MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ LESNICKÁ A DŘEVAŘSKÁ FAKULTA ÚSTAV NAUKY O DŘEVĚ

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ LESNICKÁ A DŘEVAŘSKÁ FAKULTA ÚSTAV NAUKY O DŘEVĚ MONITORING TVORBY DŘEVA BUKU LESNÍHO (Fagus sylvatica L.) NA BUNĚČNÉ ÚROVNI NA VÝZKUMNÉ PLOŠE RÁJEC HOLÍKOV BAKALÁŘSKÁ PRÁCE 2013/2014 Ondřej Veteška

2 Čestné prohlášení: Prohlašuji, ţe jsem práci: Monitoring tvorby dřeva buku lesního (Fagus sylvatica L.) na buněčné úrovni na výzkumné ploše Rájec - Holíkov vypracoval samostatně a veškeré pouţité prameny a informace uvádím v seznamu pouţité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom, ţe se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a ţe Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a uţití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, ţe před sepsáním licenční smlouvy o vyuţití díla jinou osobou (subjektem) si vyţádám písemné stanovisko univerzity, ţe předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to aţ do jejich skutečné výše. V Brně, dne podpis

3 Poděkování Děkuji vedoucímu práce Doc. Ing. Vladimíru Grycovi, Ph.D. za cenné rady, jeho čas a osobní přístup, se kterým přistupoval k řešeným problémům. Děkuji Dr. Kyriaki Giagli a Ing. Marku Fajstavrovi za jejich ochotu, pomoc při metodickém zpracování a poskytnuté materiály. Dále chci poděkovat Ing. Jiřímu Rosíkovi a Jaroslavu Boţkovi za poskytnutí klimatických údajů z ekosystémové stanice v Rájci. Tato práce vznikla za podpory projektu InoBio - Inovace biologických a lesnických disciplín pro vyšší konkurenceschopnost. Tento projekt je spolufinancován evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. Registrační číslo projektu CZ.1.07/2.2.00/

4 Abstrakt Ondřej Veteška; Monitoring tvorby dřeva buku lesního (Fagus sylvatica L.) na buněčné úrovni na výzkumné ploše Rájec Holíkov. Práce se zabývá aktivitou kambia a fázemi radiálního růstu dřeva kmene stromů během vegetačního období 2013 a analyzuje vliv klimatických podmínek stanoviště na proces tvorby dřeva. Monitoring probíhal u skupiny 6 stromů, ze kterých byly odebírány vzorky (mikrovývrty) v týdenních intervalech od 7. dubna do 7. listopadu. Z periodických odběrů byly vyhotoveny trvalé mikroskopické preparáty. Kambium zahájilo svou aktivitu dubna při průměrných teplotách 12,01 C a v činnosti setrvávalo po následující 3 měsíce. Sekundární buněčná stěna se začala vytvářet 3 týdny po vzniku nových buněk a k úplnému zdřevnatění letokruhu došlo v polovině října. Průměrný radiální přírůst za vegetační období činil 1532 µm. Klíčový slova: buk lesní, aktivita kambia, radiální růst, sekundární buněčná stěna

5 Abstract Ondrej Veteska; Monitoring of wood production of European beech (Fagus sylvatica L.) at the cellular level in research site Rajec - Holikov. The thesis is focused on the cambium activity and radial growth phase of trees stem during the growing season 2013 and it analysis the influence of habitat climatic conditions on the wood formation process. Six trees were monitored and samples from them were taken every week from 7 April to 7 November Permanent microscopic preparations showing the radial growth changes were prepared from the periodic collections. Cambium was beginning its activity from 18 April to 25 April at the air average temperature 12,01 C and it was active for three months. The secondary cell wall formation began three weeks after the new cells formation and the total lignification was finished in mid-october. The average radial growth in the growing season was 1532 µm. Key word: European beech, cambial activity, radial growth, secondary wall formation

6 Obsah 1 Úvod Cíl práce Literární přehled Buk lesní (Fagus sylvatica L.) Anatomická stavba bukového dřeva Cévy Cévice Libriformní vlákna Parenchymatické buňky Anatomická stavba kůry Rostlinná buňka Buněčná stěna Chemické sloţení buněčné stěny Kambium Faktory ovlivňující činnost kambia Diferenciace anatomických elementů dřeva Xylogeneze Materiál a metodika... 28

7 4.1 Charakteristika výzkumné plochy Rájec - Holíkov Odběr a skladování vzorků Příprava na zalévání Dehydratace a parafínová infiltrace Zalévání do parafínových bloků Krájení na mikrotomu Podvojné barvení a výroba trvalých preparátů Zpracování trvalých preparátů pod mikroskopem Výsledky Radiální přírůst kmene Vzorníkový strom B Vzorníkový strom B Vzorníkový strom B Vzorníkový strom B Vzorníkový strom B Vzorníkový strom B Souhrn zjištěných výsledků Aktivita kambia Radiální přírůst kmene Tvorba floému... 44

8 5.2.4 Vliv klimatických podmínek na proces tvorby dřeva Diskuze Závěr Summary Seznam pouţité literatury... 54

9 1 Úvod Tato práce se zabývá monitoringem tvorby dřeva buku lesního (Fagus sylvatica L.) na buněčné úrovni na výzkumné ploše Rájec - Holíkov během vegetačního období roku Buk lesní (Fagus sylvatica L.) je opadavý strom z čeledi Fagaceae a fylogeneze recentních rodů této čeledi pravděpodobně sahá aţ do starších třetihor. Na rozdíl od jehličnatých dřevin je dřevo buku značně sloţitější a obsahuje více anatomických elementů. Stromy jsou dlouhověké organizmy vyznačující se sekundárním tloustnutím kmenů a tvorbou dřevní části. Dřevo vzniká dělivou činností kambia a skládá se z pletiv tvořených převáţně lignifikovanými buňkami. Tvorbu dřeva lze rozdělit na tři fáze: radiální růst buňky, tloustnutí buněčné stěny a lignifikace buněčných stěn. Při procesu lignifikace dochází k ukládání ligninu do buněčných stěn a zvyšování jejich pevnosti. Buk lesní (Fagus sylvatica L.) je nejvíce zastoupenou listnatou dřevinou v lesním hospodářství na území České republiky. V současné době je v lesních porostech zastoupen 7 %. Vzhledem ke snaze vytvářet odolné smíšené porosty se však jeho zastoupení zvyšuje. S ohledem k očekávaným změnám klimatu je potřeba věnovat pozornost procesu tvorby dřeva na buněčné úrovni a pochopit souvislosti mezi optimálním růstem dřeviny a jejím okolím. Na základě analýz kompletních letokruhových šířek se vlivem klimatických podmínek na růst dřeviny zabývá dendroklimatologie. Podrobnější analýza tvorby letokruhu však vyţaduje metodu periodického odběru vzorků během vegetačního období. Kromě klimatických faktorů ovlivňují činnost kambia také vitalita jedince, stanoviště a hospodaření člověka. Obsah půdní vody a teplota vzduchu mají zásadní vliv na začátek a konec aktivity kambia. V této práci byl monitorován vliv teploty vzduchu, teploty půdy a relativní půdní vlhkosti na tvorbu dřeva buku lesního. 9

10 2 Cíl práce Cílem práce bylo v pravidelných týdenních intervalech odebírat mikrovývrty ze vzorníkových stromů buku lesního (Fagus sylvatica L.), z nich poté vyrobit trvalé mikroskopické preparáty a po jejich převedení do digitalizované podoby provést mikroskopická pozorování a měření. Dalším z cílů bylo analyzovat vliv klimatických podmínek na činnost kambia a proces tvorby dřeva během vegetačního období roku Zjištěná data dále porovnat s literaturou zabývající se problematikou xylogeneze buku. 10

11 3 Literární přehled 3.1 Buk lesní (Fagus sylvatica L.) Buk lesní (Fagus sylvatica L.) je opadavý strom z čeledi Fagaceae. Dosahuje výšky kolem 35 m a průměru kmene aţ 1,5 m. Koruna je podle umístění stromu v porostu kulovitá nebo metlovitá tvořená větvemi, které odstávají v ostrém úhlu. Kmen je válcovitý, vysoko do koruny průběţný s hladkou a šedou borkou. Jedinec můţe dosahovat objemu kmene aţ 30 m 3 dřeva. Doţívá se věku let (Úradníček, 2004). Klikatě rostoucí výhony jsou zakončeny dlouhými špičatými pupeny. Opadavé listy jsou tmavozelené barvy, v horní třetině rozšířené s přibliţně 10 páry nervů (Coombes, 2008). Střídavě rostoucí listy jsou celokrajné nebo po okrajích mírně zvlněné. Při pohledu proti světlu jsou listy po okrajích jemně a dlouze pýřité (Větvička, 2003). Drobné různopohlavné květy raší spolu s listy, nápadná jsou bledoţlutá převislá samčí květenství. Plody jsou aţ dvě jedlé naţky v dřevité číšce asi 2,5 cm dlouhé (Coombes, 2008). Plody - bukvice, dozrávají na podzim a zpočátku mají vysokou klíčivost. Poměrně mohutný kořenový systém zabezpečuje stabilitu stromu a činí jej odolným proti vývratům, spíše dochází k poškození zlomy při silném větru (Úradníček, 2004). Z pohledu ekologických nároků dává buk lesní (Fagus sylvatica L.) přednost spíše stanovištím s oceánským podnebím. Je to polostinná dřevina, snášející po dlouhou dobu i silný zástin. V důsledku svého brzkého rašení často trpí čerstvé letorosty vymrzáním. V období léta vyţaduje vysokou relativní vlhkost vzduchu a střední nároky na pudní vlhkost. Obsazuje široké spektrum geologických podkladů, nejkvalitnější bučiny se však vyskytují na humózních půdách. Nevyskytuje se jen na suchých píscích, těţkých jílnatých půdách, baţinách a rašelinách (Úradníček, 2004). 11

12 Areál přirozeného rozšíření buku je znázorněn na Obr. 1. V jihovýchodní části svého rozšíření je buk lesní (Fagus sylvatica L.) nahrazován bukem východním (Fagus orientalis). Na kontaktu obou druhů se pravděpodobně vyskytuje hybrid Fagus moesiaca. V horách Evropy vystupuje Fagus sylvatica nejvýše do 1300 m, předpokládaný kříţenec Fagus moesiaca aţ do 2000 m. V místě svého přirozeného rozšíření vytváří monotypické, čisté porosty, nebo je součástí smíšených lesů (Větvička, 2003). Obr. 1. Oblast přirozeného výskytu buku lesního (von Wühlisch, 2008). Jako procentuálně nejvíce zastoupená listnatá dřevina v ČR má buk všestranné vyuţití. Cennější výřezy dříví jsou vyuţity na výrobu parket a nábytku. Přibliţně 30 % veškerého dříví je ekonomicky znehodnoceno estetickou vadou, tzv. nepravým jádrem (Putna, 2012). Dříví horší kvality je pouţito na výrobu buničiny, paliva a dřevěného uhlí. Kromě dřevní hmoty mají význam téţ jedlé bukvice, zejména pro zvěř ţijící v lesích. Poţití nepraţených bukvic člověkem můţe vyvolat stavy podobné opilosti. Dříve z nich byl lisován olej (Úradníček, 2009). S oblibou je tato dřevina také vyuţívána v mnohých parkových a zahradních úpravách po celém světě. Je zde na výběr z mnoha okrasných kultivarů, jako např. Atropurpurea nebo Pendula či Asplenifolia (Banfi et al., 2001). Opadané bukové listí je výborným substrátem pro pěstování orchidejí (Větvička, 2003). Listy stromu lze pouţít k léčbě nemocných dásní či k rozpouštění ledvinových a ţlučových kamenů. Známy jsou povzbuzující bukové mízy, která má také antiseptické účinky a usnadňuje odkašlávání. Své místo má buk i v řecké mytologii, kde byl spojován s bohem Diem (Altman, 2002). 12

13 3.2 Anatomická stavba bukového dřeva Anatomická stavba dřeva je značně proměnlivá u jednotlivých rodů dřevin. Fylogeneze recentních rodů čeledi Fagaceae pravděpodobně sahá aţ do starších třetihor (Manchester & Dilhoff, 2004). Na rozdíl od jehličnatých dřevin je dřevo buku značně sloţitější a obsahuje více anatomických elementů (Gandelová et al., 2009). Struktura dřeva listnáčů je vyobrazena na Obr. 2. Dřevo vzniká dělivou činností kambia a skládá se z pletiv tvořených převáţně lignifikovanými buňkami (Gričar, 2007). Při procesu lignifikace dochází k ukládání ligninu do buněčných stěn a zvyšování jejich pevnosti (Vigué, 2009). Obr. 2. Prostorové zobrazení dřeva listnáčů: 1 hranice letokruhu, 2 libriformní vlákna, 3 dřeňové paprsky, 4 cévy, 5 dřevní parenchym (Požgaj et al., 1997). V periodicky přirůstajících letokruzích není výrazně odlišeno jarní dřevo od letního, hranici zvýrazňuje jen tmavší a hustější zóna vláknitých, mechanických pletiv (Dubovský et al., 1999). Kromě mechanické pevnosti plní dřevo také funkci vodivou a zásobní. V průřezu po obvodu kmene je fyziologicky aktivní běl, jejíţ funkcí je vedení vody s rozpuštěnými minerálními látkami a vytváření zásobních látek v jednotlivých částech rostliny. Šířka běli je proměnlivá, existuje zde kladná korelace mezi šířkou běli, velikostí asimilační plochy a mocností transpiračního proudu. Ve středu kmene se nachází fyziologicky neaktivní vyzrálé dřevo, které se u buku tvoří ve věku 30 aţ 50 let. Vyzrálé dřevo vzniká v důsledku odumírání protoplazmy v ţivých parenchymatických buňkách (Poţgaj et al., 1997). 13

14 3.2.1 Cévy Základním vodivým prvkem dřeva jsou cévy. Nacházejí se pouze ve dřevě listnáčů v podobě tenkých kapilár a jejich funkcí je vést vodu s rozpuštěnými minerálními látkami od kořenů do koruny stromu. Jejich zastoupení je 22 aţ 37 % objemu dřeva buku (Poţgaj et al., 1997). Letní cévy plní částečně funkci mechanickou (Gandelová et al., 2009). Podle uspořádání cév se dřevo listnáčů dělí na kruhovitě pórovité, roztroušeně pórovité, přechodem mezi oběma typy je dřevo polokruhovitě pórovité (Poţgaj et al., 1997). Podle příčného rozměru jsou cévy rozděleny na makrocévy o velikosti nad 0,1 mm a mikrocévy do 0,1 mm. Cévy roztroušeně pórovitého dřeva buku se pohybují na hranici viditelnosti (Gandelová et al., 2009). Systém cév je tvořen spojením cévních článků, jejichţ délka se během roku zvětšuje a pohybuje se v rozmezí od 300 do 700 µm. Jednotlivé články jsou spojeny perforacemi, které mohou být jednoduché či sloţené (Braun, 1970). Jednoduché perforace se vyskytují u širokých cév v jarním dřevě, kdeţto v letním dřevě se vyskytují úzké cévy se sloţenými perforacemi (Balabán, 1955). Sloţené perforace lze dále dělit na síťovité, schodovité či ţebříčkovité (Matovič, 1988). Celková délka cévy je brána jako vzdálenost cévních článků propojených perforacemi a jejich délka bývá 0,8 aţ 2 m (Braun, 1970). Na stěnách cévních článků je moţné pozorovat typické ztenčeniny nazývané téţ dvojtečky, které na rozdíl od ztenčenin tracheid jehličnanů nemají uzavírací blanku (torus) ve střední části ztenčeniny. U jehličnanů jsou uzavírací blanky kompaktnější, menší a ve větším počtu. Seskupení mohou být jednotlivá, řadová, schodovitá nebo protistojně uspořádaná a bývají rozpoznávacím znakem pro řadu dřev (Gandelová et al., 2009). Přes dvojtečky ve stěnách vrůstají do cév parenchymatické buňky a vyplňují tak jejich lumeny. Vznikají thyly, které částečně nebo kompletně ucpávají cévy a zamezují jim plnit jejich vodivou funkci (Matovič, 1988). Thyly vznikají v důsledku působení stresových faktorů, ale také vlivem přirozeného stárnutí dřeviny. Plní funkci zásobního pletiva nebo zvyšují mechanickou pevnost dřeva (Poţgaj et al., 1997). Buněčné stěny 14

15 thyl zůstávají ve většině případů tenké. V jejich dutinách se můţe hromadit škrob, krystaly, pryskyřice nebo kleje (Novák & Skalický, 2008) Cévice Ve dřevě listnatých dřevin se vyskytují cévice několika přechodných typů. Podle tvaru a funkce jsou rozlišovány na cévice vazicentrické, vláknité a cévovité. Jejich zastoupení je odlišné u kaţdé dřeviny. U buku se vykytují početně všechny typy (Gandelová et al. 2009), naopak u některých dřevin se nevyskytují vůbec (Šlezingerová et al., 2004). Vazicentrické cévice se vyskytují v podobě krátkých buněk se zakulacenými okraji. V buněčných stěnách cévic lze pod mikroskopem pozorovat kruhové dvojtečky (Matovič, 1988). Ve dřevě se vyskytují v blízkosti cév a mohou se účastnit vodivé funkce, avšak nejsou schopny vytvářet samostatné vodivé dráhy (Poţgaj et al., 1997). Vláknité cévice mají protáhlý tvar a úzký lumen, jsou tlustostěnné se zašpičatělými okraji. V rámci vývoje jsou přechodem od cévic jehličnatých dřevin k libriformním vláknům listnáčů (Šlezingerová & Gandelová, 1999). Vláknité cévice se velmi podobají libriformním vláknům, nicméně rozlišit je lze podle výskytu párových ztenčenin na stěnách cévic, kdeţto u libriformních vláken se vyskytují ztenčeniny jednotlivě (Gandelová et al., 2009). Vláknité cévice jsou téţ kratší a mají uţší buněčnou stěnu (Matovič, 1988). Jejich funkce je především mechanická, ale mohou plnit i funkci vodivou nebo zásobní (Gandelová et al., 2009). Dalším typem jsou cévovité cévice připomínající malé cévy. Podobně jako cévy vytváří axiální sloupce a v jejich stěnách lze zpozorovat ztenčeniny. Přesto se na jejich koncích nevyskytují perforace. Objevují se jako neúplně diferenciované prvky cév, kde nedošlo k perforaci. Ve skutečnosti se můţe zdát, ţe se cévy skládají z části cévovitých cévic a čáštečně z cévních článků (Wilson & White, 1986). Cévovité cévice se podílejí na vedení vody s minerálními látkami. Jejich délka nepřesahuje 0,5 mm (Wagenführ, 1989). 15

16 3.2.3 Libriformní vlákna Výskyt libriformních vláken ve dřevě buku se pohybuje mezi 37 aţ 44 % objemu dřeva a plní převáţně mechanickou zpevňovací funkci (Poţgaj et al., 1997). Jedná se o vlákna sloţená z vřetenovitě protáhlých buněk o délce 0,2 aţ 2,2 mm. Šířka buněk dosahuje aţ 0,05 mm. Jejich uspořádání v letokruzích je buď nepravidelné, nebo řadové tangenciální či radiální. Na podélném řezu jsou vlákna pozorovatelná jako podlouhlé zašpičatělé buňky s jednoduchými ztenčeninami v buněčných stěnách. Tloušťka buněčných stěn se uvádí v rozmezí 3,7 6,5 µm (Gandelová et al., 2009). Na příčném řezu je tvar libriformních vláken dosti proměnlivý - hranatý, nepravidelný, méně často kulatý. Podle Matoviče (1988) téţ dochází ke změnám délky libriformních vláken a tloušťky jejich buněčné stěny během roku, coţ je patrné při srovnání vláken v jarním a letním dřevu. Kromě umístění libriformních vláken v letokruhu je jejich velikost ovlivněna věkem dřeviny, postavením v kmeni a stanovištními podmínkami (Gandelová et al., 2009). Libriformní vlákna po diferenciaci ze zóny kambia rychle odumírají, jen u některých dřevin se v oblasti cév a na hranici letokruhu vyskytují buňky částečně lignifikované se ţivým obsahem. (Poţgaj et al., 1997) Parenchymatické buňky Tvar parenchymatických buněk je dosti proměnlivý. Buňky mohou být podlouhle hranolovité, krátké krychlovité, oválné nebo vřetenovité. Šířka parenchymatických buněk listnatých dřevin je poměrně jednotná v rozmezí µm a délka µm. Buněčné stěny jsou lignifikované a nesou jednoduché ztenčeniny. V parenchymatických buňkách dochází k ukládání škrobů, tuků a bílkovin. Kromě vytváření zásob téţ mohou plnit funkci vodivou (Gandelová et al., 2009). Zastoupení parenchymatických buněk ve dřevě listnáčů je 8 35 % objemu dřeva. Podíl ve dřevě jehličnanů je 5 13 %. Rozdíl vzniká v důsledku velké spotřeby zásobních látek listnatých dřevin pro tvorbu asimilačního aparátu v jarním období (Poţgaj et al., 1997). Ve dřevě listnatých dřevin se vyskytují parenchymatické buňky ve směru axiálním a radiálním. Axiální parenchym je tvořen řadami buněk rovnoběţných s podélnou osou kmene v podobě navazujících krátkých válečků. Takto vytvořené řetězce mají zašpičatělé konce, u některých dřevin se mohou vyskytovat buňky ve tvaru vřeten bez 16

17 příčného přehrazení (Matovič, 1988). Buněčné stěny nejsou příliš ztloustlé a vyskytují se v nich jednoduché ztenčeniny (Poţgaj et al., 1997). Díky propojení buněk pomocí ztenčenin vzniká ve dřevě rozsáhlý parenchymatický systém. Důleţité zásobní látky jsou do buněk axiálního dřevního parenchymu ukládány právě přes parenchymatické buňky dřeňových paprsků (Šlezingerová a Gandelová, 1999). Podíl axiálních parenchymatických buněk ve dřevě listnáčů je přibliţně 10 % z celkového objemu. Ţivé buňky obsahují zásobní látky jako tuk a škrob. Podle seskupení parenchymatických buněk lze rozdělit axiální parenchym na paratracheální a apotracheální. Kolem cév a cévovitých tracheid se vyskytuje paratracheální axiální dřevní parenchym, který se podle uspořádání ve vztahu k cévám dělí na vazicentrický, vazicentricky splývavý, skupinový, vazicentricky křídlovitý, křídlovitě splývavý, svazkový a jednostranný. Buněčné stěny apotracheálního axiálního dřevního parenchymu nejsou v přímém kontaktu s cévami pomocí teček. Apotracheální parenchym můţe být rozptýlený, rozptýleně nakupený, svazkový, tangenciálně síťový, ţebříčkovitý a hraniční (Gandelová et al., 2009). Uspořádání axiálního dřevního parenchymu lze také rozdělit ve vztahu k ostatním anatomickým elementům dřeva. Význam to má pouze pro paratracheální axiální dřevní parenchym, který můţe být paratrachální kontaktní, v případě tečkového kontaktu s cévami nebo interfibrilární, v případě styku s libriformními vlákny (Šlezingerová a Gandelová, 1999). Radiální parenchym se vyskytuje v podobě oválných válečků orientovaných kolmo na podélnou osu kmene a tvoří dřeňové paprsky. Na radiálním a příčném řezu jsou buňky radiálního parenchymu čtvercového a obdélníkového tvaru, na řezu tangenciálním jsou oválné. Ve dřevě listnáčů jsou buňky radiálního parenchymu zastoupeny % z celkového objemu dřeva, u jehličnanů je jejich zastoupení poloviční. V buněčných stěnách radiálního parenchymu se vyskytují četné tečky, nazývané kontaktní, jestliţe jsou spojeny s buněčnými stěnami cév, nebo izolační, pokud zde spojení není. Dřeňové paprsky mohou být tvořeny buňkami stejného tvaru, jsou tedy homogenní a typické pro buk a většinu listnatých dřevin ČR. Heterogenní dřeňový paprsek je tvořen kombinací buněk různých tvarů, buňky jsou stojaté, leţaté nebo čtvercové. Heterogenní typ se vyskytuje u vrby, jeřábu, lísky, habru a třešně. Na podélných řezech různých dřevin se dřeňové paprsky liší také co do počtu svých vrstev. Maximální počet parenchymatických buněk orientovaných kolmo na výšku dřeňového paprsku je popsán 17

18 vrstevnatostí. Jednovrstevný dřeňový paprsek je tvořen pouze jednou vrstvou buněk, vícevrstevná pak dvěma a více vrstvami, přičemţ vrstevnatost udává číslo vyjadřující počet vrstev. Mnohovrstevný dřeňový paprsek je tvořen značným počtem buněk vedle sebe. U lísky, habru a olše se vyskytují tzv. nepravé neboli sdruţené dřeňové paprsky, které vznikají seskupením jednotlivých úzkých dřeňových paprsků (Gandelová et al., 2009). Podobně jako axiální parenchym, tak i radiální parenchym plní funkci vedení a ukládání látek (Matovič, 1988). Dalším typem parenchymatických buněk je traumatický parenchym. Traumatický parenchym se vytváří v zóně kambia v důsledku mechanického poškození stromu, následně zavaluje poraněná místa a dává vznik dřeňovým skvrnám zvláště typických pro olši, břízu, hrušeň a vrbu (Matovič, 1988). 3.3 Anatomická stavba kůry Souvrství kůry má podstatně sloţitější stavbu neţ dřevo. Vyplývá to z její vodivé, ochranné a dělivé funkce. Tvar buněk dřeva po diferenciaci z kambia zůstává stejný a nemění se, kdeţto lýkový parenchym, primární kůra a felogen vytváří v kůře nové typy buněk. Aby byla kůra schopna plnit ochrannou funkci, neustále se mění po celou dobu růstu stromu. Přestoţe můţe být kůra na první pohled rozbrázděná a popraskaná, vytváří souvislou vrstvu, která pokrývá tloušťkově přirůstající kmen (Poţgaj et al., 1997). Buňky korku (suberoderm) se rozlišují na vrstvu tvrdého a měkkého korku. Tvrdý korek tvoří u buku ochrannou vrstvu po celou dobu ţivota stromu, u jiných dřevin jen do určitého věku. Skládá se z tlustostěnných čtvercových buněk o velikosti 6 aţ 10 µm s šířkou 2 µm. Měkký korek má buňky tenkostěnné s proměnlivou velikostí a nepravidelným tvarem. Korkové buňky jsou impregnovány suberinem, coţ je látka chránící dřevinu proti houbám a mikroorganizmům, částečně také odolává průniku vody. Jediná vrstva buněk tvoří felogen, ze kterého vzniká zelená kůra feloderm. Feloderm je tvořen ţivými buňkami schopnými asimilace (Poţgaj et al., 1997). Nejhojněji se v kůře vyskytuje výplňový parenchym, jehoţ ţivé buňky jsou největší s pravidelným tvarem o velikosti aţ 35 µm. U některých listnatých dřevin jsou sítkovice provázeny ţivými buňkami doprovodného parenchymu, mrtvý parenchym doprovází 18

19 lýková vlákna. U buku se lýková vlákna nevyskytují. Část ţivého parenchymu můţe vytvářet tzv. sklereidy. U buku se vyskytují sklereidy v podobě velkých zrn a jsou pozorovatelné i makroskopicky. Je to jeho jediné mechanické pletivo kůry s podílem aţ 60 % z celkového objemu kůry. Sklereidy se nevyskytují u našich důleţitých listnatých dřevin jen u vrby a lípy. Parenchymatické buňky lýkového paprsku nemají tak pravidelné tvary jako buňky dřeňového paprsku, tangenciálně rostou a dělí se převáţně v starších lýkových vrstvách, také mohou vytvářet sklereidy. Sítkovice jsou obdobou cév a rozvádějí v lýku látky vzestupným i sestupným směrem. Jsou tvořeny sítkovými destičkami s perforovanými příčnými přehrádkami. Ty jsou nad sebou uloţeny do sítkových článků. U buku jsou na příčném průřezu buňky okrouhlé nebo i obdélníkovité o velikosti 0,02 aţ 0,04 mm. Délka je jen několik desetin milimetru. Ţivotnost sítkovic je zpravidla jedno vegetační období, ale výjimečně odumírají například u lípy po 3 aţ 4 letech. Ke konci vegetačního období se sítkové destičky ucpávají kalosou, odumírají a jejich lumen zaniká stlačením rostoucího parenchymu (Poţgaj et al., 1997). 3.4 Rostlinná buňka Rostlinná říše zahrnuje mnoho druhů odlišných velikostí a struktur. Navzdory obrovské variabilitě jsou všechny rostliny mnohobuněčné a eukaryotní. Kaţdá rostlinná buňka je tvořena buněčnou stěnou a protoplastem fluidní konzistence, který obsahuje koloidní cytoplasmu a jádro s chromozomy nesoucí genetickou informaci. Vnější hranice cytoplasmy je ohraničena cytoplasmatickou membránou, která účinně izoluje vnitřní buněčné komponenty od okolního prostředí. Aby byla buňka schopna výměny látek s okolím, je cytoplasmatická membrána polopropustná (Dickison, 2000). Látková výměna buněk je zajištěna funkčním cyklickým prouděním cytoplasmy, tzv. cyklózou (Procházka, 2006) Buněčná stěna Rostlinné buňky jsou obklopeny vnější, více či méně rigidní buněčnou stěnou, která ovlivňuje růst a diferenciaci buňky, její komunikaci a výměnu látek s ostatními buňkami. Někteří rostlinní biologové povaţují buněčnou stěnu jako propracovaný extracelulární matrix obklopující buňku, branou pouze jako protoplast (Dickison, 2000). Rostlinné buňky lze uměle zbavit pevné vnější stěny a při opatrném zacházení je lze 19

20 udrţet i v kultuře. Ovšem i při malých změnách osmotického tlaku v kultivačním médiu dochází ke zničení buněk. Na rozdíl od ţivočišných buněk neobsahuje cytoskelet rostlinných buněk intermediální filamenta a tak se stává vnější stěna nepostradatelnou. Rostlinná buněčná stěna musí být dostatečně odolná, aby téţ limitovala osmotické bobtnání buňky. Při vzniku většiny buněk dochází nejprve k vytvoření primární buněčné stěny, která je schopna se s postupným růstem buňky zvětšovat. Po zastavení růstu se primární stěna dále nezvětšuje a dochází k vytvoření mnohem pevnější sekundární buněčné stěny, která vzniká buď tloustnutím primární buněčné stěny, nebo tvorbou a ukládáním nových vrstev. Obvykle jsou produkovány buněčné stěny se speciální adaptací: voděodolné voskové vrstvy, dřevnaté vrstvy xylému aj. (Alberts et al., 1998). Buněčná stěna diferencované a lignifikované buňky není homogenní, ale skládá se z několika vrstev odlišného chemického sloţení. Chemické sloţení a submikroskopická stavba jednotlivých vrstev jsou ve velmi úzkém vztahu. Podle způsobu tvorby, struktury a chemického sloţení je moţno buněčnou stěnu rozdělit na vrstvy: střední lamela, primární stěna a sekundární stěna (Obr. 3). Sekundární stěna je dále sloţena z vnější, střední a vnitřní vrstvy (Poţgaj et al., 1997). Lumeny buněk občas můţe vystýlat bradavičnatá vrstva navazující na vnitřní vrstvu sekundární stěny (Gandelová et al., 2009). Buněčná stěna vzniká ze základní cytoplazmy při dělení buněk. Jako první vzniká plazmatická destička oddělující dceřiné cytoplazmy. Později je plazmatická destička přeměněna ve střední lamelu, tvořenou převáţně pektiny a hemicelulózy. Lignin se zde objevuje aţ v procesu lignifikace. Rovněţ další vrstva primární stěna je produktem základní cytoplasmy, vytváří se během růstu buněk na střední lamele. Primární stěna je tvořena látkami jako hemicelulózy, pektiny a později i lignin, které se tzv. intususcepcí ukládají do mezifibrilárního prostoru předem vytvořené celulózové fibrilární kostry. Po ukončení růstu buněk se ve fázi dozrávání vytváří sekundární buněčná stěna přikládáním nových vrstev na jiţ vytvořenou primární stěnu směrem dovnitř prostoru buňky. Po ukončeném tloustnutí buněčné stěny nastává její zrání a lignifikace. Charakter vnitřní vrstvy sekundární buněčné stěny výrazně ovlivňuje fyzikální vlastnosti dřeva (Gandelová et al., 2009). 20

21 Obr. 3. Struktura buněčné stěny: SL střední lamela, P primární stěna, S sekundární stěna, L lumen, FP podélně uložené fibrily, FS spirálovitě uložené fibrily (Balabán, 1955) Chemické složení buněčné stěny Celulóza je nejrozšířenější organickou makromolekulou na Zemi. Jedná se polysacharid vytvářející u vyšších rostlin dlouhá vlákna, která jsou uloţena u kaţdé extracelulární matrix. Celulózová vlákna jsou protkána jinými polysacharidy a některými proteiny, coţ dohromady vytváří komplexní strukturu, která zajišťuje buněčným stěnám zvýšenou tlakovou a tahovou pevnost. Ještě větší pevnosti je dosaţeno u dřevnatých vláken vytvořením husté ligninové sítě. Rozpínání buněk při jejich růstu je omezováno právě celulózovými vlákny, která svou orientací udávají buňkám směr, ve kterém se mohou zvětšovat. Celulózová vlákna tedy neovlivňují jen tvar jednotlivých buněk, ale zároveň tvar a směr růstu celých pletiv. Na rozdíl od většiny ostatních extracelulárních makromolekul vzniká celulóza na vnějším povrchu buňky díky enzymovým komplexům. Výskyt enzymových komplexů je v plazmatické membráně, přes kterou transportují monomery sacharidů do rostoucích polymerových řetězců. Po transportu enzymových komplexů zůstávají v membráně dráhy celulózové fibrily, které udávají směr uloţené celulózy. Pohyb enzymových komplexů je řízen vláknitými mikrotubuly uloţenými souběţně s celulózovými vlákny pod plazmatickou membránou. Tímto způsobem je cytoskelet schopen ovlivňovat tvar buňky a formování pletiv (Alberts et al., 1998). Spojení hydroxylových skupin celulózy zajišťují vodíkové vazby tak silné, ţe brání propustnosti molekulám vody (Kubišta, 1998). Celulóza se tedy běţně nerozpouští ve vodě, jen v omezeném počtu rozpouštědel (Blaţej & Košík, 1985). 21

22 Dalším polysacharidem zastoupeným ve dřevě buku 22,5 % je hemicelulóza (Jankovský, 1999). Od celulózy se liší stavbou řetězce a sloţením. Hemicelulóza má podobu lineárního řetězce s krátkými řetězci postranními a je tvořena z hexóz, pentóz a urónových kyselin. Také polymerizační stupeň je niţší, v rozmezí od 149 do 187. V porovnání s jinými listnatými dřevinami obsahuje bukové dřevo vyšší obsah D- galaktózy a L-ramnózy (Barna et al., 2011). Molekuly hemicelulózy mají nízký podíl krystalické části a tvoří tmelící sloţku mezi vláknitými strukturami celulózy a ligninem (Gandelová et al., 2009). Díky své větvené povaze je umoţněna hydratace a interakce s dalšími sloţkami buněčné stěny (Kubišta, 1998). Lignin je po celulóze nejvíce zastoupeným přírodním biopolymerem. Chemicky se jedná o vysokomolekulární polyfenolickou amorfní látku (Votrubová, 1996). Vyskytuje se nerovnoměrně v celé tloušťce buněčné stěny, nejvíce však ve střední lamele. Obsah ligninu ve dřevě buku se pohybuje v rozmezí od 21 do 27 % (Barna et al., 2011). V sekundární buněčné stěně, kde jsou celulózová vlákna orientovaná, dochází k ukládání ligninu převáţně podél celulózových vláken rovnoběţných s povrchem buněčné stěny. Expanze ligninu směrem dovnitř lumenu buněk je omezována mechanickým působením celulózových vláken (Donaldson, 1994). Lignin je významnou sloţkou dodávající dřevu mechanickou pevnost při dřevnatění buněčných stěn převáţně libriformních vláken a vláknitých tracheid. U listnatých dřevin je obsah ligninu menší neţ u jehličnatých (Jankovský et at., 1999). Kromě výše popsaných jsou v buněčných stěnách obsaţeny organické látky, zjišťované izolováním pomocí různých rozpouštědel, a anorganické látky stanovené z popela. Jedná se o látky odlišného chemického sloţení, struktury a vlastností vázané různými vazbami a fyzikálními silami (Barna et al., 2011). 3.5 Kambium Matovič (1975) popisuje kambium jako sekundární meristém vznikající v zóně mezi cévními svazky primárního xylému a primárního floému. Kambium je postupně diferencováno z prokambia, které si zachovává svou dělivou schopnost po vytvoření primárních vodivých pletiv. Po vytvoření kambia je ukončen proces primárního růstu a následuje sekundární růst, kde se činností kambia vytvářejí kromě elementů dřeva a 22

23 lýka také parenchymatické buňky dřeňových paprsků. U listnáčů s roztroušeně pórovitou stavbou dřeva se mateřské buňky lýka tvoří asi s měsíčním předstihem neţ buňky dřeva. Kambiální zóna zahrnuje buňky s meristematickou schopností a mateřské buňky dřeva a lýka, které si po určitou dobu ponechávají dělivou schopnost. Počet buněk je během roku proměnlivý, přičemţ maximální počet (aţ 20) je různý v závislosti na druhu dřeviny. Z počátku vegetačního období se nové buňky vytvářejí pomaleji a po plné aktivitě se dělení buněk zrychluje. Největší aktivita kambia je v období od poloviny června do poloviny srpna, poté doznívá na přelomu srpna a září (Gandelová et al., 2009). Kambium zahajuje svou činnost dříve před vlastním dělením buněk. Nejprve dochází ke změně stavu cytoplasmy a jejího proudění, buňky kambia bobtnají a následně pak dochází k dělení buněk. Činnost kambia je s činností pupenů stromu v úzké souvislosti, neboť právě zde, pod pupeny, kambium zahajuje svou aktivitu a ta se dále šíří směrem k bázi kmene a větví. Nástup aktivity kambia po zahájení činnosti pupenů se liší v závislosti na druhu dřeviny. Aktivní kambium postupuje nejrychleji u kruhovitě pórovitých dřevin a jehličnanů, kde je moţné zpozorovat aktivitu kambia jiţ několik týdnů před rašením pupenů. U listnatých dřevin s kruhovitě pórovitou stavbou dřeva se vyskytuje činné kambium několik týdnů při bázi pupenů a dále postupuje do větví a báze kmene aţ po vyrašení pupenů (Gandelová et al., 2009). 3.6 Faktory ovlivňující činnost kambia Růst stromu a tvorba dřeva jsou ovlivněny mnoha faktory, často jejich kombinací. Šířka letokruhů je během ţivota stromu proměnlivá a odvíjí se od vnitřních a vnějších vlivů působících na jedince. Vnitřním faktorem je především vitalita jedince odvíjející se od přirozeného procesu stárnutí organismu, kdy s postupem času dochází ke změně dělivé činnosti kambia. Mezi vnější vlivy řadíme vlastnosti stanoviště - trofnost půdy, vodní reţim, vzdušnost, ph, dále umístění stromu v porostu ve vztahu ke konkurenčním podmínkám ostatních jedinců, hospodaření člověka a v neposlední řadě klimatické vlivy (Gryc, 2005). Jedním z hlavních faktorů ovlivňující tvorbu dřeva je obsah vody v půdě (Horáček et al., 1999). Nízký obsah vody v půdě má vliv na nízkou produkci buněk, jejich radiální 23

24 rozměr a tloušťku buněčné stěny, která je menší (Abe et al., 2003). Tloušťkový růst kmene můţe být výrazně ovlivněn na konci vegetačního období díky poklesu půdní vlhkosti, zejména při vyšších teplotách vzduchu v létě dochází ke zvýšenému výparu (Horáček, 1994). Opakující se období sucha způsobuje proměnlivou hustotu dřeva (Schweingruber, 2007). Pokud po období sucha dojde ke změně klimatických podmínek, dodatečné sráţky nejsou schopny vyrovnat způsobenou ztrátu (Rossi et al., 2006). Teplota vzduchu je zásadním faktorem ovlivňující dobu začátku a konce aktivity kambia. Doba činnosti kambia tedy udává délku vegetačního období (Horáček et al., 1999). Rostliny obecně jsou organizmy s minimální termoregulační schopností a svou vlastní vnitřní teplotu přizpůsobují vnějšímu okolí. I malé výkyvy teplot v rozmezí jen několika málo stupňů Celsia se výrazně promítají do rychlosti růstu (Horáček, 1994). Činnost kambia je také nepřímo ovlivněna teplotami vzduchu během předchozího roku (Larcher, 1988). Sluneční záření je zdrojem energie pro růst rostlinných organismů, ale působí také jako stimulátor vývoje. Fotosynteticky aktivní radiace (FAR) je oblast spektra viditelného záření o vlnových délkách 380 aţ 750 nm. Jedná se o jediný přímo vyuţitelný zdroj energie vyuţívaný při fotochemických procesech k primární produkci. Intenzita a kvalita slunečního záření se při průchodu atmosférou a porostem mění (Horáček, 1994). Pro buk a ostatní stinné dřeviny je typický tzv. světlostní přírůst, coţ je schopnost jedince reagovat na větší mnoţství světla zvýšenou asimilací a objemovým přírůstem (Jurča, 1988). Z biotických činitelů mohou činnost kambia ovlivňovat houby např. Nectria ditissima. Spóry vstupují do stromu přes listové jizvy nebo pahýly odlomených větví a pokračuje do zóny kambia. Pod vlivem několika pomístních infekcí je kambiem produkován kalus. Na kmenech a větvích pak vznikají nepravidelné boule. V blízkosti kambia je mrtvá část oddělena a zarůstá v kalusu. V kalusovém zárostu se po několika infekcích vytváří abnormální pletiva. Narušením vodního reţimu stromu často dochází k tvorbě falešného letokruhu (Schweingruber, 2007). Kromě narušené činnosti kambia jsou houby významným organismem, který se podílí na rozkladu dřevní hmoty. Mycelia hub vyuţívají dřevní hmotu jako substrát pro jejich saprofytický, parazitický nebo 24

25 symbiotický způsob ţivota. Podle typu rozkladu se dělí na houby způsobující bílou hnilobu (rozkládají lignin), hnědou hnilobou (rozkládající celulózu a hemicelulózu) a houby způsobující měkkou hnilobu vyskytující se ve dřevě s vysokou vlhkostí za vzniku dutin v buněčných stěnách (Kües et al., 2007). K narušení tvorby dřeva téţ dochází ohryzem kůry hlodavci a jelenovitými (Cervidae) (Schweingruber, 2007). 3.7 Diferenciace anatomických elementů dřeva Diferenciace anatomických elementů dřeva je proces, který začíná v okamţiku, kdy se mateřská buňka, či její deriváty začnou radiálně rozšiřovat, ztrácí svou dělivou schopnost a přestávají být součástí zóny kambia (Gandelová et al., 2009). Proces diferenciace buněk je rozdělen podle Poţgaje et al. (1997) celkem na tři fáze. První fází je radiální růst buňky, dochází ke změně jejího tvaru a zvětšování velikosti. Buněčnou stěnu tvoří v této fázi střední lamela a primární stěna, uvnitř buňky je obsaţena základní cytoplasma a organely. Z vřetenovitých buněk kambia se u listnatých dřevin vytváří libriformní vlákna nebo cévy (Poţgaj et al., 1997). Ve druhé fázi dochází u nově vytvořených buněk k tloustnutí buněčné stěny. Vytváří se u nich sekundární buněčná stěna s novými vrstvami celulózových vláken. Buňky v této fázi stále obsahují základní cytoplasmu (Gandelová et al., 2009). Poslední fází je lignifikace buněčných stěn. U buněk dochází k vyčerpání cytoplasmy a po lignifikaci umírají v případě, ţe buňky vznikly z vřetenovitých iniciál kambia (libriformní vlákna, cévy a cévice) (Poţgaj et al., 1997). Výjimkou jsou parenchymatické buňky, které zůstávají naţivu i několik let po lignifikaci buněčných stěn a účastní se fyziologických procesů (Gandelová et al., 2009). 3.8 Xylogeneze Kambiální aktivitu a tvorbu dřeva buku lesního během roku 2006 pozorovali Čufar et al. (2008) v lesních porostech poblíţ hlavního města Slovinska. Činnost kambia zde byla zahájena v období a maximální počet buněk (10 13) byl zaznamenán na konci května. K ukončení procesu buněčného dělení došlo v období od 25. června do 16. srpna. Na konci vegetačního období obsahovalo dormantní kambium průměrně

26 buněk. Tvorba sekundární buněčné stěny začala na této lokalitě v období a následná lignifikace byla zaznamenána června. Poslední nově vytvořené buňky se v letokruhu vyskytovaly do poloviny srpna. Průměrná šířka nově vytvořeného letokruhu dosahovala 2552 µm. Naměřená data byla upravena pomocí Gompertzovy funkce. Xylogenezí buku na výzkumné ploše Rájec - Domanka se zabýval Ondrouch (2013). Na počátku vegetačního období 2010 zaznamenal aktivitu kambia k datu při průměrné teplotě vzduchu 11,1 C. Kambium bylo tvořeno největším počtem buněk (9 10) v období Ukončení činnosti kambia zaznamenal 12. srpna, průměrná délka kambiální aktivity trvala 4 měsíce. Úplná lignifikace letokruhu nastala v období září. Sledované stromy vytvořily během vegetačního období průměrný radiální přírůst kmene 1666 µm. Na stejných vzornících se xylogenezí zabýval Ondrouch (2013) i v následujícím roce Počátek kambiální aktivity v roce 2011 zaznamenal v období od 7. do 28. dubna, průměrné teploty se tehdy pohybovaly kolem 9,7 C. Kambium bylo tvořeno největším počtem 9 10 buněk a průměrná šířka letokruhu po ukončení růstu dosahovala 1004 µm, coţ je o 662 µm méně neţ v předcházejícím roce. Počátek tvorby sekundární buněčné stěny byl zaznamenán od první poloviny května do začátku června. K úplné lignifikaci letokruhu došlo v týdnu od 19. do 25. srpna. Na lokalitě Rájec - Němčice popsal tvorbu dřeva buku lesního (Fagus sylvatica L.) během vegetačního období 2012 Fajstavr (2013). V práci uvádí počátek kambiální aktivity v období s počtem 5 7 buněk v oblasti kambiální zóny. Průměrná teplota se při aktivizaci kambia pohybovala u jednotlivých vzorníků od 5,34 19,29 C. Zóna kambia byla v druhé polovině května tvořena maximálně buňkami. Po ukončení kambiální aktivity zaznamenal poslední buňky ve fázi radiálního růstu v rozmezí Průměrné teploty se v tomto období pohybovaly od 13,81 20,99 C. Tvorba sekundárních buněčných stěn byla zahájena při průměrných teplotách vzduchu 9,20 19,29 C. Začátek lignifikace zaznamenal června, kdy se teploty vzduchu pohybovaly od 12,60 20,99 C. Průměrný maximální radiální přírůst kmene během vegetačního období zjistil 2100 µm. Vliv letního přísušku na tvořící se letokruh sledoval van der Werf et al. (2007) ve východní části Nizozemska. V práci uvádí, ţe radiální růst buku je více ovlivněný 26

27 sráţkami neţ teplotou, přesto je růst negativně ovlivněn teplotami vzduchu během předchozího léta. Buk také nejlépe reaguje na zvýšené vlhkostní podmínky během podzimu. Růst buku silně koreluje s celkovým úhrnem sráţek během vegetačního období, nejvýznamněji však v červnu a červenci. Současně je zde významný vztah mezi růstem a teplotami během měsíce června. Z jeho výsledků vyplývá, ţe buk reaguje na dostupnost vody velmi citlivě a okamţitě. Další studii xylogeneze buku na území Slovinska provedli Prislan et al. (2013). Počátek aktivity kambia stanovili v polovině dubna při teplotě vzduchu 7,3 C. Proces diferenciace nově vytvořených buněk dřeva dále pokračoval a jeho ukončení bylo zaznamenáno v polovině září. Pozdní floém se začal vytvářet v polovině června, tedy 9,5 týdne po vytvoření nových buněk v kambiu. Prislan et al. (2013) ve své práci uvádí, ţe kambium produkuje 5 12 krát více buněk xylému neţ floému. Poslední buňky ve fázi radiálního růstu zpozorovali na konci srpna, kdy byla zjištěna průměrná teplota vzduchu 22, 0 C. Kambium tedy setrvávalo v činnosti po dobu týdnů. Tvorba sekundárních buněčných stěn byla ukončena 9. září. Průměrné teploty před kompletně vytvořeným letokruhem dosahovaly 17, 9 C. 27

28 průměrná denní teplota vzduchu [ C] srážky [mm] 4 Materiál a metodika 4.1 Charakteristika výzkumné plochy Rájec - Holíkov Výzkumná plocha Rájec - Holíkov se nachází v Jihomoravském kraji, západně od obce Němčice. Lokalita spadá ke geomorfologickému celku Drahanská vrchovina a ke stejnojmenné Přírodní lesní oblasti PLO 30. Podle biogeografického členění je oblast zařazena do bioregionu 1.52 (Culek et al., 2005). Nadmořská výška se pohybuje okolo 630 m n. m. a v pojetí vegetační stupňovitosti se nachází v 5. lesním vegetačním stupni. Z pohledu fytocenóz se jedná o kostřavovou bučinu s dominantní kostřavou nejvyšší (Festuca altissima) a kyčelnicí cibulkonosnou (Dentaria bulbifera) (Skořepa, 1999, Chytrý et al., 2001). Lesním typem je svěţí jedlová bučina šťavelová 5S1 (Plíva, 1987). Převládajícím půdním typem je kambizem modální oligotrofní s povrchovým humusem typu moder. Mocnost povrchových forem humusu se pohybuje mezi 4 5 cm. Následují horizonty Ah a Bv s hlinitou aţ jílovohlinitou zeminou. Fyziologická hloubka půdního profilu sahá aţ k 45 cm (Menšík, 2010). Celkový úhrn sráţek během vegetačního období byl 590 mm (Obr. 4). Z Obr. 5 je patrný vztah mezi průměrnou teplotou stanoviště a relativní půdní vlhkostí. Data byla poskytnuta Ústavem ekologie lesa. 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0, datum srážky teplota Obr. 4. Průměrná denní teplota vzduchu a množství srážek na výzkumné ploše Rájec Holíkov. 28

29 průměrná denní teplota vzduchu [ C] relativní půdní vlhkost 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0,00 0% datum teplota půdní vlhkost Obr. 5. Průměrná denní teplota vzduchu a relativní půdní vlhkost na výzkumné ploše Rájec Holíkov. 4.2 Odběr a skladování vzorků Pro analýzu tvorby dřeva byla vybrána v porostu skupina 6 stromů buku lesního označených B1, B2, B3, B4, B5, B6. Stromy byly rozmístěny vzájemně nedaleko od sebe na jedné ploše a jejich stáří dosahovalo zhruba 130 let. Tyto vzorníky byly vybrány s ohledem na jejich zdravotní stav, bez patrného mechanického poškození a jiných škodlivých činitelů. Vzorky byly odebírány pomocí nástroje Trephor, který se gumovým kladivem zarazil kolmo na osu kmene tak, aby byl získán vzorek neporušený špatnou orientací anatomických elementů. Kromě polohy nástroje bylo třeba dbát na udrţování jeho ostří. V případě pouţití nástroje s otupeným ostřím dochází při odebírání vzorků k jejich kompresi a deformaci nově vytvořených buněk. Po zaraţení nástroje do kmene a následném potočení jeho rameny došlo k uvolnění vzorku, který zůstal uvnitř trubicovitého ostří. Od trubicovitého tvaru ostří se odvíjí válcovitý tvar vzorkumikrovývrtu, jeho šířka 2 mm a délka přibliţně 15 mm. Speciální jehlou byl mikrovývrt posunut do těla Trephoru, odkud bylo moţné pouhým vyklopením přemístit vzorek do histologických kazetek (Rossi et al., 2006). Takto odebraný vzorek musel obsahovat floém, kambium a xylém nově tvořícího se letokruhu. Odběr byl prováděn v tzv. prsní výšce (130 cm od paty stromu). Odebírány byly vţdy dva vzorky z jednoho stromu v minimální vzdálenosti 2 cm od předchozích odběrů tak, aby neobsahovaly poškozené pletivo (Vavrčík et al., 2013). 29

30 Histologická kazetka byla před odběrem popsána označením jednotlivých stromů a datem odběru. První sada vzorků byla odebrána , druhá sada a poté odběr probíhal v týdenních intervalech aţ do Vzorky byly ihned po uzavření do pouzder ponořeny do uzavíratelné nádoby s fixační tekutinou FAA (Gričar 2007). Pouţití fixačních směsí je základním krokem při zpracování rostlinných pletiv, jelikoţ dochází k rychlému usmrcení biologického materiálu a upevňování vnitřních buněčných struktur (Cutler et al., 2008). Po týdnu v FAA byly vzorky opláchnuty a přemístěny do 30% etanolu, kde se vzorky mohou skladovat po neomezeně dlouhou dobu (Gryc et al. 2009). FAA (formalin-acetic acid-alcohol) sloţení: 850 ml 70% etylalkohol, 100 ml 40% formaldehyd, 50 ml ledové kyseliny octové 4.3 Příprava na zalévání Před dalším zpracováním byl mikrovývrt zkrácen oddělením přebytečné dřevní části z důvodu snadnější manipulace. Pro měření bylo postačující ponechat 1 aţ 2 poslední letokruhy. Přebytečná dřevní část byla oddělena na dřevěném prkénku ostřím ţiletky. Neopatrným zacházením můţe být vzorek poškozen, proto byl pinzetou vţdy uchycen za těţší dřevní část. Po zkrácení bylo nutno tuţkou označit příčný řez, který usnadňoval orientaci vzorku při tvorbě parafínových bloků. Příčný řez lze rozpoznat podle výrazných dřeňových paprsků a také podle změny barvy při pootočení vzorku, kdy je příčný řez na první pohled tmavší barvy neţ řez radiální. Zkrácený a označený vzorek byl umístěn zpět do histologické kazetky, druhý (méně kvalitní) vzorek byl přemístěn do označených plastových lahviček s 30% etanolem k archivaci. 4.4 Dehydratace a parafínová infiltrace Dehydratace vzorků je nezbytným krokem umoţňující infiltraci podpůrného media parafínu. Parafín poskytuje adekvátní podporu materiálu při krájení sekcí. Dehydratací se rozumí odstranění vody ze zafixovaných a upevněných rostlinných pletiv. Úplné odstranění vody zajišťuje přilnavost matrixu na vnější a vnitřní povrchy buněk a tkání, proto byly vzorky ošetřeny řadou dehydratačních činidel s ubývajícím podílem vody (Cutler et al., 2008). Bez nutné podpory pletiv by však došlo k deformaci vzorků při 30

31 krájení sekcí. Po předchozím odvodnění následovala kompletní infiltrace vzorků tekutým parafínem. Celý proces dehydratace a prosycení parafínem probíhal v tkáňovém procesoru podle Tab. 1. Tab. 1. Postup dehydratace a parafínové impregnace vzorků v tkáňovém procesoru. pouţité činidlo doba (hodin) Ethanol 70% 2 Ethanol 70% 1,5 Ethanol 90% 1,5 Ethanol 90% 1,5 Ethanol 95% 1,5 Ethanol 100% 1,5 Ethanol 100% 1,5 Bio Clear 1,5 Bio Clear 1,5 Bio Clear 1,5 Parafín 2 Parafín Zalévání do parafínových bloků Výrobu řezů lze provádět dvěma způsoby a to ručním krájením nebo krájením za pouţití rotačního mikrotomu. Jelikoţ se vzorek skládá se zralého xylému na jedné straně a měkkého floému na straně druhé, je vyloučena metoda ručního krájení. Mikrovývrty by se často lámaly v oblasti kambiální zóny, coţ by vedlo k nevratnému poškození pletiv. Pro výrobu řezů je ideální pouţití rotačního mikrotomu, jenţ vyţaduje fixaci vzorku v parafínovém bloku (Rossi et al., 2006). Koš se vzorky po vyjmutí z tkáňového procesoru byl přemístěn do laboratorní sušárny, čímţ bylo zabráněno ztuhnutí přebytečného parafínu, slepení histologických pouzder a zhoršené manipulaci s nimi. K zalévání vzorků byl pouţit parafínový dispenzor značky Leica EG Princip spočívá v uloţení vzorků do ocelových forem a zalití tekutým parafínem, který po ztuhnutí vytvářel kompaktní bloky určené ke krájení. Pracovní teplota zařízení a vyhřívaných kleští byla nastavena na 65 C. Na vyhřívanou pracovní desku přístroje bylo rozloţeno několik vzorků ze sušárny a potřebné mnoţství kovových forem. Důleţité bylo zahřátí forem na vyšší teplotu, aby nedocházelo k předčasnému tuhnutí parafínu při kontaktu se studenou plochou. Dno takto zahřáté 31