Imunofenotypizace leukemií z kostní dřeně, periferní krve, výpotku a mozkomíšního moku průtokovou cytometrií

Transkript

1 Imunofenotypizace leukemií z kostní dřeně, periferní krve, výpotku a mozkomíšního moku průtokovou cytometrií 1) Použití validovaných kitů od výrobce značka CE/IVD 2) Home made metoda s vlastní (laboratoří provedenou) validací 3) Metoda publikována v mezinárodním impaktovaném časopise, kde prošla recenzním řízením

2

3 Panely kombinující protilátky pro detekci povrchových a intra znaků definujících příslušnost k buněčné linii (B, T, myelo, erythro), stadiu diferenciace apod.

4 Interní kontrola kvality 1) Kontrola přístrojů 2) Verifikace metody Reprodukovatelnost? Opakovatelnost? Nejistota měření? Externí kontrola kvality Česká mezilaboratorní porovnání Mezinárodní UK NEQAS ibfm EuroFlow

5 Nezávislou verifikací musí laboratoř potvrdit, prostřednictvím získání objektivního důkazu (ve formě výkonnostních charakteristik), že požadavky na výkonnost u daného postupu laboratorního vyšetření byly splněny. Požadavky na výkonnost, které se potvrzují procesem verifikace, musí být takové, které odpovídají zamýšlenému použití výsledků laboratorního vyšetření. Celková analytická chyba, velikost odchylky (bias), v cytometrii??? 1) Dlouhodobá přesnost měření v laboratoři, získávanou v procesu vnitřní kontroly kvality hodnoceno v rámci verifikací (CV a SD u metod s dostupným referenčním materiálem, kdy hodnotíme jednotlivé antigeny zvlášť) 2) Dlouhodobá přesnost měření získávaná v procesu externí kontroly kvality 3) Stabilita přístroje sledování CV pro jednotlivé kanály (Rainbow Beads)? 4) Specifičnost? 5) Požadavek na minimalizaci ztrát buněk v průběhu přípravy vzorku?

6 Metodické pokyny Sekce laboratorní imunologie ČSAKI: csaki.cz/metodicke pokyny/ Praktické provádění validace a verifikace metod Doporučení pro určení odhadů nejistot výsledků měření v laboratoři Doporučení k aplikaci in house metod v imunologických laboratořích

7 Pravidelná údržba cytometrů servis, promývání Denní kontrola správné činnosti cytometrů CST Beads laser delay, linear range, optical background, Rainbow Beads standardizace MFI, definovat přijatelnou mez detekce, standardizace mezi různými cytometry B 530/30 A B 575/26 A B 610/20 A B 695/40 A V 450/50 A datum start měření konec měření CV CV CV CV CV :00:00 dop. 04:30:00 odp. 2,8 2,4 2,7 3,9 4,9 Kontrola kompenzací

8 CD1a CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD10 CD24 CD33 CD34 CD38 CD45 CD56 CD58 CD64 CD11b CD13 CD14 CD15 CD16 CD19 CD20 CD22 CD66c CD81 CD117 HLA DR Kappa Lambda NG2 TCRab/gd intra TdT intra MPO intra CD3 intra CD79a, IVD kit? IVD protilátky?

9 IMMUNO TROL cells IVD CD2, 3, 4, 5, 8, 19, 45, not IVD CD7, 10, 13, 14, 22, 33,,, HLA DR CD Chex Plus Cílové hodnoty uvedené výrobcem: CD3+ CD4+ CD8+ CD19+ CD3-56+ % pozitivity ,9 12,2 SD IVD CD2, 3, 4, 5, 8, 19, 20, 45, , HLA DR not IVD CD7, 10, 11b, 11c, 13, 15, 22, 23, 33, 38,,... CD117, 25, 71 CD34 Stabilizovaný vzorek leukemie UK NEQAS B, T

10 Rozsáhlé panely znaků (protilátek a fluorochromů) FITC PE PerCP ECD PC7 APC A700 PB PO 4/8/3/7/45 CD4 FITC BD CD8 PE IM CD3 PC5 IM CD7 ECD IM CD45 APC BD DR GATE KOMBI HLA DR FITC IM CD14 PE EX CD45 PerCP EX CD4 ECD IM CD3 PC7 IM CD8 APC EX 99/7/5/3/45 CD99 FITC BD CD7 PE IM CD45 PerCP EX CD5 PC7 IM CD3 APC IM KORSA/56/19/45 KORSA 3544 FITC IM CD56 PE BD CD45 PerCP EX CD19 PC7 IM 20/10/19/34/45/SYTO 41/38 CD20 FITC BD CD10 PE DAKO CD45 PerCP EX CD19 PC7 IM CD34 APC IM CD38 A700 EX SYTO 41 INV 15/117/34/33/45/7 CD15 FITC BD CD117 PE IM CD45 PerCP EX CD7 ECD IM CD34 PC7 IM CD33 APC IM 34/iLYSOZYM/45/33/14/11c CD34 FITC IM ilysozym PE ADG CD11c PerCp CY5.5 BD CD33 PC7 IM CD14 APC BD CD45 PO EX itdt/7/3/i3/45 itdt FITC DAKO CD7 PE IM CD45 PerCP EX CD3 PC7 IM icd3 APC IM impo/i79a/i3/45/7/19 impo FITC IM icd79a PE DAKO CD45 PerCP EX mcd7 ECD IM CD19 PC7 IM icd3 APC IM 11b/45/7/19/i22 CD11b PE BD CD45 PerCP EX CD7 ECD IM CD19 PC7 IM icd22 APC BD Vybrat protilátky, které reportujeme na výsledkovém listě. CD45 PerCP KORSA 3544 FITC CD20 FITC CD34 APC CD15 FITC CD117 PE n=45 Měsíční testování na referenčním materiálu, zdravé PK, zdravé KD

11 Reprodukovatelnost cílové hodnoty uvedené výrobcem cílové hodnoty uvedené výrobcem cílové hodnoty uvedené výrobcem Testovaný znak říjen listopad prosinec CD4 FITC 44,9 46±5 47,5 49±5 47,5 49±5 CD8 PE 29,5 27±7 28,2 27±7 28,2 27±7 HLA DR FITC 20,1 19±6 22,6 20±6 21,9 20±6 CD14 PE 77,7 77±20 77,5 82±20 77,5 82±20 CD7 PE 75,8 73±18 78,7 77±18 78,7 77±18 CD5 PC7 70,5 73±12 73,1 75±12 73,6 75±12 šarže refer.materiálu šarže protilátek kontrola návaznosti různých šarží Testovaný znak Na čem? Lymfo Mono Granulo % pozitivní/negativní MFI % pozitivní/negativní MFI % pozitivní/negativní MFI KORSA 3544 FITC krev G 88,8 pozitivní ,9 pozitivní pozitivní 2336 CD20 FITC krev L 5,4 pozitivní ,2 pozitivní ,83 pozitivní CD34 APC dřeň L 34,4 pozitivní ,1 pozitivní ,8 pozitivní 3381 CD15 FITC krev G 99,9 pozitivní 1.3e5 99,4 pozitivní 1.31e5 99,2 pozitivní 1.33e5 CD117 PE dřeň L 3,8 pozitivní ,4 pozitivní ,8 pozitivní 1969 Nejistotu měření nestanovujeme

12

13 UK NEQAS. stabilizovaný vzorek leukemie (diagnoza + minimal residual disease) dg, vybrat antigeny pro detekci zbytkové nemoci, % leukemických blastů Léčebná skupina ibfm mezilaboratorní porovnání diagnostického vzorku UK NEQAS % pozitivity jednotlivých znaků vybraných podle ibfm SOP EuroFlow QA Quality assessment program for EuroFlow protocols: Summary results of four year ( ) quality assurance rounds. Kalina T, et al. (Cytometry A, 2015 Feb;87(2):145 56) Monitoruje celý cytometrický proces : nastavení cytometru, příprava vzorku, nahrávání, analýza.

14 PRIMÁRNÍ VERIFIKACE REAGENCIÍ nově v normě ISO Kontrola reagencií probíhá při prvním měření vzorku danou reagencií. Reagencie jsou monitorovány, včetně šarže, doby expirace, data otevření a data vypotřebování. SPRÁVNĚ TITROVAT zejména na vhodném materiálu DOBŘE A PRAVIDELNĚ KOMPENZOVAT CD19 PerCP x general (PE) SLEDOVAT DOBU EXPIRACE Jak zacházet s protilátkami, které mají po době expirace?

15 NIS LIS Databáze nutná validace výrobcem nově v normě ISO Analyzační software (Diva, FlowJo, ) Vzorek (referenční materiál) několikrát analyzován stejnou gejtovací strategií porovnání dat. Softwary nebo tabulky pro automatické přepočty př. Stanovení absolutního počtu buněk z WBC podle referenčních kuliček versus kalkulačka 13:30 workshop Synchronizační software kontrola přenosu a celistvosti dat

16 #Don.27t_Panic Poděkování Hana Feixová zástupce manažera kvality CLIPu kolegové z CLIPu: Daniel Thürner Martina Šmídková Pavla Luknárová Pavel Semerák 13:30 workshop workshop Klinická cytometrie kontrola kvality, problémy v cytometrických vyšetřeních konference seminare konferencecsac.html