AMINOKYSELINY STANOVENÍ AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ BÍLKOVIN. Stanovení sirných aminokyselin. Obecná struktura

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "AMINOKYSELINY STANOVENÍ AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ BÍLKOVIN. Stanovení sirných aminokyselin. Obecná struktura"

Vilém Kříž
před 8 lety
Počet zobrazení:

1 AMIKYSELIY becná struktura STAVEÍ AMIKYSELIVÉH SLŽEÍ BÍLKVI 1. IZLAE (jen v některých případech) 2. HYDLÝZA kyselá hydrolýza pomocí Hl ( c = 5 mol.dm -3 ) klasicky: , h, inertní atmosféra, někdy přídavek thioglykolové kyseliny nově: mikrovlnný ohřev (trvá minuty) destrukce některých AA za podminek hydrolýzy - tryptofan, sirné aminokyseliny, amidy aminokyselin (částečně serin, threonin) Stanovení sirných aminokyselin Kyselá hydrolýza oxidace kyselinou permravenčí (kyselá hydrolýza) H 2 H H SH H 2 cystein 3 HH H-H H 2 H H - H-H S 3 H H 2 cysteová kyselina H 2 H 2 H H S H 3 H 2 methionin 2 HH H-H - 2 H-H H 2 H 2 H H S H 3 H 2 methioninsulfon 1

hydrolýzy - tryptofan, sirné aminokyseliny, amidy aminokyselin (částečně serin, threonin) Stanovení sirných aminokyselin Kyselá hydrolýza oxidace kyselinou

2 Stanovení tryprofanu po alkalické hydrolýze, nejčastěji Ba(H) 2 ( c = 5 mol.dm -3 ), , 24 hodin Stanovení asparaginu a glutaminu enzymovou hydrolýzou -pepsin -trypsin - papain - peptidasy SEPAAE A KVATIFIKAE AMIKYSELI hromatografie v plošném uspořádání KAPALIVÁ HMATGAFIE Plynová chromatografie Elektromigrační metody Dělení aminokyselin chromatografií na tenké vrstvě 2

-trypsin - papain - peptidasy SEPAAE A KVATIFIKAE AMIKYSELI hromatografie v plošném uspořádání

3 DĚLEÍ AMIKYSELI PMÍ (HP)L ůzné é typy separačních mechanismů hromatografie (nízkotlaká) na měničích iontů silně kyselé katexy - mobilní fáze: pufry se vzrůstající hodnotou ph a iontovou sílou - nižší ph - neutrální a kyselé aminokyseliny -vzrůst ph - bazické aminokyseliny automatický analyzátor aminokyselin hromatografie v reverzní fázi často předkolonová derivatizace Iontově párová chromatografie typicky pokolonová derivatitace - snadná automatizace, snazší manipulace se vzorkem (B) A = εbc A = log P 0 /P A A = log 1/T A = log 100/%T A = 2 - log %T 3

automatický analyzátor aminokyselin hromatografie v reverzní fázi často předkolonová derivatizace Iontově párová chromatografie typicky

4 tázka: jak detekovat aminokyseliny? absorbce v UV - jen aromatické aminokyseliny fluorescence - tryptofan změna indexu lomu (refraktometrie) - nespecifické, málo citlivé potřeba derivatizace 1. TVBA DEIVÁTŮ P (HP)L základní aspekty zvažované při volbě derivatizační metody Dobrá L separace analytů Snadnost přípravy derivátu, jeho stabilita, možnost automatizace itlivost a selektivita detekce A. Derivatizace před separací - prekolonová Požadována tvorba stabilních projektů A1. fluoreskující produkty S 2 l H 3 H 3 dansylchlorid + H 2 H H S 2 H H H H 3 H 3 dansylderivát S 3 H + H 2 H H S 2 H H H H 3 H 3 4-toluensulfonová kyselina tosylderivát AQ (6-aminoquinolyl - hydroxysuccinimidylcarbamate) - vznikají stabilní deriváty absorbující též v UV 4

TVBA DEIVÁTŮ P (HP)L základní aspekty zvažované při volbě derivatizační metody Dobrá L separace analytů Snadnost přípravy derivátu, jeho stabilita, možnost automatizace itlivost a

5 A2. UV- absorbující produkty 2 F 2 + H 2 H H 2 H 2 H H + HF 2, 4-dinitrofluorbenzen 2, 4-dinitrofenylderivát Fenylisothiokyanát B. derivatizace po separaci - pokolonová musí být velmi rychlá, stabilita derivátu není rozhodující ejčastější činidla: PA (o- ftaldehyd), fluorescence (někdy i prekolonově) ninhydrin - produkty absorbující ve viditelné části spektra ejčastější činidla: PA (o- ftaldehyd), fluorescence (někdy i prekolonově) ninhydrin - produkty absorbující ve viditelné části spektra H H H H + -H= + H3 + + H 2 H H +2 ninhydrin (trioxohydrindenhydrát) H H + + H3 H H dioxohydroxyhydringen H + 3 H2 5

(někdy i prekolonově) ninhydrin - produkty absorbující ve viditelné části spektra ejčastější činidla: PA (o- ftaldehyd), fluorescence (někdy i

6 2. TVBA DEIVÁTŮ P G požadavek: těkavé produkty nutné derivatizovat obě funkční skupiny A. estery -acylaminokyselin esterifikační činidla (derivatizace( H): isopropanol, isobutanol, n-butanol, metanol, isobutanol + 3M Hl -acylační činidla (derivatizace( aminoskupiny): anhydridy kyselin - pentafluor- propionové, heptafluormáselné, trifluoroctové H H H 2 + H H () 2 H H 2 H + H B. Trimethylsilylestery -trimethylsilyl aminokyselin H H + (H3)3SiX H Si(H 3 ) 3 H H Si(H 2 3 ) 3 + HX AALÝZA AMIKYSELI - specielní aspekty volné - izolace po okyselení (obtíže s rozpustností leucinu, cysteinu aj.) Důkaz aminokyselin a) eakce s kovovými ionty barevné komplexy su 2+, Fe 3+ aj. H H 2 Me b) eakce s ninhydrinem (Streckerova degradace aminokyselin) 6

anhydridy kyselin - pentafluor- propionové, heptafluormáselné, trifluoroctové H H H 2 + H H () 2 H H 2 H + H B.

7 A. STAVEÍ ELKVÉH BSAHU AMIKYSELI Formolová titrace H H + H2= H 2 H H H H 2 H další produkty Titrace karboxylové skupiny alkalimetricky Manometrická van Slykeova metoda H H H H + H2 H H H2 2 3 H 2 H H H 2 H 3 + H 2 H 2 + H ah a 2 + a H 2 4. Spektrofotometrické metody eakce s ninhydrinem - měření fialového zbarvení viz důkaz aminokyselin eakce s 2,4,6-trinitrobenzensulfonovou kyselinou 2 2 S 3 H + H 2 H H S 2 H H H + H2 2 B. STAVEÍ ĚKTEÝH PTAVIÁŘSKY DŮLEŽITÝH AMIKYSELI Stanovení lysinu ELKVÝ BSAH Spektrofotometrická metoda -vznik komplexu s u (II) a derivatizace ε-aminoskupiny 2,4- dinitrofluorbenzenem, redukce vzniklého produktu 7

Spektrofotometrické metody eakce s ninhydrinem - měření fialového zbarvení viz důkaz aminokyselin eakce s 2,4,6-trinitrobenzensulfonovou kyselinou 2 2 S 3 H + H 2 H H 2

8 2 H 2 (H2) 3 H H H 2 H 2 u H+ H H 2 (H 2 ) 4 H 2 u H (H 2 ) 4 H 2 H F 2-2 HF 2 H H (H 2 ) 4 H 2 u H (H 2 ) 4 H H H (H 2 ) 4 H H H 2 Enzymová metoda L-lysinkarboxylasa, E (= lysindekarboxylasa) měření uvolněného oxidu uhličitého či kadaverinu H 2 (H 2 ) 3 H H H 2 (H 2 ) 3 H 2 H 2 H H2 2 H 2 lysin kadaverin + 2 HAAKTEIZAE EZYMVÝH METD reakce jsou specifické není třeba selektivně izolovat analyt ze vzorku jednoduché provedení specifita enzymu - ve vztahu k typu katalyzované reakce - pro daný substrát, který je konvertován nelze získat informaci o jednotlivých komponentách spektra sloučenin, měří se jednotlivé analyty 8

(= lysindekarboxylasa) měření uvolněného oxidu uhličitého či kadaverinu H 2 (H 2 ) 3 H H H 2 (H 2 ) 3 H 2 H 2 H H2 2 H 2 lysin kadaverin + 2 HAAKTEIZAE EZYMVÝH METD

9 Využitelný lysin Spektrofotometrická metoda 2 H H (H 2 ) 4 H F H H (H 2 ) 4 H 2 H2 (Hl) H H H (H 2 ) 4 H Stanovení hydroxyprolinu Spektrofotometrická metoda H H H H22-2 H2 H 2 H H H H H H 3 H 3 - H2 H H H H 3 H 3 H H H H H H Využití: Stanovení obsahu kolagenu v masných výrobcích (příliš vysoký obsah kolagenu je známkou nadměrného obsahu pojivové tkáně) bsah kolagenu se získá vynásobením obsahu hydroxyprolinu faktorem 8.0 Stanovení tryptofanu Spektrofotometrická metoda měření intenzity zbarvení s, - dimethylaminobenzaldehydem v přítomnosti H 2 Stanovení glutamové kyseliny Enzymové metody Varianta A H 2 H 2 H H H H 2 L-glutamát 1-karboxylasa H 2 H 2 H 2 H H možno stanovit 4-aminomáselnou kyselinu nebo 2 9

tkáně) bsah kolagenu se získá vynásobením obsahu hydroxyprolinu faktorem 8.

10 Varianta B H 2 H 2 H H H H 2 L-glutamát: AD oxidoreduktasa H 2 H 2 H H AD+, H2 H H 2 + ADH + H4 + možno stanovit 2- oxoglutarovou kyselinu nebo ADH (přímo v ultrafialové oblasti spektra nebo po následné enzymové reakci 1. ADH + H + + diaforasa-fad (red. AD: lipoamid oxidoreduktasa, E ) AD + + diaforasa-fadh 2 2. diaforasa-fadh 2 + tetrazolinová sůl diaforasa-fad + formazan X- 2 H - XH 3 H 1 2 tetrazoliová sùl formazan H2 H2 H H H H 2 L-glutamát: FAD oxidoreduktasa FAD, 2, H2 H2 H2 H H H + FADH2 + H22 + H3 možno stanovit 2-oxoglutarovou kys., kyslík nebo peroxid vodíku Stanovení sirných aminokyselin Titrační argentometrická metoda 2 -SH + 2 Ag 3 -S-S- + 2 Ag + H 3 redukce disulfidů : -S-S- + a 2 S 3 + H 2 2 -SH + a 2 S 4 Spektrofotometrická metoda H H2 H2 H H H3 H2 + H3 H2 SH H H 2 H SH2 H H -ethylmaleinimid H2 redukce disulfidů: -S-S- + a + H 2 2 SH + a 10

diaforasa-fadh 2 + tetrazolinová sůl diaforasa-fad + formazan 3 + 1 2 X- 2 H - XH 3 H 1 2 tetrazoliová sùl formazan H2 H2 H H H H 2 L-glutamát: FAD oxidoreduktasa FAD, 2, H2 H2 H2 H H H + FADH2 + H22

11 Stanovení různých aminokyselin Prolin (ninhydrin, HH) Arginin (8-hydroxycholin, HH) Kreatin, resp. kreatinfosfát (biacetyl, 2-naftol; enzymové stanovení) Kreatinin (pikrová kyselina, enzymové stanovení) AALÝZA PEPTIDŮ Karnosin, anserin: histidylalaninové peptidy reakce s 2, 4-dinitrofluorbenzenem 2, 6-dioxopiperaziny ( cyklické dipeptidy) chromatografické metody Vyšší peptidy - chromatografické metody, L/MS Další dusíkaté sloučeniny nukleotidy (volné nukleotidy), nukleosidy, báze nukleových kyselin aminy, biogenní aminy dusitany, dusičnany Stanovení nukleotidů v hovězích játrech (HPL/UV, ionex) 11

histidylalaninové peptidy reakce s 2, 4-dinitrofluorbenzenem 2, 6-dioxopiperaziny ( cyklické dipeptidy) chromatografické metody Vyšší peptidy -

Podobné dokumenty

STANOVENÍ AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ BÍLKOVIN. Postup stanovení aminokyselinového složení

STANOVENÍ AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ BÍLKOVIN. Postup stanovení aminokyselinového složení STANVENÍ AMINKYSELINVÉH SLŽENÍ BÍLKVIN Důvody pro stanovení AK složení určení nutriční hodnoty potraviny, suroviny (esenciální vs. neesenciální AK) charakterizace určité bílkovinné frakce nebo konkrétní