Hodnocení kvality ejakulátu a přežitelnosti spermií psa domácího

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat Hodnocení kvality ejakulátu a přežitelnosti spermií psa domácího Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Martin Hošek, Ph.D. Vypracovala: Radka Škarecká Brno 2013

2

3

4 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Hodnocení kvality ejakulátu a přežitelnosti spermií psa domácího vypracovala samostatně a použila jsem jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. Dne. Podpis diplomanta

5 PODĚKOVÁNÍ Děkuji Ing. Martinu Hoškovi, Ph.D. za jeho odborné vedení, poskytnuté konzultace, věcné připomínky a pomoc při zpracování bakalářské práce. Poděkování patří také mé rodině a nejbližším přátelům za podporu a pomoc během mého studia.

6 ABSTRAKT Bakalářská práce se zabývá popisem reprodukčních samčích orgánů, reprodukční aktivitou psa, stavbou spermie, metodami hodnocení kvality ejakulátu a morfologií spermie. Mezi speciální laboratorní metody hodnocení kvality ejakulátu bylo zaměřeno na popis testů přežitelnosti spermií. Byla nastíněna metodika postup pro použití laboratorních metod hodnocení kvality ejakulátu a testů přežitelnosti spermií během vyšetření ejakulátu. Na bakalářskou práci bude navazovat diplomová práce, ve které budou popsány výsledky získané během vyšetření. Klíčová slova: psí ejakulát, spermie, laboratorní vyšetření, přežitelnost spermií, morfologie ABSTRACT This thesis deals with the description of the male reproductive organs, male reproductive activity, sperm structure, methods of assessing the quality of semen and sperm morphology. The special laboratory methods for assessing semen quality was focused on the description of the sperm survival test. Was outlined methodology - a process for using laboratory methods for assessing the quality of semen and sperm survival test during examination of ejaculate. The work will be followed by a bachelor's master's thesis, which will be described in the results obtained during the examination. Keywords: dog ejaculate, sperm, laboratory testing, survivability of sperm, morphology

7 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁLNÍ PŘEHLED Anatomie pohlavních orgánů psa Varlata (testes) Nadvarle (epidydymis) Chámovod (ductus deferens) Přídatné pohlavní žlázy (glandulae genitales accessoriae) Žláza předstojná (prostata) Pyj (penis) Reprodukční aktivita psa Ejakulát psa Spermatogeneze Spermatocytogeneze Spermatohistogeneze Ejakulát (semeno, sperma, chám) Spermie Stavba spermie Chemické složení spermií Semenná plazma Enzymy ejakulátu Frakce ejakulátu Hodnocení psího ejakulátu Makroskopické hodnocení ejakulátu Objem ejakulátu Konzistence, zrnitost Barva Pach... 23

8 Cizí přimíseniny Mikroskopické hodnocení ejakulátu Hodnocení aktivity (motility spermií) Stanovení hustoty koncentrace ejakulátu Stanovení hustoty spermatu fotometricky Stanovení hustoty spermatu haematocytometricky Stanovení hustoty spermatu spermiodenzimetrem podle Karrase Stanovení hustoty spermatu odhadem Biologické zkoušky ejakulátu Testy přežitelnosti spermatu Krátkodobý tepelný test přežitelnosti Dlouhodobý chladový test přežitelnosti Zkouška rezistence spermatu Metoda vzestupného ředění Zkouška živých spermií na odolnost vůči chladovému šoku Stanovení procenta živých a mrtvých spermií barvením Stanovení koncentrace vodíkových iontů ph spermatu Biochemické zkoušky spermatu Dehydrogenační zkouška Zkouška anaerobního metabolismu spermií testem fruktolýzy podle Manna Morfologie spermie Morfologické vyšetření spermatu Morfologicky normální spermie Morfologické změny spermie ZÁVĚR LITERATURA... 43

9 1 ÚVOD Pes je nejstarším zdomácnělým zvířetem a doprovázel člověka již v době kamenné. Jeho nejpravděpodobnějším předkem je vlk, který mu předal asi 95 % genetické informace. V průběhu let došlo k symbióze mezi člověkem a psem, kde hrál pes důležitou roli jako ochránce před predátory, pomocník při lovu a přehánění stád, člověk mu poskytoval obživu a přístřeší. V dnešní populaci nachází pes domácí pracovní využití, kde řadíme obranu majetku, bezpečnostní složky, ale i myslivost a sport. Má ale také své nenahraditelné místo při pomoci za záchranu lidského života, nebo jako asistenční a canisterapeutický pes usnadňující život postiženým lidem. Zejména se těší oblibě jako nepostradatelný společník. Během dlouhého soužití člověka se psem bylo vyšlechtěno nespočet plemen rozdílných velikostí, proporcí, délky a struktury srsti i povahy. V současnosti Mezinárodní kynologická federace uznává 343 plemen. Rozdělení plemen podle Mezinárodní kynologické federace FCI: 1. Plemena ovčácká, pastevecká a honácká 2. Pinčové, knírači, molossoidní plemena a švýcarští salašničtí psi 3. Teriéři 4. Jezevčíci 5. Špicové a psi původního typu 6. Honiči a barváři 7. Ohaři 8. Slídiči, retrívři a vodní psi 9. Společenští psi 10. Chrti Pro zachování těchto plemen hraje důležitou roli reprodukce. Pro správný reprodukční cyklus je zásadní tvorba oplození schopných samičích pohlavních buněk vajíček a samčích pohlavních buněk spermií. V dnešní době, kdy se stále více uplatňuje při reprodukci inseminace, je důležité mít kvalitní ejakulát. Za pomocí metod laboratorního vyšetření kvality spermatu a testů přežitelnosti spermií můžeme získat opravdu kvalitní ejakulát, který je potřebný pro vznik potomstva. A pro zachování některých ohrožených plemen mohou tato laboratorní vyšetření ukázat vhodnost případné konzervace ejakulátu po delší dobu. 9

10 2 CÍL PRÁCE Cílem bakalářské práce byl popis hodnocení kvality ejakulátu psa domácího, dále popis hlavních metod makroskopického a mikroskopického hodnocení ejakulátu. Vlastnímu hodnocení předcházel popis reprodukčních samčích orgánů, ejakulátu psa a morfologie spermie. Hodnocení bylo zaměřeno na metody speciálního vyšetření ejakulátu se zřetelem na testy přežitelnosti spermií. 10

11 3 LITERÁLNÍ PŘEHLED 3.1 Anatomie pohlavních orgánů psa Samčí pohlavní orgány jsou tvořeny pohlavními žlázami varlata, vývodnými pohlavními cestami nadvarlata a chámovody, přídatnými pohlavními žlázami (u psa se jedná pouze o prostatu) a kopulačním orgánem pyj Varlata (testes) Varlata jsou uložena v šourku mimo tělní dutinu. Je to párový orgán, který plní dvě základní funkce: kdy se v točitých semenotvorných kanálcích vytvářejí spermie (činnost exkretorická), druhou funkcí je tvorba androgenů v intersticiálních Leydigových buňkách (činnost inkretorická) (Gamčík, Kozumplík et al., 1984). Na varleti rozlišujeme vzhledem k uložení nadvarlete dva konce a to hlavový a ocasní konec. Povrch varlete je potažen serózním povlakem, který je pevně srostlý s pevným fibrózním obalem, označovaný jako pouzdro varietní. Od varietního pouzdra vnikají do hloubky varlete paprskovitě uspořádané vazivové přepážky, které rozdělují parenchym varlete na jednotlivé lalůčky. Jednotlivé lalůčky jsou tvořeny ze stočených semenoplodných kanálků vystlaných zárodečným epitelem a Sertoliho buňkami. Stočené kanálky přecházejí v přímé kanálky, které vytvářejí síť varlete. Z níž vystupuje na hlavovém konci varlete asi vývodných kanálků, prostupujících až do hlavy nadvarlete (Gamčík, Kozumplík et al., 1984). U psa je varle téměř kulovitého tvaru, parenchym je na řezu šedé barvy. V šourku je varle uloženo mírně šikmo, hlavový konec směřuje kraniálně a poněkud ventrálně, ocasní konec kaudodorsálně. U štěňat jsou varlata uložena v břišní dutině a jsou poměrně malá (Gamčík, Kozumplík et al., 1984). Do dvou měsíců stáří štěněte nemusejí být varlata sestouplá v šourku, ale mohou se nacházet v tříselném kanálu nebo v břišní dutině. Po dvou měsících stáří štěněte se jeví absence varlat v šourku jako abnormální stav. Průměrná velikost varlat u psa střední velikosti je 3 x 2 x 1,5 cm. Kůže šourku je tenká, pigmentovaná, vybavená potními žlázami a pokryta jemným ochlupením. Pro správný vývoj spermií ve varleti je teplota v šourku o C nižší než je normální tělesná teplota (Svoboda, Senior et al., 2001). Varlata reagují také na změny teploty prostředí. V chladném prostředí se smršťují, a tím zmenšují plochu odparu z povrchu šourku. Naopak v teplém prostředí ochabují, čímž se odpařovací plocha šourku zmenšuje. Jedná se o termoregulační mechanismus, 11

12 díky němuž je teplota v šourku menší než normální tělesná teplota (Komárek et al., 1971) Nadvarle (epidydymis) Na povrch varlat nasedají nadvarlata. Nadvarle je orgánem, kde se shromažďují spermie a funkčně zde dozrávají. Nadvarle je vytvořené nahloučením kliček vývodných kanálků varlete a kliček vývodů nadvarlete. Spermie vytvořené v semenotvorném epitelu stočených kanálků varlete jsou z lumina kanálků vyplavovány do nadvarlete (Najbrt et al., 1982). Hlavní funkce nadvarlete je ve shromažďování spermií a ukládání do zásob. Zde spermie zcela dozrávají a získávají schopnost pohybu (Věžník et al., 2004). Na nadvarleti rozlišujeme hlavu, tělo a ocas nadvarlete (Najbrt et al., 1982). Hlavu nadvarlete tvoří vývodných kanálků, které vystupují z varletní síně a opouštějí varle na jednom jeho pólu. Tyto kanálky jsou postupně slévány do společného nadvarletního vývodu, jehož husté meandrovité kličky vytvářejí tělo a ocas nadvarlete (Komárek et al., 1971). Hlavní funkcí hlavy nadvarlete je, že zde dochází k odjímání tekutiny, která vyplavuje spermie z varlete a dochází zde k zahuštění spermií (Gamčík, Kozumplík et al., 1984). V těle nadvarlete se spermie setkávají se sekrety, které obsahují velké množství tuků a dalších látek. Tyto látky mají za úkol zvyšovat odolnost povrchových membrán spermií. Spermie projdou celým tělem nadvarlete minimálně za 8 11 dní (Gamčík, Kozumplík et al., 1984). Spermie si zde uchovávají životnost a oplozovací schopnost především díky tomu, že je tady nižší hladina kyslíku a vyšší hladina oxidu uhličitého. Látkový metabolismus spermií je tedy snížen na minimum (Komárek et al., 1971). Rozvinutý nadvarletní vývod měří u psa 5 8 m (Gamčík, Kozumplík et al., 1984) Chámovod (ductus deferens) Nadvarlata přecházejí do chámovodu, který je tvořen sliznicí, svalovinou a serozou. Po výstupu z ocasu nadvarlete prochází šourkovou dutinou, tříselným kanálem a dutinou břišní se dostává do dutiny pánevní až na dorzální plochu močového měchýře (Věžník et. al., 2004). Ampule chámovodu na rozdíl od přežvýkavců a koní není u psa vytvořena. U samců bez ampul chámovodů se spermie dostávají do močové roury při ejakulaci z ocasu nadvarlete kontrakčními vlnami celého chámovodu (Gamčík, Kozumplík et al., 1984). V břišní dutině je chámovod spolu s varletní tepnou, žílou a nervem, lymfatickými cévami, svalem a vnitřním zdvihačem varlete obalen útrobním listem poševního obalu. Celý tento útvar se nazývá semenný provazec (Věžník et al., 2004). Chámovody se ve své konečné části spojují s vývodem semenného váčku příslušné strany ve vývodný kanálek, který vyúsťuje do močové roury na semenném hrbolku. Chámovod společně 12

13 s varletem a nadvarletem se v jeho průběhu protahuje až k tříselnému kanálu, kde stejným směrem procházejí cévy, které zprostředkovávají krvení varlete (Gamčík, Kozumplík et al., 1984) Přídatné pohlavní žlázy (glandulae genitales accessoriae) Žláza předstojná (prostata) Předstojná žláza prostata je tubuloalveolární žláza ležící na krčku močového měchýře a začátku močové trubice, do které vyúsťuje četnými vývody (Gamčík, Kozumplík et al., 1984). U psů je prostata jedinou přídatnou pohlavní žlázou. Je uložena přibližně v polovině pánve okolo kraniální části uretry asi 1 cm za krčkem močového měchýře. Sekret prostaty je vylučován při ejakulaci těsně před spermiemi a zároveň s nimi. Sekret prostaty obsahuje volné aminokyseliny, neobsahuje cukry, je však relativně vysoký obsah anorganických solí, které udržují stejný osmotický tlak v ejakulátu (Gamčík, Kozumplík et al., 1984). Je kulovitého tvaru a mediální prohlubeninou na dorzální straně na dvě symetrické části (Svoboda, Senior et al., 2001). Žláza je tuhé konzistence a hladkého povrchu, dle plemene a stáří jedince je různě velká. Délka, šířka a tloušťka prostaty pohlavně dospělého psa se pohybuje v rozmezí od 1,4 1,9 cm do 2,5 2,8 cm (Svoboda, Senior et al., 2001) Pyj (penis) Pyj je pohlavní orgán, který díky své anatomii zabezpečuje přenos spermatu do pohlavních cest samice a současně i odvodnou cestou moči mimo tělo (Věžník et al., 2004). Podkladem pyje je topořivé těleso. U psa je přední část pyje vyztužena pyjovou kostí. Kaudálně uložený uzel žaludu při kopulaci mohutně zduří a způsobuje svázání při kopulaci je penis zafixován v pochvě feny. Žalud pyje jeho konečná část je intenzivně inervována a v jeho sliznici nacházíme početná senzitivní tělíska. Pomocné svaly pyje, jejichž funkcí je spojení kořenu penisu s pánví a ocasními obratli, umožní uvedení pyje do polohy vhodné pro páření napřimovač pyje. Po kopulaci zatažení pyje zpět do předkožky zatahovač pyje (Gamčík, Kozumplík et al., 1984). Penis má přibližně válcovitý tvar. U velkých plemen psů je až 25 cm dlouhý a 2 3 cm silný (Najbrt et al., 1982). Erekce je způsobena zvýšením tlaku krve uvnitř dutinek v topořivých tělesech penisu a díky tomu je větší přítok krve než jeho odtok (Reece, 1998). Za pomocí funkčních změn při erekci je penis dělený na několik typů. Prodloužení a zvětšení penisu při erekci je založeno buď na překrvení kavernózních topořivých těles. U psa a u hřebce nachází- 13

14 me tento typ topořivých těles. U přežvýkavců je ztopoření založeno na vyrovnání esovitého zakřivení penisu. U kance jsou oba dva typy na stejné úrovni, takže při erekci dochází jak ke zbytnění penisu, tak i k jeho vyrovnání zakřivení. U psa dochází ke konečné erekci a zduření penisu až po jeho zasunutí do pochvy feny (Reece, 1998). Za klidového stavu je pyj zcela schován v předkožce. Kůže předkožky je volná a ochlupená (Najbrt et al., 1982). 3.2 Reprodukční aktivita psa U psů je reprodukční aktivita způsobena dostatečnou sekrecí pohlavního hormonu testosteronu, který se vytváří ve varlatech díky vlivu hormonů z podvěsku mozkového. Testosteron ovlivňuje jednak tvorbu spermií a také vývoj sekundárních pohlavních znaků psa a jeho chování (Kvapil, Kvapilová, 2007). Psi dospívají pohlavně o něco málo později než feny stejného plemene. Dosažení puberty nastává okolo 9 měsíce věku. V pubertě je pes schopen krytí. Z toho vyplývá, že pes s dostatečným pohlavím pudem je v přítomnosti hárající feny schopen realizovat své pohlavní reflexy. Projevy určitého stupně pohlavní aktivity bez schopnosti tvorby semene jsou zjevné již ve věku 3 4 týdnů. Plnohodnotný ejakulát se dá očekávat ve věku jednoho roku stáří. Po 8 9 roce stáří se kvalita ejakulátu snižuje (Svoboda, Senior et al., 2001) Ejakulát psa Spermatogeneze Spermatogenezí nazýváme proces tvorby spermií, který probíhá v semenotvorných kanálcích varlat. Proces probíhá celoročně a opakuje se v pravidelných cyklech. Cyklus je tvořen obdobím rozmnožování, meiózy a metamorfózy. Spermatogenezi dělíme na dvě etapy: spermatocytogeneze, kde dochází k rozmnožování, růstu a zrání. A na druhou etapu nazývanou spermatohistogeneze, kde dochází k přeměně spermatid na spermie (Sova et al., 1981) Spermatocytogeneze Období rozmnožování je charakterizováno opakovaným mitotickým dělením původních kmenových buněk A spermatogonií. Dochází zde k dělení mateřských buněk 14

15 A spermatogonií na dvě nestejně veliké dceřinné buňky. Jedna buňka je větší a podobná buňce mateřské, tato buňka zůstává po celou dobu v latentním stadiu, druhá menší intermediální buňka se opakovaně několikrát dělí. Výsledkem jsou buňky typu B spermatogonie (Jelínek, Koudela et al., 2003). Na období množení navazuje období růstu, kdy spermatocyty I. řádu zvětší svůj objem. Období zrání meiozy je charakteristické dvěma po sobě následujícími děleními a díky tomu dochází k redukci počtu chromozomů na polovinu z diploidního počtu chromozomů se stává haploidní počet chromozomů a dochází k rekombinaci vloh. Vstupují do ní spermatocyty I. řádu a v prvním meiotickém dělení vznikají dva spermatocyty II. řádu. Druhým meiotickým dělením vznikají čtyři spermatidy, které jsou charakteristické přítomností vždy jednoho sexchromozomu X chromozom nebo Y chromozom, poměr spermatid se zřetelem na sex chromozomy je 50 : 50 (Jelínek, Koudela et al., 2003). První meiotické dělení je charakteristické velmi dlouhou profází, která se skládá z leptotenního stádia, zde dochází ke spiralizaci chromozomů. A ze zygotenního stádia, zde vznikají dvojice bivalentních chromozomů. Pachytenní stádium je charakteristické vznikem chromatidové tetrády. Diplotenní stádium je z genetického hlediska nejdůležitějším stádiem charakteristické výměnou materiálu mezi jednotlivými chromozomy. Diakineze je posledním stádiem meiozy, jehož výsledkem jsou dvě haploidní buňky sekundární spermatocyty (Sova et al., 1981). Při druhém meiotickém dělení dochází ke vzniku spermatid, které se vytvářejí ze sekundárních spermatocytů. Spermatidy mají rovněž haploidní počet chromozomů a vznikly mitotickým dělením spermatocytů II. řádu (Marvan et al., 1992). Vznikem spermatid, kde z jednoho primárního spermatocytu vznikají čtyři spermatidy, se uzavírá fáze spermatocytogeneze (Sova et al., 1981) Spermatohistogeneze V průběhu spermiohistogeneze prochází spermatidy strukturálními změnami a změní se do formy zralé spermie. Dochází k transformaci jádra spermatidy, mění se postupně jádro chromatinu za pomocí ztráty tekutiny a kondenzace do krystalické formy deoxyribonukleové kyseliny. Tento proces doprovází vytváření akrozomálního aparátu, který má základ v Golgiho aparátu (Věžník et al., 2004). Charakteristické pro vlastní průběh metamorfózy je tvorba pohybového aparátu bičíku, vznik akrozómu na hlavičce spermie potřebného pro penetraci vniknutí spermie do vajíčka. Hlavička spermie vzniká za pomocí prodloužení jádra spermatidy, které 15

16 se prodloužilo, oploštilo a posunulo k apikálnímu pólu buňky. Oba buněčné centrioly dávají vznik krčku a osovému vláknu bičíku spermie. Spermie postupují odvodnými kanálky do ocasu nadvarlete během dní. V ocasu nadvarlete jsou uchovány až do ejakulace bez vykazujícího pohybu (Sova et al., 1981) Ejakulát (semeno, sperma, chám) Ejakulát je viskózní, nažloutlá, šedobílá tekutina. Skládající se ze dvou částí: buněčná část spermie a ze semenné plazmy tekutá část (Marvan et al., 2007). Největší podíl ejakulátu tvoří voda 90 až 98 %. Z anorganických látek obsahuje Na, Cl, K, P, Ca, S. Z organických látek obsahuje bílkoviny, cukry a tuky (Komárek et al., 1964). Ejakulát se vytváří během období dospívání ve varlatech (spermie) a přídatných pohlavních žlázách (semenná plazma) samců (Kliment et al., 1983). Ejakulát má druhově specifickou barvu, pach i konzistenci. Přežvýkavci mají obecně menší objem ejakulátu ale s vyšší koncentrací spermií. Všežravci, šelmy a lichokopytníci mají poměrně velký objem ejakulátu s nízkou koncentrací spermií (Marvan et al., 2007). Tab. 1 Přehled ejakulátů různých druhů zvířat Druh zvířete Objem ejakulátu (ml) Celkové množství v ejakulátu v miliardách Koncentrace spermií (10 3 *mm -3 ) Vzhled ejakulátu Býk Bělavě nažloutlá smetanovitá tekutina, páchne po čerstvě nadojeném mléku. Kanec tis. Řídká, mléčně vodnatá tekutina, páchne po moči. Hřebec tis. Bělavě opaleskující tekutina. beran Smetanovitá tekutina. (Komárek et al., 1971) 16

17 3.2.3 Spermie Jedná se o buněčnou část a nejdůležitější část ejakulátu. Velikost i tvar jsou druhově rozdílné. Společným znakem u všech spermií je pohyblivost a schopnost oplození (Jelínek, Koudela et al., 2003). Jsou to samčí pohlavní buňky vytvářející se v semenotvorných kanálcích (Gamčík, Kozumplík et al., 1976). Velikost spermií se pohybuje v rozmezí µm. V hmotnosti jsou nepatrné rozdíly, vzhledem k přítomnosti sexchromozomu. Spermie mající heterochromozom Y (androspermie) jsou lehčí než spermie s heterochromozomem X (gynospermie) (Jelínek, Koudela et al., 2003) Stavba spermie Morfologická stavba spermií udává jejich fyziologické vlastnosti a cytochemické složení. Nepoškozená spermie se skládá z: hlavičky, krčku a bičíku (Kliment et al., 1983). Hlavička je 5 10 µm dlouhá. Ze stran je zploštělá a má oválný tvar. Základním materiálem hlavičky je jádro nukleoplazma. Kde se nachází otcovský dědičný materiál chromozomy. Přední část hlavičky je pokryta čepičkou. Pod čepičkou se nachází akrozom. Uvnitř je obsažen akrozomový materiál, který je složený z mukopolysacharidů a obsahuje velké množství enzymů. Tyto enzymy jako hyaluronidáza a akrozin mají nezastupitelnou roli při pronikání spermie do vajíčka a při jeho oplození. Koncentrace enzymu hyaluronidáza je vysoká ve spermiích býka a králíka, v menší míře pak u kance, psa a muže. Spermie ptáků tento enzym neobsahují vůbec (Gamčík, Kozumplík et al., 1976). Krček měří jen 2 3 µm, obsahuje dva za sebou uložené centrioly, které jsou proximální a distální. Osové vlákno bičíku tvoří dvacet mikrofibril vystupujících z centrálního centriolu. Mikrofibrily jsou uspořádány do dvojic, přitom jedna dvojice je centrální, která je obklopena devíti dvojicemi periferními, doprovázenými zevnějšku ještě devíti hladkými provazci chordami (Sova et al., 1981). Bičík je dlouhý µm. A prezentuje pohybové ústrojí spermie. Rozdělujeme ho na spojovací, hlavní a koncovou část. Ve spojovací části bičíku je osové vlákno bičíku, které je obaleno mitochondriemi, které jsou seřazeny za sebou v podobě spirály. Hlavní úsek bičíku je nejdelší a jeho osové vlákno je zevně obaleno fibrózní pochvou z homogenní a silně kontrastní hmoty. Koncová část bičíku je tvořena osovým vláknem bez chord i fibrózní pochvy (Sova et al., 1981). Celá spermie je kryta cytoplazmatickou membránou (Gamčík, Kozumplík et al., 1976). Hlavním úkolem cytoplazmatické membrány je ochrana před nepříznivými vlivy vnějšího prostředí a také permeabilita cytoplazmatické membrány umožňuje látkovou výměnu spermií. Díky tomu cytoplazmatická membrána u živých spermií nepropouští 17

18 některá barviva jako je eozin a fluorochromozomy, dala možnost vzniku metodě vitálně letálního barvení, díky kterému lze rozlišovat živé a mrtvé spermie. Důkazem, že je spermie mrtvá, je zvýšení permeability cytoplazmatické membrány spermie (Jelínek, Koudela, 2003). Obr. 1 Morfologie spermie 1 cytoplazmatická membrána A hlavička 2 vnější akrozomální membrána B krček 3 akrozom C střední část 4 vnitřní akrozomální membrána D hlavní část bičíku 5 jádro E koncová část bičíku 6 proximální centriola 7 zbytek centrální centrioly 8 vnější fibrózní vlákna 9 mitochodrie 10 axonema 11 terminální disk (anulus) 12 prstencovitá vlákna 18

19 Tab. 2 Rozměry spermií (µm) Hlavička bičíku Druh zvířete kanec býk hřebec králík pes muž Délka 8,73 9,11 6,27 8,46 6,49 7,06 4,0 5,0 Šířka 4,63 5,05 3,21 4,7 3,77 4,46 2,5 3,5 Bičík spermie Druh zvířete kanec býk hřebec králík pes muž Spojovací část 10 14,8 8, , Hlavní část , ,5-40 Délka celé spermie Druh zvířete kanec býk hřebec králík pes muž 48,15 68,9 73,9 57,55 59,7 54,2 67,5 68,1 47,5-51 (Věžník et al., 2004) Chemické složení spermií Hlavička spermie je vyplněna jádrem, obsahující chromatin, který v sobě nese deoxyribonukleovou kyselinu. Akrozóm, který pokrývá hlavičku spermie, je složen z mukopolysacharidů. Pronikání spermií do vajíčka přes zonu pellucidu je za pomocí proteinázy, která je obsažena v akrozómech spermií. Bičík spermií je bohatý na proteiny, lipoproteiny a enzymy. Minerální látky tvoří asi 1 2 % hmotnosti spermie. Patří mezi ně fosforečnany, chloridy a sírany. Železo se vyskytuje jako hematin. Část železa je vázána na protein ve formě cytochromu (Gamčík, Kozumplík, et al., 1984) Semenná plazma Semenná plazma obsahuje sekrety přídatných pohlavních orgánů samčích. Jedná se o tekutinu specifického množství, barvy, rozdílného ph 6,2 5,6 a konzistence. Vytváří přirozené prostředí pro spermie a umožňuje jejich výživu, transport v pohlavních orgánech samice. Na celkovém objemu ejakulátu je rozdílný podíl semenné plazmy (Jelínek, Koudela et al., 2003). Sekret prostaty u psa se podílí na objemu ejakulátu různou měrou, u psa je to % objemu ejakulátu s mírně kyselým ph 6,5. Sekret prostaty psa má okolo 1 % bílkovin a % lipidů (Gamčík, Kozumplík et al., 1984). Dále obsahuje minerální látky a cukry, kyselinu citronovou u psa se jedná o hodnotu menší než 1,56 nmol/l 19

20 krve, četné enzymy, i biologicky aktivní složky jako prostaglandiny, estrogeny a androgeny. Semenná plazma má relativně stálý osmotický tlak a vyznačuje se velkými pufračními schopnostmi. Rovněž stimuluje pohyb spermií (Jelínek, Koudela et al., 2003) Enzymy ejakulátu Mezi enzymy ejakulátu řadíme akrozin, který umožňuje spermiím proniknout přes zonu pellucidu do vajíčka. V akrozinu byly zjištěny 3 druhy: indofenoloxidáza, která je důležitá během látkové výměny a dýchání spermií enzym dýchání. Fosfatáza je nejaktivnější z enzymů. Vytváří se převážně v prostatě. Adenozintrifosfatázy (ATP) nacházejí se jak v bičíku spermie i v semenné plazmě (Gamčík, Kozumplík et al., 1984) Frakce ejakulátu Ejakulace u psů probíhá ve třech fázích: Prespermatická frakce tato frakce neobsahuje spermie nebo jen ojediněle. Jedná se o nažloutlou tekutinu z prostaty o celkovém množství 0,2 0,3 ml. Vylučuje se v průběhu kopulačních pohybů po dobu 5 20 sekund. Spermatická frakce tato frakce obsahuje spermie. Má bílou až mléčnou barvu o objemu 0,5 12,0 ml. K uvolňování dochází po skončení kopulačních pohybů a zklidnění psa při maximálně zduřeném pyji. Vylučování trvá 0,5 4 minuty. Postspermatická frakce většinou už neobsahuje spermie. Zkalená tekutina pochází z prostaty a její množství je 2 30 ml. Vylučuje se v průběhu svázání. Doba vylučování je od 5 do 15 minut (Svoboda, Senior, et al., 2001). 20

21 3.2.7 Metody získávání ejakulátu Existuje velké množství způsobů získání ejakulátu. V tabulce jsou uvedeny nejvhodnější metody odběru u jednotlivých druhů zvířat. Tab. 3 Metody získávání ejakulátu Druh Býk Beran, kozel Kanec Hřebec Pes Kožešinová zvířata Králík Kohout Kačer Metoda získávání Umělá vagína, elektroejakulace, masáž měchýřkovitých žláz (ojediněle) Umělá vagína, elektroejakulace Uměla vagína, manuální metoda, elektroejakulace Umělá vagína Masturbace penisu, umělá vagína, elektroejakulace Masturbace penisu, elektroejakulace Umělá vagína Kondom fixovaný na kloaku, masáž mělké části břicha, elektroejakulace Elektroejakulace, masáž mělké části břicha (Gamčík, Kozumplík et al., 1976) Obr. 2 Odběr ejakulátu foto Marie Vágenknechtová 21

22 3.3 Hodnocení psího ejakulátu Hodnocení psího ejakulátu zahrnuje makroskopické hodnocení, mikroskopické hodnocení, speciální vyšetření testy přežitelnosti spermií Makroskopické hodnocení ejakulátu Makroskopické hodnocení ejakulátu se provádí ihned po odběru. Hodnotí se hmotnost nebo objem, hustota, barva, pach a obsah cizích přimísenin (Louda et al., 2001) Objem ejakulátu Objem je variabilní a značně kolísá (Louda et al., 2001). Závisí na plemenné příslušnosti, na věku a hmotnosti jedince, intenzitě pohlavního dráždění. Dále pak závisí na výživě, zdravotním stavu, ročním období a způsobu odběru. Objem se zjišťuje měřením v kalibrovaném válci nebo vážením na laboratorní automatické váze (v gramech) (Louda et al., 2001). Toto stanovení je nejzákladnější pro vyšetření ejakulátu. U býka, berana a muže se ejakulát získává v plném rozsahu a objem se stanoví z celkového množství. Rozlišujeme tři základní frakce: prespermatická, která vyčišťuje močovou rouru a připravuje prostředí pochvy u samice pro přijetí ejakulátu, druhou frakcí je spermatická, kde se nachází 90% spermií a poslední frakcí je postspermatická, jejíž konzistence je hustší až gelovitá. Frakce bohaté na spermie získáváme u kance a hřebce. Objem ejakulátu stanovujeme jen z frakcí určených k jejich využití. Podobným způsobem stanovujeme i objem ejakulátu u psa. Nádoby na měření objemu mají být dvouplášťové nebo kryté izolačním obalem. Veškeré nádoby a pomůcky, se kterými přijde ejakulát do styku, musí mít určitou teplotu. U býka, hřebce a psa se doporučuje teplota C. Laboratorní prostředí by mělo mít teplotu C. Minimální objem ejakulátu by měl mít hodnoty u býka 4 ml, hřebce 20 ml, kance 100 ml, u psa se objem výrazně liší dle plemenné příslušnosti, ale minimální objem by měl být 2 ml. Průměrné hodnoty u ejakulátu jsou u býka 6 ml, hřebce 60 ml, kance 230 ml, u psa 6 ml (Věžník et al., 2004). Největší objem spermatu byl zjištěn u psů chovaných v domácím prostředí 11,0 ml, nejmenší objem byl zjištěn u psů s možností volného pohybu 4,2 ml. Psi, kteří jsou používáni ve sportu, rodinní psi a policejní psi měli objem spermatu 12,7 ml, 6,3 ml, 5,7 ml (Vágenknechtová et al., 2011). U loveckých plemen psů se objem pohybuje v rozmezí 6,4 až 7 ml (Doleželík, 2011). 22

23 V závislosti na věku psa byly zjištěny následující objemy: objem ejakulátu od skupiny psů ve věku od 1,5 až 2 let věku stáří byl 6,00 ± 1,48 ml, ke zvýšení objemu u této kategorie došlo u dalšího odběru na 12,50 ± 5,39 ml, u posledního odběru byl však objem 6,93 ± 2,68 ml. Největší objem byl zjištěn ve věkové kategorii od 2 3 let věku stáří 11,05 ± 4,31 ml, s druhým a třetím odběrem došlo k poklesu objemu na 8,44 ± 4,62 ml a 7,82 ± 2,35 ml. Ve skupině psů ve věku od 3 do 5 let stáří byl zjištěný objem 8,00 ± 2,35 ml, s následujícími odběry došlo k poklesu objemu na 5,00 ± 2,08 ml a 2,00 ± 0,38 ml. Největší rozdíly v objemu ejakulátu byly mezi první a třetí věkovou skupinou (Filipčík et al., 2011) Konzistence, zrnitost Posuzuje se u každého ejakulátu ve sběrači v dopadajícím nebo procházejícím světle. Husté sperma dobré jakosti je neprůhledná vazká tekutina, zpravidla smetanového mírně zrnitého vzhledu, zrnité shluky spermatu se pomalu pohybují. Řídké sperma špatné jakosti je vodnaté, průsvitné bez zrnitosti (Louda et al., 2001) Barva Barva se posuzuje proti světlu. Dobré sperma je barvy bělavé, v některých případech šedobílé nebo mírně nažloutlé. Špatné sperma nehodící se k inseminaci bývá zbarveno žlutozeleně nebo zeleně přimísením hnisu, moče nebo nežádoucími mikroorganismy. Špatné je i sperma s přimísením krve. Žlutavé zabarvení může být způsobeno flavinovými barvivy obsaženými v krmivu ( Louda et al., 2001) Pach Pach se posuzuje čichem ve sběrači. Dobré sperma má slabý specifický pach, připomínající pach kravského mléka. Nazelenalé sperma páchne močí. Hnilobný zápach svědčí o přimísení hnisu ( Louda et al., 2001) Cizí přimíseniny Nejčastěji to bývají chlupy, vazelína, nečistoty z předkožky. Při odběru venku to může být prach nebo písek. Hnis se zjišťuje při zánětech semenných váčků, pyje nebo varlat a předkožky. Dobré sperma má být bez přimísenin (Louda et al., 2001). 23

24 3.3.2 Mikroskopické hodnocení ejakulátu Hodnocení aktivity (motility spermií) Jedná se o progresivní pohyb vpřed za hlavičkou a je jedním z nejdůležitějších ukazatelů oplozovací fertilizační schopnosti čerstvého ejakulátu. Hodnotí se charakter pohybu, určuje se směr a rozsah kmitů hlavičky spermie. Přímý progresivní pohyb spermií je znakem jejich funkční plodnosti a vyjadřuje se v procentech. Minimální aktivita 70 % je vyžadována u ejakulátu používaných pro přímou inseminaci nebo určených pro konzervaci ( Louda et al., 2001). Vedle pohybu progresivního vpřed za hlavičkou je možno sledovat i ostatní druhy pohybu, které se hodnotí jako závadné kolébavý, kruhový, na místě, zpětný. Nežádoucí je shlukování spermií aglutinace (Louda et al., 2001). S prodlužující se dobou po odběru se mění progresivní pohyb a dochází k tzv. vitální degeneraci spermií, kdy se rychlost pohybu zpomaluje a pohyb se mění na kruhový, přerušovaný až do ustání pohybu. Při hodnocení motility se aplikuje kapka spermatu na čisté předehřáté podložní sklíčko. Hodnotí se minimálně 3 zorná pole a odhadem se stanoví % zastoupení spermií, které se pohybují progresivním pohybem vpřed za hlavičkou (Louda et al., 2001). Pro posouzení pohyblivosti spermií u psího ejakulátu se také využívají počítačové automatizované programy pro vyšetření spermatu CASA computer-based automated semen analysis. Použitím těchto programů můžeme zhodnotit více parametrů motility (Agarwal et al., 2003). Pohyblivost spermií v ejakulátu by se měla posoudit co nejdříve po jeho získání. U psího ejakulátu se lépe uchovává pohyblivost, pokud máme vzorky při pokojové teplotě než při tělesné teplotě. Nemělo by docházet k rychlému kolísání teplot. Pokojová teplota může hrát velkou roli: zpráva o hodnocení psího ejakulátu z tropických oblastí udává, že nedostatek pohyblivosti u některých vzorků byl způsoben nedostatečnou klimatizací v místnosti, kde byly vzorky skladovány (Kustnitz, 2007). Nižší motilitu může ejakulát vykazovat v případě první ejakulace po delším sexuálním klidu psa v důsledku skladování mrtvých spermií v nadvarleti. V takovém případě je doporučován opakovaný odběr. Pokud nacházíme ve vzorku vysoké procento mrtvých nebo poškozených spermií a je snížena tak motilita, je nutno provést opakované odběry a vyloučit tak negativní vliv nesprávnou technikou odběru a použití spermiotoxických látek. O onemocnění varlat nebo nadvarlat hovoříme v případě přetrvávajících problémů s motilitou (Svoboda, Senior et al., 2001). Průměrná aktivita u ejakulátu psa je 68,8 %. Aktivita spermií u psů chovaných v domácím prostředí se pohybovala okolo 77,8 %. U psů se sportovní zátěží byla aktivita spermií 76,7 %. Mezi psy využívanými pro potřeby policie byla aktivita spermií jen 24

25 49,4 % (Vágenknechtová et al., 2011). Aktivita spermií u loveckých plemen psů se pohybovala okolo 74,4 % (Doleželík, 2011). U mladých psů byla aktivita spermií zhruba o 10 % větší než u starších psů. Vyšší aktivita spermií byla zaznamenána u psů malých a středních plemen než u psů velkých plemen (Vágenknechtová et al., 2011). Aktivita spermií v ejakulátu dle věku psa byla následující: největší aktivita spermií byla zjištěna u psů ve věku od 3 5 let stáří. Ve věkové kategorii od 1,5 2 let stáří věku byla největší aktivita spermií zjištěna během prvního odběru 79 ± 6% ze tří následujících odběrů, během druhého odběru se aktivita spermií snížila na 67 ± 14%, ve třetím odběru se aktivita zvýšila na 73 ± 5%. Nejhorší aktivita spermií byla zjištěna u psů ve věku od 2 3 let stáří. V této věkové kategorii byla aktivita spermií v prvním odběru 68% s relativně vysokou variabilitou 23%, v následujících odběrech se aktivita spermií v ejakulátu snižovala na 67 ± 17% a 59 ± 10%. Aktivita spermií velmi úzce souvisí s koncentrací spermií v ejakulátu (Filipčík et al., 2011) Stanovení hustoty koncentrace ejakulátu Hustota koncentrace spermií v ejakulátu je dána funkční aktivitou semeplodného epitelu varlat, věkem, zdravotním stavem psa, připraveností a technikou odběru daného psa (Louda et al., 2001). Množství spermií v normálním ejakulátu se může pohybovat v rozmezí a závisí na velikosti varlat a plemenu psa. Počet může být nižší v důsledku nedostatečné sexuální stimulace způsobené nepřítomností feny nebo stresem a bolestí (Martínez, 2005). Hustotu spermií v ejakulátu vyjadřujeme počtem spermií v 1 mm 3 ejakulátu nebo v 1 ml. Koncentrace spermií v ejakulátu psa je velmi různorodá, záleží, kterou frakci získáme spermatická nebo postspermatická. Menší plemena psů budou mít menší koncentraci spermií v ejakulátu než psi větších plemen. Hustotu spermií je možné hodnotit fotometricky, haemocytometricky pomocí Bürkerovy komůrky, spermiodenzimetrem podle Karrase a někdy i odhadem (Louda et al., 1980). Nejnižší koncentrace byla zjištěna u psů chovaných v domácím prostředí mm -3. U psů chovaných v kotcích byla koncentrace mm -3. Nejvyšší koncentrace spermií byla u psů s možností volného pohybu, kde byla zjištěná koncentrace mm -3. Psi využívaní pro potřeby policie, psi ve sportovní zátěži a rodinní psi měli koncentraci spermií mm -3 ; 126, mm -3 ; 135, mm -3 (Vágenknechtová et al., 2011). U skupiny velkých plemen psů byla zjištěna větší koncentrace spermií, hodnota byla mm -3, střední plemena psů dosahovala hodnot mm -3, malá plemena psů měla hodnotu pouze mm -3 (Vágenknechtová et al., 25

26 2011). U loveckých plemen psů se koncentrace spermií pohybovala v rozmezí 147, mm -3 až 186, mm -3 (Doleželík, 2011). Koncentrace spermií v ejakulátu psa dle rozdílných věkových kategorií byla následující: největší koncentrace spermií byla zjištěna při posledním odběru v nejstarší věkové kategorii od 3 5 let věku stáří 218,00 ± 40, mm -3. Při prvním odběru bylo nejvíce spermií zjištěno u psů ve věku od 1,5 2 let stáří 195,91 ± 38, mm -3. V dalších věkových kategoriích koncentrace spermií během odběrů byla prakticky vyrovnaná 111,36 ± 44, mm -3 a 100,00 ± 39, mm -3. Výrazné zvýšení koncentrace spermií bylo zjištěno ve věkové kategorii od 2 3 let věku stáří během druhého odběru 195,93 ± 61, mm -3. Naproti tomu během posledního odběru ze tří, kdy se koncentrace spermií v ejakulátu zvýšila na 110,00 ± 18, mm -3 u věkové kategorie 1,5 2 let věku a 218,00 ± 40, mm -3 ve věkové kategorii 3 5 let věku psa, došlo u kategorie 2 3 let věku ke snížení koncentrace spermií na 153,57 ± 51, mm -3 (Filipčík et al., 2011) Stanovení hustoty spermatu fotometricky Spermie počítáme po příslušném naředění a znehybnění pod mikroskopem. Dnes se většinou hustota spermatu stanovuje fotometricky (Říha et al., 2003). Přístroj zajišťuje objektivní přesnost, rychlost měření a malou spotřebu spermatu. Přesnost závisí na dobré funkci přístroje a na přesně vypracované kalibrační křivce. V současné době se používá fotometr digitální. Na základě změření stupně zakalení standardního roztoku, ve kterém je rozptýleno odměřené množství spermatu, zjistíme jeho hustotu. Výchozí stupeň ředění stanovíme podle typu přístroje. Údaje na stupnici přepočítáváme podle tabulky sestavené pro každý fotometr na množství spermií v 1 mm 3 naředěného spermatu. Jednou za měsíc kontrolujeme měření fotometru porovnáním výsledků s hodnotami zjištěnými počítáním v Bürkerově komůrce. Rozdíl nesmí být větší než 15 %. Postačuje ověřit hustotu 3 ejakulátů o rozdílné hustotě (Louda et al., 1980) Stanovení hustoty spermatu haematocytometricky Hustotu spermatu stanovíme také počítáním spermií v počítací komůrce - Bürkerově (Říha et al., 2003). Pomůcky: - Počítací komůrka Bürker s krycím sklíčkem - Melanžér na červené krvinky 26

27 - Balónek se zpětným ventilem - Dvě hodinová sklíčka - 3% roztok NaCl zbarvený methylenovou modří, eozinem nebo neutrální červení - 96% líh - Etyléter - Destilovaná voda (Louda et al., 2001). Při tomto stanovení používáme mísící pipetu tzv. melanžér. Semeno používáme nativní nebo ředěné, kdy poměr ředění musíme mít součástí výpočtového vzorce. Suspenzi musíme v pipetě dobře homogenizovat před vlastním odebráním a počítáním v komůrce. Ejakuláty s větší koncentrací ředíme v různých poměrech. U ejakulátu s větší koncentrací je ředění 1: 200 a ejakulát s menší koncentrací má ředění 1 : 100. Toto ředění používáme u ejakulátů kanců, hřebců, králíků a psů (Věžník et al., 2004). Obsah melanžéru homogenizujeme po dobu 3 minut (Louda et al., 2001). Prvních pět až deset kapek odkapeme na buničitou vatu (Věžník et al., 2004). Další kapku aplikujeme na počítací plochu komůrky s přisátým sklíčkem. Krycí sklíčko komůrky uchytíme svorkami a roztíracími pohyby palců provedeme mírné přetírání krycího skla až jsou patrné duhové skvrny (Louda et al., 2001). Vzorec pro výpočet: X = PS x Č x Z x V/PČ X. počet spermií v 1 mm 3 neředěného ejakulátu PS počet napočítaných spermií Č. plocha čtverce, ve kterém jsme počítali Z stupeň ředění V výška komůrky PČ.. počet čtverců, ve kterých jsme počítali (Věžník et al., 2004). Počítají se spermie ležící uvnitř čtverce o velikosti 1/16 mm 3 a všechny spermie, jejichž hlavičky se dotýkají nebo leží na levé a horní straně čtverce. Počítají se spermie v deseti čtverečcích (Louda et al., 2001). 27

28 Koncentrace spermií v 1mm 3 u vybraných druhů: - Býk Hřebec Kanec Králík Pes (Věžník et al., 2004) Stanovení hustoty spermatu spermiodenzimetrem podle Karrase Spermie počítáme po příslušném naředění také v Karrasově spermiodenzimetru (Říha et al., 2003). Pomůcky: - Karrasův klín - Tabulka k určení hustoty ejakulátu - 1 % roztok NaCl - Pipeta dělená po 0,1 cm 3 Pracovní postup: do Karrasova klínu odpipetujeme 0,1 cm 3 spermatu a doplníme objem 10 cm 3 1% roztoku NaCl. Po promíchání obsahu odečteme na stupnici spermiodenzimetru hodnotu, která je ještě dobře viditelná. Dle tabulky stanovíme koncentraci spermií v 1 cm 3. Chyba se pohybuje ± 5% od skutečného počtu spermií. Touto metodou lze získat stejné výsledky jako při počítání v Bürkerově komůrce, musíme však dodržovat přesně návod k použití a zpočátku porovnávat výsledky získané spermiodenzimetrem s výsledky získanými v Bürkerově komůrce alespoň u 50 vzorků (Louda et al., 2001) Stanovení hustoty spermatu odhadem Odhadem se ověřuje hustota spermatu na inseminačních stanicích pouze ve výjimečných případech. Tento způsob hodnocení je vhodný v polních podmínkách. Pomůcky: - Podložní sklíčko s důlkem - Krycí sklíčko. 28

29 Pracovní postup: na sklíčko s důlkem dáme kapku spermatu, přikryjeme krycím sklíčkem a vyšetřujeme pod mikroskopem při zvětšení násobném. Na základě prostorového uspořádání spermií a jejich vzájemné vzdálenosti subjektivně zhodnotíme hustotu spermatu (Louda et al., 2001). Tab. 4 Odhad hustoty spermatu podle prostorového uspořádání spermií v zorném poli mikroskopického obrazu Označení hustoty spermatu Počet spermií Charakteristika mikro- (mil./mm 3 ) skopického obrazu VH velmi husté Nad 1,5 V zorném poli jsou spermie natěsnané a pohybují se těsně vedle tak, že mezi nimi nejsou žádné mezery. H husté (D- densum) SH středně husté (SD semidensium) Ř řídké (R rarum) O ojedinělé spermie (O oligospermie) A ejakulát bez spermií (A aspermie) 1,0 1,5 V zorném poli se spermie pohybují hustě vedle sebe. Mezi jednotlivými spermiemi jsou pouze malé světlé proužky. Vzdálenost mezi spermiemi není větší než šířka hlavičky spermie. 0,7 1 Mezi jednotlivými spermiemi jsou patrné mezery. Vzdálenost mezi spermiemi dosahuje až do poloviny délky spermie. 0,2 0,7 Mezi spermiemi v zorném poli jsou mezery velikosti poloviny až celé délky spermie. Jednotlivé spermie lze zřetelně rozlišit. Do 0,2 V zorném poli jsou vidět pouze ojedinělé spermie. V zorném poli jsou pouze výměšky přídatných pohlavních žláz, neobsahují ani živé ani mrtvé spermie. (Louda et al., 2001) 29

30 Tab. 5 Vztah mezi koncentrací, barvou a konzistencí semene u různých plemeníků od- Hustota hadem Plemeník Konzistence ejakulátu Barva ejakulátu Koncentrace spermií (mil/mm 3 ) Býk Vodnatá Šedobílá průhledná ,2 Slabě mléčná Žlutobílá 2 0,2-0,5 průhledná Mléčná Barva slonoviny 3 0,5-1,0 Kozel Vodnatá Šedobílá ,6 Mléčná Nažloutlá 2 0,6-2,0 Beran Smetanově mléčná Bílá až sědě 3 2,0-3,5 bílá Smetanová Nažloutlá 4 Nad 3,5 až žlutá Hřebec Skoro vodnatá Šedivá ,03 Hlenovitá,syrovátková šedobílá 2-3 0,03-0,5 Málo hlenovitá mléčná bílá 4 Nad 0,5 (Louda et al., 2001) Biologické zkoušky ejakulátu V biologických testech sledujeme odolnost spermií vzhledem k různým vnějším vlivům. Provádíme dlouhodobý chladový test, krátkodobý tepelný test, zjišťujeme odolnost spermií vůči chladovému šoku a odolnost spermií vůči 1% roztoku NaCl (Louda et al., 2001) Testy přežitelnosti spermatu Testy přežitelnosti spermatu jsou důležité pro posouzení biologické hodnoty a oplozovací schopnosti spermií. Mezi výsledky těchto testů a skutečnou plodností byla zjištěna vysoká korelace (Louda et al., 2001) Krátkodobý tepelný test přežitelnosti Pomůcky: - Vodní lázeň - Vyhřátý termostat 30

31 - Podložní a krycí sklíčka - Mikroskop - Vyšetřované sperma. Pracovní postup: do zkumavky odměříme 0,5 1 cm 3 ředěného nebo neředěného. Zkumavku se spermatem dáme do vodní lázně a postupně zahříváme na 38 0 C. Začátek testu zaznamenáme po dosažení požadované teploty. V hodinových intervalech pak odebíráme ze zkumavky vzorky a provádíme posouzení aktivity spermií. Aktivitu zaznamenáváme do zlomku, do jehož čitatele uvedeme čas, který uplynul od začátku testu a do jmenovatele aktivitu v %. Doba trvání testu nebývá delší než 6 hodin, jelikož spermie v teplém prostředí rychle ztrácejí aktivitu. Ejakuláty s větší absolutní délkou životnosti jsou biologicky jakostnější a mají vyšší oplozovací schopnost (Louda et al., 2001) Dlouhodobý chladový test přežitelnosti Přežitelnost spermií hodnotíme v ředěném spermatu (Říha et al., 2003). Pomůcky: - Podložní a krycí sklíčka - Chladnička - Mikroskop - Vyšetřované sperma. Pracovní postup: do malé zkumavky odměříme 3 cm 3 naředěného spermatu, posoudíme aktivitu spermií, následně vzorek vložíme do chladničky, kde je teplota C a zapíšeme čas. Každý den ve stejnou dobu sledujeme aktivitu spermií pod mikroskopem s vyhřívací destičkou a výsledky zaznamenáváme. Dobré ejakuláty si zachovávají po dobu 96 hodin od odběru aktivitu alespoň 50% (Louda et al., 2001) Zkouška rezistence spermatu Zkouška rezistence spermatu je ukazatelem odolnosti spermií vůči působení 1% roztoku NaCl. Vyjadřujeme stupněm zředění zkoušeného spermatu tímto roztokem, který v určitém časovém sledu přidáváme ke spermatu, a to až do okamžiku, kdy ustane přímočarý pohyb spermií vpřed za hlavičkou (Louda et al., 2001). 31

32 Metoda vzestupného ředění Sperma pro krátkodobou i střednědobou konzervaci ředíme za účelem získání většího objemu, abychom mohli rozdělit ejakulát na větší množství inseminačních dávek (Říha et al., 2003). Pomůcky: - Zkumavky - 1 % roztok NaCl - Byreta s výpustným kohoutkem upevněná na stojánku a kalibrovaná po 0,01 nebo 0,02 cm 3 - Podložní sklíčka. Pracovní postup: do zkumavky č. 1 odměříme pipetou 4 cm 3 1 % roztoku NaCl a do zkumavky č. 2 odměříme 0,96 cm 3 1 % roztoku NaCl. Odměříme 0,02 cm 3 spermatu a přidáme do zkumavky č. 1, promísíme, a tím dosáhneme zředění 1 : 200. Ze zkumavky č. 1 odpipetujeme 0,04 cm 3 roztoku a přidáme do zkumavky č. 2, tím docílíme zředění 1 : Obsah promícháme a po 5 minutách posoudíme pod mikroskopem pohyb spermií. Zjistíme li přímočarý pohyb, přidáme 1 cm 1 % roztoku NaCl, vždy po minutách posuzujeme pohyb, a to tak dlouho dokud neustane přímočarý pohyb spermií vpřed za hlavičkou. Výsledek zkoušky ukazuje stupeň ředění v okamžiku, kdy se zastavil přímočarý pohyb spermií (Louda et al., 2001). Tab. 6 Stanovení rezistence spermatu (metoda vzestupného ředění) Pořadové Označení Objem použitého Objem po- Celkový Rezistence číslo ředění zkumavek spermatu užitého 1 % objem (stupeň ředěného a roztoku vzorku ředění) neředěného NaCl (cm 3 ) (cm 3 ) 1 I 0,02 4,0 4, II 0,04 0,96 1, II 1,0 1,0 2, II 2,0 1,0 3, II 3,0 1,0 4, II 4,0 1,0 5, II 5,0 1,0 6, II 6,0 1,0 7, II 7,0 1,0 8, II 8,0 1,0 9, II 9,0 1,0 10, (Louda et al., 2001) 32

33 Zkouška živých spermií na odolnost vůči chladovému šoku Touto zkouškou posuzujeme reakce spermií na rychlé zchlazení. Pomůcky: - Vodní lázeň - Pipety - Podložní a krycí sklíčka - Mikroskop. Pracovní postup: nasajeme 0,1 cm 3 spermatu do kapiláry, uzavřeme spodní konec plastelínou nebo gumovou čepičkou a ponoříme kapiláru na 10 minut do vodní lázně o teplotě 0 0 C. Následně ze spermatu zhotovíme roztěr, u něhož provedeme barvení na živé spermie. Procento nezbarvených živých spermií je výrazem odolnosti vůči chladovému šoku (Louda et al., 2001) Stanovení procenta živých a mrtvých spermií barvením Obraz o kvalitě získáváme pomocí této biologické zkoušky, která je založena na rozdílné afinitě živých a mrtvých spermií k barvivům. Mrtvé nebo oslabené spermie přijímají barvivo. Živé spermie nepropouštějí semipermeabilní membránou barvivo a zůstávají bílé. Málo životaschopné spermie se značně sníženým metabolismem se barví bledě růžově až červeně (Louda et al., 2001). Způsoby barvení: Eosínem- použité barvivo je eosín Barvení podle Bloma I. použitá barviva jsou 1 kapka eosínu a 4 kapky roztoku nigrosínu Barvení podle Lasleye barviva jsou nigrosín nebo opálová modř Barvení podle Bloma II. barviva 5 % roztoku eosinu v citrátu sodném a 10 % vodní roztok nigrosínu (Louda et al., 2001) Stanovení koncentrace vodíkových iontů ph spermatu Kyselost spermatu je výrazem činnosti a zdravotního stavu přídatných pohlavních žláz. Mělo by být stanoveno do 15 minut po odběru (Louda et al., 2001). Nepříznivé hodnoty ph negativně působí na fertilitu spermatu (Gamčík, Kozumplík et al., 1992). Pracovní postup: do pinzety uchopíme nitrazínový papírek, který si mírně navlhčíme sterilní tyčinkou se vzorkem spermatu. Sperma necháme působit asi 1 minutu. Po zaschnutí vznikne na indikátorovém papírku barevný odstín, který porovnáváme 33

34 s barevnou srovnávací stupnicí. U každého barevného odstínu je vyznačeno číslo určující ph. Vyhledáme barevný odstín srovnávací stupnice souhlasící se zbarvením indikátorového papírku, příslušné číslo udává hodnotu ph. Přesnější způsob stanovení ph je pomocí ph metru kolorimetricky (Louda et al., 2001). Tab. 7 Průměrné hodnoty ph normálního spermatu Býk 6,4 6,8 Beran, kozel 6,2 7,6 Hřebec 7,2 7,6 Kanec 7,3 7,9 Pes 6,7 7,1 (Louda et al., 2001) Biochemické zkoušky spermatu Na základě stupně anaerobního a aerobního metabolismu spermií se usuzuje na oplozovací schopnost a jejich životnost. Podstatou zkoušky je rychlost anaerobního rozkladu fruktózy obsažené v semenné plazmě (Louda et al., 2001) Dehydrogenační zkouška Při dehydrogenační zkoušce sledujeme rychlost fruktolýzy ve vztahu k počtu pohyblivých spermií. Úlohu akceptoru vodíku uvolněného při anaerobním štěpení cukru má v této zkoušce methylenová modř, touto redukcí se mění v bezbarvou leukoformu. Bylo prokázáno, že dehydrogenační aktivita neboli produkce enzymu dehydrogenázy, je vázána jedině na živé spermie a že lze tedy z rychlosti odbarvení methylenové modři usuzovat na počet živých spermií ve spermatu, jejich aktivitu, a tím i oplozovací schopnost. Cennou pomůckou jsou dehydrogenační zkoušky při objektivním hodnocení jakosti spermatu. Byla prokázána vysoká pozitivní korelace mezi dobou odbarvení methylenové modři a hustotou spermatu, pohyblivostí spermií, jakož i dobrou přežitelností spermií při dlouhodobém chladovém testu a krátkodobém tepelném testu (Louda et al., 2001). 34