Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Ftaláty v jogurtech po dobu skladování

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Ftaláty v jogurtech po dobu skladování Diplomová práce Vedoucí práce: prof. Ing. Alžbeta Jarošová, Ph.D. Vypracovala: Bc. Markéta Stará Brno 2018

2

3

4 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem práci Ftaláty v jogurtech po dobu skladování vypracoval/a samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách a o změně a doplnění dalších zákonů (zákon o vysokých školách), ve znění pozdějších předpisů, a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom/a, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:.. podpis

5 PODĚKOVÁNÍ Mé poděkování patří především prof. Ing. Alžbetě Jarošové, Ph.D. za odborné vedení diplomové práce, cenné rady a připomínky, kterými přispěla k vypracování práce. Dále bych ráda poděkovala Ing. Marcele Jandlové za zaučení v laboratoři. V neposlední řadě bych chtěla poděkovat své rodině a přátelům, bez jejichž podpory by práce nevznikla.

6 ABSTRAKT Diplomová práce Ftaláty v jogurtech po dobu skladování je zaměřena na monitoring esterů kyseliny ftalové ve vzorcích jogurtů v závislosti na době skladování. Detekovanými ftaláty byly di-2-(ethylhexyl)-ftalát (DEHP) a di-n-butyl-ftalát (DBP), jež patří mezi nejpoužívanější plastifikátory polymerních materiálů, zejména polyvinylchloridu. Byly analyzovány vzorky jogurtů s přídavkem 1 % a 5 % chia a bambusové vlákniny, jež byly následně porovnány s jogurty natural. Celkem bylo analyzováno 120 vzorků jogurtů, u nichž byly naměřeny koncentrace DBP v rozmezí hodnot od 0,2 mg.kg -1 do 7,7 mg.kg -1 původní suroviny, u DEHP byly naměřeny koncentrace od nedetekovaných hodnot do 2,6 mg.kg -1 původní suroviny. V analyzovaných obalech, do nichž byly jogurty plněny, byly stanoveny průměrné hodnoty DBP 174,1 µg.dm -2 (68,0 µg.g -1 plastu) a DEHP 26,2 µg.dm -2 (10,2 µg.g -1 plastu). K analýze ftalátů byla po předchozí přípravě vzorků použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Klíčová slova: estery kyseliny ftalové, ftaláty, PAE, di-2-(ethylhexyl)-ftalát (DEHP), di-n-butyl-ftalát (DBP), jogurty ABSTRACT The thesis Phthalates in yoghurts during storage focuses on monitoring of phthalic acid esters in yogurt samples in relation to their storage period. The analyzed phthalates are di-2-(ethylhexyl)-phthalate (DEHP) and di-n-butyl-phthalate (DBP), which are among the most commonly used polymeric plasticizers, especially polyvinyl chloride. I analyzed samples of yoghurt with 1 % and 5 % chia and bamboo fiber and then subsequently compared them with natural yogurts. In total, I analyzed 120 samples of yoghurt, for which I measured DBP concentrations ranging from 0.2 mg.kg -1 to 7.7 mg.kg -1 of the original raw material and concentration of undetected values of DEHP in range up to 2.6 mg.kg -1 of the original raw material. While analyzing the yoghurt packaging, I measured average DBP values of μg.dm -2 (68.0 μg.g -1 plastic) and DEHP values of 26.2 μg.dm -2 (10.2 μg.g -1 plastic). After prior preparation of samples, I used high performance liquid chromatography to do the phthalates analysis. Keywords: phthalic acid esters, phthalates, PAE, di-2-(ethylhexyl)-phthalate (DEHP), di-n-butyl-phthalate (DBP), yoghurt

7 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Estery kyseliny ftalové Struktura Fyzikální a chemické vlastnosti Využití ftalátů Di-2-(ethylhexyl)-ftalát Di-n-butyl-ftalát Metabolismus a expozice ftalátů Metabolismus ftalátů Expozice ftalátů Snížení expozice ftaláty Ftaláty jako kontaminanty životního prostředí a potravin Atmosféra Vodní prostředí Půda Potravinový řetězec Výskyt ftalátů v produktech Plastové nádoby a obalové materiály Polymerní materiály Zdravotnictví a farmacie Kosmetika a výrobky pro osobní péči Podlahy z polyvinylchloridu Rukavice Účinky ftalátů na zdraví Endokrinní disruptory a reprodukční toxicita Karcinogenní a teratogenní účinky Účinky na zdraví kojenců, batolat, dětí a dospívajících Účinky na zdraví mužů Účinky na zdraví žen Legislativní předpisy Evropské legislativní požadavky Národní legislativní požadavky Metody stanovení ftalátů Chromatografické metody Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

8 Plynová chromatografie MATERIÁL A METODIKA Materiál Vzorky jogurtů Obalový materiál Chemikálie Přístroje a pomůcky Metodika Stanovení ftalátů ve vzorcích jogurtů Stanovení ftalátů v obalových materiálech Statistické zpracování dat VÝSLEDKY A DISKUZE Výsledky koncentrace ftalátů v obalových materiálech Vyhodnocení jogurtů Jogurty s přídavkem chia vlákniny Jogurty s 1% přídavkem chia vlákniny Jogurty s 5% přídavkem chia vlákniny Vzájemné porovnání jogurtů s přídavkem chia vlákniny Vyhodnocení jogurtů s přídavkem bambusové vlákniny Jogurty s 1% přídavkem bambusové vlákniny Jogurty s 5% přídavkem bambusové vlákniny Vzájemné porovnání jogurtů s přídavkem bambusové vlákniny Statistické porovnání všech analyzovaných vzorků v průběhu skladování Porovnání naměřených koncentrací v 0. týdnu skladování Porovnání naměřených koncentrací v 1. týdnu skladování Porovnání naměřených koncentrací ve 2. týdnu skladování Porovnání naměřených koncentrací ve 3. týdnu skladování ZÁVĚR PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK SEZNAM ZKRATEK SEZNAM PŘÍLOH

9 1 ÚVOD Životní prostředí představuje základní podmínky pro existenci živých organismů včetně člověka, i přesto je však kontaminováno celou řadou perzistentních chemických polutantů vznikajících zejména antropogenní činností, mezi které řadíme také estery 1,2-benzendikarboxylové kyseliny, jež jsou běžně označovány jako ftaláty (PAE, estery kyseliny ftalové). Ftaláty jsou látky vyskytující se ubikvitárně po celém světě, se kterými lidská populace přichází do každodenního kontaktu. Vyznačují se širokým spektrem výroby téměř ve všech průmyslových odvětvích. Z důvodu výborných plastifikačních a adhezních vlastností je primární využití těchto látek při výrobě polymerních materiálů, kde slouží jako plastifikátory plastů, především polyvinylchloridu (PVC). V současné době patří polymery mezi nejpoužívanější materiály, a to zejména z finančního hlediska. Jelikož nejsou ftaláty v polymerním materiálu vázány chemickou vazbou, mohou migrovat do potravin, jejichž obalový materiál je vyroben z měkčených plastů, čímž představují potenciální hrozbu pro bezpečnost potravin. V důsledku urbanizace a industrializace dochází k uvolňování ftalátů a jejich následnému rozšiřování do všech složek životního prostředí zahrnujících ovzduší, půdu, sedimenty i vodu. Každým rokem se na světě produkují tuny plastů, jimž jsou lidé vystaveni, což vzbuzuje značné obavy ohledně vlivu na lidské zdraví. Estery kyseliny ftalové jsou předmětem mnoha krátkodobých i dlouhodobých intenzivních výzkumů zejména na hlodavcích, jejichž cílem je zjistit možné negativní účinky. Provedené studie poukazují na schopnost ftalátů narušit endokrinní funkce a ovlivňovat hormonální homeostázu. V současné době existuje mnoho epidemiologicky doložených hypotéz, podle kterých má expozice ftalátů i přes jejich nízkou akutní toxicitu za následek pravděpodobné reprodukční, embryotické, hepatotoxické, karcinogenní, teratogenní a mutagenní účinky. U mužů bylo prokázáno statisticky významné snížení počtu spermií, jejich pohyblivosti i celkové kvality spermatu. Expozice ftalátů v průběhu těhotenství a prenatálního období je obzvláště znepokojivá, neboť může negativním způsobem působit na délku těhotenství a zvyšovat riziko potratovosti. U dětí mohou ftaláty nepříznivě ovlivňovat pubertální vývoj. 8

10 Vzhledem k negativnímu zdravotnímu potenciálu a vzniku možných environmentálních rizik jsou ftaláty globálním problémem. V současné době jsou zapsány na prioritním seznamu nebezpečných látek právních předpisů většiny průmyslových zemí. Měkčené plastové materiály s obsahem ftalátů jsou využívány ve velkém množství zejména z finančního hlediska i přesto, že jsou dostupné alternativní materiály, jako je sklo nebo bezpečnější plasty (polyethylen, polypropylen, ethylenvinylacetát). V zájmu ochrany životního prostředí a lidského zdraví je proto důležité, aby byli spotřebitelé informováni o problematice ftalátů a upřednostňovali materiály a produkty bez obsahu těchto látek, pokud je to u daných výrobků možné. K zajištění bezpečnosti a zdravotní nezávadnosti potravin je podstatné sledovat tyto látky ve všech fázích potravinového řetězce. Problematika ftalátů je vysoce aktuální a globálně diskutované téma. V České republice je však obyvatelstvo nedostatečně obeznámeno, dokonce neexistuje žádná odborná literatura v českém jazyce. Z tohoto důvodu diplomová práce shrnuje dostupné poznatky ohledně esterů kyseliny ftalové, zabývá se jejich výskytem v životním prostředí, potravinách, ale také ve výrobcích, se kterými lidé přichází do každodenního kontaktu, jako jsou kosmetické výrobky, produkty pro osobní péči nebo hračky. Práce rovněž informuje o potenciálních negativních účincích ftalátů na zdraví. 9

11 2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce Ftaláty v jogurtech po dobu skladování bylo sledování obsahu esterů kyseliny ftalové, konkrétně di-2-(ethylhexyl)-ftalátu (DEHP) a di-n-butyl-ftalátu (DBP) ve vzorcích jogurtů v závislosti na době skladování. Rovněž byly analyzovány i obalové materiály, do kterých byly jogurty plněny, a sledována případná migrace ftalátů z obalu do jogurtu. V úvodní části práce bylo cílem vypracovat literární rešerši na témata: Ftaláty jako kontaminanty životního prostředí a potravin Výskyt ftalátů Účinky ftalátů na zdraví Metody stanovení ftalátů Praktická část diplomové práce si kladla za cíl: Provádět přípravu vzorků pro analýzu Zúčastnit se stanovení ftalátů pomocí kapalinové chromatografie Zpracovat a vyhodnotit výsledky 10

12 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Estery kyseliny ftalové Estery kyseliny ftalové (PAE phthalic acid ester; ftaláty) jsou všudypřítomné kontaminující cizorodé látky s rozsáhlým uplatněním, a to především z důvodu jejich výborných plastifikačních a adhezních vlastností (Jarošová et al., 2009). Ftaláty jsou obvykle bezbarvé nebo slabě nažloutlé viskózní tekutiny bez zápachu, pouze nepatrně rozpustné ve vodě (Mikula et al., 2005). Jedná se o důležitou skupinu průmyslových chemikálií využívaných již od roku 1930 při výrobě širokého sortimentu výrobků (Cobellis et al., 2003). Nejčastější využití estery kyseliny ftalové nacházejí jako plastifikátory (změkčovadla) především v polyvinylchloridových materiálech (PVC), jelikož zvyšují pružnost materiálu a mají vhodné technické vlastnosti (Huang et al, 2013). Roční celosvětová spotřeba ftalátů se odhaduje zhruba na pět milionů tun a tvoří přibližně 87 % všech použitých plastifikátorů (Olkowska et al., 2017). Změkčovadla mohou tvořit až 50 % celkové hmotnosti výrobku. Jelikož ftaláty nejsou v polymeru chemicky vázány, během používání dochází k jejich přímému nebo nepřímému uvolňování a následnému rozptýlení do ovzduší, vody, jídla, domácího prachu, půdy, živých organismů a dalších médií (Lowell Center for Sustainable Production, 2011). Kontaminace životního prostředí se stala významným zdrojem esterů kyseliny ftalové v potravinách a obalových materiálech, ze kterých mohou PAE migrovat do potravin, a proto je velmi důležité sledovat jejich hladiny výskytu (Cao, 2010). U potravin s vyšším obsahem lipidů bylo pozorováno statisticky významné zvýšení výskytu ftalátů. Jednalo se zejména o mléko a mléčné výrobky, rostlinné oleje nebo maso (Bogdanovičová et al., 2015). Spotřební produkty s obsahem ftalátů mohou vést k expozici člověka prostřednictvím přímého kontaktu a použití, nepřímo vyluhováním do jiných produktů či znečištěním životního prostředí (Schettler, 2005). V současné době jsou ftaláty předmětem mnoha výzkumů, jelikož jejich přítomnost v životním prostředí a potravinách může mít nepříznivý dopad na fungování ekosystémů a způsobovat negativní účinky na zdraví lidské populace (Net et al., 2015). V roce 2016 řešily dozorové orgány České republiky celkem 11

13 30 záležitostí týkajících se migrací látek. Estery kyseliny ftalové patřily k velmi častým případům notifikace (Poustková, 2017b). Studie zjistily, že člověk pasivně pohlcuje ftaláty včetně jejich metabolitů, což může mít za následek různé dysfunkce (Benjamin et al., 2017). Ftaláty jsou klasifikovány jako endokrinně narušující sloučeniny, které negativně působí na hormonální homeostázu (Bowman et Choudhury, 2016). Efektivním nástrojem pro eliminaci rizika těchto látek je systém analýzy nebezpečí a kontrolních kritických bodů (HACCP) (Jarošová et al., 2009). Agentura pro ochranu životního prostředí (EPA - Environmental Protection Agency) odlišuje šest esterů kyseliny ftalové, jež zařadila mezi prioritní rizikové polutanty: dimethyl-ftalát (DMP) diethyl-ftalát (DEP) di-n-butyl-ftalát (DBP) di-2-(ethylhexyl)-ftalát (DEHP) di-n-octyl-ftalát (DOP) benzylbutyl-ftalát (BBP) (Jarošová et al, 2008). Mezi ftaláty s komerčním využitím naopak patří: di-isobutyl-ftalát (DiBP) di-isooctyl-ftalát (DiOP) di-isononyl-ftalát (DiNP) di-isodecyl-ftalát (DiDP) a další (Staples et al., 1997). Mezi nejvíce používaná změkčovadla patří di-n-butyl-ftalát (DBP) a di-2-(ethylhexyl)-ftalát (DEHP), která mají karcinogenní, hepatotoxické a teratogenní účinky. Tyto látky mohou poškodit funkci jater a snížit reprodukční schopnost (Stratil et Kubáň, 2005). V zájmu ochrany lidského zdraví je snaha eliminovat užívání ftalátů (zejména DEHP) a nahradit je alternativními produkty, které neobsahují tyto látky (Šula, 2007). 12

14 3.1.1 Struktura Ftaláty jsou estery 1,2-benzendikarboxylové kyseliny, odvozené od triviálního názvu této kyseliny, kyseliny ftalové, jejíž molekula obsahuje aromatický kruh většinou s alifatickými postranními řetězci (Velíšek et Hajšlová, 2009). Názvosloví ftalátů je odvozeno dle polohy těchto řetězců připojených esterovou vazbou k benzenovému zbytku (Benjamin et al., 2017). Obr. 1 Obecný strukturní vzorec ftalátu (National Research Council, 2008) Obr. 1 znázorňuje obecný strukturní vzorec ftalátů, přičemž R a R jsou alkylové či arylové skupiny. Pro vybrané ftaláty platí: dimethyl-ftalát (DMP) R = R = CH3 diethyl-ftalát (DEP) R = R = CH2CH3 di-n-butyl-ftalát (DBP) R = R = [CH2]3CH3 benzylbutyl-ftalát (BBP) R = CH2C6H5, R = [CH2]3CH3 di-2-(ethylhexyl)-ftalát (DEHP) R = R = CH2CH(CH2CH3)[CH2]3CH3 dioctyl-ftalát (DOP) R = R = [CH2]7CH3 (Velíšek et Hajšlová, 2009). Podle chemické struktury (Tab. 1), respektive dle délky postranního řetězce, lze rozlišit ftaláty s nízkou, střední (přechodnou) nebo vysokou molekulovou hmotností. Ftaláty s nízkou molekulovou hmotností (DMP, DEP, DBP) se vyznačují krátkými a přímými postranními řetězci se třemi nebo méně atomy uhlíku, zatímco přechodné ftaláty (střední) obsahují čtyři až šest atomů uhlíků, přičemž jejich postranní řetězce mohou být rovné nebo rozvětvené. Estery kyseliny ftalové s vysokou molekulovou hmotností (DEHP) obsahují více než sedm atomů uhlíků (Holohan et Smith, 2015). 13

15 Tab. 1 Chemická struktura nejběžnějších ftalátů (Gobas, 2003) Název Dimethyl-ftalát (DMP) Sumární vzorec C10H10O4 Strukturní vzorec Diethyl-ftalát (DEP) C12H14O4 Di-n-butyl-ftalát (DBP) C16H22O4 Di-2-(ethylhexyl)-ftalát (DEHP) C24H38O4 Di-n-octyl-ftalát (DOP) C24H38O4 Benzylbutyl-ftalát (BBP) C19H20O4 14

16 3.1.2 Fyzikální a chemické vlastnosti Ftaláty jsou při běžných podmínkách kapaliny čirého, olejovitého a nehořlavého charakteru pouze nepatrně rozpustné ve vodě (Velíšek et Hajšlová, 2009). Vyznačují se nízkou teplotou tání (u všech s výjimkou DMP) a vysokým bodem varu, což jsou vlastnosti, které přispívají ke vhodnému využití PAE jako změkčovadel plastů (Staples et al, 1997). Z Tab. 2 je patrné, že se zvyšující se relativní molekulovou hmotností (Mr) klesá rozpustnost ftalátů ve vodě a zároveň stoupá hodnota rozdělovacího koeficientu oktan-1-ol/voda (pkow), který vyjadřuje lipofilitu sloučenin (Velíšek et Hajšlová, 2009). Tab. 2 Fyzikálně chemické vlastnosti vybraných ftalátů (Velíšek et Hajšlová, 2009) Ftalát Mr Bod varu ( C) Bod tání ( C) Rozpustnost ve vodě v mg.dm -3 ( C) pkow DMP 194, (25) 1,53 DEP 222, (25) 2,35 DBP 278, ,2 (25) 4,57 BBP 312, ,69 (25) 4,91 DEHP 390, ,3 (25) 5,11 Z výše uvedeného vyplývá skutečnost, že ftaláty jsou látky velmi stabilní a odolné vůči vysokým teplotám. Degradují při vystavení slunečnímu záření a jsou snadno metabolizovány za aerobní mikrobiální aktivity (Wenzl, 2009). Nejvýznamnějším faktorem, jenž určuje chemické vlastnosti ftalátů, je esterifikovaná karboxylová skupina. Primární reakcí je stejně jako u ostatních esterů hydrolýza (Obr. 2), kterou mohou katalyzovat kyseliny i zásady. Malá rozpustnost ftalátů ve vodě způsobuje pomalý průběh reakce, který lze však urychlit zvýšením teploty (Velíšek et Hajšlová, 2009). Obr. 2 Hydrolýza esterů kyseliny ftalové (Velíšek et Hajšlová, 2009) 15

17 3.2 Využití ftalátů Estery kyseliny ftalové se vyrábí ve velkém množství a mají všestranné využití (Tab. 3) (Huang et al., 2013). Použití PAE je možno rozdělit na dvě základní skupiny: ftaláty nacházející se ve spotřebních výrobcích a ftaláty sloužící jako plastifikátory (změkčovadla). Způsob využití částečně závisí na různých chemických a fyzikálních vlastnostech, například na molekulové hmotnosti (Kleerebezem et al., 1999). Estery kyseliny ftalové s krátkým postranním řetězcem (nízkomolekulární ftaláty) jsou hojně používány jako rozpouštědla v kosmetických prostředcích nebo jako solventy u polymerů na bázi celulosy. Ftaláty se středně dlouhým postranním řetězcem (ftaláty se střední molekulovou hmotností) mají primární využití rovněž jako rozpouštědla v některých výrobcích z PVC, ale pouze v kombinaci s jinými plastifikátory. Estery kyseliny ftalové s dlouhým postranním řetězcem (ftaláty s vyšší molekulovou hmotností) jsou užívány jako plastifikátory ke změkčení polyvinylchloridu (PVC), například při výrobě drátěných a kabelových krytů, zdravotnických pomůcek a dalších spotřebních materiálů (Cao, 2010; David et Gans, 2003). Tab. 3 Využití vybraných ftalátů (Lowell Center for Sustainable Production, 2011) Ftalát Využití ftalátů ve výrobcích DEHP Panenky, boty, pláštěnky, oblečení, zdravotnické prostředky, nábytek, potravinové obaly, automobilové čalounění, podlahové dlaždice DBP Latexová lepidla, rozpouštědla, kosmetika, potravinové obaly, barvy, insekticidy DiNP Hračky, rukavice, chrastítka, lžíce, slámky na pití, barvy a laky, potraviny DiDP Umělá kůže, PVC podlahy DnOP Podlahové dlaždice, plachty, zahradní hadice BBP Lepidla, vinylové podlahy, rozpouštědla, automobilový průmysl, umělá kůže Nejčastější využití mají tyto látky při výrobě plastů, kde slouží zejména jako plastifikátory polyvinylchloridu (PVC). Změkčení tvrdého PVC vede ke zlepšení mechanických vlastností plastické hmoty, a to především ke zvýšení pružnosti 16

18 a jednodušší zpracovatelnosti hmoty. Měkčené PVC nachází rozsáhlé využití v chemickém průmyslu při výrobě celé řady spotřebních výrobků, jako jsou například obaly, stavební materiály, hračky nebo zdravotnické pomůcky (Šuta, 2007). Je vhodno připomenout, že ftaláty využívané jako plastifikátory nejsou na polymerní matrici chemicky vázány, a proto se snadno uvolňují nebo migrují z polymeru během jejich výroby, použití, ale také při likvidaci, a to zejména v případě, kdy jsou produkty s obsahem esterů kyseliny ftalové vystaveny vysokým teplotám (National Research Council, 2008). Mezi nejvyužívanější ftaláty patří DEHP a DBP. Jedná se o toxické látky lipofilního charakteru, které se kumulují v tukových tkáních (Jarošová et al., 2008). I přesto, že jsou syntetizovány červenými řasami, je jejich přirozený výskyt zanedbatelný ve srovnání s PAE produkovanými lidskou činností (Net et al., 2015) Di-2-(ethylhexyl)-ftalát DEHP je zkratka pro di-2-(ethylhexyl)-ftalát, někdy též označovaný jako bis-2-ethylhexyl-ftalát (BEHP). Obchodní názvy, pod nimiž bývá DEHP uváděn do oběhu, jsou Octoil, Platinol DOP, Silicon 150, Bisoflex 81 a Eviplast 80 (ATSDR, 2002). Z hlediska fyzikálněchemických vlastností je DEHP charakterizován jako bezbarvá olejovitá kapalina bez zápachu (Strauss, 2004). V důsledku nízké rozpustnosti ve vodě a vysoké hodnotě rozdělovacího koeficientu oktan-1-ol/voda (pkow) se vyznačuje vysoce hydrofobními vlastnostmi. Již shora uvedené specifikace uvádějí, že DEHP stejně jako ostatní ftaláty není kovalentně vázán na polymery, což vyjadřuje jeho schopnost vylučovat se do vnějšího prostředí (voda, vzduch, půda), krve a dalších lipofilních tekutin. Množství DEHP, které migruje z plastových výrobků, závisí na podmínkách skladování a lipofilních vlastnostech tekutin. Expozice může nastat po požití, inhalaci, dermální absorpci nebo přímým uvolněním látek ze zdravotnických prostředků do těla (Magdouli et al., 2013; Mariana et al., 2016). DEHP se získává reakcí 2-ethyhexanolu s anhydridem kyseliny ftalové. Po expozici je metabolizován a převeden na mono-2-(ethylhexyl)-ftalát (MEHP), který je toxický, avšak bývá opět rychle metabolizován jinými oxidačními reakcemi a nakonec vylučován z těla močí (Strauss 2004; Mariana et al., 2016). 17

19 DEHP je všudypřítomný kontaminant životního prostředí, jenž patří mezi nejpoužívanější změkčovadla polyvinychloridových výrobků (Latini et al., 2003). Byl detekován v kosmetických výrobcích a přípravcích pro osobní péči, v léčivech, lékařských a laboratorních vybaveních, v barvách, ve stavebnictví, používá se při balení potravinářských výrobků a při výrobě mnoha dalších produktů. Studie naznačují, že intenzivním používáním plastových materiálů dochází ke zvýšení expozice DEHP u lidské populace (Magdouli et al., 2013). Di-2-(ethylhexyl)-ftalát byl klasifikován jako prioritní znečišťující látka s relativně nízkou akutní toxicitou, avšak s pravděpodobnými mutagenními, karcinogenními a xenoestrogennmi účinky (Roslev et al., 1998). V souladu s nařízením Komise (EU) 2017/999, kterým se mění příloha XIV nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek (REACH), je DEHP klasifikován do kategorie 1B, kterou se označují látky toxické pro reprodukci Di-n-butyl-ftalát Di-n-butyl-ftalát (DBP), označován též jako dibutylester kyseliny 1,2-benzendikarboxylové, má rozsáhlé průmyslové využití (Marsman, 1995). Za normálních podmínek se jedná o nezředěnou bezbarvou nebo slabě nažloutlou olejovitou kapalinu špatně rozpustou ve vodě, avšak velmi dobře rozpustnou v acetonu, benzenu a dalších organických rozpouštědlech (ATSDR, 2001). DBP se vyrábí reakcí n-butanolu s ftalanhydridem (Mariana et al., 2016). V chemickém průmyslu slouží DBP nejen jako plastifikátor PVC, ale také jako součást latexových lepidel, barev nebo jako rozpouštědlo éterických olejů. Rozsáhlé použití má při výrobě zdravotnických pomůcek, v automobilovém průmyslu může být součástí bezpečnostních skel. Byl aplikován rovněž jako insekticid, avšak nepovažuje se za stejně účinný jako dimethyl-ftalát (Marsman, 1995). V předchozích letech býval často přidáván do kosmetických přípravků a jiných výrobků pro osobní péči (Mariana et al., 2016). Vzhledem k rozsáhlému upotřebení DBP existuje vysoký potenciál expozice člověka, jednak přímo na pracovišti nebo nepřímo z životního prostředí (Marsman, 1995). DBP stejně jako DEHP není chemicky vázán na polymery a může být uvolněn během výroby, použití nebo likvidace výrobku. Expozice člověka může nastat po 18

20 jeho následném uvolnění (Mariana et al., 2016). DBP může být přítomen v potravinách jednak na základě migrace z materiálů obsahujících DBP, jež přicházejí do styku s potravinami, nebo v důsledku jeho rozšířené přítomnosti v životním prostředí, kde se jako kontaminant může nacházet ve vzduchu, vodě nebo půdě (EFSA, 2005). 3.3 Metabolismus a expozice ftalátů Estery kyseliny ftalové se v organismu příliš nekumulují a bývají v poměrně krátké době metabolizovány a vylučovány zejména močí, částečně i stolicí (Mikula et al., 2005; Latini, 2005) Metabolismus ftalátů Obr. 3 Biodegradace esterů kyseliny ftalové (Frederiksen et al., 2007) Metabolismus ftalátů (Obr. 3) probíhá ve dvou fázích biotransformace a je ovlivněn délkou postranního řetězce. U ftalátů s kratším řetězcem (DEP a DBP) se první fáze vyznačuje poměrně rychlou hydrolýzou, při níž vznikají patřičné monoestery. Produkované monoestery jsou bioaktivní molekuly zodpovídající za nepříznivé účinky v játrech. Monoestery dialkyl ftalátu jsou ve druhé fázi biotransformace konjugovány glukuronovou kyselinou a následně vyloučeny močí (Mikula et al., 2005; Latini, 2005). 19

21 Ftaláty s dlouhou délkou řetězce (DEHP, DiNP, DnOP) jsou podobným způsobem hydrolyzovány na příslušné monoestery, posléze na oxidační produkty, a až následně podléhají konjugaci s glukuronovou kyselinou zprostředkovanou enzymem uridin-5-difosfoglukuronyltransferázou. Volné i konjugované ftalátové metabolity jsou vylučovány močí i stolicí (Mikula et al., 2005; Latini, 2005). Během 24 hodin je eliminováno přibližně % ftalátů, ale i přesto dochází k jejich akumulaci v organismu (Velíšek et Hajšlová, 2009). Biomonitoring koncentrace metabolitů v moči je používán pro průkaz expozice ftalátů (Heudorf et al., 2007) Expozice ftalátů Vstup esterů kyseliny ftalové do lidského organismu probíhá v průběhu celého života, a to včetně intrauterinního (nitroděložního) vývoje (Latini, 2005). Expozice může být orální (např. DEHP z potraviny, vody nebo dalších tekutin kontaminovaných ftaláty), dermální (např. DEP prostřednictvím kosmetiky a dalších výrobků pro osobní péči) nebo inhalačně (Swan, 2008). Bylo zjištěno, že největším zdrojem expozice ftaláty je přijímání potravin, dále vdechování a požívání prachu (Fierens et al., 2012). DMP, vyskytující se zejména ve vzduchu, představuje hlavní zdroj expozice ftalátů prostřednictvím inhalace, příjem DEP je především kožní a inhalační cestou, jelikož jeho výskyt je prokázán zejména u výrobků pro osobní péči. U DBP a DEHP jsou dominantním zdrojem potraviny, a proto převládá expozice orální ingescí, nicméně také prach patří mezi významný zdroj DEHP, a to obzvláště u dětí a batolat (Heudorf et al., 2007). Při konzumaci potravin je největší expozice zejména u těch, které obsahují vyšší množství lipidů, jako jsou oleje, mléko, sýry, ryby a maso (Šuta, 2007). Rizikové skupiny tvoří především gravidní ženy, předčasně narozené děti a novorozenci. Provedené výzkumy stanovily statisticky vyšší koncentrace ftalátů v plodové vodě, mateřském mléce, ve slinách i v krvi. U těhotných žen se DEHP může dostat přes placentární bariéru a negativním způsobem ovlivnit plod. Vyšší expozice ftalátů je taktéž u žen, jež v průběhu těhotenství podstoupily určité lékařské zákroky, v důsledku kterých byly vystaveny vyšším dávkám těchto látek. 20

22 Nejspolehlivějším způsobem pro analýzu ftalátů z biologické matrice je měření koncentrace metabolitů v moči (Šuta, 2007; Holohan et Smith, 2015). Odhaduje se, že denní příjem PAE u dětí je asi čtyřikrát vyšší než u dospělých, a proto je důležité, aby se rizikové skupiny jedinců vyhýbaly vysokým účinkům expozice ftalátů (Xia et al., 2018). Děti absorbují chemikálie ve větším množství, avšak zpracovávají a odstraňují je mnohem pomaleji než dospělí (Růžičková et al., 2004). Při použití měkčených plastů v hračkách nebo zdravotnických pomůckách dochází ke styku s biologickými tekutinami (sliny, žaludeční šťáva), které poskytují vhodné prostředí pro rychlejší průběh uvolňování nebezpečných ftalátů (Lindström, 2007). Z důvodu ochrany lidského zdraví stanovil Evropský úřad pro bezpečnost potravin (EFSA) tolerovaný denní příjem (TDI) pro DBP 0,01 mg.kg -1, DEHP 0,05 mg.kg -1, BBP 0,5 mg.kg -1, DiDP a DiNP 0,15 mg.kg -1 na tělesnou hmotnost a den (Cao, 2010) Snížení expozice ftaláty Na tomto místě je vhodné poukázat na možnosti snížení expozice ftaláty, jež by mohly být přínosné především pro spotřebitele. Je vhodné preferovat používání skleněných nádob před plastovými, jelikož, jak již bylo výše uvedeno, právě pro výrobu plastových nádob bývají používána změkčovadla zahrnující rovněž ftaláty. V případě použití plastových výrobků a materiálů je důležité vyhnout se měkčeným plastům s označeným číslem 3 nebo nápisem PVC, jež se vyskytují zejména u hraček, které byly vyrobené ještě dříve, než bylo používání PVC v Evropské unii při výrobě hraček zakázáno. Plastové výrobky by se neměly používat v mikrovlnné troubě, jelikož ftaláty migrují zejména při zvýšených teplotách. Rovněž je patřičné nepoužívat plastové nádoby pro udržení teplých potravin nebo tekutin (Kumar, 2017). Mezi alternativní polymery bez obsahu ftalátů je možno zařadit polyethylen (PE), polypropylen (PP), etylenvinylacetát (EVA) nebo silikon (Šuta, 2008). Při výběru kosmetických přípravků (včetně osvěžovačů vzduchu) je třeba dbát na to, zda ve svém názvu neobsahují slovo parfum, jelikož pod tímto označením se mohou vyskytovat nebezpečné chemické látky včetně ftalátů (Kumar, 2017). Rovněž je vhodné dávat přednost produktům pro osobní péči bez obsahu DEP a DBP (Braun et al., 2013). 21

23 3.4 Ftaláty jako kontaminanty životního prostředí a potravin Estery kyseliny ftalové jsou jedny z nejčastěji stanovovaných perzistentních organických polutantů vyskytujících se ubikvitárně v životním prostředí po celém světě, a to zejména díky jejich širokému spektru využití (Wenzl, 2009; Gao et Wen, 2016). Byly detekovány ve vzduchu, půdě, vodě, v sedimentech nebo výpalkách ze země (Huang et al., 2013; Gao et Wen, 2016). Vlivem urbanizace došlo ke zvýšení objemu vypuštěných ftalátů do atmosféry a vodního prostředí. Používání zemědělských plastů negativním způsobem ovlivňuje kvalitu zemědělských půd. Primární znečišťující látkou v životním prostředí je DEHP, a na to na základě jeho širokého průmyslového využití (Gao et Wen, 2016). Cíleného odstraňování ftalátů z životního prostředí je možno dosáhnout biodegradací za aerobních podmínek (Gao et Wen, 2016) Atmosféra Estery kyseliny ftalové mají nízkou těkavost a při používání se pomalu uvolňují z PVC produktů a difundují do ovzduší. V životním prostředí se mohou navázat na prachové částice. Ve vnitřním vzduchu a domovním prachu se vyskytují ftaláty, jež se vylučují zejména z produktů obsahujících PVC, jako jsou různé stavební výrobky, bytové zařízení, hračky nebo plastové komponenty uvnitř automobilů (Schettler, 2005). Analýza ftalátů ve vzduchu se provádí prostřednictvím plynové chromatografie (Jo et al., 2016). Ftaláty s krátkými postranními řetězci jsou přítomny především v plynné fázi (ve formě par), zatímco PAE s delšími řetězci bývají navázány na prachové částice (Net et al., 2015). Distribuce ftalátů mezi plynnou a tuhou fází závisí na molekulové hmotnosti. Čím je vyšší molekulová hmotnost, tím více ftaláty přecházejí z plynné do pevné fáze, tlak par se tedy s narůstající molekulovou hmotností snižuje. Mezi hlavní parametry ovlivňující rozklad ftalátů a jejich odstranění z atmosféry patří dešťové srážky a vyšší teploty (Růžičková et al., 2016). Vdechování vzduchu a požití prachu představují jedny z nejdůležitějších nepotravinářských zdrojů expozice ftaláty (Clark et al., 2003). Více těkavé látky, jako jsou DMP, DEP a DBP, se vyskytují především ve vzduchu, zatímco DEHP a BBP jsou častěji identifikovány v prachu (Rudel et Perovich, 2009). Provedené studie 22

24 prokázaly, že dermální expozice může představovat více než 50% expoziční cestu ftalátů ze vzduchu. Jedním z nejdůležitějších zdrojů expozice u kojenců a batolat je podlahový prach (Kumar, 2017). Ftaláty mají v důsledku antropogenní činnosti tendenci kumulovat se v městských oblastech a průmyslových aglomeracích, což potvrzují rovněž experimentální výzkumy (Růžičková et al., 2016). Kvalita prostředí má významný dopad na zdraví člověka, a proto je důležité srovnání koncentrací ftalátů ve venkovním (vnějším) a vnitřním prostředí, poněvadž značná část populace stráví přibližně 80 % svého času právě v prostředí vnitřním (Xia et al., 2018). Při tomto porovnání byly naměřeny statisticky vyšší hodnoty ftalátů ve vnitřních prostorech, z nichž nejvíce zastoupeným byl právě DEHP (Jo et al., 2016). Xia et al. (2018) potvrdili tytéž výsledky a uvádí, že vyšší koncentrace ftalátů ve vnitřním prostředí jsou způsobeny především expozicí ze spotřebních výrobků, u nichž byly PAE využity jako plastifikátory. Růžičková et al. (2016) se zabývali analýzou ovzduší v České republice, konkrétně v Moravskoslezském kraji, jenž se vyznačuje vysokou úrovní kontaminace. Cílem studie byla identifikace DEHP, DEP nebo DBP. Naměřené koncentrace se v průběhu ročních období lišily, v zimě byly naměřeny vyšší hodnoty než v létě Vodní prostředí Pro estery kyseliny ftalové je charakteristická poměrně nízká rozpustnost ve vodě, přesto je však prokázána zvýšená kontaminace těchto látek ve vodním prostředí, především DEHP, který se vyznačuje schopností sorpce na organické částice a následné vzájemné interakce s rozpuštěnými huminovými kyselinami nebo fulvokyselinami v půdě (Velíšek a Hajšlová, 2009). Dešťové srážky přenášejí estery kyseliny ftalové v atmosféře do povrchové vody na zemi, a právě hromadění těchto látek ve vodě způsobuje široké rozložení PAE v řekách, jezerech a sedimentech. Estery kyseliny ftalové byly detekovány v povrchové vodě a sedimentech po celém světě (Gao et Wen, 2016). DEHP je převládajícím kongenerem, což je způsobeno zejména důsledkem urbanizace a industrializace (Gao et Wen, 2016). Ve vodě představuje potenciální riziko vzniku karcinomu u lidí, a to obzvláště při používání vody pro zavlažování 23

25 zeleniny (Magdouli et al., 2013). Úroveň kontaminace vodního prostředí je tedy pravděpodobně spojená s antropogenní aktivitou, což potvrzuje také fakt, že koncentrace esterů kyseliny ftalové byly v městských oblastech naměřeny výrazně vyšší než ve venkovských lokalitách (Gao et Wen, 2016; Selvaraj et al., 2015). Americká agentura pro ochranu životního prostředí (EPA) stanovila maximální přípustnou koncentraci ve vodě pro DEHP na 6 mg/l (Shen, 2005). Selvaraj et al. (2015) zjišťovali v Indii kontaminaci vody šesti hlavními ftaláty pomocí hmotnostní spektrometrie a plynové chromatografie. Po zhodnocení výsledků byla zjištěna přítomnost DEP a DMP v každém vzorku, zatímco BBP a DEHP byly detekovány v 92% vzorků vody. Estery kyseliny ftalové v odpadních vodách je možno cíleně odstranit v některých procesech čistění odpadních vod biodegradací a absorpcí primárního kalu (Gao et Wen, 2016) Půda Zemědělská půda je faktorem kvality a zdravotní nezávadnosti potravin nejen rostlinného, ale taktéž živočišného původu, tudíž je nezbytné věnovat zvýšenou pozornost obsahu znečišťujících látek v půdě (Daňková et al., 2016). Kontaminace půd je způsobena zejména intenzivní zemědělskou činností a průmyslovou aktivitou. Vyšší koncentrace PAE se nachází především v okolí skládek odpadů nebo průmyslových závodů (Jarošová, 2010a). Ftaláty byly v půdě naměřeny téměř ve všech částech světa. V důsledku nízké rozpustnosti ve vodě mají tendenci koncentrovat se z vody do půdy a sedimentů. Ftaláty, které se hromadí v zemědělských půdách, mohou být absorbovány plodinami, a dostávat se tak do zemědělských produktů. DEHP je z důvodu širokého využití a nízké míry degradace a mineralizace dominantní kontaminující látkou v půdě (Gao et Wen, 2016). V České republice se každoročně provádí monitoring obsahu ftalátů v půdách. V roce 2016 byly koncentrace PAE na stabilní úrovni, nejvyšší zatížení půd ftaláty bylo v půdách Zlínského kraje, což mohlo být zapříčiněno průmyslovou činností a blízkosti čistírny odpadních vod. Analyzované koncentrace DBP se pohybovaly v rozmezí od 0,02 mg.kg -1 do 0,35 mg.kg -1 sušiny, hodnoty DEHP v rozmezí od 0,05 mg.kg -1 do 1,25 mg.kg -1 sušiny (Poustková, 2017a). 24

26 3.4.4 Potravinový řetězec Potraviny jsou hlavním zdrojem expozice ftalátů pro člověka, tudíž je velmi důležité sledovat hladiny PAE u různých druhů potravin a surovin (Cao, 2010). Ke kontaminaci může dojít jednak v průběhu prvovýroby - primární kontaminace, ale také během následného zpracování - sekundární kontaminace (Bogdanovičová, et al., 2016). Výzkumy prokázaly statisticky vyšší koncentrace ftalátů v potravinách s vysokým obsahem lipidů, jako je maso, smetana a různé tuky a oleje (Cao, 2010). K zajištění prevence výskytu esterů kyseliny ftalové v potravním řetězci, a na základě zjištěných nežádoucích účinků na organismus, je nutný monitoring kontaminace ftalátů nejen v surovinách a potravinách, ale také v obalových materiálech včetně tiskových potisků. Rovněž je nutné sledovat kontaminace ftalátů v krmivech a krmných komponentech (Jarošová, 2010b). Mezi zdroje ftalátů v potravním řetězci se řadí rovněž materiály z PVC, jako je potrubí, rukavice, polyvinylchloridové těsnění v kovových uzávěrech a u skleněných nádob, PET lahve a mnoho dalších (Cao, 2010). Serrano et al. (2014) stanovovali ftaláty v různých vzorcích potravin, zahrnujících maso, oleje, mléčné výrobky, obilniny, ovoce a zeleninu a další. Byly analyzovány vzorky masa drůbežího, vepřového a hovězího. Nejvyšší naměřené hodnoty PAE byly u drůbežího masa, avšak nebylo zjištěno, jaké faktory tyto výsledky ovlivnily, jelikož nebyl znám obsah tuku v jednotlivých vzorcích. Přestože v čerstvém ovoci a zelenině byly zjištěny všechny druhy ftalátů (s výjimkou DiNP a DiDP), jejich koncentrace byly velmi nízké. U mléčných výrobků bylo zjištěno, že smetana je ve srovnání s jogurtem více kontaminována ftaláty. Koncentrace PAE byly naměřeny i v dětské výživě, a to v rozmezí od 0,01 mg do 0,63 mg DEHP na kilogram dětské stravy (Růžičková et al., 2004). V roce 2017 byl v České republice prováděn monitoring přítomnosti ftalátů v ovocných destilátech. Celkem bylo odebráno 20 vzorků, z nichž byl prokázán pozitivní nález ftalátů v osmi vzorcích (Poustková, 2017a). Ve studii Harazim et al. (2008) byly zjištěny vysoké hladiny koncentrace esterů kyseliny ftalové v krmivech s vysokým obsahem tuku, zejména u sójového oleje (148 mg.kg -1 ). U živočišného tuku, rybího oleje a palmového tuku byly naměřeny hodnoty nad 10 mg.kg -1, u ostatních vzorků pouze v jednotkách mg.kg -1. Jarošová et al. (2008) rovněž zkoumali kontaminaci ftaláty u krmiv a naměřili podobné hodnoty. 25

27 3.5 Výskyt ftalátů v produktech Estery kyseliny ftalové mají díky širokému spektru použití uplatnění v mnoha průmyslových odvětvích a spotřebitelských produktech, se kterými přichází lidská populace do každodenního kontaktu (Staples, 2003). Jak již bylo výše uvedeno, nejvíce se PAE využívají jako plastifikátory plastů. Plasty jsou levné, lehké, odolné, korozivzdorné materiály vyznačující se vysokou tepelnou odolností (Thompson et al., 2009) Plastové nádoby a obalové materiály V současné době je kontaminace potravin ftaláty záležitostí veřejného zájmu v důsledku rozšířeného využití plastů pro výrobu nádob a obalů (Fan et al., 2012). Plastové materiály používané při skladování a zpracování potravin mohou v některých potravinách zvyšovat obsah esterů kyseliny ftalové (Braun et al., 2013). Obalové materiály, s nimiž potravina přichází do styku, patří mezi primární zdroj kontaminace. Migraci ftalátů ovlivňuje mnoho faktorů, zejména vlastnosti polymerního materiálu, množství tuku a bílkovin v potravině nebo teplota a délka skladování (Bogdanovičová et Jarošová, 2015). Konkrétní požadavky, které musí splňovat materiály, jež jsou v přímém styku s potravinou, jsou popsány v kapitole 3.7, kde jsou shrnuty dostupné legislativní předpisy. Při výrobě potiskových barev využívaných pro balení potravin jsou velmi často přidávány plastifikátory, zejména DBP a DEHP, sloužící pro zlepšení adheze povrchu, což vede ke zvýšení pružnosti a odolnosti proti vráskám na povrchu výrobku (Cao, 2010). Provedené studie potvrzují jednak to, že vyšší obsah PAE bývá zejména v potištěných částech obalu, ale také zvýšené riziko kontaminace surovin a potravin migrací ftalátů z barevně potištěné části obalu do potraviny (Bogdanovičová et al., 2016). Fan et al. (2012) došli k závěru, že PAE mohou do potravin migrovat nejen z plastových, ale taktéž z papírových obalů, a zároveň potvrdili, že v důsledku jejich lipofility byl značnější přestup ftalátů do potravin s vyšším obsahem lipidů. Při záhřevu v mikrovlnné troubě byla migrace ftalátů urychlena, například u plastových obalů došlo ke vzrůstu naměřených koncentrací z příkladných hodnot 6795,5 μg/kg na 42806,8 μg/kg. 26

28 V České republice sleduje Státní zemědělská a potravinářská inspekce (SZPI) systematicky migraci esterů kyseliny ftalové z plastového obalového materiálu do minerálních vod již od roku V roce 2002 bylo odebráno 44 vzorků minerálních vod, z nichž u čtyř vzorků byl zaznamenán pozitivní nález ftalátů (ÚI SZPI, 2003) Polymerní materiály Polymerní hračky jsou zdrojem potenciální orální expozice u dětí, a proto Evropská unie zakázala prodej všech dětských hraček a předmětů pro péči o děti z měkčeného PVC, jež obsahují DEHP, DBP a BBP, ale také DiNP, DnOP a DiDP určených pro děti do tří let (Schettler, 2005). V roce 2007 bylo nařízeno, že DEHP, DBP a BBP nesmí být v hračkách vůbec obsaženy. Zároveň nesmí maximální množství ftalátů DiNP, DiDP a DnOP překročit koncentraci 0,1 % hmotnostních v dětských hračkách a předmětech určených pro péči o děti (Válek, 2016). Shen (2005) se zabýval stanovením ftalátů celkem v 25 polymerních materiálech. Na základě této studie identifikoval tři nebo i více ftalátů u 24 plastových vzorků. Převládajícím ftalátem ve vzorcích byl DEHP Zdravotnictví a farmacie Výskyt ftalátů byl zjištěn nejen v lékařských přístrojích vyrobených z PVC, ale také ve farmaceutických výrobcích (Schettler, 2005). Mnoho nemocnic využívá zdravotnické prostředky z polyvinylchloridového materiálu, jenž vylučuje DEHP. Na trhu je však dostupných mnoho druhů plastových materiálů bez obsahu nebezpečného PVC, které by bylo vhodnější využít. Jedná se například o ethylenvinylacetát, polypropylen nebo polyethylen (Růžičková et al., 2004). V materiálech sloužících pro lékařské účely (infúze, transfúze, dialýza) bývá využíván zejména DEHP, a to v koncentracích až do 40% hmotnostních. Rizikové skupiny tvoří pacienti při hemodialýze, jelikož jsou v pravidelných intervalech přímým způsobem ohroženi uvolňováním ftalátů z materiálů měkčeného PVC přímo do krve (IARC, 2001). Novorozenci jsou paradoxně vystaveni ftalátům již po narození prostřednictvím zdravotnických pomůcek nebo zařízení v nemocnicích, které velmi často obsahují DEHP (Bowman et Choudhury, 2016). U předčasně narozených dětí, zejména velmi 27

29 malého vzrůstu, bývají mnohdy potřebné léčebné procedury, například krevní transfúze. Krev, červené krvinky nebo krevní plazma jsou však často dodávány v materiálu s obsahem DEHP, čímž po následné aplikaci dochází ke vniknutí ftalátů do těla pacienta (Růžičková et al., 2004). I přesto, že Evropská unie zakázala používání DEHP do kosmetických výrobků, přípravků pro osobní péči a hraček, v lékařských zařízeních je jeho použití stále povoleno (Růžičková et al., 2004). Současné výzkumy se však zaměřují na stanovení limitních požadavků pro používání DBP a DEP v lékařských prostředcích (Miljøstyrelsen, 2013). Doporučuje se, aby novorozencům a kojencům byla podávána parentální výživa prostřednictvím produktů, jež neobsahují DEHP (Heudorf et al., 2007). Ftaláty nalézají uplatnění rovněž při výrobě léků, kde se využívají jako pomocné látky u enterosolventních tablet. Mezi schválené ftaláty v lécích patří DBP a DEP (Heudorf et al., 2007). Ftaláty v enterosolventních tabletách se využívají z důvodu předcházení dráždění sliznice žaludku (Miljøstyrelsen, 2013) Kosmetika a výrobky pro osobní péči Koncentrace ftalátů byly zjištěny v kosmetických přípravcích a výrobcích pro osobní péči, avšak informace o potenciální expozici člověka při použití těchto přípravků jsou omezené (Koniecki et al., 2011). Přítomnost ftalátů je možno evidovat v parfémech kvůli udržení vůně, přípravcích na vlasy (spreje, pěny, gely), deodorantech včetně antiperspirantů, lacích na nehty, pleťových přípravcích (pleťové vody, tělová mléka a krémy), ale také v přípravcích pro děti. Ve výše uvedených výrobcích byly naměřeny poměrně vysoké koncentrace zejména DEP, což potvrzuje primární využití této sloučeniny. V předchozích letech byly v kosmetice zjišťovány taktéž vyšší koncentrace DBP, avšak v současné době je zakázán pro použití v kosmetice včetně laků na nehty (Koniecki et al., 2011). Epidemiologické studie potvrdily, že užívání určitých výrobků osobní hygieny s PAE zvyšuje monoesterové metabolity ftalátů v moči. U žen byly naměřeny v reprodukčním věku vyšší koncentrace metabolitů ftalátů než u mužské populace, což naznačuje, že ženy vlivem častějšího užívání produktů osobní péče jsou náchylnější expozici ftaláty než muži (Braun et al., 2014). 28

30 3.5.5 Podlahy z polyvinylchloridu Používání podlahových materiálů z polyvinylchloridu může mít za následek uvolňování ftalátů do vnitřního prostředí. Rizikové skupiny jsou zejména kojenci a batolata, u nichž dochází ke zvýšené expozici zejména prostřednictvím podlahového prachu. Na základě dostupných výzkumů se předpokládá, že PVC podlahy zvyšují riziko výskytu astmatických a alergických onemocnění u dětí (Carlstedt et al., 2013) Rukavice Ftaláty jsou rovněž používány při výrobě gumových latexových rukavic. Studie prokázaly, že používání jednorázových rukavic z PVC materiálu při kontaktu s potravinami během tepelného zpracování způsobuje vyšší koncentrace DEHP v konečném produktu, zvláště jedná-li se o potraviny bohaté na lipidy (Luch et al., 2012). 3.6 Účinky ftalátů na zdraví Estery kyseliny ftalové jsou v současné době předmětem mnoha krátkodobých i dlouhodobých výzkumů na laboratorních zvířatech, jelikož i přes jejich nízkou nebo žádnou akutní toxicitu byly prokázány nežádoucí účinky na zdraví (Tab. 4) (David et Gans, 2003). Mezi nejčastěji sledované ftaláty patří DEHP, DBP a BBP (Miljøstyrelsen, 2013). U laboratorních zvířat byl zjištěn teratogenní a karcinogenní účinek, antiandrogenní aktivita a reprodukční toxicita. Výzkumy potvrdily vznik vývojových dysfunkcí, jako je například malformace (znetvoření, vrozené vývojové úchylky tvaru), poranění varlat, poškození jater nebo dokonce úmrtí plodu. Ftaláty jsou rovněž definovány jako peroxisomální proliferátory (Latini, 2005). U hlodavců, kteří byli dlouhodobě vystaveni účinku ftalátů s vysokou molekulovou hmotností (DEHP), došlo k výskytu karcinomu jater (David et Gans, 2003). DEHP a DBP jsou klasifikovány jako endrokrinní disruptory s reprotoxickým účinkem, jejichž expozice má nežádoucí vliv na syntézu pohlavního hormonu testosteronu u mužů (Bowman et Choudhury, 2016). 29

31 V současné době prováděné studie naznačují, že expozice ftalátů pravděpodobně souvisí taktéž s alergickými reakcemi (Lin et al., 2018). Některé výzkumy uvádí, že expozice ftalátů v domácím prostředí zvyšuje riziko nežádoucích účinků na dýchací cesty a imunitní systém (Koniecki et al., 2011). Tab. 4 Negativní účinky vybraných ftalátů na zdraví (Kumar, 2017) Ftalát DMP DEP DBP BBP DEHP Dopad na zdraví Fetální toxicita, vývojové abnormality oka a ucha, postihuje muskuloskeletální systém Poruchy růstu Snížená produkce spermií, mírné podráždění kůže Testikulární toxicita, kryptorchismus, snížení anogenitální vzdálenosti, moduluje hladiny steroidních hormonů Hepatocelulární karcinom, omezení růstu plodu, anovulace, testikulární toxicita Endokrinní disruptory a reprodukční toxicita Estery kyseliny ftalové se řadí mezi endokrinní disruptory (ECD), kterými se rozumí exogenní chemické látky vyskytující se ubikvitárně v životním prostředí, jež mohou měnit funkce hormonálního systému a následně vyvolat nežádoucí účinky na zdraví (Caserta et al, 2007). ECD jsou všudypřítomné kontaminanty nacházející se v obalech potravin, kosmetice, stavebních materiálech, pleťových přípravcích, nábytku nebo v podlahových krytinách. Uvolňování endokrinních disruptorů z výrobků či materiálů a jejich následná sedimentace například v prachu je nebezpečná zejména pro děti, mladé jedince a těhotné ženy, jež jsou tomuto riziku vystaveni. Výrobky z plastů často obsahují jeden nebo i více druhů chemických látek, které mohou vyvolat endokrinní poruchy (Evropský parlament, 2013). Endokrinní systém je nezbytný pro různé biologické úlohy, včetně reprodukční funkce a sexuálního vývoje. Z tohoto důvodu u lidí existují obavy týkající se nežádoucích účinků expozice ftalátů během vývoje (Lyche et al., 2009). Z provedených výzkumů vyplývá, že právě ftaláty s rozvětveným postranním řetězcem narušují reprodukční vývoj (Marie et al., 2015). 30

32 Intenzivní studie na hlodavcích, především na potkanech, prokázaly antiandrogenní vlastnosti ftalátů, zejména u DEHP (rovněž i jeho metabolit MEHP), DBP, BBP, DiDP a DiNP (Lottrup et al., 2006; Lee et Koo, 2007). Významným ukazatelem antiandrogenního vlivu je zkrácení anogenitální vzdálenosti (Meeker et al., 2009) Karcinogenní a teratogenní účinky Některé estery kyseliny ftalové jsou klasifikovány jako pravděpodobné karcinogenní látky s účinkem na lidskou populaci. Výzkumy potvrzují, že se jedná o peroxisomální proliferátory, jež mají vliv na aktivitu enzymů v játrech a zvýšení počtu a velikosti peroxizomů. DEHP a BBP mohou být důvodem vzniku hepatocelulárního karcinomu, respektive orální příjem DEHP způsobuje vznik nezhoubného nádoru jater (hepatocelulární adenom) nebo zhoubného nádoru jater (karcinom). BBP pravděpodobně zvyšuje výskyt karcinomu u žen, poněvadž byla zjištěna souvislost mezi naměřenými koncentracemi BBP v moči a rizikem vzniku karcinomu prsu (Wang et al., 2012). Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny (IARC) však dospěla k názoru, že DEHP nemůže být klasifikován jako lidský karcinogen, jelikož indukuje jaterní nádory u hlodavců aktivačním mechanismem, což není pro člověka relevantní. Z tohoto důvodu je DEHP klasifikován do skupiny 2B, tedy pouze jako pravděpodobný lidský karcinogen (Karačonji et al., 2017) Účinky na zdraví kojenců, batolat, dětí a dospívajících U kojenců, batolat, dětí a dospívajících jsou zdroje a cesty expozice ftalátů ovlivňovány vývojem, a proto je důležité zvážit zejména potenciální expoziční cesty. Jak již bylo výše řečeno, hlavním zdrojem DEHP či DBP je jídlo, DEHP bývá hojně rozšířen rovněž v prachu. Děti a batolata mají vyšší příjem ftalátů, a to v důsledku zvýšeného příjmu jídla a vody (vztaženo na požadavky na tělesnou hmotnost) a zvýšenou náchylností jejich úst k materiálům s obsahem PVC. Existuje obava ohledně negativních účinků ftalátů na normální růst a vývoj (Braun et al., 2013). Výzkumy prokazují, že kojenci jsou nepřímo spojeni s přítomností ftalátů již v mateřském mléce (Bi et al., 2015). Bylo zjištěno, že ftaláty DEHP, DBP, DiNP 31

33 a DiDP mohou již u kojenců působit antiandrogenně, čímž může dojít ke zkrácení anogenitální vzdálenosti (Lee et Koo, 2007). Zvýšená expozice ftalátů již v raném věku může mít za následek narušení správné funkce plic, riziko vzniku chronické bronchiální obstrukce, poruchy autistického spektra, vývoj alergických a astmatických onemocnění (Karačonji et al., 2017; Bi et al., 2015). Vznik astmatu a alergických onemocnění je spojen s vyššími koncentracemi ftalátů prachu v domácnostech, především z podlahových krytin vyrobených z polyvinylchloridového materiálu (Larsson et al., 2010). Zhang et al. (2015) zkoumali, zda může mít expozice ftalátů vliv na pubertální vývoj. Na základě provedeného výzkumu došli k názoru, že ftaláty mohou ovlivňovat, respektive urychlit, nebo opozdit pubertální vývoj, dále mohou působit na homeostázu v energetickém metabolismu a lipogenezi. U dívek bylo zjištěno, že vlivem expozice ftalátů (DEHP, DBP) dochází k dřívějšímu nástupu puberty, naopak u chlapců estery kyseliny ftalové prokazovaly antiandrogenní vliv a následně opožděný nástup puberty. U chlapců může při zvýšené koncentraci ftalátů rovněž docházet ke špatnému vývoji pohlavních orgánů, což může způsobovat snížení plodnosti a zvýšení rizika karcinomu prostaty (Válek, 2016). U dětí konzumujících potraviny s obsahem DEHP byly naměřeny nižší hladiny hormonů stimulujících štítnou žlázu, jež jsou důležité pro správný vývoj reprodukčního systému. Pokud je hormonů štítné žlázy při vývoji plodu nebo po narození dítěte nedostatek, může docházet k poškození mozku a neurologickým poruchám (Karačonji et al., 2017) Účinky na zdraví mužů Dostupné výzkumy zejména na hlodavcích prokazují, že u mužské populace působení esterů kyseliny ftalové nežádoucím způsobem ovlivňuje reprodukční systém. Zvýšená expozice má za následek statisticky významné snížení počtu spermií, jejich pohyblivosti a celkové kvality spermatu. Současné vědecké studie naznačují, že níže popsané účinky na hlodavcích jsou rovněž relevantní pro muže (Kay et al., 2014). Expozice ftalátů (DEHP, DBP a BBP) inhibuje produkci fetálního testosteronu z Leydigových buněk (Swan, 2008). Rovněž může dojít ke kryptorchismu, hypospadii či k různým malformacím (Meeker et al., 2009). Několik studií uvádí, že 32

34 ftaláty mohou být důvodem mužské neplodnosti (Valenzuela-Leon et Dobrinski, 2017). Spektrum účinků označující výše popsané abnormality bývá označováno jako ftalátový syndrom (Meeker et al., 2009). Ftalátový syndrom se u potkanů projevuje právě testikulárním poškozením, kryptorchismem, deformacemi chámovodů, nadvarlat, semenných váčků, prostaty nebo externího genitálu (Latini et al., 2006). Rovněž může dojít k neúplnému testikulárnímu sestupu, menší hmotnosti varlat, velikosti penisu a zkrácení anogenitální vzdálenosti (Swan et al., 2014). Vědci rovněž zkoumali účinky ftalátů na spermatogonální kmenové buňky, konkrétně u opic Rhesus, u kterých došlo vlivem zvýšené koncentrace DEHP a DBP k narušení steroidogenní dráhy a snížení počtu Sertoliho buněk (Valenzuela-Leon et Dobrinski, 2017) Účinky na zdraví žen Zvýšená expozice ftalátů u žen může mít za následek negativní účinek na délku těhotenství a zvýšené riziko potratovosti (Válek, 2016). Vyšší koncentrace DEHP rovněž negativně ovlivňují plodnost žen (Net et al., 2015). Působením ftalátů může docházet k narušení hormonů štítné žlázy, vyšší hodnotě hladiny oxidativního stresu, vzniku zánětů nebo ke vzniku endometríózy (Ferguson et al., 2014). U žen je hlavním endokrinním orgánem vaječník, jenž je důležitý pro správný průběh fyziologických funkcí a schopnost reprodukce. V současné době experimenty na zvířatech prokázaly, že DBP narušuje folikulogenezi a snižuje hladinu ženského pohlavního orgánu estradiolu (Graig et Ziv-Gal, 2017). Provedené výzkumy na potkanech prokázaly, že působení ftalátů během těhotenství může u samic způsobovat resorpci plodů a zvyšovat počet mrtvých plodů, nižší hmotnost potomků při narození a různé malformace plodu, jako je rozštěp patra, atrezie nebo deformace skeletu (Mikula et al., 2005). Studie Ferguson et al. (2013) prokázala, že u žen ve třetím trimestru těhotenství, u nichž byly naměřeny metabolity esterů kyseliny ftalové v moči, bylo zvýšené riziko předčasného porodu. 33

35 3.7 Legislativní předpisy Vzhledem k negativním účinkům ftalátů je nutné tyto látky regulovat právními předpisy. Právní předpisy Evropské unie mají v zásadě bezprostřední přednost před právem členského státu (Týč, 2014). Regulačním rámcem Evropské unie pro chemické látky je nařízení REACH zabývající se právními předpisy ohledně uvádění chemických látek na trh. Nařízení je platné na území všech členských států EU, tedy i v České republice. Cílem nařízení REACH je zajistit vstupování na trh pouze takových chemických látek, u nichž nebyly prokázány negativní účinky na lidské zdraví a životní prostředí. Z tohoto důvodu bylo zavedeno registrování chemických látek vyráběných v zemích EU nebo do nich vyvážených, a to v množství převyšující 1000 kg/rok. Povinnost registrace látek podle nařízení REACH musí mít chemické látky klasifikované jako nebezpečné včetně chemických látek, jež se mohou uvolňovat z výrobku při jeho používání v případě, že množství látky ve výrobku je vyšší než jedna tuna ročně. Nařízení REACH zahrnuje například následující estery kyseliny ftalové: DEHP, DBP, DEP, BBP nebo DMP (Miljøstyrelsen, 2013; Přichystalová et al., 2013) Evropské legislativní požadavky Sloučeniny DEHP a DBP jsou dle nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 o klasifikaci a označování a balení látek a směsí, zařazeny do skupiny 1B, kterými se označují látky toxické pro reprodukci, u nichž provedené výzkumy na zvířatech prokázaly nepříznivé účinky na sexuální funkci, plodnost nebo vývoj. Nařízení Evropského Parlamentu a Rady (ES) č. 1935/2004 o materiálech a předmětech určených pro styk s potravinami, uvádí, že nesmějí z materiálů migrovat látky v množství, které by ohrožovalo lidské zdraví. Materiály, jež jsou v přímém styku s potravinou, musí splňovat požadavky dané v nařízení Komise (EU) č. 10/2011 o materiálech a předmětech z plastů pro styk s potravinami. V nařízení je stanoven specifický a celkový migrační limit pro zajištění bezpečnosti konečného materiálu nebo předmětu. Specifickým migračním limitem je stanoveno nejvyšší povolené množství látky v potravině, jež činí pro DBP 0,3 mg.kg -1 a pro DEHP 1,5 mg.kg -1 potraviny. Celkový migrační limit je naopak nejvyšší povolené množství jednotlivých látek, vyjádřených jako celkový obsah 34

36 uvedených látek, jež se uvolňují do potravin nebo simulantů potravin. Limit celkové migrace nesmí přesáhnout 10 mg na 1 dm 2 povrchové plochy nebo 60 mg na 1 kg potraviny. Seznam Unie povolených látek pro výrobu polymerů včetně omezení týkajících se jednotlivých esterů kyseliny ftalové, je vyobrazen v Příloze 1 výše uvedeného nařízení. Je zde rovněž definováno použití DBP a DEHP. Obě sloučeniny mohou být použity jako plastifikátory v předmětech a materiálech určených pro opakované použití přicházejících do styku s beztukovými potravinami, avšak pro DBP je stanovena maximální koncentrace 0,05 % konečného výrobku, v němž slouží jako technická pomocná látka v polyelofinech, DEHP může být použit rovněž jako technický konečný materiál, nicméně v množství do 0,1 % konečného výrobku. Dle směrnice Evropského parlamentu a Rady 2007/47/ES musí být na zdravotnických pomůckách, z nichž by se mohly do těla pacienta uvolňovat estery kyseliny ftalové, zřetelné označení. Nařízení Komise (ES) č. 552/2009 omezuje DBP, DEHP a BBP uvádět na trh nebo používat jako látky ve směsích či koncentracích převyšujících 0,1 % hmotnosti v materiálech z měkčeného plastu sloužících pro výrobu hraček či předmětů pro péči o děti, kterými se rozumí výrobky usnadňující dětem hygienu, krmení, sání, spánek nebo odpočinek Národní legislativní požadavky Národní legislativní požadavky jsou stanoveny ve vyhlášce Ministerstva zdravotnictví České republiky č. 127/2009 Sb., o hygienických požadavcích na výrobky určené pro styk s potravinami a pokrmy. Uvedená vyhláška formuluje specifikace ohledně produktů z plastů a jejich materiálů. Rovněž je definován specifický a celkový migrační limit. Požadavek na omezení použití jednotlivých ftalátů, jenž je stanoven v nařízení Komise (EU) č. 10/2011, o materiálech a předmětech z plastů pro styk s potravinami, je v českém právním řádu upraven vyhláškou Ministerstva zdravotnictví č. 38/2001 Sb., o hygienických požadavcích na výrobky určené pro styk s potravinami a pokrmy. Ve znění vyhlášky č. 409/2005 Sb., o hygienických požadavcích na výrobky přicházejících do přímého styku s vodou a na úpravu vody, je stanoveno omezení na 35

37 množství DEHP v pitné vodě, jež nesmí přesáhnout maximální přípustnou koncentraci 0,008 mg.l -1. V souladu s nařízením vlády č. 9/2013 Sb., jímž se mění nařízení vlády č. 361/2007 Sb., kterým se stanovují podmínky ochrany zdraví při práci, jsou určeny chemické látky a jejich hygienické limity pro ochranu lidského zdraví. V tomto nařízení je zaveden pojem tzv. přípustný expoziční limit (PEL) chemické látky v pracovním ovzduší, kterému může být vystaven zaměstnanec v pracovní době, aniž by při celoživotní pracovní expozici docházelo k poškození jeho zdraví nebo ohrožení jeho pracovní výkonnosti a schopnosti. Nejvyšší přípustné koncentrace (NPK-P) chemických látek v pracovním ovzduší jsou takové koncentrace látek, kterým nesmí být zaměstnanec v žádném časovém úseku pracovní doby vystaven. V nařízení je uveden seznam chemických látek a jejich přípustné expoziční limity a nejvyšší přípustné koncentrace, ve kterém jsou zahrnuty rovněž DEHP a DBP, pro které platí hodnota PEL 5 mg.m -3 a NPK-P 10 mg.m Metody stanovení ftalátů Stanovení ftalátů v potravinářských matricích může být mnohdy velmi obtížné, jelikož koncentrace PAE v potravinách bývá velmi nízká, někdy dokonce i pod mezí detekce (Yang et al., 2013). Mez detekce (LOD limit of detection) znázorňuje hodnotu koncentrace, pro kterou je analytický signál odlišný od šumu (Kovács et Csapó, 2015). Problémem při monitoringu ftalátů v potravinách, včetně složek životního prostředí, je přítomnost těchto látek prakticky všude, stopová množství jsou obsažena taktéž ve všech rozpouštědlech, chemikáliích a laboratorních materiálech, jež jsou nezbytné pro analýzu testovaných výrobků (Cao, 2010). Hlavní komplikací při analýze ftalátů je riziko sekundární kontaminace, jež může vést ke zkresleným závěrům. Ke kontaminaci může dojít v důsledku ubikvitárního výskytu ftalátů v každé fázi analytického stanovení, včetně odběru vzorku, jeho přípravy (extrakce, čištění) i vlastní chromatografické analýzy (David et al., 2003). Z tohoto důvodu je nezbytné dbát na bezpečnostní opatření a minimalizovat veškeré potenciální zdroje kontaminace, zejména úpravou materiálů pomocí destilované vody a následného propláchnutí hexanem (Fromme et al., 2011). 36

38 Používané chemikálie mohou být rovněž zdrojem ftalátů, zejména kontaminací z laboratorního vzduchu, a proto je potřebné, aby byly láhve uchovávány uzavřené až do použití. Plastové materiály, včetně latexových rukavic, obsahují rovněž ftaláty, a proto je nezbytné vyhýbat se těmto materiálům, v ideálním případě odstranit plastové materiály a pomůcky zcela z laboratoře. V neposlední řadě je nutno podotknout, že mnohdy také výrobky pro osobní hygienu (mýdla, ruční krémy a kosmetika) obsahují ftaláty (David et al., 2003). DEHP tvoří přibližně 50 % světové produkce ftalátů, což je důvod, proč patří mezi nejčastěji analyzované ftaláty v potravinách. Mezi další nejvíce stanovované ftaláty patří DBP a BBP (Wenzl, 2009). Stanovení DEHP ve vzduchu, půdě, vodě a sedimentech se obvykle provádí plynovou chromatografií, pro potraviny bývá používána především vysokoúčinná kapalinová chromatografie (IARC, 2001). Pro analýzu ftalátů se využívají analytické techniky založené na extrakci vhodným rozpouštědlem a následné stanovení prostřednictvím chromatografických metod. Extrakce se provádí nejčastěji hexanem, dichlormethanem nebo chloroformem, ale mohou být využity rovněž metody mikroextrakce a superkritické fluidní extrakce pomocí CO2 ke stanovení pevného vzorku (Wenzl, 2009) Chromatografické metody Chromatografie je významná analytická separační metoda, která umožňuje separaci, identifikaci a čištění složek směsi pro kvalitativní a kvantitativní analýzu. Princip spočívá v oddělení analytu mezi dvě vzájemně nemísitelné fáze, z nichž jedna je mobilní pohyblivá a druhá stacionární nepohyblivá (Coskun, 2016). Stacionární fází se rozumí sorbent umístěný ve vrstvě nebo ve sloupci. Mobilní fáze rozhoduje o charakteru chromatografie (Králová et al., 2001). Jako mobilní fáze bývá v případě plynové chromatografie používán plyn, u vysokoúčinné kapalinové chromatografie se jedná o kapalinu (Kovács et Csapó, 2015). Při chromatické separaci dochází k proudění mobilní fáze, při kterém jsou vzorky analytu unášeny přes stacionární fázi (Klouda, 2003). Stacionární fázi (sorbent) mohou tvořit tuhé látky, tenký film kapaliny nanesený na vnitřní stěně kapiláry nebo tenká vrstva kapaliny na pevných částicích (Jančářová et Jančář, 2008). Pro analýzu esterů kyseliny ftalové se využívají zejména chromatografické metody, z nichž nejvíce plynová chromatografie (Gas Chromatography GC) 37

39 a vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High Performance Liquid Chromatography HPLC), jež budou popsány v následujících kapitolách (David et al., 2003). Analýza esterů kyseliny ftalové v praktické části diplomové práce byla provedena pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie, a proto bude podrobněji popsána právě tato metoda stanovení Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC), nazývaná též jako vysokotlaká kapalinová chromatografie, je velmi používanou analytickou technikou pro separaci, identifikaci a kvantifikaci složek směsi (Malviya et al., 2010). Aplikace vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) je vhodná na rozdíl od plynové chromatografie taktéž pro separaci netěkavých a tepelně nestálých sloučenin (Klouda, 2003). V potravinářství bývá využívána zejména pro stanovení tuků, sacharidů, vitaminů, aditiv nebo kontaminujících látek (Bélanger et al., 1997). Pro HPLC je charakteristické přivádění mobilní fáze do systému prostřednictvím čerpadla za podmínek vysokého tlaku (Nováková et Douša, 2013). Obr. 4 Schéma kapalinového chromatografu (Klouda, 2003) Instrumentace pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (Obr. 4) se sestává ze zásobníku mobilní fáze, vysokotlakého čerpadla, dávkovacího zařízení, chromatografické kolony, detektoru a registračního zařízení (Novák, 1993). Čerpadlo - díky vysokému tlaku (až 50 MPa) zajišťuje konstantní průtok mobilní fáze v rozmezí 0,1 ml.min -1 až 10 ml.min -1. V současné době se nejčastěji využívají pístová čerpadla, u nichž se kapalina střídavě vytlačuje a následně je nasávána pohyby pístu (Novák, 1993). 38

40 Dávkovací zařízení - k dávkování vzorku slouží především manuální smyčkové dávkovače (injektory), jejichž úlohou je umístit vzorek do kolony. Toto se provádí pomocí injekční stříkačky, zatímco eluent proudí z čerpadla do kolony při vysokém tlaku. Injektory pracují na principu přepínacích ventilů a umožňují přesné dávkování pouze požadovaného objemu vzorku. Lze využít také automatické dávkovače, jež umožňují dávkovat velké množství vzorků (Novák, 1993; Kovács et Csapó, 2015). Kolona chromatografu - musí odolávat tlakům až do 60 MPa, chemickému působení separovaných látek a mobilních fází, a proto bývá zhotovena převážně z nerezových rovných trubic s hladkým vnitřním povrchem. V HPLC se používají hlavně detektory koncentračního typu, které poskytují signál úměrný koncentraci zjišťovaných látek v eluátu, tedy v mobilní fázi. Nejpoužívanějšími detektory jsou detektory pracující v ultrafialové oblasti, detektory fluorometrické, elektrochemické a refraktometrické (Novák, 1993). Detektor jedná se o zařízení monitorující změny ve složení mobilní fáze (Kovács et Csapó, 2015). Na základě výše definovaných instrumentací sloužících pro HPLC je třeba zmínit ve stručnosti princip dané metody. Stacionární fáze, jež je tvořena polárním adsorbentem (křemík, oxid křemičitý), je zakotvena v chromatografické koloně. Vzorky jsou dávkovány dávkovacím zařízením do mobilní fáze, kterou je kapalina, konkrétně nepolární rozpouštědlo (například hexan). Působením vysokého tlaku postupuje mobilní fáze prostřednictvím čerpadla kolonou. Po průchodu kolonou dochází k separaci analytů a následné detekci vzorků v detektoru. Retenčním časem se rozumí doba, jež uplyne od nástřiku vzorku po dosažení maximální velikosti křivky (píku). Chromatogram je grafickým záznamem závislosti odezvy detektoru na retenčním čase, který slouží k hodnocení plochy nebo výšky píku (Malviya et al., 2010). Záznam z chromatografu bývá zpravidla charakterizován křivkami gausovského tvaru označovanými jako píky neboli eluční křivky (Nováková et Douša, 2013; Kovács et Csapó, 2015) Plynová chromatografie Plynová chromatografie (GC) je metoda sloupcové chromatografie, při níž bývá používána jako mobilní fáze plynná látka a stacionární fází se rozumí imobilizovaná kapalina nebo pevná látka, jež je zabalena v uzavřené trubici. Tato metoda se používá 39

41 zejména při separaci tepelně stabilních těkavých látek, příkladem lze uvést methylestery mastných kyselin (Kovács et Csapó, 2015). Použití plynové chromatografie (GC) má řadu výhod, mezi které patří zejména skutečnost, že se jedná o jednoduchou metodu, která se vyznačuje rychlým průběhem procesů v plynné fázi a zároveň je poměrně jednoduché dospět k teoretickým závěrům a interpretovat výsledky měření, poněvadž systém není vzdálen ideálnímu chování (Štulík, 2006). GC však může být použita pouze pro separaci látek, které lze převést do plynné fáze, tedy látek tepelně stálých, s dostatečným tlakem syté páry a s relativní molekulovou hmotností menší než Vzorek je dávkován do proudu plynu a následně je unášen kolonou (Klouda, 2003). Mobilní fáze je tvořena nosným plynem, což je obecné označení pro inertní plyny, používá se zejména helium, dusík, argon, vodík a kysličník uhličitý. Hlavním problémem v GC jsou nečistoty (vodní pára a kyslík), které se nachází v nosném plynu, a proto je nutné používat plyny o vysoké čistotě (Ševčík, 2005). Princip separace pomocí GC (Obr. 5) spočívá v tom, že kolonou naplněnou sorbentem (stacionární fází) prochází nosný plyn. Vzorek se nastříkne do injektoru (temperovaná nástřiková komora), kde je následně odpařen ve formě par a unášen nosným plynem páry až do kolony, ve které probíhá separace vzorku na jednotlivé složky, které postupně vychází z injektoru a vstupují do detektoru. Detektor slouží k detekci separovaných látek v nosném plynu (Jančářová et Jančář, 2008). Obr. 5 Schéma plynového chromatografu (Klouda, 2003) 40

42 4 MATERIÁL A METODIKA Experimentální část diplomové práce se zaměřuje na stanovení koncentrací vybraných esterů kyseliny ftalové, konkrétně DEHP a DBP ve vzorcích jogurtů. Jogurty byly vyrobeny na pavilonu M Ústavu technologie potravin Mendelovy univerzity v Brně, analýza vzorků jogurtů i obalových materiálů probíhala v chemické laboratoři Ústavu technologie potravin Mendelovy univerzity v Brně. 4.1 Materiál Vzorky jogurtů Mléko, z něhož byly jogurty vyrobeny, pocházelo od holštýnských dojnic z Jihomoravského kraje. Jeho procentuální složení bylo následující: 4,5 % laktosy, 3,42 % proteinů a 3,5 % tuku. Pasterace mléka byla provedena při teplotě 85 C po dobu 5 minut, poté následovalo ochlazení na 36 C. Po zaočkování mléka a 18hodinové fermentaci při 36 C bylo mléko homogenizováno po dobu 5 minut. Hotové jogurty byly z důvodu zvýšení výživové hodnoty obohaceny vlákninou, konkrétně bambusovou a chia vlákninou v množství 1 % a 5 % hmotnostních, poté byl analyzován obsah ftalátů (DBP a DEHP) v jednotlivých vzorcích v průběhu skladování (v nultém, prvním, druhém a třetím týdnu). Rovněž byl zjišťován obsah ftalátů v plastových obalových materiálech a byla sledována jejich případná migrace do vzorků jogurtů. Pro účely diplomové práce byly použity tři vzorky jogurtů natural nebo jogurtů s přídavkem chia a bambusové vlákniny v množství 1 % a 5 %, které byly analyzovány duplicitně pro každý týden skladování a každý druh jogurtu (šest vzorků jogurtů jednoho druhu v jednom týdnu), přičemž celkový počet činil 120 analyzovaných jogurtů. Chia semena Chia jsou drobná semena šalvěje hispánské (Salvia hispanica L.), která jsou zkoumána především díky jejich obsahu tuků (30 35 %), proteinů (19 23 %), vlákniny (34 40 %) a antioxidantů (Silva et al., 2016). V současné době se řadí mezi funkční potraviny. Některé studie poukazují, že přidání látek s vysokým 41

43 obsahem vlákniny do běžných výrobků potraviny má pozitivní účinky. Studie Ayaz et al. (2017) zaznamenala po přídavku chia semen do jogurtu zvýšený pocit sytosti. Bambusové výhonky Bambusové výhonky se vyznačují bohatým obsahem bílkovin, sacharidů, vlákniny, minerálních látek a vitaminů. Naopak obsahují nízký obsah tuků (2,46 g/100 g) a cukrů. Současné výzkumy poukazují na zdravotní benefity konzumace bambusových výhonků, zejména pak na jejich antibakteriální, antioxidační, protinádorovou a antivirovou funkci. Bambusovou vlákninou mohou být obohaceny pekařské, mléčné i masné výrobky. Doporučená denní dávka činí pro dospělého jedince g (Chongtham et al., 2011). Seçkin et Baladura (2012) zkoumali v jogurtech účinky různých druhů vlákniny v průběhu skladování. Ve svém výzkumu u jogurtů s bambusovou vlákninou v průběhu skladování zjistili vyšší hodnoty pevnosti, zejména v důsledku vysoké schopnosti zadržovat vodu Obalový materiál Pro analýzu DBP a DEHP byly použity vzorky obalů, do nichž byly jogurty plněny. Celkem bylo sledováno pět vzorků obalových materiálů (s označením 1K 5K). Odebrané vzorky obalů pocházely z obvodové stěny kelímku Chemikálie Standardy DBP a DEHP o minimální čistotě 99,9 % (Supelco) Acetonitril (Penta) Dichlormethan (Penta) Hexan (Honeywell) Aceton (Mikrochem) Koncentrovaná kyselina sírová p. a. (Lachema) Dusík (SIAD) Přístroje a pomůcky Zařízení pro homogenizaci vzorků (tyčový mixér) Stříkačka s jehlou Hamilton (Švýcarsko) 42

44 Analytické váhy (ABJ 220 4M Kern&Sohn GmbH; Německo) Zařízení pro lyofilizaci vzorků (lyofilizátor Alpha 1-2 LD plus; Německo) Třepačka (GFL typ 3005 Gesellschaft für Labotechnik mbh; Německo) Vakuová rotační odparka RVO (05-ST, IKA Werke GmbH&Co KG; Německo) Filtrační papíry Zařízení k separaci ko-extraktů od ftalátů - gelová permeační chromatografie (ECOM spol. s.r.o.; Česká republika) Zařízení pro homogenizaci vzorků vortex (MS2, IKA WerkeGmbH&Co KG; Německo) Chlazená centrifuga (Hettich-Zentrifugen D Tuttlingen-universal 32R; Německo) Zařízení k detekci a kvantifikaci ftalátů - vysokoúčinná kapalinová chromatografie Agillent 1100 series (Německo) 4.2 Metodika Stanovení ftalátů ve vzorcích jogurtů Analýza esterů kyseliny ftalové byla provedena dle ověřené metody Jarošová et al. (1999). Metoda je vhodná pro kvantitativní stanovení DEHP a DBP v surovinách a potravinách rostlinného i živočišného původu. Před vlastní analýzou vzorků pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie byla nutná příprava vzorků, jež zahrnovala navážku vzorku, lyofilizaci, extrakci, separaci pomocí gelové permeační chromatografie a následné přečištění vzorků koncentrovanou kyselinou sírovou. Vlastní stanovení bylo provedeno pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Analýza vzorků jogurtů probíhala v chemické laboratoři na Ústavu technologie potravin Mendelovy univerzity v Brně. Příprava vzorků před extrakcí V rámci minimalizace sekundární kontaminace a následných zkreslených výsledků byl nutný úklid laboratoře zahrnující zejména odstranění prachu. Vzorky jogurtů byly homogenizovány a následně z každého jogurtu bylo paralelně naváženo přibližně 20 g do aluminiových misek. Veškeré laboratorní sklo a ostatní pomůcky byly po 43

45 umytí a vypláchnutí destilovanou vodou třikrát důkladně propláchnuty hexanem, aby se zabránilo případné dekontaminaci vzorků. Navážené vzorky byly uchovány v mrazničce při teplotě -18 C. Postupně byly skladované vzorky lyofilizovány. Extrakce organickými rozpouštědly Lyofilizované vzorky byly po kvantitativním převedení do Erlenmayerových baněk extrahovány na třepačce celkem třikrát pomocí směsi rozpouštědel hexanu a acetonu v poměru 1:1. První extrakce probíhala jednu hodinu, druhá a třetí extrakce 30 minut. Po každé extrakci byly vzorky zfiltrovány do odpařovací baňky a ke zbytku byla opět přidána směs rozpouštědel. Po poslední extrakci byly spojené extrakční podíly přefiltrovány, odpařeny na rotační vakuové odparce při maximální teplotě 40 C, a poté byly dosušeny dusíkem. Následně byly vzorky uchovány v mrazicím boxu pro další zpracování. Obr. 6 Třepačka Obr. 7 Vakuová rotační odparka Gelová permeační chromatografie Gelová permeační chromatografie umožňuje separaci sloučenin s podobnou molekulovou hmotností, při které jsou nejprve eluovány molekuly, jež nemohou proniknout do pórů gelového nosiče, naopak nejdéle jsou zadržovány nejmenší molekuly. Před vlastní separací byla kolona alespoň půl hodiny promývána mobilní fází dichlormethan a cyklohexan při průtoku 0,2 ml.min -1. Po promytí smyčky následoval nástřik standardů DEHP a DBP a dle odezvy detektoru byla zjištěna doba, při níž bylo třeba zachytit frakce obsahující ftaláty. Do vialek bylo naváženo přibližně 0,05 g tuku doplněných do 2 ml roztokem mobilní fáze. Toto množství bylo 44

46 promícháno na vortexu a následně pomocí Hamiltonovy stříkačky vstřiknuto do ventilu. Do popsaných a hexanem propláchnutých srdcových baněk byly zachyceny frakce s obsahem DEHP a DBP. Po separaci ftalátů od koextraktu na gelové permeační chromatografii následovalo zahuštění vzorků na rotační vakuové odparce při 40 C. Po vysušení dusíkem byly vzorky pomocí hexanu převedeny do vialek. Obr. 8 Gelová permeační chromatografie Čištění koncentrovanou kyselinou sírovou Obsah vialek byl vysušen na 1 ml, k němuž byl přidán 1 ml 96% kyseliny sírové (H2SO4). Po desetiminutovém intenzivním třepání na třepačce byly fáze odděleny na centrifuze po dobu 10 minut při 4 C, počet otáček byl 1000 za minutu. Došlo k vytvoření dvou fází, z nichž organická frakce (hexanová - vrchní) byla odstraněna do odpadu. Po přídavku 2 ml 65% kyseliny sírové a 1 ml hexanu byly vzorky opět třepány a následně odstředěny, čímž došlo opět k vytvoření dvou fází, z nichž však hexanová fáze již obsahovala ftaláty a byla pomocí Hamiltonovy stříkačky převedena do malých vialek. Proces třepání a odstředění byl opakován při stejných podmínkách ještě dvakrát, vždy s přídavkem 1 ml hexanu. Spojené extrakty byly poté odpařeny do sucha a odparek byl rozpuštěn v 1 ml acetonitonitrilu a následně použit pro analýzu pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Vlastní stanovení obsahu esterů kyseliny ftalové bylo provedeno pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) s UV detekcí (diodové pole) při 45

47 vlnové délce 224 nm. Byla použita kolona Zorbax Eclipse C8, jako mobilní fáze byl použit acetonitril s průtokem 0,8 ml.min -1. Před a po každé analýze bylo prováděno promývání kolony, a to do nulové odezvy detektoru. Automatický dávkovač odebíral množství vzorku 10 μl vždy 7 mm pod úrovní hladiny vzorku. K identifikaci obou esterů kyseliny ftalové, tedy DEHP i DBP byl zjištěn čas eluce a specifického spektra. Limit detekce pro ftaláty v tukové matrici byl 0,2 mg.kg -1 původního vzorku. Při stanovení výsledků se měří plochy píků a z kalibrační přímky byly odečteny koncentrace ftalátů Stanovení ftalátů v obalových materiálech Analýza DBP a DEHP v obalových materiálech byla provedena dle ověřené metody Gajdůšková et al. (1996). Veškeré laboratorní sklo a pomůcky byly rovněž po umytí destilovanou vodou propláchnuty třikrát hexanem. Před vlastním stanovením vzorků pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie byla nutná příprava vzorků. Analýza obalových materiálů byla provedena v chemické laboratoři na Ústavu technologie potravin Mendelovy univerzity v Brně. Příprava vzorků před extrakcí Z každého plastového obalového materiálu od jogurtu byly odebrány vzorky o ploše 10x10 cm (1 dm 2 ), jež byly nastříhány na co nejmenší kousky a následně kvantitativně převedeny do Erlenmayerových baněk. Extrakce organickými rozpouštědly Vzorky obalů byly naloženy do směsi rozpouštědel hexan a dichlormethan v poměru 1:1 po dobu 72 hodin při laboratorní teplotě, načež byly pomocí uvedených směsí rozpouštědel třikrát extrahovány na třepačce, první extrakce probíhala jednu hodinu, druhá a třetí extrakce trvala 30 minut. Po extrakci byly spojené extrakční podíly přefiltrovány, odpařeny na vakuové rotační odparce při teplotě 40 C a dosušeny proudem dusíku. Po trojnásobném vypláchnutí baněk hexanem byly vzorky převedeny do vialek a uchovány v chladicím zařízení. K čirému dusíkem dosušenému extraktu byl přidán 1 ml acetonitrilu, načež bylo možné analyzovat čiré vzorky prostřednictvím HPLC, zatímco zbarvené či zakalené extrakty bylo nutné nejprve odstředit na centrifuze. 46

48 Odstřeďování vzorků Odstřeďování vzorků probíhalo při teplotě 4 C po dobu 10 minut při 1000 otáčkách za minutu. Horní hexanová vrstva (přibližně 1,5 ml) byla odebrána do malé vialky a vysušena proudem dusíku do sucha. Tento postup byl za stejných podmínek opakován ještě jednou. Pokud byl extrakt čirý, doplnila se vialka acetonitrilem na objem 1 ml a byla připravena k analýze pomocí HPLC. Čištění koncentrovanou kyselinou sírovou Čištění koncentrovanou kyselinou sírovou bylo prováděno v případě získaného stále barevného či kalného extraktu. V tomto případě se postupovalo stejným způsobem, jaký je uvedený výše, tedy dle metody Jarošová et al. (1999). Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Stanovení ftalátů v obalových materiálech bylo provedeno pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) s UV detekcí (diodové pole) při vlnové délce 224 nm. Byla použita kolona Zorbax Eclipse C8, jako mobilní fáze byl použit acetonitril s průtokem 0,8 ml.min -1. Před a po každé analýze bylo prováděno promývání kolony, a to do nulové odezvy detektoru. Automatický dávkovač odebíral množství vzorku 10 μl vždy 7 mm pod úrovní hladiny vzorku. K identifikaci obou esterů kyseliny ftalové, tedy DEHP i DBP byl zjištěn čas eluce a specifického spektra. Detekční limit pro ftaláty v obalových materiálech byl 0,1 mg.kg -1 původního vzorku Statistické zpracování dat Výsledky z měření byly zpracovány v programu MS Excel 2016 do tabulek, statistické zpracování bylo provedeno v programu Statistica 12. Po provedení Grubbsova testu byly z naměřených koncentrací vypuštěny odlehlé hodnoty. V práci byly použity metody výpočtu základních parametrů zahrnujících průměr, směrodatnou odchylku a rozptyl, popisná statistika a neparametrické porovnání pomocí Kruskal-Wallisova testu, jenž je založen na pořadí hodnot a porovnává mediány výběrů. 47

49 5 VÝSLEDKY A DISKUZE Výsledky analýzy esterů kyseliny ftalové v obalových materiálech jsou uvedeny v kapitole 5.1, zhodnocení PAE v jogurtech v kapitole 5.2. Naměřené koncentrace DEHP a DBP jsou vyjádřeny pomocí mediánu hodnot, tedy prostřední hodnoty statistického souboru uspořádaného podle velikosti, přičemž platí, že alespoň polovina hodnot je menší nebo rovna mediánu a polovina hodnot je větších. 5.1 Výsledky koncentrace ftalátů v obalových materiálech Pro zjištění koncentrace DEHP a DBP v obalových materiálech bylo analyzováno celkem pět totožných vzorků obalů, jež byly odebrány před naplněním jogurtů do obalů. Naměřené koncentrace DEHP a DBP a vypočítané základní statistické údaje ve sledovaných obalech (n = 5) znázorňuje níže uvedená tabulka (Tab. 5). Tab. 5 Koncentrace DBP a DEHP (mg.kg -1 plastu a µg.dm -2 ) v obalech a základní statistické údaje zahrnující průměr, minimální a maximální hodnotu, směrodatnou odchylku a rozptyl DBP DEHP µg.g -1 plastu µg.dm -2 µg.g -1 plastu µg.dm -2 MIN 31,5 79,9 6,4 16,3 MAX 99,8 254,9 13,0 33,3 Průměr 68,0 174,1 10,2 26,2 SD 31,0 78,0 2,7 6,8 Rozptyl 960,0 4869,6 7,29 46,6 Koncentrace DBP v analyzovaných kelímcích byly naměřeny v rozmezí od 31,5 µg.g -1 plastu (79,9 µg.dm -2 ) do 99,8 µg.g -1 plastu (254,9 µg.dm -2 ), přičemž průměrná koncentrace byla stanovena 68,0 µg.g -1 plastu (174,1 µg.dm -2 ). Koncentrace DEHP byly stanoveny v rozpětí hodnot od 6,4 µg.g -1 (16,3 µg.dm -2 ) do 13,0 µg.g -1 (33,3 µg.dm -2 ). Průměrný obsah DEHP činil 10,2 µg.g -1 (26,2 µg.dm -2 ). Na základě procentuálního vyjádření obsahu DEHP a DBP v kelímcích použitých pro skladování (Obr. 10) bylo stanoveno vyšší zastoupení DBP (87 %), DEHP byl zastoupen pouze ze 13 %. 48

50 Koncentrace (µg.dm -2 ) 200,0 150,0 Koncentrace DBP a DEHP v obalových materiálech 174,1 100,0 50,0 26,2 DBP DEHP 0,0 DBP DEHP Obr. 9 Průměrné koncentrace DBP a DEHP (µg.dm -2 ) v kelímcích použitých pro skladování jogurtů Procentuální zastoupení DBP a DEHP v obalových materiálech 13% 87% DBP DEHP Obr. 10 Procentuální zastoupení DBP a DEHP v kelímcích použitých pro skladování jogurtů Migraci ftalátů z obalových materiálů ovlivňuje mnoho faktorů, zejména fyzikální a chemické vlastnosti polymerního materiálu, složení potraviny, teplota a délka skladování (Sireli et al., 2017). Dle nařízení Komise (EU) č. 10/2011 o materiálech a předmětech z plastů pro styk s potravinami, je pro výrobky určené pro styk s potravinami a pokrmy stanoven celkový migrační limit, jenž nesmí přesáhnout 10 mg na 1 dm 2 povrchové plochy, což znamená u krychlového balení obsahujícího 1 kg potravin migraci 60 mg na 1 kg potraviny. Na základě těchto požadavků lze konstatovat, že stanovené koncentrace 49