlinsky et al., 2005). Tito jedinci jsou vystaveni problémům s početím ve smyslu častých spontánních potratů a riziku narození potomka s vrozenými vývojovými vadami nebo mentální retardací (Scriven et al, 1998). Pro vyšetřování mutací v případě monogenních onemocnění je pak využivána nepřímá genetická diagnostika s využitím STR markerů. Před samotným vyšetřením embryí je nutno provést tzv. přípravný test, který spočívá ve vyšetření postiženého i jeho rodičů a optimalizaci primerů specifických pro danou rodinu a chorobu. Pak následuje IVF cyklus a vyšetření jednotlivých embryí pro konkrétní mutaci či změnu v genomu, která je asociovaná s chorobou. S využitím PGD technik je možné vybrat embryo, které nenese strukturní aberaci nebo vyloučit embrya nesoucí mutaci. Dnes se jako optimální metoda jeví karyomapování, které umožňuje analyzovat mutace, odlišit balancovanou formu strukturní aberace a zároveň odhalit aneuploidie. V rámci PGD jsou vyšetřovány monogenní choroby, u kterých již byla odhalena kauzální mutace a hereditární formy nádorových onemocnění. Velmi závažné jsou monogenní choroby, jejichž příznaky nastupují až v pozdějších dekádách života člověka jako je např. Huntingtonova chorea. 25

27 2.1.6 Monitorování embryí v čase Výběr embrya dle morfologie patří stále mezi každodenní praxi v embryologických laboratořích. Embrya jsou kontrolována druhý den po oplodnění a je sledován vznik prvojader, další kontrola nastává třetí den, kdy je již možné odhadnout dle počtu buněk a případné fragmentace jeho další vývoj. Pro transfer je vybíráno embryo s nejlepší morfologií. Toto monitorování je spojeno s manipulací embrya mimo inkubátor a při použití velkých termostatů pak také se stresem embrya ze změny teploty a podmínek vně inkubátoru. Pro sledování vývoje a omezení potřeby manipulace s embryem mimo ideální prostředí inkubátoru byl zaveden monitoring embryí v reálném čase. Umožňuje sledovat dělení buněk kontinuálně. Byla také zjištěna jistá souvislost vývoje embrya s výskytem aberací. Monitorování embryí v realném čase, nazývaný též Time-lapse, je jednou z dalších možností sledování aneuploidií v embryích a to především pro skupinu pacientek, které nechtějí invazivní zákrok do embrya v podobě biopsie nebo pro embrya, která bioptovat vůbec možné není. Morfologická variabilita během jednotlivých stádií vývoje embrya může být porovnávána se stavem genomu. Bylo zjištěno, že embrya s mnohočetnými aneuploidiemi jsou ve vývoji pomalejší ve srovnání s embryi euploidními. Také čas začátku blastulace je mnohem pomalejší u embryí s aneuploidií než u euploidních embryí a čas, kdy dojde k úplné blastulaci rovněž. Zásadní rozdíl mezi aneuploidními a euploidními embryi pak není nalézán mezi délkou prvního a druhého buněčného dělení a ani u dalších parametrů vývoje embrya v čase. Tyto morfokinetické rozdíly byly sledovány pomocí přístroje EmbryoScope. Fotografie embryí pak byly retrospektivně porovnávány s výsledky získanými pomocí biopsií a následné analýzy DNA (Campbell et al., 2013a). Dle výsledků pak byla v další studii Campbell (2013b) embrya rozdělena do skupin s lehkým, středním a vysokým rizikem aneuploidie. U embryí zařazených do skupiny s lehkým a středním rizikem nebyl nalezen zásadní rozdíl v uchycení do dělohy srovnávaný s embryi bez rizika. Embrya zařazená do skupiny s vysokým rizikem se po transferu do dělohy neuchytila (Campbell et al., 2013b). Zajímavostí je odhad pohlaví budoucího potomka z rychlosti morfologického vývoje embrya. Bylo prokázáno, že embrya mužného pohlaví se vyvíjí prokazatelně rychleji než embrya ženského pohlaví (Alfarawati et al., 2011). Nejnovější studie na více jak 1200 embryích ukázala, že mnoho aneuploidních embryí není možné pouze dle morfologie odhalit (Fragoulli et al., 2014). 26

28 Při rozhodování, zda bude nebo nebude embryo aneuploidní, není možné brát Time-lapse jako metodu, která je schopná spolehlivě určit ploiditu buněk. Neexistuje přímá souvislost mezi aberacemi a morfologickým obrazem embrya. Některá aneuploidní embrya se vyvíjí normálně a naopak některá euploidní embrya mají abnormální morfologii. Monitorování embryí v reálném čase je neinvazivní technika, která přesto našla v embryologii uplatňení hlavně z důvodu omezení manipulace s nimi. 2.2 Metody IVF Intracytoplazmatická injekce spermie (ICSI) ICSI je mikromanipulační technika využívaná pro účely IVF. Provádí se pod mikroskopem a to tak, že je do vajíčka vpravena mikromanipulační jehlou právě jedna morfologicky nejkvalitnější spermie. Spermii je před nasátím do mikromanipulační pipety nalomen bičík a tak narušena membrána obalu. Tento úkon slouží k aktivaci procesu oplodněnění, tak jako je tomu u přirozeného procesu, kde dochází ke ztrátě bičíku spermie po proniknutí do vajíčka. ICSI je využívána v případech, kdy spermie nemají odpovídající kvalitu a množství, dále pak striktně pro oplodnění vajíček, které budou už jako embrya podrobena genetickému vyšetření pomocí metod celogenomových analýz nebo PCR. Pro genetická vyšetření je použití ICSI nezbytné z důvodu vyloučení kontaminace jinou spermií či jiným genetickým materiálem (Obr. 3). Vajíčko Spermie Pipeta Biopsační Jehla Obrázek 3: Proces ICSI (Zdroj: 27

29 2.2.2 Intracytoplazmatická injekce předvybrané spermie (PICSI) PICSI je stejně jako ICSI mikromanipulační technika využívaná pro účely IVF. Narozdíl od ICSI, kde je spermie vybrána náhodně dle morfologie, je u PICSI vybrána spermie dle její schopnosti vázat se na hyaluronan (Obr. 4). Hyaluronan (mukopolysacharid) je v přirozeném prostředí součástí mezibuněčné hmoty obklopující spolu s kumulárními buňkami vajíčko. Pokud není spermie schopná vázat se na hyaluronan není pak schopná penetrovat a oplodnit vajíčko. Pro metodu PICSI jsou tedy vybírány spermie schopné se na hyaluronan vázat (in vitro), což je zárukou jejich zralosti a dobré kondice. Spermie navázané na hyaluronan Obrázek 4: Proces PICSI; spermie navázané na hyaluronan (Zdroj: upraveno). 28

30 2.2.3 Asistovaný hatching (AH) Pro lepší uvolnění buněk a možnost biopsie se 3. den po oplodnění provádí narušení zony pellucidy, která tvoří obal vajíčka a posléze embrya. Tento mikromanipulační výkon lze provést buď mechanicky mikromanipulační jehlou nebo laserem. V obalu pak vznikne mezera, kterou mohou buňky vyvíjejícího se zárodku lépe expandovat. Tzv. vyhatchování je nutné k možnosti provedení biopsie a to obvykle 5. nebo 6. den po oplodnění. Kompletní expanze buněk z obalu je také nutná pro uhnízdění embrya v děloze (Obr. 5). Obrázek 5: Částečně vyhatchovaná blastocysta (Zdroj: 29

31 2.2.4 Biopsie Biopsie se provádí mikromanipulační technikou pod mikroskopem (Obr. 6). Biopsii lze provádět 3. den, kdy se embryo nachází v buněčném stádiu nebo 5. či 6. den, kdy je embryo ve stádiu blastocysty. V buněčném stádiu obsahuje embryo 8-10 buněk (odebírá se 1-2 buňky), ve stádiu blastocysty pak buněk (odebírá se 8-12 buněk) a lze rozlišit trofektoderm (TE) a vnitřní buněčnou masu (angl. inner cell mass; ICM). Z blastocysty jsou odebírány buňky trofektodermu, ze kterých se později vyvíjí plodové obaly a placenta. ICM zůstává nedotčena, vyvíjí se z ní vlastní plod. Pipeta s odebranými buňkami trofektodermu Obrázek 6: Schéma provedení biopsie (Zdroj: upraveno) Kryokonzervace Zárodečný materiál jako jsou vajíčka, spermie a embrya je mnohdy nutné uchovat delší dobu. Důvodem je buď vznik hyperstimulačního syndromu u ženy, kdy není možné provést čerstvý transfer nebo genetické vyšetření embrya, které trvá určitou dobu. Další z důvodů je také uchování embryí či zárodečných buněk pro budoucí použití tzv. Social freezing, sloužící hlavně k udržení možnosti mít vlastní potomky někdy v budoucnu. K tomu se využívají kryokonzervační techniky. Spermie jsou za pomoci zmrazovacího média s přídavkem kryokonzervační látky zamraženy na vhodném nosiči v parách dusíku a dále přeneseny do tekutého dusíku, kde jsou 30

32 uchovávány. Vajíčka/embrya jsou nejprve vitrifikována a pak také uchovávána v tekutém dusíku. Dříve používaná metoda pro uchování vajíček a embryí tzv. pomalé mražení byla nahrazena metodou vitrifikace. Pomalé mražení spočívalo v přidání kryprotektantu k vajíčku/embryu, dále probíhalo postupné snižování teploty, při které dochází k výměně intra a extra celulárních tekutin buněk za kryoprotektant. V závěru dojde ke zmražení vajíčka/embrya bez větších změn osmotického tlaku buněk a deformit. Při tomto postupném procesu zamražování však vznikají mikrokrystalky ledu, které mohou buňky poškodit. Vitrifikace je založena také na přidání kryoprotektanku k buňkám a snižování teploty. Kryoprotektant je však přidáván v mnohem větší koncentraci a ke snižování teploty nedochází postupně, ale nárazově a je tak přeskočena kritická zóna, při které vznikají ledové krystalky. Díky tomu, že je materiál takto rychle zmražen, místo ledových krystalků vzniká ledová amorfní hmota a buňky zůstanou nepoškozeny a v lepším stavu. Ve studiích byly po použití techniky pomalého mražení a vitrifikace srovnávány některé parametry. Bylo to: přežití embrya po rozmražení, jeho morfologie a jeho schopnost uchycení v děloze. Výsledkem bylo zjištění, že vitrifikace je ve všech sledovaných parametrech mnohem výhodnější. Vykazuje vyšší stupeň přežití embryí, embrya jsou v lepší kondici po morfologické stránce a jejich úspěšnost uchycení v děloze je naprosto srovnatelná s embryi po čerstvém transferu nezamraženého embrya (Loutradi et al, 2008; Valojerdi et al., 2009; AbdelHafez et al., 2010) Transfer embrya a počet transferovaných embryí Transfer embrya v Sanatoriu Helios (SH) nebo také embryotransfer je prováděn po prodloužené kultivaci, která trvá do dne vývoje embrya. Probíhá ambulantně pod kontrolou ultrazvukem. Po několika minutách ležení v klidu (asi 15 min) pak pacientka z ordinace odchází a není třeba dodržovat žádný zvláštní režim. Kromě čerstvého embryotransferu (ET) lze provádět kryoembryotransfer (KET), což je transfer embrya, které bylo kryokonzervováno a následně rozmraženo. Díky novým kryokonzervačním technikám, které nemají vliv na kvalitu embrya, jsou KET, ve smyslu úspěšnosti IVF cyklu, naprosto srovnatelné s ET. 31

33 Pro zvýšení pravděpodobnosti otěhotnění je důležitý také počet transferovaných embryí. Mnoho klinik IVF ještě stále preferuje transfer více embryí, přestože je mnohočetné těhotenství rizikové jak pro matku tak pro plody. Hrozí předčasný porod a s ním spojená náročná neonatální péče o dítě. Vyšetření všech chromozomů pomocí acgh v rámci PGS umožňuje transfer jednoho embrya bez genetické aberace a zároveň zvyšuje pravděpodobnost jeho uchycení v děloze a následné těhotenství. Transfer jednoho embrya (SET) se tak stává jakýmsi standardem pro IVF kliniky (Sills et al., 2012). V další vědecké práci je pak uvedeno srovnání SET a transferu dvou embryí (DET). Z výsledků jasně vyplývá, že SET v kombinaci s vyšetřením pomocí acgh a kryokonzervací je nejlepší volbou pro co nejvyšší pravděpodobnost otehotnění (Schoolcraft et al., 2013). Ze statistických údajů Sanatoria Helios vyplývá, že úspěšnost IVF cyklu nezvyšuje počet transferovaných embryí při jednom embryotransferu, ale počet transferů jednoho kvalitního embrya po jeho vyšetření pomocí acgh Dárcovství gamet či embryí K dárcovství gamet či embryí se přistupuje v případech, kdy není možné získat vlastní zárodečné buňky pacienta/ky. Důvodem mohou být různé fyzické vady ve smyslu obstukčních vad či chybění orgánů tvořících gamety, ať už pro chirurgické odstranění nebo různé vrozené defekty. Dalším z důvodů pak mohou být prodělaná onkologická či jiná onemocnění nebo věk ženy. Dárcovství je v České republice oboustranně anonymní a není spojeno s finanční odměnou. Dárci/kyně musí podle požadavek zákona 296/2008 Sb. resp. vyhlášky 422/2008 Sb. splnit kritéria pro posouzení zdravotní způsobilosti a pro výběr dárců reprodukčních buněk. Jsou mimo jiné podrobeni základnímu genetickému vyšetření, které spočívá ve stanovení karyotypu a vyšetření mutací pro recesivní onemocnění cystickou fibrózu. Jsou také vyšetřováni pro některé infekční choroby jako je HIV, žloutenka typu B a C, syfilis, chlamydie. Pro infekční choroby je pak vyšetřena každá dávka ejakulátu. U mužů je vždy proveden spermiogram a také funkční testy kam patří např. test integrity DNA. Nezbytné je také pravdivé vyplnění zdravotního dotazníku. Dárcovství je omezeno věkem, pro ženy platí možnost darovat vajíčka ve věku let včetně a pro muže platí včetně dle zákona 373/2011 Sb. 32

34 Náhradní (surogátní) mateřství Pro náhradní mateřství existují jasné lékařské indikace: chybění dělohy (vrozené nebo získané), nevratné poškození děložní dutiny (pooperační stavy), mnohočetné myomy s deformujícím efektem na dělohu, imunologické příčiny apod. Posouzení vhodnosti náhradního mateřství vždy provádí lékař specializovaný na tuto problematiku. Náhradní mateřství je proces, při kterém je embryo biologických rodičů vloženo do dělohy náhradní matky. Ta plod odnosí a po porodu se vzdá práv a povinností k tomuto dítěti. Biologičtí rodiče si pak takto narozené dítě adoptují. Surogátní mateřství není v České republice legislativně upraveno. Není ani zakázáno ani povoleno. Řada právníků zastává názor, že je dovoleno a svůj názor opírají o čl. 2 odst. 3 Listiny základních práv a svobod, který říká, že každý může činit, co není zákonem zakázáno, a nikdo nesmí být nucen činit, co zákon neukládá. Prozatím nebylo u soudu žádné náhradní mateřství zpochybněno. Náhradní mateřství je spojeno s velkou psychickou zátěží jak pro budoucí rodiče, tak pro náhradní matku. Nejistota plynoucí z možnosti, že náhradní matka nakonec nedá souhlas k přímému osvojení, je většinou minimální, ale toto riziko stále existuje. Soud také nemusí návrh k osvojení přijmout. Celý proces nesmí být spojen s žádnou finanční odměnou (kromě běžných nákladů na jídlo, oblečení, dopravu, porod atd.), jinak by se jednalo o trestný čin (Rumpík a kol., 2013). Centra IVF, která se touto problematikou zabývají, nenesou žádnou právní odpovědnost za případné rozpory ohledně práva na dítě. Provádí IVF cyklus a právní stránku problematiky si zajišťují pacienti sami ve spolupráci s právníky. 33

35 2.3. Biologický materiál Vajíčka (oocyty) Vývoj vajíčka začíná už v prenatálním období ve vaječnících, produkce zralých vajíček je pak omezna plodným obdobím ženy a to od puberty po menopauzu. První meiotické dělení vajíčka je dokončeno těsně před ovulací a druhé meiotické dělení pak po jeho oplodnění. Vývoj může tedy trvat až několik desítek let. Vzhledem k tomu, že v přirozeném cyklu ženy se uvolní a dozrává jedno vajíčko za měsíc, je pro získání většího počtu vajíček před IVF nutná hormonální stimulace, která probíhá dle daných stimulačních protokolů. Všeobecně lze říci, že v první fázi stimulace jsou použity gonadotropiny (léky Gonal, Puregon), které umožní vývoj většího počtu folikulů potažmo vajíček. Od je třeba regulovat hladinu luteinizačního hormonu (LH), který by ve vyšší koncentraci mohl způsobit ovulaci dříve, než je třeba. Snížením hladiny LH je možné zamezit spontánní ovulaci, velmi nízká hladina LH pak způsobí neuvolnění vajíčka ze stěny folikulu do folikurání tekutiny. Pro vyvolání ovulace ve správný čas je možné použít choriogonadotropní hormon (HCG) (léky Pregnyl, Ovitel). Velmi důležité je načasování. Po celou dobu stimulace je její průběh kontrolován (Obr. 7). Stimulační cyklus Přirozený cyklus Nárůst hladiny FSH Den 3 Den 14 Den 28 Obrázek 7: Hladiny hormonů v séru ženy v normálním a stimulačním cyklu IVF, zkratky: FSH folikulostimulační hormon, LH luteinizační hormon, hcg choriogonadotropní hormon (Zdroj Lamb et al., 2011; upraveno). 34

36 Pacientky jsou zvány na odběry krve (sledování hladiny hormonů FSH, LH) a ultrazvukovou kontrolu stavu vaječníků. Dle výsledků je pak množství aplikovaných hormonů individuálně upravováno. Po ukončení stimulace dochází k odběru vajíček a to s použitím anestezie na operačním sále. Přes pochvu je speciální punkční jehlou odsáta folikulární tekutina z jednotlivých folikulů spolu s vajíčky (Obr. 8). Embryolog pak získaná vajíčka vyhledá, uchová ve speciálním médiu, posléze očistí od kumulárních buněk a připraví na vlastní proces oplodnění. Hormonální stimulace je spojena s rizikem vzniku tzv. hyperstimulačního syndromu (OHSS), s velkým nepohodlím ve smyslu každodenní injekční aplikace hormonů, zvětšením a bolestivostí břicha a v neposlední řadě také s velkou psychickou zátěží páru. Je tedy nutné k pacientkám přistupovat velmi citlivě a ohleduplně. Folikulární tekutina obsahující vajíčko Vlastní výsuvná punkční jehla Vnější obal punkční jehly Obrázek 8: Odběr vajíček z folikulů pomocí speciální punkční jehly na operačním sále (Zdroj: upraveno) 35

37 2.3.2 Spermie (spermatozoa) Spermie se vyvíjí ve varlatech a to od puberty po zbytek života. Meiotické dělení probíhá kontinuálně a vývoj z prekurzorové buňky po gametu trvá asi 60 dní. Ejakulát je získáván masturbací, která probíhá ve speciálních prostorách, kde je zajištěno soukromí a pohodlí klienta. Spermie jsou vyšetřeny nejprve formou spermiogramu, v indikovaných případech je pak provedeno další vyšetření ejakulátu dle doporučení WHO jako je např. vyšetření integrity DNA. V den odběru vajíček je pro účely oplodnění proveden čerstvý odběr ejakulátu. V případě, že partner není přítomen, oplodnění proběhne se zmrazených spermií. Jestliže nejsou spermie v ejakulátu přítomny (azoospermie) nebo při velmi nízkém počtu a kvalitě spermií lze využít pro získání zárodečných buněk např. techniku TESE (TEsticular Sperm Extraction) a TESA (TEsticular Sperm Aspiration). Jedná se o drobný chirurgický zákrok, kdy je z varlete odebrána tkáň a z ní jsou pak extrahovány spermie. Podobně je možné spermie získat u obstrukčních poruch či vazektomií a to technikami MESA (Microsurgical Epididimal Sperm Aspiration) odsátí tekutiny obsahující spermie z nadvarlete nebo PESA (Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration) odsátí tekutiny obsahující spermie z nadvarlete vpichem jehly přes šourek (Obr. 9). Obrázek 9: Schématické znázornění odběru spermií různými technikami (Zdroj: 36

38 V posledních letech je často diskutována kvalita spermií. Problémem jednotlivých studií je, že data jsou sbírána z různých zemí, v rozdílném čase, v rozdílných populacích a také je použito jiných metod pro vyhodnocení kvality spermatu. Celkově se ukazuje, že existuje velká heterogenita mezi výsledky a to ve smyslu geografickém i etnickém (Hiltud et al., 2010; Merzenich et al., 2010). Dánská studie, která hodnotila objem ejakulátu, koncentraci spermií, motilitu a morfologii, ukazuje, že pouze 23 % mužů z Dánska, mělo optimální koncentraci spermií a morfologii. Ukázalo se, že v porovnání s dřívější studií z roku 1940 došlo ke klesajícímu trendu jak v koncentraci spermií tak v jejich počtu. Asi 15 % mužů je v rizikové skupině, která by v budoucnosti mohla potřebovat pomoc reprodukčního centra (Jørgensen et al., 2012). Pro ucelení dat a možnosti správně analyzovat kvalitu ejakulátu a spermií v klinické praxi vydává Světová zdravotnická organizace (WHO) manuál. V posledním vydání směrnice bylo do studie zapojeno více jak 4500 mužů ze 14 zemí a čtyř kontinentů, kteří v posledním roce zplodili potomka. Jako normozoospermie je označen tento stav: objem semene 1,5 ml (rozmezí 1,4-1,7); celkový počet spermií 39 milionů v ejakulátu (rozmezí 33-46); koncentrace spermií 15 milionů v 1 ml ejakulátu (rozmezí 12-16); vitalita 58 % živých (rozmezí 55-63); progresivní motilita 32 % (rozmezí 31-34); celkem (progresivní i neprogresivní) motilita 40 % (rozmezí 38-42); morfologicky normální formy 4 % (rozmezí 3-4) (WHO reference values for human semen characteristic, 2010). Tato kritéria byla od roku 1987, kdy byla poprvé uveřejněna, několikrát upravena ve smyslu snížení hodnot Pólová tělíska Pólová tělíska vznikají v rámci vývoje oocytu (Obr. 10). Těsně před ovulací je dokončeno první meiotické dělení. Vzniká sekundární oocyt a první pólové tělísko. Po ovulaci vstupuje sekundární oocyt do profáze druhého meiotického dělení, kterou prozatím nedokončí. Teprve při oplození vajíčka spermií je dokončeno druhé meiotické dělení a vzniká druhé pólové tělísko a zralý oocyt, který je už vlastně zygotou. Pro genetickou analýzu lze použít obě pólová tělíska. Je známo, že v pólovém tělísku nalézáme jakýsi "obrácený" obraz genomu oocytu tzn. pokud, je v pólovém tělísku nalezen zisk nějakého chromozomu znamená to, že v oocytu ten stejný chromozom chybí a naopak. Analýza však neodráží podíl paternálního genomu ani mitotické chyby. Přesto je odběr a vyšetření pólového tělíska pro mnoho pacientů eticky přijatelnější a v mnoha zemích jako jediný povolen legislativně. 37

39 Vzhledem k tomu, že chromozomálníc aberace jsou častěji maternálního původu a jejich počet stoupá s věkem ženy, jsou pólová tělíska často využívána ke studiu. Bylo zjištěno, že nález aberací v pólových tělíscích byl pak potvrzen i v dalších stádiích vývoje embrya (Christopikou et al., 2013). Obrázek 10: Odběr pólového tělíska (Zdroj: Embrya Blastomery Blastomery obsahuje třetí den vývoje po oplodnění buněčné embryo (Obr. 11). V tomto stádiu má embryo v ideálním případě 7-10 buněk. Všechny buňky jsou totipotentní a je tedy možné odebrat při biopsii kteroukoliv z nich, aniž by došlo k poškození embrya. Do tohoto stádia doroste velká většina embryí. Provádět biopsie pro účely genetických analýz se však ve stádiu buněčného embrya nedoporučuje. Jednak je zbytečně vyšetřováno velké množství embryí, které nemusí překonat kritický třetí den, kdy je spuštěn vlastní embryonální genom a embrya s aberacemi se pak dále nevyvíjí, ale také samotný transfer buněčného embrya je spojen s určitými riziky. Třetí den je embryo v přirozeném cyklu ještě ve vejcovodu a jeho přenesením do prostředí dělohy v rámci IVF cyklu vzniká stres, který může způsobit jeho neuchycení. Další nevýhodou je malá pravděpodobnost odhalení případného mozaicismu, který se v tomto stádiu vývoje vyskytuje často. Oproti pólovému tělísku je již analyzován maternální i paternální genom a lze odhalit mitotické chyby. Mnoho klinik 38

40 vyšetření blastomer stále provádí. Jsou citovány studie, kde je potvrzeno, že v případě analýzy všech chromozomů pomocí acgh se zvyšuje pravděpodobnost otěhotnění (Gutiérrez-Mateo et al., 2011; Rubio et al., 2013). Obrázek 11: Buněčné embryo ve stádiu 7 buněk (Zdroj: archiv Sanatoria Helios) Blastocysty Blastocystou označujeme stádium embrya den jeho vývoje (Obr. 12). Embryo má už buněk a je možné odlišit vniřní buněčnou masu (ICM), ze které vzniká vlastní plod a trofektoderm, ze kterého se vyvíjí placenta a plodové obaly. Pro genetické analýzy se odebírají vždy jen buňky trofektodermu a to v počtu 5-12 buněk. Blastocysty jsou získávany tzv. prodloženou kultivací za použití speciálního kultivačního média. Výhodou odběru buněk z blastocysty je větší množství biologického materiálu, které zajistí menší pravděpodobnost např. ADO či PA při analýze. Další výhodou je samotný transfer 5. nebo 6. den, kdy je při přirozeném oplodnění embryo už v děloze. Přenos embrya po prodloužené kultivaci se tak co nejvíce podobá přirozenému početí. Mozaicismus je v blastocystách lépe odhalitelný než v blastomerách. Negativní vliv odběru buněk je v tomto stádiu vývoje embrya minimální. Při plánovaném čerstvém transferu vzniká časová tíseň pro genetickou analýzu. Tu je však možné eliminovat kryokonzervací embrya a transferm v některém z dalších cyklů ženy. Bylo prokázáno, že biopsie blastocysty a vyšetření pomocí acgh je optimální strategií pro PGS (Fragouli et al., 2011). 39

41 Obrázek 12: Hatchující blastocysta (Zdroj: archiv Sanatoria Helios) Tekutina z dutiny blastocysty (blastocoele fluid) DNA je přítomna i v tekutině, kterou obsahuje dutina blastocysty. Odběr této tekutiny se provádí před kryokonzervací, stejně tak jako klasická biopsie. Studie ukázala, že embryonální DNA byla přítomna v 90 % tekutin z dutiny blastocysty studovaných embryí a byla analyzována pomocí Real Time PCR a následně pomocí metody acgh. Ve všech případech byla potvrzena shoda v pohlaví embryí a také shoda v nalezených aneuploidích (Pallini et al., 2013). V současné době však existuje jen málo studií a využití tohoto materiálu pro genetickou analýzu je v na experimentální úrovni, využití v klinické praxi zatím není možné. 40

42 2.4 Metody analýzy pro PGS/PGD Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) Principem metody je hybridizace značené DNA sondy ke komplementárnímu úseku v analyzovaném genomu. Celý proces probíhá v několika krocích. Nejprve je nutné specifickou sondu i analyzovaný genom denaturovat, následně se DNA sonda značená fluorochromem při renaturaci hybridizuje k úsekům vyšetřované DNA na principu komplementarity, po odmytí nespecificky navázané sondy se preparát dobarví a prohlíží ve fluorescenčním mikroskopu. U interfázní FISH je hodnocen počet fluorescenčních signálů (Obr. 13). Technika FISH byla zavedena v 70. letech minulého století. Jako první byly používány radioaktivně značené sondy, hodnocení probíhalo autoradiograficky (Pardue and Gall, 1969). Později byly radioaktivně značené sondy nahrazeny sondami fluorescenčně značenými (Werner et al., 1997). Pomocí interfázní FISH byla prováděna první vyšetření blastomer. Bylo použito 5 DNA sond a to sondy pro chromozomy 13, 18, 21, X a Y. Bylo dosaženo 93 % úspěšnosti a ukázalo se, že 70 % embryí je abnormálních (Munné et al., 1993). Byla také vyšetřována pólová tělíska, a to první i druhé, kde bylo nálézáno také velké množství aneuploidií (Verlinsky et al., 1995). Počet používaných DNA sond byl dále zvyšován až na 15. V první fázi byly vyšetřeny chromozomy 13, 14, 15, 16, 18, 21, 22, X a Y. Ve druhé fázi pak chromozomy 1, 2, 6, 7, 10 a 17 a to už na blastocystách. Bylo nalezeno % abnormálních embryí (Baart et al., 2006). Vyloučením embryí s abnormalitami pak vzrostla úspěšnost IVF cyklů. Techniku FISH lze také vyžít pro PGD, zejména pro pacienty s balancovanou translokací. Pro vyšetření embryí jsou DNA sondy speciálně připravovány. Využívány jsou lokus specifické, centromerické a telomerické sondy (Scriven et al., 1998 a 2000). Pro použití metody FISH v PGD byla ESHRE (European Society for Human Reproduction and Embryology) konsorciem vydána pravidla, která jasně stanovují postup analýzy pro vyšetření strukturních aberací v tomto případě translokací. DNA sondy, ať už komerčně dostupné nebo tzv. "home made", musí vždy ve své kombinaci pokrýt všechny možné segregační módy. Vždy musí být nejdříve vyzkoušeny na lymfocytech či fibroblastech pacienta s translokací, je třeba zjistit informativnost DNA sondy, nikdy nelze sondu hned použít na buňky embrya. Vyšetření lze provést na jedné buňce embrya za předpokladu využití dvou informativních DNA sond. Na dvou buňkách embrya pak stačí jedna informativní sonda. DNA sonda by měla zahrnovat oblasti za zlomovými místy a také oblast uvnitř zlomu (Harton et al., 2011). Mezinárodní 41

43 institut pro kontrolu kvality CEQAS (Common External Quality Assessment System) má dosud PGD/FISH běžně ve své nabídce. Přes snahu vyšetřit pomocí FISH čím dál větší počet chromozomů a odhalovat nebalancované strukturní aberace, se tato technika pro účely PGS/PGD v moderních IVF centrech dnes využívá zřídka, právě pro převažující negativa jako je problematická manipulace s buňkami a jejich fixace, která je pro validní výsledek zcela zásadní, navíc nelze v žádném případě vyšetřit všechny chromozomy a odhalit případný mozaicismus. Z doporučení společností ESHRE a ASRM (American Society for Reproductive Medicine) vyplývá, že technika FISH už není vhodná pro využití v PGS. Důvodem je možnost analýzy jen omezeného počtu chromozomů a žádný vliv na zvyšení úspěšnosti IVF cyklu u žen starších 35 let. Zcela jasný je pak přechod na metody umožňující celogenomovou analýzu. Obrázek 13: Buňka trofektodermu analyzovaná metodou FISH; pětibarevná sonda, dva signály pro chromozom 13 (červená), dva signály pro chromozom 18 (aqua), dva signály pro chromozom 21 (zelená), jeden signál pro chromozom X (modrá), jeden signál pro chromozom Y (žlutá) (Zdroj: archiv Laboratoře lékařské genetiky Sanatoria Helios). 42

44 2.4.2 Celogenomová amplifikace (WGA) Při biopsii buněčného embrya jsou získány 1-2 blastomery, při biopsii blastocysty pak 5-12 buněk. Jedna diploidní buňka obsahuje asi 7 pg DNA, pro celogenomové analýzy je třeba DNA v koncentraci desítek ng. Malé množství vstupního biologického materiálu vedlo k rozvoji metod celogenomových amplifikací, pomocí kterých je získáno větší množství DNA odpovídající kvality. V souvislosti s malým množstvím DNA hrozí některé jevy s tím spojené. Jedná se hlavně o vysoké riziko kontaminace při manipulaci s buňkami, dále hrozí selhání amplifikace, preferenční amplifikace a alelický dropout. Pro získání DNA z limitního množství vstupního materiálu byly zavedeny techniky celogenomové amplifikace. Pro účely PGS/PGD je možné využít tyto WGA: 1) založené na principu PCR primer extension amplification PCR (PEP-PCR) PCR s degenorovanými oligonukleotidovými primery (DOP-PCR) 2) nezaložené na principu PCR OmniPlex WGA multiple displacement amplification (MDA). První pokusy zavést metodu WGA sahají na začátek 90tých let minulého století. Vědci amplifikovali DNA z jediné spermie. Amplifikace byla provedena na principu PEP-PCR a byla využita pro studium rekombinace DNA (Zhang et al., 1992). Vylepšenou modifikaci PEP-PCR tj. IPEP-PCR (Improved PEP PCR) pak využil Dietmaier (1999), vylepšení spočívalo v použití kombinace dvou polymeráz (Taq a Pwo polymerázy) a přidání kroku cyklické elongace před denaturací (Dietmaier et al., 1999). Další možností je využití DOP- PCR (Telenius et al., 1992). WGA na principu DOP-PCR byla pro PGS/PGD využita jako první pro odhalení trizomií a určení konstituce pohlavních chromozomů (Wells et al., 1999). Výsledkem WGA založené na PCR (PEP-PCR, IPEP-PCR, DOP-PCR) mohou produkovat nespecifické amplifikační artefakty, genom nebývá kompletně pokryt, výsledné fragmenty DNA jsou menší než 1kb a ty nemusí být vhodné pro některé následné analýzy. Tyto metody jsou celkově tolerantnější k poškozené DNA. 43

45 OmniPlex WGA patří do řady tzv. Plex WGA (PicoPlex, SurePlex, GenomePlex). Technika je založená na náhodné neenzymatické fragmentaci analyzované DNA, na 3 a 5 konce jsou pak připojeny specifické adaptérové sekvence, čímž je vytvořena knihovna. Následná amplifikace těchto fragmentů definované délky pak probíhá pouze s jedním typem primerů a výsledek je efektivnější (Langmore, 2002) (Obr. 14). Analyzovaná DNA - štěpená Nasednutí primerů Prodlužování komplementárního řetězce Druhé nasednutí primerů Vytvoření knihovny Amplifikace DNA Produkt OmniPlex WGA Obrázek 14: Princip celogenomové amplifikace typu GenomePlex (Zdroj: genomeamplification/nimblegen-genomeplex.jpg; upraveno). 44

46 MDA je isotermická technika využívající pro amplifikaci fágovou DNA polymerázu ɸ29 a random hexamery. Hexamery jsou navazovány na denaturovanou jednovláknovou DNA, následuje syntéza DNA, při které je vytěsněn nově vznikající řetězec (Obr. 15). MDA je schopná generovat větší fragmenty (>10 kb). Tato technika byla původně určena pro amplifikaci velkých cirkulárních DNA templátů např. plazmidů. Produktem MDA je DNA velmi vysoké kvality i kvantity, pokrytí genomu je velmi vysoké (Deane et al., 2002; Spits et al., 2006). Porovnáním metod OmniPlex a MDA bylo dosaženo srovnatelných výsledků. Obě metody jsou vhodné pro genetické analýzy s nejvyšším rozlišením, oproti metodám založeným na PCR jsou efektivnější (Barker et al., 2004). Hexamery Vzorek DNA Denaturace a hybridizace Přidání dntps a DNA polymerázy ɸ29, inkubace při 30 o C Obrázek 15: Schéma průběhu celogenomové amplifikace pomocí metody MDA (Zdroj: upraveno). 45

47 2.4.3 Array komparativní genomová hybridizace (acgh) Pro analýzu všech chromozomů byla poprvé použita technika komparativní genomové hybridizace (CGH) u pacientů s onkologickým onemocněním. Principem metody je hybridizace značené kontrolní a analyzované DNA na podložní sklo s metafázními chromozomy a následé zkaryotypování. Hodnocení intenzity fluorescence ve fluorescenčním mikroskopu probíhá za pomoci speciálního programu. Výsledkem jsou profily DNA, na kterých je možné rozpoznat delece či amplifikace. Nelze hodnotit balancované změny genomu (Kallioniemi et al., 1992). Metoda acgh (metoda DNA čipů) se od klasické CGH liší požitím podkladu pro hybridizaci. Řadí se mezi metody nepřímého sekvencování, kdy je sekvence genomu určena na základě výsledku hybridizace sekvencí analyzované DNA se sekvencemi oligonukleotidových nebo BAC sond. Sondy DNA reprezentují v případě PGS/PGD celý lidský genom, jsou imobilizovány na skleněné podložní sklíčko a následně použity pro hybridizaci fluorescenčně značené analyzované i kontrolní DNA. Detekci intenzity fluorescence zajišťuje laserový scaner, který je propojen s počítačem a následně díky speciálnímu programu proběhne konečná analýza dat (Šmarda a kol., 2005). Nanesení sond na podložní sklo může probíhat dvěma způsoby. Úseky DNA lze nanést technikou vtláčení (spotování) a jejich následnou imobilizací k pevnému podkladu (podložní sklo). Spotování je prováděno pomocí speciálních přístrojů, které jsou schopné nanést sondu na přesně určené místo. Dalším způsobem je přímá syntéza krátkých sekvencí DNA na sklíčku tzv. fotolitografie. Metoda využívá světla a světlocitlivé ochranné masky na syntézu velkého množství přesně definovaných krátkých oligonukleotidů (Pease et al., 1994). Dle původu použitých DNA sond na DNA čipu lze acgh (Obr. 16) rozdělit na jednotlivé podskupiny: BAC acgh, Oligonukleotidová acgh (oacgh), SNP acgh. 46

48 Testovaná DNA Kontrolní DNA DNA klony (BAC, Oligo, SNPs) spotované na čipu P o m ě r Zisky DNA Ztráty DNA Pozice na chromozomu Obrázek 16: Princip acgh - značení kontrolní i analyzované DNA, hybridizace na čip a konečná analýza (Zdroj: upraveno). Čipy založené na BAC sondách tzv. BAC acgh využívají DNA získanou z bakteriálních chromozomů (z angl. Bacterial Arteficial Chromosomes) o délce kb, celkové pokrytí genomu je pak po 1 Mb. BAC acgh je využívána hlavně pro hledání větších nebalancovaných změn v genomu, má široké uplatnění, lze ji využít např. pro vyšetření pacientů s mentální retardací (Shaw-Smith et al., 2004), v onkologii (Jarošová a kol., 2006) a ideální je pro stanovení chromozomálních aberací v genomu embryí. Technika BAC acgh, díky své poměrně malé rozlišovací schopnosti, odhaluje pouze velké nebalancované aberace a je tedy vhodná právě pro screening embryí (Fragouli et al, 2011). 47

49 U metody acgh všeobecně je obvykle používána jedna kontrolní DNA (mužská) pro každý vzorek. BAC acgh BlueGnome 24sure V3, využívaná pro odhalování aneuploidií v embryích, má oproti jiným platformám jednu zvláštnost. Jako kontrolní DNA jsou použity jak mužská tak ženská DNA, obě jsou značeny fluorochromy, vždy zeleně i červeně (Obr. 17). Ve výsledku jsou tedy vzorky porovnávány jak s mužskou tak se ženskou kontrolní DNA, tím je možné chromozom X tzv. X-separaci využít jako interní kontrolu pro kalibraci. Přesněji řečeno, když je vzorek srovnáván s kontrolní DNA opačného pohlaví (sex-mismatch) jsou možné dva scénaře výsledku, biologický poměr chromozomu X 1:2 nebo 2:1, protože muži mají jedno X a ženy dvě. Využitím X-separace je možné mapovat a srovnat ideální biologický poměr 2:1 (žena vs. muž) nebo 1:2 (muž versus žena) s poměrem v aktuálním vzorku. Další zvláštností je pak smíchání vždy dvou vzorků značených opačným flurochromem a umístění na stejné pole čipu (Obr. 17). Cy3 kontrolní DNA mužská Cy5 kontrolní DNA mužská testovaná DNA testovaná DNA kontrolní DNA ženská kontrolní DNA ženská testovaná DNA testovaná DNA T = značená DNA vzorku R = značená kontrolní DNA = značeno Cy5 = značeno Cy3 Obrázek 17: Schéma značení a umístění vzorků a kontrolních DNA na čipu při analýze DNA embryí pomocí platformy BAC acgh 24sure V3 (Zdroj: upraveno). 48

50 Oligonukleotidové DNA čipy (oacgh), u této metody jsou sondy tvořeny uměle připravenými nukleotidů dlouhými sekvencemi DNA a mohou být získávány z oligonukleotidových knihoven. Výsledky analýz prokázaly, že oacgh je schopná detekovat aberace menší než 100 kb i jednotlivé kopie genů. Díky ní je možné získat podrobnější informace o stavu genomu (Iafrate et al., 2004; Barett et al., 2004). Vyšší rozlišení této techniky umožňuje nalezení změn v počtu kopií ve smyslu zisků či ztrát v genetickém materiálu o velikosti 500 kb. Analýza z jedné buňky či malého počtu buněk (5-10) vykazuje vyšší šum pozadí, které může ztěžovat analýzu dat (Geigl et al., 2009). SNP array tento typ acgh využívá jako sond také oligonukleotidy, zároveň je však možné analyzovat jednonukleotidové polymorfismy. Tyto čipy tak lze využít jak pro odhalení chromozomových aberací tak pro analýzu ploidií, uniparentální dizomie a balancovaných změn v genomu (Obr. 18). Technika byla validována na analýzu z jedné buňky (Iwamoto et al., 2007). Pro účely PGS má SNP array zbytečně velké rozlišení, nicméně nabízí možnost vyšetřit zároveň aneuploidie a mutace spojené s monogenními chorobami. Touto otázkou se zabýval Harper (2010). Obrázek 18: Profil homozygotní delece na chromozomu 22, metoda SNP array (Zdroj: 49

51 Polymerázová řetězová reakce (PCR) Polymerázová řetězová reakce (angl. Polymerasa Chain Reaction; PCR) byla objevena K. B. Mullisem v roce 1983, v roce 1993 pak za tento objev dostal Nobelovu cenu. Metoda je založena na replikaci DNA a umožňuje získat velké množství požadované sekvence DNA. Cílová sekvence je ohraničena primery, díky přidání DNA polymerázy a nukleotidů do reakce probíhá syntéza nových řetězců. Použitím termostabilní polymerázy může reakce probíhat opakovaně v cyklech. Během těchto cyklů se pravidelně opakují 3 kroky: denaturace, připojení primerů a syntéza nových řetězců (Obr. 19). Výsledkem cyklického opakování reakce je zmnožení molekul původní DNA na potřebnou kvantitu (Šmarda a kol., 2005). Polymerázová řetězová reakce Cílová DNA Nukleotid DNA primer Denaturace o C Nasednutí primerů 68 o C Prodlužování řetězce 72 o C Obrázek 19: Schématické znázornění průběhu polymerázové řetězové reakce (Zdroj: upraveno). PCR a její modifikace jsou dnes zcela běžně využívány jako základ analýzy v molekulárně genetických laboratořích. Jako příklady modifikací PCR budou uvedeny PCR, které jsou využívány pro WGA. 50

52 PCR s degenerovanými oligonukleotidovými PCR primery (DOP-PCR) Tato technika je využívaná pro náhodnou amlifikaci DNA. Degenerované oligonukleotidové primery mají definované sekvence na 5 a 3 koncích, ty ohraničují náhodnou hexamerovou sekvenci. DOP primery se připojují v prvních cyklech při nízké stringenci v dalších pak při vyšší stringenci k denaturované templátové DNA, kde hybridizují k vazebným místům primeru (Obr. 20). Amplifikací DOP-PCR vznikají různě dlouhé fragmenty DNA. Metoda je vhodná pro amplifikaci krátkých molekul DNA nebo pro DNA velmi nízké koncentrace (Šmarda a kol., 2005). Obrázek 20: Schématické znázornění DOP-PCR (Zdroj: IPEP-PCR Improved Primer Extension Preamplification Narozdíl od PEP-PCR je pokrytí amplifikovaného genomu větší a její účinnost byla modifikací na IPEP-PCR zvýšena několika změnami. Vylepšený PEP (I-PEP) PCR postup spočívá ve využití koktejlu DNA polymeráz, který obsahuje Taq a Pwo DNA polymerázu (provádí prodloužení primeru jako v tradičním PCR) a korektury DNA polymerázy (probíhají 3-5 exonukleázovou aktivitou, odstraněním "misincorporated" nukleotidů, které zpomalují progresi Taq DNA polymerázy). Výsledkem je efektivnější WGA vzhledem k odstranění "misincorporated" nukleotidů a vytvoření většího počtu vazebných míst pro primery. Podobně jako u DOP-PCR jsou vytvářeny fragmenty DNA pozorovatelně na agarózovém gelu. 51

53 2.4.5 Karyomapování Karyomapování je technika využívající SNP arrays pro genetické analýzy s vysokým rozlišením a je další technikou, která umožňuje analyzovat všechny chromozomy. Pokrytí genomu zajistí přibližně SNPs. Procesu analýzy předchází celogenomová amplifikace typu MDA, následuje značení jednotlivých genotypů a hybridizace. DNA čipy jsou pak vyhodnoceny speciálním softwarem. Je možné identifikovat 4 rodičovské haplotypy na všech chromozomech, zmapovat jejich dědičnost a nalézt crossingovery u probanda či vyšetřovaného embrya (Obr. 21). Umožňuje tak provést vazebnou analýzu, odhalit mutaci pro monogenní chorobu a detekovat chromozomové aberace početní i strukturní. Výhodou karyomapování je možnost rozlišit balancované formy translokace. Pro vyšetření monogenních chorob není nutné provádět přípravný test, který trvá i několik týdnů či měsíců (Handyside et al., 2009). V jednom kroku tak lze spojit vyšetření mutací i aneuploidií, což není za použití technik acgh pro PGS a PCR pro PGD možné. Nevýhodou je možnost falešně negativního výsledku v případě de novo mutací. Obrázek 21: Vyhodnocení haplotypů rodičů a embryí pomocí karyomapování (Zdroj: 52

54 2.4.6 Sekvenování nové generace - Next Gene Sequencing (NGS) Metoda NGS také umožňuje analyzovat všechny chromozomy najednou. Analýza začíná celogenomovou amplifikací, následuje fragmentace amplifikované DNA na fragmenty velké bp, vytvoření knihovny. Všechny fragmenty jsou pak postupně sekvenovány pomocí sekvenátorů nové generace (HiSeq, MiSeq). Získaná data jsou porovnána s kontrolní DNA a vyhodnocena speciálním programem. Pro validaci metody NGS bylo vyšetřeno 190 vzorků embryonální DNA a to pomocí acgh a NGS. Porovnáním výsledků byla potvrzena 100 % shoda, všechna embrya označená jako aneuploidní po acgh byla aneuploidní po NGS a všechna embrya euploidní po acgh byla euploidní po NGS. Při NGS je možné sekvenovat až 96 vorků, což snižuje cenu vyšetření. NGS lze využít nejen k odhalení aneuploidií a strukturních aberací, ale i k vyšetření monogenních chorob včetně chorob mitochondriálně dědičných. Není však možné odlišit embrya s balancovanou formu aberace od embryí zdravých (Fiorentino et al., 2014) 53

55 2.5 Etické aspekty IVF Etické otázky IVF se objevují od samotného počátku zavedení těchto technik a s využíváním nových modernějších metod analýzy jich stále přibývá. Na tuto problematiku lze pohlížet z mnoha hledisek, jsou to např. názory různých odborných společností, legislativa, filozofická hlediska, náboženství, psychologie, genetika, finance, eugenika atd. Mnoha aspekty se zábývá studie Mary Carrington Coutts (2001). Od doby narození Luisy Brownové v roce 1978, která je označovaná jako první dítě "ze zkumavky", se narodily po IVF miliony dětí. Počet párů s poruchou reprodukce se stále zvyšuje. Problematika etiky je aktuální mnoho let a je stále cílem debat na vědecké i laické úrovni. S jistotou lze říci, že toto téma nenechá nikoho chladným. Reprezentantem jednoho z hledisek je církev, která považuje za začátek života už samotné početí. Z toho vyplývají další otázky. Co tedy s embryi, která nejsou transferována a jsou mnoho let v kryoboxech? Jak s embryi, která nejsou využita pro transfer, naložit? Co když chci embryo s genetickou aberací, které nechci transferovat pochovat jako zemřelého? Je proces IVF slučitelný s vírou? Ať už na tyto otázky odpovíme jakkoliv, žádná odpověď nebude špatná. Přístup k asistované reprodukci se liší mezi jednotlivými státy světa dle místní legislativy a vlivu církve na ni. Z genetického hlediska se jedná o dva přístupy ke genetickým analýzám. Prvním je vyloučení embryí, která nesou aberace především početní. Tyto numerické aberace vzrůstají s věkem a možnost vyšetřit embrya, pak vede k možnosti odkládat těhotenství na pozdější dobu. Druhým přístupem je analýza embryí pro vyloučení mutací spojených se závažnými monogenními chorobami nebo hereditárními onkologickými onemocněními a také lze vyloučit embrya s nebalancovanou i balancovanou translokací. Vyšetření mutací u monogenních chorob a výběr "zdravých" embryí jsou často diskutovány. Na straně jedné umožní nepřenášet závažná onemocnění do další generace, na straně druhé vyvstává otázka, proč se nemohou tyto děti narodit, když nemoc např. nastoupí až v dospělosti a do té doby mohou žít plnohodnotný život. Jinak se na celou problematiku budou dívat lidé, kteří mají zkušenost s touto chorobou v rodině nebo blízkém okolí a jinak lidé, kteří o nemoci slyší či čtou poprvé. Jinak ženy, kterým muselo být, právě z důvodu závažných postižení, ukončeno několikrát těhotenství a jinak ženy s jeho bezproblémovým průběhem. Lze také provádět genetickou diagnostiku pro HLA-typizaci, pro potřebu získání kmenových buněk pro léčbu sourozence (Verlinsky et al., 2001). Právě otázka přípravy "dítěte na míru" pro léčbu jiného nemocného dítěte je často diskutována (Penning et al., 2002; Robertson et al., 2002). 54

56 Kontroverzním se stává možnost výběru pohlaví dítěte tzv. sexace embryí. Někteří lidé si přejí narození dítěte opačného pohlaví, než je prvorozené dítě, někteří chtějí všechny děti stejného pohlaví, další jsou pak vedeni k výběru pohlaví kulturními nebo regionálními zvyklostmi (Robertson et al., 2001 a 2003). Sexace embryí bez genetického podkladu (např. X-vázané choroby) není dle naší legislativy možná. Diskuse týkající se vyšetřování embryí probíhají kontinuálně a bohužel nutno říci, že metody analýzy genomu jsou vyvíjeny mnohem rychleji než může reagovat legislativa. Z toho důvodu je zásadní přístup zdravotnického personálu a hlavně lékařů, na kterých v tuto chvíli leží zodpovědnost vybrání informací, které budou pacientovi sděleny s co nejvyšší možnou mírou empatie a v souladu se současnou platnou legislativou. Dalším z diskutovaných bodů je tzv. social frezing. V rámci tototo programu lze zamrazit zárodečné buňky a to jak vajíčka tak spermie na pozdější dobu. Z jedné strany jde o vhodnou pomoc pro jedince, kterým je např. diagnostikováno onkologické onemocnění a je jasné, že po absolvované léčbě nemusí mít už kvalitní genetický materiál k dispozici. Na straně druhé je možné odložit početí na pozdější dobu, protože není k dispozici vhodný partner pro založení rodiny a "pozastavit" tak (zvláště pak u žen) biologické hodiny. Z psychologického hlediska je zcela zásadní už samotné zjištění, že žena nebo muž nemůže mít potomka přirozenou cestou. Další problém pak reprezentuje pohled na to jak sdělit dítěti, že vzniklo z darované spermie či oocytu a dále pak, kdy nebo jestli vůbec tuto informaci dítěti poskytnout. Vzhledem k anonymnímu dárcovství je prakticky nemožné biologického rodiče dohledat. Na druhou stranu jsou zde práva dítěte, které by mohlo zajímat, kdo je jeho biologický rodič. Z pohledu dárce/kyně gamet, kteří ví, že někde mohou mít dítě a je zde možnost, že vlastní děti, které budou jednou mít, se mohou s dětmi z dárcovského programu v budoucnu setkat. Nemalou roli hraje také finanční hledisko. I když je IVF cyklus v indikovaných případech hrazen zdravotní pojišťovnou, stále je nutné doplácet např. za léky a manipulaci s embryi. Vzhledem k tomu, že se nejedná o malé částky, vyvstává otázka: Budou si moci IVF dovolit pouze bohatí lidé? Budu muset zastavit majetek, abych si mohla dovolit IVF cyklus? Mohu si za peníze koupit dítě na míru? Mohu si vybrat pohlaví potomka a koupit si např. dědice svého majetku? Atd. Naskýtá se také otázka eugeniky. Tato oblast genetiky byla již mnohokrát zneužita. Je tedy výběr embrya bez chromozomální aberace či mutace v genu jakási forma vylepšování genomu populace (Holub, 2011). 55

57 Etika v IVF je široká problematika, kterou nelze shrnout do několika odstavců. Nemůžeme jednoznačně označit názor jedince či skupiny za dobrý nebo špatný, nelze říči, která otázka je kontroverznější než jiná. Některé aspekty IVF jsou už vyřešeny legislativně a některé zůstávají stále otevřené. 56

58 3. CÍLE PRÁCE Cílem této práce bylo vyšetření chromozomových abnormalit celogenomovu analýzou buněk trofektodermu pomocí techniky acgh a vyhodnotit její přínos pro PGS a PGD prováděné u souborů pacientek podstupujícich umělé oplodnění v centru asistované reprodukce Sanatoria Helios Brno. Tento cíl zahrnoval několik dílčích ůkolů: vyhodnotit celkový počet a typ chromozomových aberací v buňkách trofektodermu u vyšetřovaného souboru 857 embryí od 525 pacientek porovnat počet aberací v 659 embryích od 352 pacientek rozdělených dle věku na skupinu žen mladších 35 let včetně a žen starších 35 let, prozkoumat vliv věku ženy na úspěšnost IVF cyklu. analyzovat soubor 39 embryí od 12 pacientek nebo jejich partnerů jako nositelů balancovaných translokací v rámci PGD, vyhodnotit procento embryí s nebalancovanými či kombinovanými chromozomálními aberacemi a určit segregační mód. 57

59 4. MATERIÁL K vypracování této práce byly použity buňky trofektodermu získané z blastocyst bioptovaných 5. nebo 6. den vývoje po prodloužené kultivaci. Buňky byly odebrány mikromanipulační technikou za přísných podmínek eliminující jakoukoliv kontaminaci cizí DNA zkušeným embryologem. Embrya byla po biopsii vitrifikována a uchována do doby transferu v některém z dalších přirozených cyklů pacientky. Všechny odběry proběhly v laboratoři IVF Sanatoria Helios Brno a všechny analýzy pak v Laboratoři lékařské genetiky (LLG) Sanatoria Helios. V rámci PGS bylo analyzováno celkem 857 embryí od 525 pacientek. Hodnocení vlivu věku ženy na úspěšnost IVF a pro nález chromozomálních aberací bylo vyšetřeno 659 embryí od 352 pacientek. V rámci PGD u skupiny jedinců, kteří jsou nositeli balancované translokace pak 39 embryí od 12 pacientek z toho 2 byly vyšetřovány 2x a 1 pacientka 3x. Buňky trofektodermu byly dále promyty a uchovány v extrakčním pufru při teplotě pod -20 o C do doby než byla provedena celogenomová amplifikace pomoci SurePlex (BlueGnome). Kontrola produktu WGA proběhla pomocí elektroforézy na 2 % agarózovém gelu a následovala vlastní analýza genomu embryí pomocí BAC acgh 24 sure V3 a 24sure+ (BlueGnome). 58

60 5. METODY Pro veškeré analýzy byla použita technika BAC acgh (BlueGnome). Systém je navržen pro analýzu aneuploidií z DNA získané z minimálního počtu buněk (1-10). Vlastní postup probíhá po promytí buněk v roztoku PBS v několika krocích: 1. Celogenomová amplifikace typu SurePlex. 2. Značení analyzované i referenční DNA pomocí flourochromů Cy3 a Cy5 za pomoci random primerů, následná koprecipitace s lidskou COT DNA. 3. Hybridizace značené DNA s resuspendováním v dextran sulfátu tj. hybridizačním pufru a nakapání ve formě DNA sondy na platformu čipu 24sure V3 nebo 24sure+ 4. Odmytí v roztocích SSC různé stringence a teploty. 5. Scanování laserovýcm scanerem a analýza dat. Analýza nebalancovaných změn v genomu embryí byla prováděna pomocí čipových platforem 24sure V3 a 24sure+ BlueGnome, kit BAC (dctp) v1.0, vstupní množství ng/ml bylo fragmentováno pomocí restrikčních enzymů, značeno fluorescenčními barvami (Cy3 a Cy5) a hybridizováno na čipu při 47 o C přes noc. Následovalo odmytí nenavázaných fragmentů DNA za specifických podmínek (roztoky SSC různé stringence: 2xSSC, 1xSSC, 0,1xSSC) a skenování pomocí scaneru ClerScan BlueGnome TM. Primární data byla upravena pomocí softwaru CleanScan v1.0.0 a dále pak hodnocena v analytickém software BlueFuse Multi v2.4 -v3.3. Vlastní aberace byla definována v případě platformy 24sure V3 dle velikosti delece či duplikace měřené ručně pomocí software a pro 24sure+ jako 3 BAC sondy o minimální velikosti definované dle mikroarray, kontrolní genom GRCh37. Analýza aneuploidií v rámci PGS proběhla na platformě čipů 24sure V3, která obsahuje 2909 BAC klonů s pokrytím genomu po 1 Mb a efektivním rozlišením aberace na 20 Mb. Analýza nebalancovaných strukturních aberací v rámci PGD na platformě čipů 24sure+, která obsahuje 4834 BAC klonů s pokrytím genomu po 623 Kb a efektivním rozlišením aberace na 10 Mb. Vyhodnocení statutu embryí s mozaikou je prováděno na základě porovnání hodnot poměrů X-separace a log2 poměru chromozomu, který je zmnožen v mozaice. 59

61 Promytí buněk trofektodermu: 1. Připravíme si skleněnou pipetu, vytaženou nad plamenem kahanu tak, abychom měli přiměřený průměr a délku. 2. Do sterilní Petriho misky nakapeme 3 kapky po 8 µl 1xPBS roztoku pro každé embryo. 3. Do mikrozkumavek na PCR nadávkujeme 5 µl extrakčního pufru pro každé embryo. 4. Pod mikroskopem pak oplachujeme buňky embrya v kapkách 1xPBS. Mezi jednotlivými kapkami vždy vyprázdníme pipetu a nabereme čistý 1xPBS z další kapky. 5. Po posledním promytí vypustíme z pipety 1xPBS a nabereme extrakční pufr z PCR mikrozkumavky, pak nasajeme promyté buňky embrya a přeneseme zpět do PCR mikrozkumavky. Takto promyté buňky uchováváme při teplotě pod -20 C. 1. Celogenomová amplifikace (WGA): Celogenomová amplifikace typu SurePlex s využitím částečně degenovarých primerů s adaptéry pro přípravu knihovny DNA sekvencí, které mohou být amplifikovány více jak 1000x. V reakční směsi jsou v posledním kroku využity univerzální PCR primery, které zajistí výslednou koncentraci DNA vhodnou pro další analýzy. 1. Namícháme extrakční mix (viz tabulka), přidáme 5 µl tohoto mixu do PCR mikrozkumavek, dobře promícháme. Extrakční mix objem na 1 vzorek na 8 vzorků na 16 vzorků na 24 vzorků (µl) (µl) (µl) (µl) Extrakční pufr 4,8 38,4 76,8 115,2 Extrakční enzym 0,2 1,6 3,2 4,8 Celkový objem 5, Inkubujeme vzorky v cycleru. 1 cyklus 75 C 10 min 1 cyklus 95 C 4 min 1 cyklus pokojová teplota do dalšího kroku analýzy 60

62 3. Namícháme pre-amplifikační mix (viz tabulka), přidáme 5 µl tohoto mixu ke vzorkům a dobře promícháme. Pre-amplifikační mix PicoPlex pre-amplifikační pufr PicoPlex pre-amplifikační enzym objem na 1 vzorek (µl) na 8 vzorků (µl) na 16 vzorků (µl) na 24 vzorků (µl) 4,8 38,4 76,8 115,2 0,2 1,6 3,2 4,8 Celkový objem 5, Inkubujeme vzorky v cycleru. 1 cyklus 95 C 2 min 12 cyklů 1 cyklus 4 C 95 C 15 sec 15 C 50 sec 25 C 40 sec 35 C 30 sec 65 C 40 sec 75 C 40 sec Do dalšího kroku analýzy Krátce centrifugujeme a uložíme do chladícího bločku. 5. Připravíme amplifikační mix (viz tabulka), přidáme 60 µl tohoto mixu ke vzorkům a dobře promícháme. Amplifikační mix objem na 1 vzorek (µl) 8 vzorků (µl) 16 vzorků (µl) 24 vzorků PicoPlex amplifikační pufr PicoPlex amplifikační enzym (µl) 0,8 6,4 12,8 19,2 Nuclease-Free voda 34,2 273,6 547,2 820,8 Celkový objem

63 6. Inkubujeme vzorky v cycleru. 1 cyklus 95 C 2 min 95 C 15 sec 14 cyklů 65 C 1 min 75 C 1 min 7. Ihned po celogenomové amplifikaci dáme vzorky do mrazáku a uchováváme při teplotě pod -20 C. Gelová horizontální elektroforéza: Před vlastní analýzou pomocí DNA čipů zkontrolujeme kvalitu DNA na gelu. Vzorky promícháme, stočíme a dávkujeme po 5 µl do jednotlivých startů na gelu (2% agaróza). Jako žebříček je použit 1kb leader. Ideální jsou fragmenty o velikosti kb (Obr. 22). Vzorky, které nemají fragmenty odpovídajíci velikosti a vzorky bez produktu, u nichž selhala amplifikace, nejsou dále analyzovány. Obrázek 22: Gelová horizontální elektroforéza po WGA, vzorky 1-10 (Zdrol: archiv Laboratoře lékařské genetiky). 62

64 2. Značení genomové DNA Vzorky i kontrolní DNA jsou značeny fluorochromy Cy3 a Cy5 pomocí random primerů. Značené DNA jsou pak vzájemně smíchány (vždy Cy3 s Cy5 značenou DNA) a koprecipitovány s lidskou COT DNA. 1. Vzorky promícháme a centrifugujeme. 2. Namícháme master mix pro značení genomové DNA (viz tabulka). Komponenty Cy3 značící mix na 1 reakci (µl) Cy5 značící mix na 1 reakci (µl) +5 % +5 % reakční pufr 5 5 DTP - značící mix 5 5 Cy3 dctp 1 Cy5 dctp 1 Klenow enzym 1 1 Celkový objem V PCR mikrozkumavkách smícháme 5 µl random primerů s 8 µl amplifikované DNA a také 8 µl kontrolních DNA. Denaturujeme 5 minut při 94 C, po uplynutí této doby ihned dáme na led. 4. Pak přidáme 12 µl Cy3 značícího mixu do poloviny PCR mikrozkumavek a 12 µl Cy5 značícího mixu do druhé poloviny PCR mikrozkumavek. Promícháme otočením a krátce centrifugujeme. 5. Inkubujeme v cycleru při 37 C 2-4 hodiny. 6. Krátce stočíme, smícháme vzorky značené Cy3 se vzorky značenými Cy5 ve zkumavkách 1,5 ml. 7. Přidáme 25 µl lidské COT DNA a 7,5 µl 3M acetátu sodného, protřepeme. 8. Přidáme 206 µl absolutního alkoholu a dvakrát promícháme otočením zkumavky. 9. Precipitujeme při -20 C 1-2 hodiny. 10. Pak centrifugujeme 10 minut při ot/min a vylijeme supernatant. 11. Přidáme 500 µl 70% etanolu, promícháme otočením a centrifugujeme 5 minut při nejvyšších otáčkách (tj ot/min). 12. Vylijeme supernatant a alkohol ze zkumavek odsajeme papírovým ubrouskem otočením dnem vzhůru. 63

65 13. Krátce stočíme a zbylý etanol odstraníme pipetou o objemu 10 µl. 14. Necháme otevřené zkumavky sušit při laboratorní teplotě 2 minuty. 3. Hybridizace Značené DNA jsou resuspendovány v dextran sulfátovém (DS) hybridizačním pufru a hybridizovány na DNA čipy 24sure V3 nebo 24sure+ 1. Pečlivě resuspendujeme pelet vzniklý kombinací DNA vzorků/kontrolních DNA/lidské COT DNA ve 21 µl DS hybridizačního pufru nahřátého na 75 C. Krátce stočíme a dáme denaturovat do suché lázně 10 min při 75 C. 2. Na DNA čipy nanášíme 18 µl takto vzniklé DNA sondy a přikryjeme krycím sklíčkem 22x22 mm. 3. Změříme teplotu v hybridizační komůrce. 4. Dáme hybridizovat do hybridizační komůrky na 3-16 hodin při 47 o C. 4. Odmytí 1. Odmývací roztoky připravujeme vždy čerstvé, příprava: Celkový objem pufru Rozpis 500 ml 50 ml 20xSSC, 450 ml dest.h 2 O, 0,25 ml Tween 20 (ph 7,0) 500 ml 25 ml 20xSSC, 475 ml dest.h 2 O (ph 7,0) 1000 ml 5 ml 20xSSC, 995 ml dest.h 2 O (ph 7,0) 2. Odmýváme dle rozpisu v odmývacích nádobkách s míchadly a na magnetické míchačce. Změříme teplotu v odmývací lázni. Potřebné množství pufru Teplota odmývání Čas odmývání Míchání Typ pufru 100 ml laboratorní dle potřeby ne 2xSSC + Tween ml laboratorní 10 min ano 2xSSC + Tween ml laboratorní 10 min ano 1xSSC 500 ml 60 C 5 min ne 0,1xSSC 400 ml laboratorní 1 min ano 0,1xSSC Sušení centrifugací 3 min při 1000 ot/min. 64

66 5. Scanování a analýza dat Primární data byla upravena pomocí softwaru CleanScan v1.0.0 (Obr. 23) a dále pak hodnocena v analytickém software BleFuse Multi v2.4 -v3.3 (Obr. 24, 26, 27, 28). Vlastní aberace byla definována v případě platformy 24sure V3 dle velikosti delece či duplikace měřené ručně pomocí software a pro 24sure+ jako 3 BAC sondy o minimální velikosti definované dle mikroarray. Analýza aneuploidií v rámci PGS proběhla na platformě čipů 24sure V3, která obsahuje 2909 BAC klonů s pokrytím genomu po 1 Mb a efektivním rozlišením aberace na 20 Mb. Analýza nebalancovaných strukturních aberací v rámci PGD na platformě čipů 24sure+, která obsahuje 4834 BAC klonů s pokrytím genomu po 623 Kb a efektivním rozlišením aberace na 10 Mb. Vyhodnocení statutu embryí s mozaikou je prováděno na základě porovnání hodnot poměrů X-separace a log2 poměru chromozomu, který je zmnožen v mozaice (Tab. 2, Obr. 25). Obrázek 23: Ukázka výstupu primárních dat při scanování čipu; vlastní obrázek čipu (Zdroj: archiv Laboratoře lékařské genetiky). trizomie monozomie Obrázek 24: Ukázka výstupu software BlueFuse Multi ve formě celogenomového profilu embrya (Zdroj: archiv Laboratoře lékařské gentiky). 65

67 Tabulka 2, Obrázek 25: Pomocná tabulka při vyhodnocování statutu embrya s mozaikou (Zdroj: upraveno). Nulizomie Monozomie Euploidní Trizomie Počet chromozomů Ztráta/zisk genet. materiálu Očekávaná velikost změny Porovnání log2 poměru a X-separace: Bez mozaiky ztráta ztráta - zisk 2x X-separace 1x X-separace 0 0,6x X-separace 0,8-1 a více -0,8 0 0,48 0,6-1 a více -0,6 0 0,36 0,5-1 -0,5 0 0,30 0,4-0,8-0,4 0 0,24 Mozaicismus 50 % 0,8-0,5 a více -0,4 0 0,24 0,6-0,5 a více -0,3 0 0,18 0,5-0,5-0,25 0 0,15 0,4-0,4-0,2 0 0,12 66

68 Obrázek 26: Profil embrya bez genetického nálezu (Zdroj: archiv Laboratoře lékařské genetiky). Obrázek 27: Profil embrya s trizomií chromozomu 16 a 18 (Zdroj: archiv Laboratoře lékařské gentiky). Obrázek 28: Profil embrya s komplexními aneuploidiemi (Zdroj: archiv Laboratoře lékařské genetiky). 67

69 6. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST - VÝSLEDKY Do této kapitoly jsou zahrnuty výsledky jednotlivých dílčích úkolů z cílů rigorózní práce. Jedná se o vyhodnocení počtu a typu chromozomových aberací v buňkách trofektodermu vyšetřených pomocí acgh a zhodnocení výsledků pro úspěšnost IVF cyklu; srovnání počtu aberací u žen mladších 35 let a žen starších 35 let a zároveň prozkoumání vlivu věku ženy na úspěšnost IVF cyklu; dále pak analýza embryí přenašečů balancované translokace, vyhodnocení počtu embryí s nebalacovanou translokací a určení segregačního módu Celogenomová analýza počtu a typu chromozomových aberací v buňkách trofektodermu Hlavním cílem této části práce bylo provést celogenomovou analýzu buněk trofektodermu, vyhodnotit celkový počet a strukturu aberací v procentech. Bylo vyšetřeno 857 embryí od 525 pacientek. Z celkového počtu 857 embryí byl získán výsledek u 798 (93 %) z toho bylo 517 (65 %) embryí vhodných k embryotransferu tj. bez nálezu chromozomové aberace a 281 (35 %) s chromozomovou aberací (Graf 2). U 59 (7 %) embryí z celkových 857 nebylo možné získat výsledek z důvodu fragmentace DNA či selhání amplifikace. Tyto dva důvody jsou nejčastější příčinou nedosažení výsledku analýzy. V Laboratoři lékařské genetiky je produkt celogenomové amplifikace kontrolován při horizöntální elektroforéze na 2 % agarozóvém gelu a nelze tedy rozlišit, která z těchto příčin je důvodem neúspěchu. Soubor nebyl posuzován z hlediska věku pacientek. Embrya s mozaikou byla započítána do aberantních, nebyla hodnocena zvlášť a nebyla transferována. Celkem bylo nalezeno 517 embryí bez aberace (65 %) a 281 (35 %) s aberací (zisk nebo ztráta genetického materiálu), dále pak z celkového počtu 366 aberací 165 (45 %) se ziskem celých chromozomů, 21 (6 %) se ziskem části chromozomů, 101 (28 %) se ztrátou celých chromozomů a 55 (15 %) se ztrátou části chromozomů. Započítány byly zisky a ztráty 1-2 chromozomů v jednom embryu. Případy 3 a více změn byly nalezeny ve 24 (7 %) embryích. Zisky chromozomů celkem byly nalezeny ve 186 (51 %) embryích a ztráty ve 156 (42 %). Nejčastěji (v počtu 10 a více) se trizomie vyskytovaly u chromozomů 6, 15, 16, 19, 21 a 22; monozomie pak u chromozomů 16, 21, 22 a X; komplexní aneuploidie byly nalezeny u 24 68

70 embryí. Parciální změny (v počtu 4 a více) byly nalezeny ve smyslu zisků (duplikace) genetického materiálu u chromozomu 9 a ztrát genetického materiálu (delece) pak u chromozomů 1, 2, 5, 6, 7, 11, 12, 13. Žádné parciální změny nebyly nalezeny u chromozomů 3, 17, 18, 22 a Y. Nejvyšší podíl změn v genomu (zisky a ztráty genetického materiálu) celkově se týkal chromozomů 16, 21, 22 (Tab. 3; Graf 3). Graf 2: Zastoupení embryí s chromozomální aberací a bez aberace ve vyšetřovaném souboru. Nález aberací v buňkách trofektodermu Embrya s aberací (35 %) Embrya bez aberace (65 %) 35 % 65 % 69

71 Tabulka 3: Celkový nález aberací ve vyšetřovaném souboru. Chromosom Zisk Parciální zisk Ztráta Parciální ztráta 3 a více aberací Celkem aberací X Y a více 24 Celkem zisky 186 ztráty

72 Graf 3: Podíl jednotlivých chromozomů na aberacích (komplexní aneuploidie nezohledněny). Počet aberací x jednotlivé chromozomy X Y 71

73 Byla vypočítána úspěšnost IVF cyklu u pacientek, které neměly vyšetřená embrya pomocí acgh v rámci PGS, ta činila v případě biochemické gravidity 55 % a srdeční akce pak byly patrné ve 43 %. Naproti tomu u pacientek s vyšetřenými embryi byla biochemická gravidita nalezena v 69 % a srdeční akce potvrzeny v 67 %. V porovnání úspěšnosti IVF cyklů bez vyšetření pomocí acgh a s vyšetřením embryí pomocí acgh byl prokázán nárůst potvrzení srdečních akcí v téměř 70 % a nárůst počtu gravidit ve smyslu potvrzení srdečních akcí o 24 % (Graf 4). Graf 4: Srovnání úspěšnosti IVF cyklu z hlediska nálezu biochemické gravidity a srdeční akce plodu 80% 70% 60% 50% 40% 30% biochemická gravidita srdeční akce plodu 20% 10% 0% Bez PGS s PGS acgh 72

74 6.2 Srovnání počtu aberací u žen mladších 35 let včetně a žen starších 35 let, vliv věku ženy na úspěšnost IVF cyklu V této části analýz byly srovnány celogenomové profily u žen mladších 35 let včetně a u žen nad 35 let věku. Následně byla porovnána úspěšnost IVF cyklu ve smyslu potvrzení srdeční akce plodu. Pacientky byly rozděleny do dvou skupin, skupina A) ženy mladší 35 let včetně (průměrný věk ve skupině 30 let) a skupina B) ženy starší jak 35 let (průměrný věk ve skupině 37 let). Do studie nebyl zařazen žádný dárcovský IVF cyklus tzn. cykly s darovanými vajíčky ani cykly s darovanými spermiemi. Všechna embrya byla po biopsii vitrifikována a k transferu došlo v některém z dalších přirozených cyklů ženy. Do studie bylo zařazeno celkově 659 embryí od 352 pacientek, skupinu A) tvořilo 517 embryí od 210 pacientek a skupinu B) 293 embryí od 301 pacientek. Ve skupině A) bylo nalezeno 348 (69 %) embryí bez aberace a 157 (31 %) embryí s aberací, u 12 (2 %) embryí z celkového počtu 517 nebylo dosaženo výsledku analýzy. Ve skupině B) bylo nalezeno 149 (55 %) embryí bez aberace a 124 (45 %) embryí s aberací (Tab. 4., Graf 5), u 20 embryí (7 %) z celkového počtu 293 nebyl získán výsledek. Zatímco u žen mladších 35 let byly nalezeny chromozomové aberace ve 31 % u žen starších už tvořila embrya s aberací téměř polovinu. Tabulka 4: Celkový nález aberací v embryích ve skupinách žen rozdělených dle věku Do 35 let včetně (skupina A) Nad 35 let (skupina B) Embrya bez aberace Embrya s aberací Celkem bez aberace 69 % 55 % Celkem s aberací 31 % 45 % 73

75 Graf 5: Nálezy aberací v embryích žen mladších 35 let a žen starších 35 let. 80% 70% 60% 50% 40% 30% Bez aberace S aberací 20% 10% 0% do 35 let nad 35 let Jako kontrolní skupina byly použity IVF cykly s transferem embrya bez celogenomové analýzy pomocí acgh od 216 pacientek, které byly rozdělen opět dle věku, 151 pacientek do 35 let včetně a 65 pacientek stařších 35 let. Úspěšnost IVF cyklu u pacientek mladších 35 let bez vyšetření embryí pomocí acgh byla 59 %, s vyšetřením embryí pomocí acgh pak 66 %. U pacientek starších jak 35 let byla úspěšnost IVF cyklu bez vyšetření embryí metodou acgh 26 %, a s vyšetřením embryí rapidně stoupla na 66 % (Tab. 5, Graf 6). Vzestup úspěšnosti IVF cyklu z 59 % na 66 % u pacientek mladších 35 let není významný. U pacientek mladších 35 let může být důvodem nedosažení těhotenství i jiný než genetický faktor (např. hormonální nebo psychický). Dále je třeba si uvědomit, že byla počítána tzv. kumulativní úspěšnost, což znamená dosažení těhotenství ve smyslu srdečních ozev po všech možných transferech. Ženy mladší 35 let mají více vajíček, více blastocyst vhodných k biopsii a také více embryí bez chromozomové aberace. Z uvedeného vyplývá větší počet "pokusů" a také vysoké procento úspěšnosti jak bez vyšetření tak s ním. Oproti tomu ženy nad 35 let věku mají méně vajíček a většinou pouze jedno embryo bez chromozomové aberace. Pro tyto ženy je vyšetření embryí pro dosažení těhotenství naprosto zásádní, protože počet chromozomových aberací s věkem vzrůstá a je velmi pravděpodobné, že právě v jejich embryích chromozomální aberace budou přítomny. Vyloučení embryí s chromozomovou 74

76 aberací tedy zcela zásadně ovlivní úspěšnost IVF cyklu. Díky celogenomové analýze pomocí metody acgh je zcela eliminován vliv věku ženy na úspěšnost IVF cyklu a pravděpodobnost otěhotnění je naprosto srovnatelná se ženami mladšími, což vyplývá ze statisticky významného vzestupu úspěšnosti IVF cyklu u žen nad 35 let věku bez vyšetření embryí pomocí acgh z 26 % na 66 % u žen nad 35 let věku s embryi vyšetřenými pomocí acgh. Tabulka 5: Srovnání úspěšnosti IVF cyklů ve skupinách žen rozdělených dle věku. Do 35 let včetně (skupina A) Nad 35 let (skupina B) Úspěšnost IVF cyklu bez PGS metoda acgh Úspěšnost IVF cyklu s PGS metoda acgh 59 % 66 % 26 % 66 % Graf 6: Srovnání nárůstu úspěšnosti IVF cyklu u pacientek dle věku a vyšetření embryí v rámci PGS acgh. 70% 60% 50% 40% 30% bez PGS s PGS acgh 20% 10% 0% do 35 let nad 35 let 75

77 6.3 Celogenomová analýza embryí přenašečů balancované translokace v rámci PGD V rámci PGD u skupiny jedinců, kteří jsou nositeli reciproké translokace, bylo vyšetřeno 39 embryí od 12 pacientek z toho 2 pacientky byly vyšetřovány 2x a 1 pacientka 3x, 1 embryo nebylo možné vyšetřit. U všech pacientek a jejich partnerů byl stanoven karyotyp pomocí G-pruhování a zápis proveden dle mezinárodní nomenklatury ISCN (Tab 6; Obr. 29). Soubor tvoří pouze reciproké translokace, přenašeči pro Robertsonovské translokace v Laboratoři lékařské genetiky Sanatoria Helios zatím nebyli vyšetřeni. Obrázek 29: Ukázka karyotypu s reciprokou translokací; zápis dle nomenklatury ISCN 46,XX,t(8;13)(q24.22q31) (Zdroj: archiv Laboratoře lékařské genetiky). 76

78 Z celkového počtu 38 embryí bylo nalezeno 16 (42,2 %) embryí bez translokace nebo s její balancovanou formou, 12 (31,5 %) nebalcovaných genotypů spojených s původní translokací, 4 (10,5 %) embrya nesla nebalancovanou translokaci a další aberaci ve smyslu aneuploidie jiného chromozomu než se účastnil translokace, 6 (15,8 %) embryí s jinou aberací bez nebalancované translokace. Zastoupení jednotlivých nálezů vyjadřuje Graf 7. Byl stanoven segregační mód jednotlivých aberací (Tab. 6) a jeho celkové procentuální zastoupení: střídavá segregace 16 (53 %), (zbylých 16 embryí s aberací spojenou s translokací i jinou aberací bráno jako 100 %) segregace přilehlých chromozomů typu 1 v počtu 11 (68,7 %), segregace přilehlých chromozomů v počtu 0 (0 %), terciální monozomie/trizomie v počtu 5 (31,2 %), vzájemná trizomie/monozomie 0 (0 %) (Graf 8). Příklady profilů embryí s nebalancovanou translokací ukazuje Obrázek 30 a-d. Z uvedeného souboru bylo prozatím transferováno 8 embryí se statutem normální nebo balancovaný typ translokace, u 4 (50 %) byly potvrzeny srdeční ozvy a 4 pacientky gravidity nedosáhly (50 %). Vzhledem k počtu transferovaných embryí je však nutné pamatovat na problém tzv. malých čísel. V každém případě lze vyhodnotit, že bylo vyloučeno 23 (22 s aberací a 1 nevyšetřené) embryí nesoucích některou s uvedených aberací a bylo tak zabráněno stejnému počtu spontánních potratů či jiným komplikacím v těhotenství. 77

79 Graf 7: Procentuální zastoupení jednotlivých typů nálezů aberací. 42,2 % 15,8 % 31,5 % 10,5 % aberace spojené s translokací aberace spojené s translokací a jiné aberace jiné aberace bez translokace normální nebo přenašeč Graf 8: Procentuální zastoupení segregačních módů 31,2 % 68,8 % segregace přilehlých chromozomů typ 1 terciální trizomie/monozomie 78

80 Tabulka 6: Shrnutí výsledků analýzy embryí přenašečů balancovaných translokací, segregační mód; barevně je odlišeno pohlaví přenašeče - modrá: přenašeč mužského pohlaví, růžová: přenašečka ženského pohlaví (Zkratky: NAD - bez aberace, no abnormality detected; ABN - abnormalita, abnormality detected; UNK - bez výsledku, unknown). Pacient č/typ translokace číslo vyš. segregační mód jiné aberace Status embrya embrya 1 střídavá segregace 2:2 - NAD / 1/46,XX,t(5;6)(q13;q27) balancovaná t 2 střídavá segregace 2:2-21 ABN 1 střídavá segregace 2:2 - NAD / balancovaná t 2/46,XY,t(4;10)(q33;q25.2) 2 segregace přilehlých - ABN chromozomů typu 1, 2:2 3/45,XX,dic(21;22)(p13,p13) 1 střídavá segregace 2:2 - NAD / balancovaná t 1 střádavá segregace 2:2 - NAD / balancovaná t 4/45,XX,rob(13;14)(q10;q10) 2 střídavá segregace 2:2-14 ABN 3 střídavá segregace - NAD / balancovaná t 1 segregace přilehlých - ABN chromozomů typu 1, 2:2 5/46,XY,t(4;10)(q33;q25.2) 2 střídavá segregace - NAD / balancovaná t 3 segregace přilehlých - ABN chromozomů typu 1, 2:2 6/45,XY,t(13;14)(q10;q10) 1 střídavá segregace 2:2 - NAD / balancovaná t 1 střídavá segregace 2:2 - NAD / balancovaná t 2 střídavá segregace 2:2 - NAD / balancovaná t 7/46,XX,t(5;14)(p11;q11) 3 zisk 5q11.1q35 - ABN terciální monozomie; 3:1 4 střídavá segregace 2:2 ztráta ABN 14q32.33q /46,XX,t(13;15)(q34;q22) 1 střídavá segregace 2:2 -X (Turner sy) ABN 1 segregace přilehlých +13 ABN chromozomů typu 1, 2:2 2 střídavá segregace +22 ABN 9/46,XY,t(4;10)(q33;q25.2) 3 segregace přilehlých -13, -22 ABN chromozomů typu 1; 2:2 10/46,XX,t(8;13)(q24.22q31) 1 segregace přilehlých chromozomu typu 1; - ABN 79

81 2:2 11/46,XY,t(11;12)(q13.3;q13.1) 12/46,XY,t(5;9)(p15.1;q22.1) 13/46,XX,t(11;12)(q25;q13.1) 14/46,XX,t(13;15)(q34;q22) 15/46,XX,t(5;14)(p11;q11) 1 střídavá segregace 2:2-6 ABN 2 střídavá segregace 2:2 - NAD / balancovaná t 3 střídavá segregace2:2 - NAD / balancovaná t 4 střídavá segregace 2:2 - NAD / balancovaná t 5 střídavá segregace 2:2 - NAD / balancovaná t 6 segregace přilehlých chromozomů typu 1; 2:2 dup (9) ABN 1 segregace přilehlých ABN chromozomů typu 1; 2:2 1 terciální monozomie; ABN 3: UNK 3 střídavá segregace 2:2 - NAD / balancovaná t 4 terciální trizomie; 3:1 ABN 5 střídavá segregace 2:2 - NAD / balancovaná t 6 terciální trizomie; 3:1 - ABN 1 segregace přilehlých ABN chromozomů typu 1; 2:2 2 segregace přilehlých ABN chromozomů typu 1; 2:2 3 dup(15) +13 ABN terciální trizomie; 3:1 4 segregace přilehlých ABN chormozomů typu 1; 2:2 1 střídavá segregace 2:2 - NAD / balancovaná t 80

82 Obrázek 30 a, b, c, d: Profily vybraných embryí a segregační mód (Zdroj: archiv Laboratoře lékařské genetiky). a) nebalancovaná t(4;10)(q33;q25.2) segregace přilehlých chromozomů typu 1; 2:2 b) nebalancovaná t(11;22)(q25;q13.1) terciální monozomie; 3:1 c) nebalancovaná t(11;22)(q25;q13.1) terciální monozomie; 3:1 d) nabalancovaná t(5;14)(q11;q11) terciální trizomie; 3:1 81

83 7. DISKUSE Preimplantační genetické analýzy představují soubor molekulárně cytogenetických nebo molekulárně biologických vyšetření, pomocí kterých můžeme odhalit genetické abnormality embrya před jeho přenosem do dělohy matky. Toto specializované vyšetření je založeno na nejnovějších pokrocích genetiky a asistované reprodukce. Preimplantační genetický screening a preimplantační genetická diagnostika dnes neodmyslitelně patří k asistované reprodukci. Vzhledem ke zvyšujícímu se počtu párů s poruchou reprodukce, roste i potřeba využití molekulárně cytogenetických a molekulárně biologických metod pro vyšetřování embryí. Tyto techniky nabízí zásadní pomoc při zvýšení pravděpodobnosti otěhotnění a narození zdravého potomka těm, kteří by fyziologického těhotenství vůbec nedosáhli nebo by jim hrozilo narození potomka s vývojovou vadou či některým genetickým onemocněním. Jako metoda volby pro celogenomovou analýzu embryí je v poslední době využívána komparativní genomová hybridizace ve formě čipových technologií různých platforem, sloužící k vyloučení embryí s chromozomovou abnormalitou z procesu IVF. Z hlediska poměrně krátké historie PGS a PGD lze vývoj technologií rozdělit do několika etap. První analýzy zárodečného genomu začaly před dvaceti lety. Výsledkem bylo zvýšení počtu živě narozených dětí, snížení počtu samovolných potratů, snížení počtu narozených dětí s aneuploidiemi v rámci IVF programů. Z metodického hlediska můžeme do první etapy zařadit techniku interfázní FISH, která umožňuje s využitím centromerických a genově specifických sond analýzu pouze limitního množství chromozomů, z toho důvodu nepředstavuje také žádný profit pro ženy vyššího věku. Dnes se v některých moderních IVF centrech již téměř nevyužívá, v některých je stále aktuální. V počátcích představovala tato metoda solidní nástroj pro zvýšení úspěšnosti otěhotnění. Pomocí FISH je vyšetřováno několik chromozomů a je nutné provádět rehybridizaci ke zvýšení počtu jejich vyšetření. Nelze spolehlivě odhalit mozaicismus ani segmentální změny v genomu (Munné et al., 1993; Verlinsky et al., 1995; Baart et al., 2006). Techniku FISH lze také vyžít pro PGD, zejména pro nositele balancovaných translokací (Scriven et al., 1998 a 2000). Představitelem druhé etapy vývoje metod pro PGS a PGD je technika acgh umožňující analýzu všech chromozomů. Její rozlišovací schopnost se odvíjí od typu použité platformy DNA čipu resp. původu a typu použitých klonů na něm. Hlavní výhodou techniky acgh je 82

84 celogenomové pokrytí a vyšetření aneuploidií i nebalancovaných strukturních aberací. Nevýhodou zůstává nemožnost odhalení balancovaných změn v genomu (s vyjímkou SNP čipů). Díky acgh dnes existuje mnoho studií, které mapují celkový výskyt a procentuální zastoupení aberací v embryích (Fragouli et al., 2011; Chung et al., 2013; Yang et al., 2013). Poslední třetí etapu tvoří nejmodernější technologie, které umožňují kombinovat přístup, jak PGS tzn. odhalení početních i strukturních aberací, tak přístup PGD z hlediska odhalení mutací spojených s monogenními chorobami v jednom kroku, což donedávna nebylo možné. Řadíme mezi ně techniku NGS a karyomapování (Fiorentino et al., 2014; Handyside et al., 2009). Jak pro acgh tak pro NGS a karyomapování je zcela zásadní kvalita vstupní DNA dostatečné koncentrace. Diploidní lidská buňka obsahuje asi 7 pg genomové DNA. Pro celogenomové analýzy jsou však třeba desítky ng DNA, proto byly vyvinuty techniky celogenomové amplifikace (Macaulay and Voet, 2014). Techniky založené na DOP-PCR a PEP-PCR (Telenius et al., 1992; Zhang et al., 1992) mohou vytvářet nespecifické a krátké amplifikační produkty, pokrytí genomu není úplné. Získané produkty tak nelze využít pro všechny techniky, jsou však dostačující pro techniky s nižším rozlišením jako je např. BAC acgh. V současné době se častěji využívají techniky celogenomové amplifikace typu MDA nebo OmniPlex, produkty těchto celogenomových amplifikací jsou využitelné i pro techniky s vysokým rozlišením jako např. SNP array nebo analýza pomocí STR markerů (Barker et al., 2004). V neposlední řadě je třeba také zmínit vstupní materiál pro analýzu genomu. Vyšetřovány byly nejčastěji embrya v buněčném stádiu, které nejsou, vzhledem k možnosti odběru 1-2 blastomer, zcela reperezentativní pro komplexní analýzu genomu. Odběr blastomer probíhá 3. den vývoje embrya, kdy ještě není zcela funkční jeho vlastní genom a po jeho "zapnutí" dochází k zastavení vývoje mnoha embryí (Campbell et al., 2012). Bývá tedy "zbytečně" vyšetřováno mnohem více embryí, což zvyšuje cenu analýz. Další nevýhodou je to, že transfer embrya ve stádiu blastomery nekoresponduje s přirozeným cyklem, protože 3. den vývoje je embryo ještě ve vejcovodu a transferem blastocysty do dělohy tak u embrya může dojít k deprivaci z jiného než přirozeného prostředí vejcovodu a hrozí jeho neuchycení v děloze. Se zavedením prodloužené kultivace embryí a tím možnosti dosažení stádia blastocysty in vitro, je možné genom embrya zmapovat z většího množství odebraných buněk a lépe tak zohlednit např. mozaicismus, dále pak při PGD analýzách snížit ritiko ADO a PA. Ve stádiu blastocysty je embryo transferováno do dělohy a tím se ocitá v prostředí, které je 83

85 stejné jako v přirozeném cyklu. Jeho implantace ja pak mhohem lépe zajištěna a nenastává stres z nevhodného prostředí (Cohen et al., Kokkali et al., 2007). Hlavním cílem této práce bylo zmapovat přínost celogenomové analýzy embryí pomocí techniky acgh v rámci PGS a PGD pro IVF cyklus. V rámci jednotlivých dílčích úkolů byl vyšetřen soubor embryí, stanoveno celkové procentuální zastoupení aberací a také jejich jednotlivé typy. Další část byla zaměřena na porovnání výskytu aberací v embryích ve skupinách žen rozdělených dle věku a vyhodnocení vlivu věku ženy na úspěšnost IVF cyklu. Poslední část byla věnována nositelům balancovaných translokací účastnících se cyklů IVF. Byl vyhodnocen celkový výskyt aberací v embryích a rozdělen na jednotlivé typy, vyhodnocen segregační mód a úspěšnost IVF cyklu. Chromozomální aberace jsou nejčastější příčinou spontánních potratů v raném stádiu těhotěnství, dále se významně podílí na samotném neuchycení embrya v děloze a tím také snižují pravděpodobnost úspěšnosti IVF cyklu a možnost narození zdravého potomka. Jejich počet vzrůstá s věkem ženy. Všechny buňky lidského těla vznikají ze dvou rodičovských haploidních gamet. Vrozené chromozomové aberace jsou tedy v dalším vývoji přenášeny do všech dceřiných buněk ve formě kompletních aneuploidií či mozaiek. Je zřejmé, že čím dříve dojde k nondisjunkci či malsegregaci tím větší porce buněk je zasažena chromozomální aberací. Integrita DNA během gametogeneze je zcela zásadní pro vývoj normálního embrya nebo naopak pro jeho zatížení chromozomální aberací. Spontánní potraty se vyskytují asi u 10 % všech těhotenství a jejich počet vrůstá s věkem ženy. Některý s vrozených defektů se vyskytuje u 3 % živě narozených, z toho je pak u 20 % příčinou genetická abnormalita. Největším rizikem jsou trizomie chromozomů 13, 18, 21, X a Y, které jsou slučitelné se životem a mohou vést k narození potomka s genetickým syndromem (Ambartsumyan and Clark, 2008). Bylo zjištěno, že v ráném stádiu vývoje embrya je více jak polovina z nich nositelem genetické abnormality (Rabinowitz et al., 2012). Méňe jak 5 % klinicky rozpoznaných gravidit je trizomických nebo monozomických. Velká většina z nich končí in utero neuchycením embrya nebo spontánním potratem. Některé trizomie jsou však slučitelné se životem a těhotenství může skončit narozením postiženého dítěte (Hassold et al., 2007). Kromě chyb v meióze a to hlavně u oocytů, se na vytváření aberací podílí i mitotické chyby vznikající po fertilizaci a jsou hlavní příčinou mozaicizmu (Fragouli and Wells, 2011). 84

86 U embryí, které vzniknou v rámci IVF, nalézáme vysoké procento nejen aneuploidích ale i mozaicismu a to hlavně u embryí vzniklých oplodněním oocytů starších matek (Haddad et al., 2013). Bylo prokázáno, že 56.6 % blastocyst je aneuploidních z toho 62,3 % má jednu aberaci a 37,7 % má více jak jednu chromozomální aberaci (Liu et al., 2012). Procento chromozomových abnormalit však kolísá v závislosti na použité metodě analýzy (FISH, CGH, acgh) a počtu analyzovaných chromozomů, dále pak na stádiu vývoje embrya (buněčné embryo, blastocysta). Analýza všech chromozomů pomocí CGH nebo acgh prokázala mnohem vyšší procento abnormalit ve srovnání s analýzami prováděnými pomocí FISH, kde je počet vyšetřovaných chromozomů omezen. Obecně lze říci, že čím více chromozomů je vyšetřováno, tím vyšší je procento nalezených abnormalit (van Echten- Arends et al., 2011). Dále pak víme, že v embryích v buněčném stádiu je více aberací než v embryích ve stádiu blastocysty. Jednotlivými typy aberací a jejich vznikem se zabývali Hassold a Hunt (2001). Lidský embryonální genom není aktivní až do stádia vývoje 8 buněk (embryo v buněčném stádiu), dělení buněk je do té doby plně závislé na maternálním genomu tzn. na transkriptech maternálních genů a zásobě proteinů v oocytech (Braude et al., 1988; Campbell et al., 2012). Po této fázi se začne embryo dělit dle svého vlastního potenciálu. V tomto časovém období pak může dojít ke korekci genetických změn a embrya, která ve buněčném stádiu byla aneuploidní pak ve stádiu blastocysty aneuploidní nejsou (Robberecht et al., 2010). Ne všechny chromozomy mají na vzniku aberací stejný podíl. Studie Fragouli a Wellse (2011) ukázala, že nejčastěji se vyskytují aberace chromozomů 15, 16, 21, 22 a X. Častější jsou ztráty chromozomů než jejich zisky. Analýza byla provedena metodou metafázní CGH. (Fragouli and Wells, 2011). V rámci cílů rigorózní práce bylo vyšetřeno 857 embryí od 525 pacientek. Z celkového počtu 857 embryí byl získán výsledek u 798, z toho bylo 517 (65 %) vhodných k embryotransferu tj. bez nálezu chromozomální aberace a 281 (35 %) s chromozomovou aberací. Soubor nebyl posuzován z hlediska věku pacientek. Studie J. Menashi ukázala, že 65,8 % potracených plodů nese chromozomovou aberaci. Aberace byly nalezeny technikou karyotypování metodou G-pruhování z kultivovaných fibroblastů potracených plodů (Menashi et al., 2005). Techniku FISH využil Bahce (2000), analyzoval chromozomy 1, 13, 15, 16, 18, 21, 22, X, Y a bylo nalezeno 66 % embryí s chromozomovou aberací. Stejnou technikou pro chromozomy 13, 15, 16, 18, 21, 22, X, Y pak 85

87 Zhang (2010) prokázal aneuploidie v 58,7 % embryí. S využitím techniky celogenomové analýzy technikou CGH vědci prokázali ve své studii nález aberací v 75 % embryí (Voullare et al., 2000; Wells and Delhanty, 2000). Pomocí techniky CGH Fragouli s Wellsem (2011) nalezli 58 % embryí s chromozomovou aberací. Fragouli (2011) pak pomocí acgh prokázala aberace v 62,4 % embryí. Celogenomovou analýzou s využitím acgh bylo v předložené práci nalezeno 65 % embryí s chormozomovou aberací a výsledek zcela odpovídá nálezům v literatuře, které se pohybují v rozmezí % získaném analýzou pomocí CGH nebo acgh (Voullare et al., 2000; Wells and Delhanty, 2000; Fragouli et al., 2011; Fragouli and Wells, 2011). Zastoupení jednotlivých chromozomů v genetických abnormalitách je různé. Bylo nalezeno celkem 517 embryí bez aberace (65 %) a 281 (35 %) embryí s aberací (zisk nebo ztráta genetického materiálu), dále pak z celkového počtu 366 aberací ve 281 embryích bylo 165 (45 %) se ziskem celých chromozomů, 21 (6 %) se ziskem části chromozomů, 101 (28 %) se ztrátou celých chromozomů a 55 (15 %) se ztrátou části chromozomů. Započítány byly zisky a ztráty 1-2 chromozomů v jednom embryu. Případy 3 a více změn byly nalezeny ve 24 (7 %) embryích. Zisky chromozomů celkem byly nalezeny ve 186 (51 %) embryích a ztráty ve 156 (42 %). Nejčastěji (v počtu 10 a více) se trizomie vyskytovaly u chromozomů 6, 15, 16, 19, 21 a 22; monozomie pak u chromozomů 16, 21, 22 a X; komplexní aneuploidie byly nalezeny u 24 embryí. Parciální změny (v počtu 4 a více) byly nalezeny ve smyslu zisků (duplikace) genetického materiálu u chromozomu 9 a ztrát genetického materiálu (delece) pak u chromozomů 1, 2, 5, 6, 7, 11, 12, 13. Celkově činil podíl parciálních změn 21 %. Žádné parciální změny nebyly nalezeny u chromozomů 3, 17, 18, 22 a Y u těchto chromozomů se jednalo vždy buď o monozomii nebo trizomii celého chromozomu. Nejvyšší podíl změn v genomu (zisky a ztráty genetického materiálu) celkově se týkal chromozomů 16, 21, 22. Vyšetřením embryí Fragouli (2011) prokázala nejvyšší výskyt aberací u chromozomů 13, 15, 16, 21, 22 a X. Zisky chromozomů, ať už celých nebo jejich částí, byly nalezeny v 524 (49 %) případech, ztráty byly nalezeny v 555 (51 %) případech. Ztráty chromozomů byly častější než zisky (Fragouli et al., 2011). Naše nálezy ukazují, že chromozomy 16, 21 a 22 se podílejí na aberacích v nejvyšší míře a to zcela odpovídá závěrům studie Fragouli (2011). Opačný poměr mezi celkovými zisky 49 % a ztrátami 51 % genetického materiálu ve studii Fragouli (2011) a naší studií, kde zisky tvořily 51 % a ztráty 42 % (7 % tvořily komplexní aneuploidie) je statisticky zanedbatelný. 86

88 Dle Rabinowitz a spolupracovníků (2012) činí podíl parciálních (segmentálních) změn chromozomů 15,3 %, což je zcela srovnatelné s 21 % nalezenými v souboru embryí z předložené rigorózní práce. Zajímavým zjištěním je teoretické porovnání techniky FISH a acgh v Laboratoři lékařské genetiky, kde byla využívána pětibarevná interfázní FISH pro chromozomy 13, 18, 21, X a Y pro účely PGS. Bylo by odhaleno pouze 93 aneuploidií a jako falešně negativní hodnoceno 249 aneuploidií z celkových 366, což činí 68 %! Je tedy zřejmé, že nahrazení techniky FISH celogenomovými analýzami jako je např. acgh je pro odhalování aneuploidií v genomu embrya nejlepší volbou. Pravděpodobnost otěhotnění v přirozeném cyklu ženy je %. Úspěšnost IVF cyklu v předloženém souboru žen bez vyšetření embryí pomocí acgh se pohybuje mezi % v závislosti na věku. Nárůst potvrzených gravidit na 67 % u souboru pacientek s vyšetřenými embryi ukazuje na zcela jasný přínos techniky acgh pro úspěšnost IVF cyklu a dosažení gravidity. Byla vypočítána úspěšnost IVF cyklu u pacientek, které neměly vyšetřená embrya pomocí acgh v rámci PGS, ta činila v případě biochemické gravidity 55 % a srdeční ozvy pak byly patrné ve 43 %. Naproti tomu u pacientek s vyšetřenými embryi byla biochemická gravidita nalezena v 69 % a srdeční ozvy potvrzeny v 67 %. V porovnání úspěšnosti IVF cyklů bez vyšetření pomocí acgh a s vyšetřením embryí pomocí acgh byl prokázán nárůst potvrzení srdečních ozev v téměř 70 %, což ukazuje na velmi vysokou úspěšnost a nárůst počtu gravidit o 24 %. Ze studií vyplývá že úspěšnost IVF cyklu se pohybuje v rozmezí 41-62,9 % (Veeck et al., 2004; McArtur et al., 2005; Schoolcraft et al., 2009; Wang et al., 2010). Yang se svými kolegy (2013) použil pro celogenomovou analýzu embryí BAC acgh BlueGnome, což je stejná platforma mikročipů, která byly použita pro analýzu v naší laboratoři. Byl zjištěn nárůst úspěšnosti IVF cyklu z 33,3 % na 69 %. Námi zjištené procento úspěšnosti, které činí 67 % je zcela srovnatelné s úspěšností jiných pracovišť. Je třeba také zmínit, že přínos preimplantačních celogenomových analýz nespočívá jen ve zvýšení úspěšnosti IVF cyklu a také ve snížení počtu spontánních potratů a snížení počtu dětí narozených s chromozomální aberací po IVF. 87

89 Výskyt chromozomálních aberací se zvyšuje s věkem ženy. Toto zjištění vedlo k potřebě prozkoumat příčiny a nalézt způsob jak vliv věku ženy na možnost otěhotnění eliminovat. Mnoho vědců se zabývalo problémem, ve které fázi vývoje gamet a zygot ke vzniku aberací dochází. Bylo zjištěno, že abnormality mohou vznikat v meióze I, v meióze II a také v mitóze (Hassold and Hunt, 2001; Fragouli and Wells, 2011). Další otázkou je, proč tyto změny vznikají více u žen vyššího věku ( 35). Touto problematikou se zabýval Battaglia (1996). Studoval oocyty žen z přirozeného menstruačního cyklu. Vytvořeny byly dvě skupiny žen, ženy mladší (20-25 let) a starší (40-45 let). Pomocí mikroskopu s vysokým rozlišením byly sledovány různé fáze meiózy a také detailně prostudováno chování mitotického vřeténka. Bylo zjištěno, že mitotické vřeténko u starších žen vykazuje v 79 % abnormality tzn. abnormální rozmístění tubulinu a nepravidelné rozmístění chromozomů během druhého meiotického dělení. U mladších žen se tyto abnormality vyskytovaly pouze v 17 %. Studie prokázala, že dysfunkční mitotické vřeténko je příčinou chromozomálních aberací u starších žen (Battaglia et al., 1996). Chromozomové aberace jsou ve vetšině případů maternálního původu. Vznikají v obou meiotických děleních. Klasické nondisjunkce v meióze tvoří pouze 3 % aberací, hlavní příčinou většiny genetických abnormalit je předčasné oddělení sesterských chromatid. Vznik trizomií je spojován s redukcí počtu crossingoverů v anafázi I, např. trizomie chromozomu 16, která reprezentuje nejčastější aberaci v embryích žen stařších 35 let, je spojována s absencí crossingoverů v koncových částech obou ramen chromozomu. V mitóze je mechanizmem vzniku aneuploidií také nesprávném oddělení chromatid. Bylo také prokázáno, že hladina kohezinu, jehož úkolem je spojení a následně separace sesterských chromatid v meióze I, klesá s věkem ženy. S věkem ženy také klesá množství proteinu Rec8, který je důležitý při rekombinaci mezi nesesterskými chromatidami (Handyside, 2012). Při studiích na embryonálních kmenových buňkách byla vyslovena hypotéza, že vysoké procento proteinových faktorů potřebných pro mitózu a buněčný cyklus, které jsou v zásobě oocytu, je nezbytné pro prevenci aneuploidií a také pro rychlou aktivaci vlastního buněčného cyklu embrya (Ambartsumian and Clark, 2008). Vyšší výskyt aneuploidií v embryích stařších matek s tímto zjištěním souvisí. Oocyty starších matek jsou delší dobu vystaveny různým environmentálním vlivům jako je akumulace radioaktivního záření, rentgenového záření, různým chemickým agens nebo oxidativnímu stresu a vliv má také zkracování telomer (Tarin, 1996; Keefe et al., 2006). Ke vzniku aberací a tedy i mozaicismu pak může vést 88

90 snížená funkce řídících mechanismů buněčného cyklu, kdy dochází k chybám segregace chromozomů v prvním buněčném dělení (Steuerwald, 2005). V jiné studii bylo na aneuploidie ve vyšším veku ženy pohlíženo z hlediska hormonální stimulace. Ženy s nižší hladinou antimülleriánského hormonu (AMH), jehož hladina v krvi je spjata s ovariální rezervou ženy, byly stimulovány v rámci IVF vyššími dávkami hormonu FSH. Procento aneuploidí bylo 66 % a jedna ze tří žen neměla žádné embryo bez aberace. Souvislost vysokého procenta aneuploidií a vyšší dávky FSH při stimulaci však nebyla prokázána. Pravděpodobnost otěhotnění, po vyloučení embryí s aberací, nebyla nižší než u mladších žen (Katz-Jaffe et al., 2013). Další studii na zvyšující se výskyt aberací s věkem ženy provedl Harton (2013). V první skupině zájmu byly ženy do 35 let a nález aberací ve skupině byl 30 %, oproti této skupině byla vyšetřována embrya žen starších a to do 42 let a nález aberací byl 87 %. Po transferu embryí bez genetické abnormality byl rozdíl mezi úspěšností IVF cyklu zanedbatelný. U mladších žen činil 51,1 % a u žen starších 47,2 % (Harton et al., 2013). Vyšetřením buněk trofektodermu pomocí acgh žen starších 35 let bylo nalezeno 51,3 % buněk s aneuploidiemi. Po vyřazení těchto embryí z transferu a transferováním embryí bez genetické aberace bylo dosaženo gravidity ve smyslu prokázaných srdečních ozev v 68,9 % (Schoolcraft et al., 2009). Cílem druhé části studie rigorózní práce bylo porovnání nálezu aberací ve skupinách žen rozdělených dle věku a vyhodnocení úspěšnosti IVF cyklu. Do studie bylo zařazeno 659 embryí od 352 pacientek, skupinu A) tvořilo 517 embryí od 210 pacientek a skupinu B) 293 embryí od 301 pacientek. Ve skupině A) bylo nalezeno 348 (69 %) embryí bez aberace a 157 (31 %) embryí s aberací. Ve skupině B) bylo nalezeno 149 (55 %) embryí bez aberace a 124 (45 %) embryí s aberací. Jako kontrolní skupina byly použity IVF cykly s transferem embrya bez PGS od 247 pacientek, které byly rozděleny opět dle věku. Úspěšnost IVF cyklu u pacientek mladších 35 let bez vyšetření embryí pomocí acgh 59 %, s vyšetřením embryí pak 66 %. U pacientek starších jak 35 let pak úspěšnost IVF cyklu bez vyšetření embryí metodou acgh činí 26 % a s vyšetřením embryí rapidně stoupá na 66 %. Výsledky studií zabývající se souvislostí věku ženy a počtu chromozomových abnormalit ukazují, že aberace se vyskytují u žen mladších 35 let ve 30 % a u žen nad 35 let věku v rozmezí %. Po vyloučení embryí s chromozomální aberací se úspěšnost IVF cyklu pohybuje mezi 47,2-68,9 % a není rozdílná od úspěšnosti IVF cyklu u žen mladších 35 let, která činí 65 % (Schoolcraft et al., 2009; Harton et al., 2013; Katz-Jaffe et al., 2013). 89

91 Dosažené výsledky předkládané studie, kdy bylo nalezeno ve skupině žen mladších 35 let 31 % embryí s aberací, ve skupině žen nad 35 let věku pak 45 % embryí s aberací a úspěšnost IVF cyklu po PGS byla u obou skupin 66 %, jsou zcela srovnatelné s nálezy uváděnými v literatuře (Schoolcraft et al., 2009; Harton et al., 2013; Katz-Jaffe et al., 2013). Z výsledků je patrné, že pro ženy nad 35 let věku je vyšetření embryí zcela zásádní pro dosažení těhotenství. Díky metodě acgh je zcela eliminován vliv věku ženy na úspěšnost IVF cyklu a pravděpodobnost otěhotnění je srovnatelná s ženami mladšími. Posledním cílem rigorózní práce bylo vyšetřit embrya přenašečů balancované reciproké translokace v rámci PGD pomocí techniky acgh, dále zjistit procentuální zastoupení aberací spojených s translokací, aberací nesouvisejících s translokací a jejich kombinace, určit segregační mód a vyhodnotit úspěšnost IVF cyklu. Přenašeči Robertsonovských translokací nebyli v Laboratoři lékařské genetiky zatím vyšetřeni. Přenašeči balacovaných translokací (stejně tak jako přenašeči mutace spojené s monogenní chorobou) tvoří zvláštní skupinu pacientů IVF center. Jsou to jedinci, kteří nemají problém s plodností jako takovou, ale díky přenašečství chromozomální aberace je u nich početí zdravého potomka s rizikem přenosu genetické abnormality do další generace. Chromozomové aberace se vyskytují s četností 1 na 380 živě narozených dětí, reciproké translokace s četností 1 na 625 živě narozených dětí a Robertsonovské translokace s četností 1 na 1000 živě narozených dětí (Van Dyke et al., 1983). Prenašečům reciproké translokace hrozí riziko narození potomka s vývojovou vadou nebo mentální retardací či kombinace obojího. Typické jsou také spontánní potraty v raném stádiu těhotenství. Reciproké translokace vznikají vzájemnou výměnou úseku chromozomu. Tato část může a nemusí zahrnovat centromeru. Pro nebalancované reciproké translokace je typická duplikace jednoho úseku nebo delece druhého úseku chromozomu účastnícího se translokace. Reciprokých translokací se ve většině případů účastní autozomy, méně často pak gonozomy. V meióze I je tvořen kvadrivalent. Při segregaci chromozomů pak vznikají tři segregační módy: 2:2, kdy každá z dceřiných buněk obsahuje 2 chromozomy (střídavá segregace nebo segregace přilehlých chromozomů typu 1 nebo nebo segregace přilehlých chromozomů typu 2); 3:1, kdy jedna dceřinná buňka obsahuje 3 chromozomy a druhá 1 (terciální trizomie nebo monozomie) a 4:0, kdy jedna z dceřiných buněk obsahuje 4 chromozomy a druhá žádný (dvojtá trizomie/monozomie; v lidské populaci pouze teoretická). V potomstvu se pak nebalancované formy objevují s rozdílnou četností: 71 % segregace přilehlých chromozomů typu 1; 4 % 90

92 střídavá segregace typu 2; 22 % terciální trizomie/monozomie a 2,5 % vzájemná trizomie/monozomie (Gardner and Sutherland, 2004). Přenašeči Robertsonovské translokace mají pro potomstvo stejná rizika jako přenašeči reciprokých translokací, navíc však hrozí riziko uniparentální dizomie (UPD). Robertsonovské translokace vznikají fúzí dvou akrocentrických chromozomů přičemž může translokovaný chromozom obsahovat jen jednu centromeru (monocentrický) nebo centromery obou chromozomů (dicentrický). Asi 75 % všech Robertsonovských translokací tvoří translokace mezi chromozomy 13 a 14. V meióze I je tvořen trivalent, mohou být tedy tvořeny gamety s nulizomií nebo trizomií jednoho ze zúčastněných chromozomů, což je spojeno právě s rizikem UPD (Scriven et al., 2001; Gardner and Sutherland, 2004). Vyšetření embryí v rámci PGD je věnována velká pozornost. Buňky embrya je možné analyzovat pomocí FISH, BAC nebo oligo acgh. Těmito technikami lze zviditelnit nebalancovanou translokaci, ale není možné odlišit zdravé embryo od přenašeče translokace. Toto odlišení umožňuje karyomapování či SNP čipy (Handyside et al., 2010). Poměrně novou strategií je pak analýza pomocí PCR a použití 8 STR markerů, vybraných tak, aby dva byly pod zlomovým místem jednoho ze zúčastněných chromozomů a dva nad zlomovým místem. Po analýze tak lze určit haplotypy embryí a tím i rozlišit zdravého embryo od embrya s balacovanou translokací (Traversa et al., 2010). Z jiného pohledu byly hodnoceny výsledky vyšetření pacientů s různými nebalancovanými chromozomálními odchylkami, u kterých bylo provedeno vyšetření lymfocytů. Lymfocyty byly separovány na flow cytometru dle fáze buněčného cyklu, konkrétně lymfocyty v S-fázi a lymfocyty ve fázi G0/G1. Z těchto buněk bylo odebráno vždy po 10 a byla provedena celogenomová amplifikace s následnou BAC acgh. Výsledky ukázaly, že buňky v S-fázi vykazují ve výsledcích vysokou falešnou negativitu oproti buňkám ve fázi G0/G1. Vzhledem k neznalosti fáze buněčného cyklu v bioptovaných buňách embrya a nemožnosti jejícho určení, je třeba počítat s falešnou negativitou výsledku hlavně u odběru 1-2 buněk blastomery (Dimitridaou et al., 2014). Výsledkem studie, kde bylo vyšetřeno 121 embryí nositelů balancované formy translokace pomocí acgh, bylo nalezeno 48,8 % embryí s nebalancovanou translokací a embryí s nebalancovanou translokací kombinovanou s jinou aberací, 28,9 % embryí s aberací nezahrnující nebalancovanou translokaci a 22,3 % embryí bez translokace nebo s její balancovanou formou. Úspěšnost IVF cyklu po 1-2 transferech byla 21 %. (Alfarawati et al., 2011). 91

93 Také další studie ukazuje výsledky analýz pomocí acgh a úspěšnost IVF cyklu po vyšetření embryí přenašečů balancované translokace. Bylo nalezeno 60,7 % embryí zdravých nebo s balancovanou translokací. Výsledná úspěšnost IVF cyklu pak byla 63,6 % (Fiorentino et al., 2011). Colls se spolupracovníky (2012) analyzoval 402 embryí přenašečů translokací metodou FISH a následně metodou acgh. Výsledkem bylo 81 (20 %) embryí normálních nebo s balancovanou translokací, 92 (23 %) s nebalancovanou přestavbou bez jiné aberace, 123 (31 %) s nebalancovanou translokací a jinou aberací a 106 (26 %) s jinou aberací nezahrnující chromozomy účastnící se translokace (Colls et al., 2012).. Ve studii k této rigorózní práci bylo nalezeno 16 (42,2 %) embryí bez translokace nebo s její balancovanou formou, 12 (31,5 %) nebalacovaných genotypů spojených s původní translokací, 4 (10,5 %) embrya nesla nebalancovanou translokaci a další aberaci ve smyslu aneuploidie jiného chromozomu než se účastnil translokace, 6 (15,8 %) embryí s jinou aberací bez nebalancované translokace. Byl stanoven segregační mód jednotlivých aberací a jeho celkové procentuální zastoupení: střídavá segregace 16 (53 %), (zbylých 16 embryí s aberací spojenou s translokací i jinou aberací bráno jako 100 %) segregace přilehlých chromozomů typu 1 v počtu 11 (68,8 %), segregace přilehlých chromozomů typu 2 v počtu 0 (0 %), terciální monozomie/trizomie 5 (31,2 %), vzájemná tetrazomie/monozomie 0 (0 %). Z uvedeného souboru bylo prozatím transferováno 8 embryí se statutem normální nebo balancovaný typ translokace, u 4 (50 %) byly potvrzeny srdeční ozvy a 4 pacientky gravidity nedosáhly (50 %). Vzhledem k malému počtu transferovaných embryí nelze brát hodnotu procent jako statisticky významnou z důvodu malých čísel. Procento embryí s balancovanou translokací nebo bez ní se pohybuje v rozmezí 16,0-22,3 % (Alfarawati et al., 2011; Fiorentino et al., 2011; Colls et al., 2012). V předkládané studii tvoří procento embryí s balancovanou formou translokace nebo embryí bez translokace 42,2 %, což je vyšší než ve výsledcích vědeckých studií (viz výše), lze to přičíst malé velikosti souboru. Zastoupení jednotlivých skupin embryí s aberací bylo v uvedných vědeckých pracích následující: nebalancované translokace buď samotné nebo spojené s jinou aberací se vyskytovaly ve 48,8-56,7 %, jiné aberace bez chromozomů účastnících se translokace ve 26,0-28,9 % (Alfarawati et al., 2011; Fiorentino et al., 2011; Colls et al., 2012). Závěry dílčího úkolu rigorózné práce jsou: 42 % embryí s nebalancovanou translokací samotnou či 92

94 kombinovanou s jinou aberací a 15,8 % embryí s jinou aberací bez chromozomů účastnících se translokace. Tyto hodnoty jsou srovnatelné s hodnotami ze studií uvedených výše. Gardner a Sutherland (2004) uvádí, že segregační módy nebalancovaných forem se vyskytují s četností: 71 % segregace přilehlých chromozomů typu 1; 4 % segregace přilehlých chromozomů typu 2; 22 % terciální trizomie/monozomie a 2,5 % vzájemná trizomie/monozomie (Gardner and Sutherland, 2004). Výsledky z rigorózní práce prokázaly poměr segregací takto: 68,8 % segregace přilehlých chromozomů typu 1; 0 % segregace přilehlých chromozomů typu 2; 31,2 % terciální trizomie/monozomie a 0 % vzájemná trizomie/monozomie. Je zřejmé, že poměr jednotlivých možných segregací získaný v předložené práci je téměř shodný s literaturou. Úspěšnost IVF cyklu 63,6 % ve smyslu potvrzeného těhotenství ve své práci uvádí Fiorentino (Fiorentino et al., 2011). Ze souboru k rigorozní práci bylo zatím transferováno 8 embryí a potvrzena 4 (50 %) těhotenství, což zhruba odpovídá úspěšnosti ze souboru Fiorentina. Vzhledem k počtu transferovaných embryí je však nutné pamatovat na problém tzv. malých čísel. V každém případě lze vyhodnotit, že bylo vyloučeno 23 embryí nesoucích některou s uvedených aberací a bylo tak zabráněno stejnému počtu spontánních potratů. Celkově jsou předkládané výsledky zcela srovnatelné se závěry citovaných autorů. Celogenomová analýza technikou acgh i přes nemožnost rozlišení balancované formy translokace od formy bez translokace představuje pro nositele balancované translokace velký přínos hlavně ve snížení počtu spontánních potratů. Vzhledem k jejich vysokému počtu a s nimi spojeného velkého psychického vypětí, se kterými se žena musí potýkat, je IVF a celogenomová analýza embryí pomocí acgh nejlepší možnou volbou pro dosažení těhotenství v co nejkratší době. 93

95 8. SHRNUTÍ V rámci procesu asistované reprodukce je dnes využíváno několik molekulárně cytogenetických a molekulárně biologických metod. Jejich význam spočívá v možnosti výběru embrya bez genetické abnormality a zvýšení pravděpodobnosti otěhotnění ženy. Tento výběr umožnují přístupy preimplantačního genetického screenigu (PGS) a preimplantační genetické diagnostiky (PGD). Zatímco PGS je zaměřen na vyhledávání jakékoliv nově vzniklé změny v počtu kopií v genomu, PGD vyhledává konkrétní změny, děděné od rodičů. U obou těchto přístupů hraje zcela zásadní roli technika array komparativní genomové hybridizace (acgh) jako představitelka jedné z metod celogenomých analýz. Tato rigorózní práce je zaměřena na provedení celogenomové analýzy v buňkách trofektodermu pomocí techniky acgh pro zmapování výskytu chromozomálních aberací v embryích celkově, dále na zjištění podílu jednotlivých chromozomů na vzniku aberací a také vliv zvyšujícího se počtu aberací s věkem ženy na IVF cyklus. V rámci PGD pak na analýzu embryí přenašečů reciprokých translokací, rozpoznání segregačního módu a vyhodnocení úspěšnosti IVF cyklu. Výsledkem práce je celogenomová analýza souboru embryí, procentuální vyhodnocení výsledků a zhodnocení významu techniky acgh pro PGS a PGD. V souboru pro PGS bylo analyzováno celkem 857 embryí od 525 pacientek. Z celkového počtu 857 embryí byl získán výsledek u 798 z toho bylo 517 (65 %) vhodných k embryotransferu tj. bez nálezu chromozomální aberace a 281 (35 %). Z celkového počtu 366 aberací bylo 165 (45 %) se ziskem celých chromozomů, 21 (6 %) se ziskem části chromozomů, 101 (28 %) se ztrátou celých chromozomů a 55 (15 %) se ztrátou části chromozomů. Započítány byly zisky a ztráty 1-2 chromozomů v jednom embryu. Případy 3 a více změn byly nalezeny ve 24 (7 %) embryích. Zisky chromozomů celkem byly nalezeny ve 186 (51 %) embryích a ztráty ve 156 (42 %). Nejčastěji (v počtu 10 a více) se trizomie vyskytovaly u chromozomů 6, 15, 16, 19, 21 a 22; monozomie pak u chromozomů 16, 21, 22 a X; komplexní aneuploidie byly nalezeny u 24 embryí. Parciální změny (v počtu 4 a více) byly nalezeny ve smyslu zisků (duplikace) genetického materiálu u chromozomu 9 a ztrát genetického materiálu (delece) pak u chromozomů 1, 2, 5, 6, 7, 11, 12, 13. Celkově činil podíl parciálních změn 21 %. Žádné parciální změny nebyly nalezeny u chromozomů 3, 17, 18, 22 a Y. U posledně jmenovaných chromozomů se jednalo vždy o monozomii nebo trizomii celého chromozomu. Nejvyšší podíl 94

96 změn v genomu celkově se týkal chromozomů 16, 21, 22. Z výsledků vyplývá, že zisky chromozomů jsou častější než jejich ztráty. Byla vypočítána úspěšnost IVF cyklu u pacientek, které neměly vyšetřená embrya pomocí acgh v rámci PGS, ta činila v případě biochemické gravidity 55 % a srdeční ozvy pak byly patrné ve 43 %. Naproti tomu u pacientek s vyšetřenými embryi byla biochemická gravidita nalezena u 69 % pacientek a srdeční ozvy potvrzeny u 67 % pacientek. V porovnání úspěšnosti IVF cyklů bez vyšetření pomocí acgh a s vyšetřením embryí pomocí acgh byl prokázán nárůst potvrzení srdečních ozev v téměř 70 %, což ukazuje na velmi vysokou úspěšnost a nárůst počtu těhotenství o 24 %. Do studie pro zjištění vlivu věku ženy na počet aberací bylo zařazeno 659 embryí od 352 pacientek, skupinu A) tvořilo 517 embryí od 210 pacientek a skupinu B) 293 embryí od 301 pacientek. Ve skupině A) bylo nalezeno 348 (69 %) embryí bez aberace a 157 (31 %) embryí s aberací, u 12 (2 %) embryí z celkového počtu 517 nebylo dosaženo výsledku analýzy. Ve skupině B) bylo nalezeno 149 (55 %) embryí bez aberace a 124 (45 %) embryí s aberací. Jako kontrolní skupina byly použity IVF cykly s transferem embrya bez PGS od 247 pacientek, které byly rozděleny opět dle věku. Úspěšnost IVF cyklu u pacientek mladších 35 let bez vyšetření embryí pomocí acgh byla 59 %, s vyšetřením embryí pak 66 %. U pacientek starších jak 35 let činí úspěšnost IVF cyklu bez vyšetření embryí metodou acgh 26 % a s vyšetřením embryí rapidně stoupá na 66 %. V rámci PGD u skupiny jedinců, kteří jsou nositeli reciproké balancované translokace, bylo vyšetřeno 39 embryí od 12 pacientek, u jednoho embrya pak nebylo dosaženo výsledku. Z celkového počtu 38 vyšetřených bylo nalezeno 16 (42,2 %) embryí bez translokace nebo s její balancovanou formou, 12 (31,5 %) nebalcovaných genotypů spojených s původní translokací, 4 (10,5 %) embrya nesla nebalancovanou translokaci a další aberaci ve smyslu aneuploidie jiného chromozomu než se účastnil translokace, 6 (15,8 %) embryí s jinou aberací bez nebalancované translokace. Byl stanoven segregační mód jednotlivých aberací a jeho celkové procentuální zastoupení: střídavá segregace v poču 16 (53 %), (16 embryí s aberací spojenou s translokací i jinou aberací bráno jako 100 %) segregace přilehlých chromozomů typu 1 v počtu 11 (68,8 %), segregace přilehlých chromozomů typu 2 v počtu 0 (0 %), terciální trizomie/monozomie 5 (31,2 %), vzájemná trizomie/monozomie 0 (0 %). Z uvedeného souboru bylo prozatím transferováno 8 embryí se statutem normální nebo balancovaný typ translokace, u 4 (50 %) byly potvrzeny srdeční ozvy a 4 pacientky gravidity 95

97 nedosáhly (50 %). Bylo vyloučeno 24 embryí nesoucích některou s uvedených aberací a bylo tak zabráněno stejnému počtu spontánních potratů. Tato práce prokázala význam celogenomových analýz v PGS a PGD. Technika acgh umožňuje vyšetření celého genomu s ohledem na početní i nebalancované strukturní aberace. Pro co nejvyšší úspěšnost IVF cyklu ve smyslu dosažení těhotenství je tedy možné stanovit strategii, která spočívá v odběru buněk z blastocysty, vitrifikaci embrya, celogenomové analýze buněk trofektodermu pomocí acgh a transferu jednoho embrya bez chromozomové aberace v některém z dalších přirozených cyklů ženy bez ohledu na její věk. Tato strategie je dnes celosvětově uznávána a doporučena ESHRE a ASRM. Vzhledem k častému výskytu mozaiek v embryích a vyšetření embryí v jejich raném stádiu vývoje, kdy ještě nelze odhadnout, jak se bude embryo vyvíjet dále, je bezesporu velmi důležité, přistupovat k případnému těhotenství velmi zodpovědně a pokračovat v jeho sledování v rámci prenatální diagnostiky v gynekologických ambulancích. Jinak řečeno, na výsledky PGS a PGD nelze pohlížet jako na záruku narození zdravého potomka, ale hlavně jako na metody sloužící k vyřazení embrya s odhalenou genetickou abnormalitou z IVF cyklu. 96

98 9. SUMMARY In the process of assisted reproduction several cytogenetic and molecular method are used nowadays. Their benefit lays in the possibility of selection of the embryo without genetic abnormality as well as in the increasing probability of pregnancy of the woman. This selection is enabled with approaches such as preimplantation genetic screening (PGS) and preimplantation genetic diagnosis (PGD). While PGS is based on searching of any change of copy number in the genome, PGD is focused on specific changes inherited from parents. The array comparative genomic hybridization method (acgh) plays crucial role in both approaches. This thesis is focused on performing PGS in cells of trophectoderm using acgh method to map the incidence of chromosomal aberrations in embryos as well as on ascertaining of the ratio of particular chromosomes on the aberration origin. The thesis is focused also on the impact of the increasing aberrations number in correlation of the age of the women and its elimination in the effort to become pregnant on older women. And, in the scope of PGD, the thesis is focused on analysis of embryos of reciprocal translocation conductors, on the recognition of segregation mode and on evaluation of the success of IVF cycle. The result of the thesis is the analysis of embryo pool and the evaluation of the importance of acgh technique for PGS and PGD. In the pool, 857 embryos from 525 patients were analysed. The result was obtained in 798 cases from which 517 (65%) was suitable for embryo transfer, it means without chromosomal aberration and 281 (35%) with chromosomal aberration. In 366 aberrations were found 165 (45 %) with gain of whole chromosome, 21 (6 %) with gain of partial change, 101 (28 %) with loss of whole chromosome a 55 (15 %) with loss of partial change. In 24 (7 %) embryos were found complex aneuplidies (3 and more). The gains were found in 186 (51 %) embryos and losses were found in 156 (42 %) embryos. Trisomies were found in chromosomes 6, 15, 16, 19, 21 a 22 the most frequently; monosomies in chromosomes 16, 21, 22 a X; complex aneuploidy were foun in 24 embryos. The segmental gain was found in chromosome 9 the most frequently and segmental losses were foud in chromosomes 1, 2, 5, 6, 7, 11, 12, 13. A share of partial changes was 21 % in the overall. Any partial changes were found in chromosomes 3, 17, 18, 22 a Y. The biggest ratio of chromosomal changes involves chromosomes 16, 21 and 22 (without complex aneuploidies). 97

99 The result of the study implies that gains of chromosomes are more often than losses. In the pool of patients with embryos without acgh method testing, the successfulness was count at 55% (biochemical gravidity) and 43% (fetal heart sounds). On the other hand, in the pool of patients with tested embryos, biochemical gravidity was found in 69% and fetal heart sounds was detected in 67%. In the comparison of the successfulness of IVF cycles without acgh and with acgh the 70% increase of fetal heart sounds detection was proved, that signifies very high successfulness and the increase of the number of gravities of 24%. The number of 659 embryos from 352 patients was included into the study of ascertaining the influence of advanced maternal age to the aberration number. Group A) included 517 embryos from 210 patients and group B) included 293 embryos from 301 patients. In the group A) there was found 348 (69 %) embryos without aberration and 157 (31 %) with aberration, 12 (2 %) was unable to analyse. In the group B) there was found 149 (55 %) embryos without aberration and 124 (45 %) embryos with aberration. IVF cycles with embryo transfer without PGS from 247 patients were used as a control group. The successfulness of IVF cycle was 59 % according patients younger than 35 years without using acgh and 66 % when acgh was used. According patients older than 35 years, the successfulness of IVF cycle was only 26 % without using acgh but increases rapidly with the acgh analysis to 66%. Within the scope of PGD 39 embryos from 12 patients (one embryo without result) was examined in the group of reciprocal or Roberstsonial balanced translocation carriers. In the number of 38 examined embryos there were found 16 (42, 2 %) embryos without translocation or with its balanced form, 12 (31, 5 %) unbalanced genotypes connected with original translocation, 4 (10, 5 %) embryos carrying unbalanced translocation and other aberration such as aneuploidy including chromosome not concerned the translocation, 6 (15,8 %) embryos with different aberration than unbalanced translocation. segregační mód and its percentage was established for particular aberration: alternate in 16 (53 %) of embryos, (16 embryos to carry abnormalities with the rearangement, either alone or in combination with other chromosomal abnormalities count as 100 %) adjacent - 1 in 11 (68,8 %)of embryos, adjacent - 2 in 0 (0 %) of embryos, tertiary trizomy/monozomy in 5 (31,2 %) of embryos, interchange trizomy/monozomy in 0 (0 %)of embryos. From this pool 8 embryos was transfect yet with normal status or balanced translocation. In 4 (50%) cases fetal heart sounds were confirmed and 4 (50%) did not reach the gravidity. 98

100 This study proved the importance of whole genome analysis in PGS and PGD. The acgh technique enables the examination of whole genome considering number and unbalanced structural aberrations. It is possible to designate the strategy how to reach the highest successfulness of IVF cycle (pregnancy). This strategy consists of blastocysts biopsy, vitrification of embryos, the whole genome amplification of cells of trophectoderm with used acgh and single embryo transfer of embryo without chromosomal aberration in some of another natural cycle of women without concerning her age. This strategy is nowadays accepted worldwide and recommended by ESHRE and ASRM organizations. Despite of all diagnostics responsible approach to the pregnancy is very important in the context of prenatal diagnostics in gynaecological ambulances because the mosaicism often occurs in embryos. Another pitfall is the fact that early stages of embryo do not enable to predict how the embryo would develop later. In other words, to the results of PGS and PGD could not rely as on prove of the birth of healthy descendent but mostly as methods serving to exclude embryos with genetic abnormalities from the IVF cycle. 99

101 10. LITERATURA AbdelHafez, F.F., Desai, N., Abou-Setta, A.M., Falcone, T., Goldfarb, J. (2010) Slow freezing, vitrification and ultra rapid freezing of human embryos: a systematic rewiev and meta analysis. Reproductive BioMedicine Online Vol 20, Issue 2: Alfarawati, S., Fragouli, E., Colls, P., and Wells, D. (2011). First births after preimplanation genetic diagnosis of structural chromosome abnormalities using comparative genomic hybridization and microarray analysis. Hum Reprod 26(6): Ambartsumyan, G. and Clark, T.C. (2008) Aneuploidy and early human embryo development. Hum Mol Genet 17(1): Arneson, N., Hughes, S., Houlston, R. and Done, S. (2007). Whole-Genome Amplification by Improved Primer Extension Preamplification PCR (I-PEP PCR). Chapter 18, in PCR (eds. Hughes and Moody). Scion Publishing Ltd., Oxfordshire, UK, Baart, E.B., Van den Berg, I., Martini, E., Eussen, H.J., Fauser, B.C.J.M. and Van Obstal, D. (2006). FISH analysis of 15 chromosomes in human day 4 and 5 preimplantation embryos: the added value of extended aneuploidy detection. Prenatal Diagnosis 27(1): Bahce, M., Escudero, T., Sandalinas, M., Morrison, L., Legator, M. and Munné, S. (2000). Improvements of preimplantation diagnosis of aneuploidy by using microwave hybridization, cell recycling and monocolour labelling of probes. Mol Hum Reprod 6(9): Barett, M.T., Scheffer, A., Ben-Dor. A., Lampas, L., Lipson, D., Kincaid, R., Tang, P., Curry, B., Baier, K., Meltzer, P.S., Yakhini, Z., Bruhn, L. and Laderman, S. (2004). Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarray and total genomic DNA. PNAS. 101: Barker, D.L., Hansen, M.S.T., Fawad Faruqi, A., Giannola, D., Irsula, O.R., Lasken, R.S., Latterich, M., Makarov, V., Olophant, A., Pinter, J.H., Shen, R., Slepsova, I., Ziehler, W. and Lai, E. (2004). Two Methods of Whole-Genome Amplification Enable Accurate Genotyping Across a 2320-SNP Linkage Panel. Battaglia, D.E., Goodwin, P., Klein, N.A. and Soules, M.R. (1996). Influence of maternal age on meiotic spindle assembly in oocyte from naturally cycling women. Hum Reprod 11(10): Brown, S. (2014). After 20 years, preimplantation genetic screening is in a new technology phase. Focus on Reproduction. January 2014:

102 Campbell, A., Hickman, C.F.L., Duffy, S., Bowman, N., Gardner, K., Fishel, S. (2012) Morphokinetics of aneuploid and euploid human embryos inferred by polar body or trophectoderm biopsy. Hum Reprod 27:176. Campbell, A., Fishel, S., Bowman, N., Duffy, S., Sedler, M., Fontes Lindeman Hickman, C. (2013a). Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reproductive BioMedicine Online 26: Campbell, A., Fishel, S., Bowman, N., Duffy, S., Sedler, M., Thornton, S. (2013b). Retrospective analysis of outcomes after IVF using an aneuploidy risk model derived from time-lapse imaging withouth PGS. Reproductive BioMedicine Online 27: Carrington Coutts, M. (1988). Ethical Issues in In Vitro Fertilization. National Rference Center for Bioethic Literature, Cohen, J., Wells, D., Munné, S.(2007) Removal of 2 cells from cleavage stage embryo is likely to reduce the efficacy of chromosomal tests that are used to enhance implantation rates. Fertl Steril 87: Colls, P., Escudero, T., Fischer, J., Cekleniak, N.A., Ben-Ozer, S., Meyer, B., Damien, M., Grifo, J.A., Hershlag, A., Munne, S. (2012). Validation of array comparative genom hybridization for diagnosis of translocation in preimplantation human embryos. Reproductive Biomedicine online 24(6): Compton, D.A. (2011). Mechanism of aneuploidy. Curr Opin Cell Biol 23(1): Coutts, M.C. (2001). Ethical issue in in vitro fertilization. National Refernce Center for Bioethic Literature (NRC), Scope Note 10:1-12. Dean, F.B., Hosono, S., Fang, L., Wu, X., Faruqi, A.F., Bray-Ward, P., Sun, Z., Zong, Q., Du, Y., Du, j., Driscoll, M., Song, W., Kingsmore, S.F., Egholm, M. and Lasken, R.S. (2002). Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. PNAS 99(6): Dietmaier, W., Hartmann, A., Wallinger, S., Heinmöler, E., Kerner, T., Endl, E., Jaucht, K- W., Hofstäter, F., Rüschoff, J. (1999). Multiple Mutation Analyses in Single Tumor Cells with Improved Whole Genome Amplification. AJP 154(1): Dimitriadou, E., Van der Aa, N., Cheng, J., Voet, T. and Vermeesch, J. (2014). Single cell segmental aneuploidy detection is compromised by S phase. Molecular Cytogenetics 7:

103 Fragouli, E., Lenzi, M., Ross, R., Katz-Jaffe, M., Schoolcraft, W.B., Wells, D. (2008). Comprehensive molecular cytogenetic analysis of the human blastocyst stage. Hum Reprod 23(11): Fragouli, E., Alfarawati, S., Daphnis, D.D., Goodall, N-N., Mania, A. et al. (2011). Cytogenetics analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and acgh: scientific data and technical evaluation. Hum Reprod 26(2): Fragouli, E and Wells, D. (2011). Aneuploidy in the human Blastocyst. Cytogenet Genome Res, Published online DOI: / Fragoulli, E., Alfarawati, S., Spath, K., Wells, D. (2014). Morfological and cytogenetics assessment of cleavage and blastocyst stage embryos. Mol Hum Reprod 20(2): Gardner, R.J.M. and Sutherland, G.R. (2004). Chromosome abnormalities and Genetic Counselling, 3th edn. Oxford, UK: Oxford University Press. Geigl, J.B., Obenauf, A.C., Waldispuehl-Geigl., J., Hoffman, E.M., Auer, M., Hörmann, M., Fischer, M., Trajanoski, Z., Schenk, M.A., Baumbusch, L.O. and Speicher, M.R. (2009). Identification of small gains and losses in single cells after whole genome amplification on tiling oligo arrays. Nucleid Acids Res 37(15):e105. Gianaroli, L., Racowski, C., Geraedts, J., Cedars, M., Makrigiannakis, A., Lobo, R.A. (2012). Best Practise of ASRM and ESHRE: a journey through reproductive medicine. Fertil Steril 98(6): Gutiérrez-Mateo, C., Colls, P., Sánchez-García, J., Escudero, T., Prates, R. et al. (2011). Validation of microarray comparative genomic hybridization for comprehensive chromosome analysis of embryos. Fertil Steril 95(3): Haddad, G., He, W., Gill, J., Witz, C., Wang, C., Kaskar, K. and Wang, W. (2013). Mosaic pregnancy after transfer of euploid blastocyst screened by DNA microarray. Journal of Ovarian Research 6:70. Handyside, A.H., Harton, G.L., Mariani, B., Thornhill, A.R., Affara, N.A., Shaw, M-A. and Groffin, D.K. (2010). Karyomapping: a Universal Method for Genome Wide Analysis of Genetic Disease based on Mapping Crossovers between Parental Haplotypes. J Med Genet 47: Handyside, A.H. (2012). Molecular origin of female meiotic aneuploidies. This article is part of a Special Issue entitled: Molecular Genetics of Human Reproductive Failure. Biochimica et Biophhysica Acta 1822:

104 Handyside, A.H. (2013). 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertil Steril 100(3): Harton, G.L., Harper, J.C., Coonen, E., Pehlivan, T., Vesela, K. and Wilton, L. (2011). Hum Reprod Vol. 26, 1: Harton, G.L., Munne, S., Surrey, M., Grifo, J., Kaplan, B., McCulloh, D.H., Griffin, D.K., Wells, D. (2013). Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization. Fertl Steril 100(6): Hassold., T., Hall, H. and Hunt, P. (2007). The origin of huma aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum Mol Genet 16(2): Hiltrud, M., Hajo, Z. and Blettner, M. (2010). Decreasing sperm quality: a global problem?. BMC Public Health 10:24. Holub, G. (2011). Some Ethical Reflections on In Vitro Fertilization. Intus-Legere Filosofia 5(1) 1: Huang, A., Adusumalli, J., Patel, S., Liem, J., Williams, J., Pisarska MD (2009). Prevalence of chromosomal mosaicism in pregnancies from couple with infertility. Fertil Steril 91: Christopikou, D., Tsorva, E., Economou, K., Shelley, P., Davies, S. et al. (2013). Polar body analysis by array comparative genomic hybridization accuratelly predicts aneuploidies of maternal meiotic origin in cleavage stage embryos of women of advanced maternal age. Hum Reprod 28(5): Chung, M.K., Jeong, H.J., Lee, J.H., Park, S-J., Chung, H-D. and Kang, H-Y. (2013). Comprehensive chromosome analysis of blastocyst before implanation using array CGH. Molecular Cytogenetics 6:22 Iafrate, A.J., Feuk, L., Rivera, M.N. et al. (2004). Detection of large-scale variation in the human genom. Nat Genet 36: Jarošová, M., Pospíšilová, H., Plachý, R a kol. (2006). Princip a význam metody array CGH a hemato-onkologii. Cas Lek Ces 145:9-13. Jørgensen, N., Joensen, Nordstöm Joensen, U., Kold Joensen, T., Blomberg Jensen, M., Almstrup, K., Ahlmann Olesen, I., Juul, A., Andersson, A-M., Carlsen, E., Holm Petersen, J., Toppari, J., Skakkebaek, N.S. (2012). Human semen quality in the new millenium: prospective cross-sectional population-based study of 4867 men. BMJ Open 2:e

105 Kallioniemi, A., Kallioniemi, O.P., Sudar, D., Rutovitz, D., Gray, J.W., Waldman, F., Pinkel, D. (1992). Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science 258(5083): Katz-Jaffe, M.G., Surrey, E.S., Minjarez, D.A., Gustofson, R.L., Stevens, J.M., Schoolkraft, W.B. (2013) Association of Abnormal Ovarian Reserve Parameters With a Higher Incident of Aneuploid Blastocysts. Obstet Gynecol 121: Kokkali, G., Traeger-Synodinos, T., Vrettou, C., Stavrou, D., Jones, G.M., Cram, D.S., Makrakis, E., Trounson, A.O., Kanavakis, E. and Pantos, K. (2007). Blastocyst biopsy versus cleavage stage biopsy and blastocyst transfer for preimplantation genetic diagnosis of b- thalassaemia: a pilot study. Hum Reprod 22(5): Lamb, J.D., Shen, S., McCulloch, Ch., Jalalian, L., Cedars, M.I., and Rosen, M.P. (2011). Follicle-stimulating hormone administred at the time of human chorionic gonadotropin trigger improves oocyte developmental competence in in vitro fertilization cycles: a randomized, double blind, placebo-controlled trial. Fertil Steril 95(5): Langmore, J.P. (2002).Rubicon Genomics, Inc. Pharmacogenomic 3(4): Liu, J., Wang, W., Sun, X., Liu, L., Jin, H., Li, M., Witz, C., Williams, D., Griffith, J., Skorupski, J., Haddad, G. and Gill, J. (2012). DNA Microarray Reveals That High Proportions of Human Blastocysts from Women of Advanced Meternal Age Are Aneuploid an Mosaic. Biology of Reproduction 87(6):148, 1-9. Loutradi, K.E., Kolbianakis, E.M., Venetis, Ch.A., Papanikolaou E.G., Pados, G., Bontis, I., Tarlatzis, B.C. (2008). Cryopreservation of human embryos by vitrification or slow freezing: a systematic rewiev and meta-analysis. Fertility and Sterility 90(1): Macaulay, I.C. and Voet, T. (2014). Single Cell Genomic: Advance and Future Perspectives. PLOS Genetics 10(1):e Menasha, J., Levy, B., Hirschhorn, K., Kardon, N.B. (2005). Incidence and spectrum of chromosome abnormalities in spontaneous abortions: New insights from a 12-year study. Genet Med 7(4): Merzenich, H., Zeeb, H. and Blettner, M. (2010). Decreasing sperm quality: a global problem? BMC Public Health 10:24. McArthur, S.J., Leigh, D., Marshall, J.T., de Boer, K.A., Jansen, R.P. (2005). Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertil Steril 84(6):

106 Munné, S., Lee, A., Rosenwaks, Z., Grifo, J., Cohen, J. (1993). Diagnosis of major chromosome aneuploidies in human preimplantation embryos. Hum Reprod 8: Munné, S., Sandalinas, M., Escudero, T., Fung, J., Gianaroli, L., Cohen, J. (2000). Outcome of preimplantation genetic diagnosis of translocations. Fertil Steril 73: Nowak, D., Hofmann, W-K., Koeffler, F. (2009). Genome-Wide Mapping of Copy Number Variations Using SNP Arrays. Transfus Med Hemother 36: Pallini, S., Galluzzi, L., De Stefani, S., Bianchi, M., Wells, D. et al. (2013). Genomic dna in human blastocoele fluid. Reprod Biomed Online 26(6): Pardue, M.L. and Gall, J. (1969). Molecular hybridization of radioactive dna to the DNA of cytological preparations. Proc Natl Acad Sci USA 64(2): Pease, A.C., Solas, D., Sullivan, E.J. (1994). Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis.pnas 91: Pennings, G., Schots, S. and Liebaers, I. (2002). Ethical considerations on preimplantation genetic diagnosis for HLA typing to match a future child as a donor of haematopietic stem cells to a sibling. Hum Reprod 17: Rabinowitz, M., Ryan, A., Gemelos, G., Hill, M., Baner, J., Cinnioglu, C., Banjevic, M., Potter, D.A. and Demko, Z. (2012). Origin and rates of aneuploidy in human blastomeres. Fertil Steril 97(2): Robberecht, C., Vanneste, E., Pexsters, A., D Hododge, T., Voet, T. and Vermeesch, J. R. (2010). Somatic Genomic Variations in Early Human Prenatal Development. Current Genomics 11: Robertson, J.A. (2001). Preconception gender selection. Am. J. Bioethics 1:2-9. Robertson, J.A. (2002). Sex selection for gender variety by preimplantation genetic diagnosis. Fertil Steril 78:463. Rubio, C., Rodrigo, L., Mir, P., Mateu, E., Peinado, V. et al. (2013). Use of array comparative genomic hybridization (array-cgh) for embryo assessment clinical result. Fertil Steril 99(4): Rumpík, D., Rumpíková, T., Pilka, L., Pilka, R., Ventruba, P. (2013). Surogátní mateřství naše praktické zkušenosti. VITA NOVA, 3. ročník medzinárodnej vzdelávacej akcie, Sborník abstrakt. Str

107 Scriven, P.N., Handyside, A.H. and Mackie Ogilvie, C. (1998). Chromosome translocations: segregation modes and strategies for preimplantation genetic diagnosis. Prenatal Diagnosis 18(13): Scriven, P.N., Flinter, F.A., Braude, P.R. and Mackie Oglivie, C. (2001) Robertsonian translocation - reproductive risks and indications for preimplantation genetic diagnosis. Hum Reprod 16(11): Scriven, P.N., O Mahony, F., Bickerstaff, H., Yeong, C-T., Braude, P. and Mackie Ogilvie, C. (2000). Clinical pregnancy following blastomere biopsy and PGD for a reciprocal translocation carrier: analysis of meiotic outcomes and embryo quality in two IVF cycles. Prenatal Diagnosis 20(7): Sills, E.S., Yang, Z., Walsh, D.J., Salem, S.A. (2012). Comprehensive genetic assessment of the human emryo: can empiric application of microarray comparative genomic hybridization reduce multiple gestation rate by single fresh blastocyst transfer? Arch Gynecol Obsted 286(3): Shaw-Smith, C., Redon, R., Rickman, L., Rio, M., Willatt, L., Fiegler, H., Firth, H., Sanlaville, D., Winter, R., Colleaux, L., Bobrow, M., Carte, N.P. (2004). Microarray based comparative genomic hybridisation(array-cgh) detects submicroscopic chromosomal deletions and duplications in patients with learning disability/mental retardation and dysmorphic features. J Med Genet 41: Schoolcraft, W.B., Fragouli, E., Stevens, J., Munne, S., Katz-Jaffe, M.G. and Wells, D. (2009). Fertil Steril doi: /j.fertnstert Schoolcraft, W.B., Katz-Jaffe, M.G. (2013). Comprehensive chromosome screening of trophectoderm with vitrification facillitates elective single-embryo transfer for infertile women with advanced maternal age. Fertil Steril 100(3): Spits, C., Le Caignec, C., De Rycke M., Van Haute L., Van Steirteghem, A., Liabaers, I., Sermon, K. (2006). Whole-genome multiple displacement amplification from single cells. Nat Protoc 1(4): Šantavý, J., Stejskal, D., Loucký, J., Šubrt, I., Všetička, J., Gregor, V., Macek, M. jr. (2014). Indikace genetických laboratorních vyšetření lidského zárodečného genomu. Actual Gyn 6: Šmarda, J., Doškař, J., Pantůček, R., Růžičková, V., Koptíková, J. (2005) Metody molekulární biologie,vydala Masarykova univerzita v Brně, 1. vydání, 2005, Vydavatelství MU, Brno-Kraví Hora, ISBN Str. 69 a

108 Telenius, H., Carter, N.P., Bebb, C.E., Nordenskjöld, M., Ponder, B.A.J. and Tunnacliffe, A. (1992) Degerate oligonucleotide-promer PCR: General amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics 13(3): niu Traversa, M., Carey, L. and Leigh, D. (2010). A molecular strategy for routine preimplantation genetic diagnosis in both reciprocal and Robertsonian translocation carriers. Mol Hum Reprod 16(5): PCR: General amplification of target DNA by a single degenerate Valojerdi, M.R., Eftekhari-Yarzi, P., Karimian, L., Hassani, F., Movaghar, B. (2009). Vitrification versus slow freezing gives excelent survival, post warming embryo morphology and pregnancy outcomes for human cleaved embryos. J Assist Reprod Genet 26: Van Dyke, D.L., Weiss, L., Roberson, J.R., Babu V.R. (1983). The frequency and mutation rate of balanced autosomal rearrangements in man estimated from prenatal genetic studies for advanced maternal age. Am J Hum Genet 35: Van Echten-Arends, J., Mastenbroek, S., Sikkema-Raddatz, B., Korevaar, J. C., Heineman, M. J., van der Veen, F. and Repping, S. (2011). Chromosomal mosaicism in human preimplantation embryos: a systematic review. Human Reproduction Update, 17(5): Veeck, L.L., Bodine, R., Clarke, R.N., Berrios, R., Libraro, J., Moschini, R.M., Zaninovic, N., Rosenwaks, Z. (2004). Hihg pregnancy rates can be achived after freezing and thawing human blastocysts. Fertil Steril 82(5): Verlinsky, Y., Cieslak, J., Freidine, M., Ivakhnenko, V., Wolf, G., Kovalinskaya, L., White, M., Lifchez, A., Kaplan, B., Moise, J., Valle, J., Ginsberg, N., Strom, C. and Kuliev. A. (1995). Mol Hum Reprod 1(5): Verlinsky, Y., Rechitsky, S., Verlinsky, O., Masciangelo, C., Lederer, K. and Kuliev, A. (2001). Preimplantation diagnosis for Fanconi anemia combined with HLA matching. JAMA 285: Verlinsky, Y., Tur-Kaspa, I., Cieslak, J., Bernal, A., Morris, \r., Taranissi, M., Kaplan, B., Kuliev, A. (2005) Preimplantation testing for chromosomal disorders improves reproductive outcome of poor-prognosis patients. Reprod Biomed Online 11: Verpoest, W., Fauser, B.C., Papanikolaou, E., Staeseen, C., Va Landuyt, L., Donoso, P., Tournaye, H., Liebaers, I. and Devroey, P. (2008). Human Reproduction 23(10): Wang, N., Zheng, Y.-M., Li, L. and Jin, F. (2010) Preimplantation Genetic Screening: An Effective Testing for Infertile and Repeat Miscarriege Patients? Obstetrics and Gynecology International Volume 2010, Article ID , 6 pages doi: /2010/

109 Wells, D., Sherloch, J.K., Handyside, A.H., Delhanty, J.D. (1999). Detailed chromosomal and molecular genetic analysis of singlke cells by whole genome amplification and comparative genomic hybridisation. Nucleid Acids Res 27(4): Werner, M., Wilkens, L., Aubele, M., Nolte, M., Zitselsberger, H., Komminoth, P. (1997). Interphase cytogenetics in pathology: Principes, metods and applications of fluorescence in situ hybridization (FISH). Histochem Cell Biol 108: World Health Organisation reference values for human semen characteristic (2010). Hum Reprod Update 16(3): Yang, Z., Salem, S., Liu, X., Kuang, Y., Salem, R. and Liu, J. (2013). Selection of euploid blastocysts for cryopreservation with array comparative genomic hybridization (acgh) results in increased implantation rates in subsequent frozen and thawed embryo transfer cycles. Molecular Cytogenetics 6:32. Zhang, L., Cui, X., Schmitt, K., Hubert, R., Navidi, W. and Arnheim, N. (1992).Whole genome amplification from a single cell: Implications for genetic analysis. Proc Natl Acad Sci 89: Zhang, X.Y., Ata, B., Son W.-Y., Buckett, W.M., Tan S.-L., Ao, A. (2010). Chromosome abnormality rates in human embryos obtained from in-vitro maturation and IVF treatment cycles. Reproductibe Biomedicine Online 21(4):

110 11. PŘÍLOHY

111 Publikace k tématu rigorózní práce Příloha 1 Abstrakt online na European Human Genetics Conference, Miláno, An analysis of the cells of trophectoderm with the use of acgh within the scope of PGS, pregnancy rate and the effect of maternal age Iva Slamova 1, Vera Horinova 1, Katerina Okenkova 2, Katerina Texlova 1, Lucie Pracharova 2, Sona Kloudova 3, Eva Matejickova 2 and Pavel Texl 1,2,3 1 Sanatorium Helios ltd., IVF Centre, Laboratory of Medical Genetics, Brno, Czech Republic 2 Sanatorium Helios ltd., IVF Centre, Laboratory of Embryology, Brno, Czech Republic 3 Sanatorium Helios ltd., IVF Centre, Laboratory of Andrology, Brno, Czech Republic Chromosomal abnormalities are a major cause (in 70 %) of miscarriages in the early stage of pregnancy and in the failure of an embryo implantation. Many aberrations are of maternal origin. The number of aberrations increases with the age of the woman. 530 embryos were analysed from 299 patients with the use of acgh within the scope of PGS, from that 256 embryos from 158 patients with the heartbeat of fetus were used for the calculation of pregnancy rate. The results of IVF cycles of 247 patients withouth PGS was used as a control group. The group of women was further divided into the group A) women younger than 35 years and group B) women over the age of ,6 % of embryos with aberrations was found in the group A, and 48,1 % of embryos with aberrations was found in the group B. Total pregnancy rate in both groups with PGS was 63 %. The pregnancy rate was 25,8 % in the group of women older than 35 years without PGS. The percentage of pregnancy rate increased to 68 % in group B. This represents an increase of 42,2 % for IVF success in the group B. The increase of aberrations is obvious after the age of 35, here are the chromosomal aberrations a clear cause of the failure of IVF. It was confirmed that the exclusion of embryos with chromosomal aberrations can eliminate the effect of the age of woman on the success of IVF. Slamova, I., Horinova, V., Okenkova, K., Texlova, K., Pracharova, L., Kloudova, S., Matejickova, E., and Texl, P. (2014) An analysis of the cells of trophectoderm with the use of acgh within the scope of PGS, pregnancy rate and the effect of maternal age. Eur J Hum Genet 22(1): 370

112 Příloha 2 Prezentace na XVII. celostátní konferenci DNA diagnostiky, Dolní Morava, Eliminace vlivu věku ženy na úspěšnost IVF cyklu s využitím array komparativní genomové hybridizace (acgh) v rámci preimplantačního genetického screeningu (PGS) I. Slámová 1,3, K. Okénková 1, L. Prachařová 1, E. Matejičková 1, S. Kloudová 1, S. McArtur 2, P. Texl 1 1 Sanatorium Helios, Brno, Česká republika 2 Genea World Leading Fertility, Sydney, Austrálie 3 Oddělení genetiky a molekulární biologie, Ústav experimentální biologie, Přirodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, Česká republika Nejčastějších příčinou spontánních potratů v raném stádiu těhotenství či samotného neuchycení embrya v děloze jsou chromozomální aberace. Genetické abnormality mohou vznikat jak během meiózy tak po oplodnění oocytu. Pomocí molekulárně-cytogenetických technik bylo prokázáno, že mnoho aberací je maternálního původu a jejich frekvence se zvyšuje s věkem ženy. S využitím metody acgh 24sure V3 (BlueGnome an Illumina Company, Cambridge, UK) bylo analyzováno 586 embryí od 214 pacientek, vyšetřovány byly buňky trofektodermu, všechna embrya byla po biopsii vitrifikována, transfer pak proběhl v některém z dalších cyklů. Jednalo se vždy o embrya z vlastních oocytů ženy, ze studie byly vyloučeny všechny IVF cykly s použitím oocytů dárkyně. Jako kontrolní skupina byly použity IVF cykly s transferem embrya bez PGS od 247 pacientek. Dále byly rozděleny pacientky dle věku a to na ženy do 35 let (průměrný věk ve skupině byl 30 let) a ženy nad 35 let (průměrný věk ve skupině 37,3 let). Ve skupině žen do 35 let bylo nalezeno 31,2 % embryí s chromozomální aberací, ve skupině žen nad 35 let bylo nalezeno 44,4 % embryí s chromozomální aberací. Srovnáním úspěšnosti IVF cyklů mezi oběma skupinami bylo zjištěno, že ve skupině žen do 35 let je úspěšnost IVF cyklu po PGS 65,9 % a bez PGS 58,7 %. Naproti tomu ve skupině žen starších 35 let je úspěšnost IVF cyklu po PGS 65,7 % a bez PGS 25,8 %. Ve skupině žen do 35 let byl nárůst úspěšnosti IVF cyklu o 7 procentních bodů a u skupiny žen nad 35 let byl tento nárůst až o 40 procentních bodů. Stále více žen se rozhoduje pro početí dítěte ve vyšším věku než tomu bylo dříve. To je spojeno, díky většímu výskytu chromozomálních aberací, s problémy při otěhotnění. Nástrojem, který může těmto ženám ulehčit jejich snahu o potomka je jednoznačně acgh v rámci PGS. Ženy starší 35 let, kterým byla vyšetřena embrya pomocí techniky acgh měly stejnou pravděpodobnost otěhotnění jako ženy mladší 35 let. Potvrdilo se tak, že vyloučením embryí s chromozomální aberací, kterých je u žen nad 35 let více než u žen mladších, můžeme eliminovat vliv věku ženy na pravděpodobnost otěhotnění a tím i úspěšnost celého IVF cyklu. Slamova, I., Okenkova, K., Pracharova, L., Matejickova, E., Kloudova, S., McArtur, S. a Texl, P. (2013). Eliminace vlivu věku ženy na úspěšnost IVF cyklu s využitím array komparativní genomové hybridizace (acgh) v rámci preimplantačního genetického screeningu (PGS). Sborník abstrakt.

113 Příloha 3 Abstrakt a poster na European Human Genetics Conference, Paříž, Preimplantation genetic screening with used 24sure microarrays, our results and the success of in vitro fertilization cycles Iva Slamova 1,4, Vera Horinova 1, Katerina Okenkova 2, Katerina Texlova 1, Lucie Pracharova 2, Sona Kloudova 3, Eva Matejickova 2 and Pavel Texl 1,2,3 1 Sanatorium Helios ltd., IVF Centre, Laboratory of Medical Genetics, Brno, Czech Republic 2 Sanatorium Helios ltd., IVF Centre, Laboratory of Embryology, Brno, Czech Republic 3 Sanatorium Helios ltd., IVF Centre, Laboratory of Andrology, Brno, Czech Republic 4 Department of Genetics and Molecular Biology, Institute of Experimental Biology, Faculty of Science, Masaryk University, Brno, Czech Republic Chromosomal abnormalities are a major cause of the failure of embryos implantation and of miscarriages, also their number increases in oocytes with age. Preimplantation genetic screening (PGS) is a principally new approach for the prevention of genetic disorders, which allows the selection of unaffected embryos in in vitro fertilization (IVF) cycles. PGS can be applied for chromozomal abnormalities such as aneuploidies using diagnostic protocols based on the Fluorescence in situ hybridization (FISH) or Array comparative genomic hybridization (acgh). In our work we studied cells of trophectoderm in 185 embryos. We analysed DNA of cells of trophectoderm with the use of 24sure microarrays BlueGnome. We obtained DNA from the few cells by the whole genome amplification. We found 30 % of abnormal embryos in group of women younger than 35 years and 49 % of abnormal embryos in group of women older than 35 years. Then the total 36 % in all analysed embryos was abnormal. Major part of abnormalities represented partial or total gains and losses of chromosomes 1, 7, 15, 16, 18 and 21. The results of genetic analyses of embryos should serve as a supporting tool for the determination of chromosomal aberrations in embryos. Probability of pregnancy and birth of a healthy child improves the selection of embryos without aberrations. The succes rate of an IVF cycle is in our centre 68% with the use of PGS and strictly one embryo transfer. Cooperation is very important between embryology and andrology. Obtaining good-quality embryos is crucial for PGS. Slamova, I., Horinova, V., Okenkova, K., Texlova, K., Pracharova, L., Kloudova, S., Matejickova, E., and Texl, P. (2013) Preimplantation genetic screening with used 24sure microarrays, our results and the success of in vitro fertilization cycles. Eur J Hum Genet 21(2):441.

114 Fig. 1: The male embryo analysed by microarray 24sure BlueGnome with aneuploidy of chromosome X Y Errors 2 2 Totals Table 1: The frequency of chromosomal abnormalities in blastocysts analysed by microarray 24sure Bluegnome Table 2: The frequency of normal and abnormal embryos in two groupe of women Figure 3. The success rate of an IVF cycle withouth and with PGS acgh Příloha 4 Poster k abstraktu z přílohy 3 Preimplantation genetic screening with used 24sure microarrays, our results and the success of in vitro fertilization cycles Iva Slámová 1,4, Věra Hořinová 1, Kateřina Okénková 2, Lenka Raszyková 1, Kateřina Texlová 1, Lucie Prachařova 2, Soňa Kloudová 3, Eva Matejičkova 2 and Pavel Texl 1,2,3 1 Sanatorium Helios ltd., IVF Centre, Laboratory of Medical Genetics, Brno, Czech Republic 2 Sanatorium Helios ltd., IVF Centre, Laboratory of Embryology, Brno, Czech Republic 3 Sanatorium Helios ltd., IVF Centre, Laboratory of Andrology, Brno, Czech Republic 4 Department of Genetics and Molecular Biology, Institute of Experimental Biology, Faculty of Science, Masaryk University, Brno, Czech Republic Introduction Chromosomal abnormalities are the major cause of the failure of embryos implantation and of miscarriages, also their number increases in oocytes with age. Preimplantation genetic screening (PGS) is a principally new approach for the prevention of genetic disorders, which allows the selection of unaffected embryos in in vitro fertilization (IVF) cycles. PGS is recommended for patients with history of heritable genetic disease, unexplained recurrent pregnancy loss or several failed IVF cycles, and for women of advanced maternal age. PGS can be applied for chromozomal abnormalities (Fig. 1) such as aneuploidies using diagnostic protocols based on the Fluorescence in situ hybridization (FISH) or Array comparativegenomic hybridization (acgh). Material and Methods DNA: Whole genome amplification (WGA) of cells of trophectoderm, SurePlex DNA Amplification Systém, BlueGnome in Illumina company, Cambridge, United Kingdom Microarrays: 24sure V3 Pack, Fluorescent Labelling Systém, COT Human DNA, BlueGnome, Software BlueFuse Multi v3.1 and v3.2, BlueGnome in Illumina company, Cambridge, United Kingdom Aims and Results In our work we studied cells of trophectoderm in 307 embryos. We analysed DNA of cells of trophectoderm with used of 24sure microarrays BlueGnome. We obtained DNA from a few cells of blastocystes by the whole genome amplification. We found 32 % of abnormal embryos in group of women younger than 35 years and 51 % of abnormal embryos in group of women older than 35 years (Tab. 1 and 2). Then the total 38 % in all analysed embryos was abnormal. Major part of abnormalities represented partial or total gains and losses of chromosomes 1, 7, 16 and 21, whereas gains are morefrequent than losses. Younger than 35 years 35 years old and older No abnormality detected (NAD) Chromosome Gain Partial Loss Partial 3 Total errors gain loss Errors Abnormal (ABN) Unknown (UNK) Total ABN (%) Total NAD (%) References: E. Fragouli, D. Wells, Cytogenet Genome Res. 2011;133(2-4): Conclusion The results of genetic analyses of embryos should serve as a supporting tool for the determination of chromosomal aberrations in embryos. Probability of pregnancy and birth of a healthy child improves the selection of embryos without aberrations. In our IVF centre, the success rate of an IVF cycle is almost 70 % (Fig. 3) with the use of PGS and strictly one embryo transfer. Cooperation is very importantbetween embryology and andrology. Obtaining of good-quality embryos is crucial for PGS.

115 Příloha 5 Článek na webu lékaři online: PGS/PGD zvyšuje šanci na zdravé těhotenství (2013)

116

117

118