Gelová permeační chromatografie

Transkript

1 Gelová permeační chromatografie

2 separace molekul na základě molekulové hmotnosti, velikosti a tvaru molekuly stacionární fáze gel (obvykle prokřížený cukr) velké molekuly se eluují dříve, malé molekuly se eluují později možnost stanovení molekulových hmotností odstraňování nízkomolekulárních sloučenin (odsolování)

3

4 Typický eluční diagram V 0 V t

5 V t V 0 V t V 0 mobilní fáze stacionární fáze 0 0 V V V V K t e av = gelu t e s e d V V V V V V V V K = = V e V R 0 =

6 Vliv tvaru molekuly

7 Kalibrace eluční čas (eluční objem) standardů je vynesen v závislosti na molekulové hmotnosti kolona by měla být pravidelně kalibrována stálý průtok kolona separuje podle velikosti ne molekulové hmotnosti, proto je získaná molekulová hmotnost jen relativní

8 Kalibrační křivka

9 Vztah mezi velikostí částic a rozlišením A 280nm VELIKOST ČÁSTIC [µm] Coarse Medium Fine Superfine V e /V t

10 Vztah mezi velikostí částic a průtokem

11 Vztah mezi rozlišením a objemem vzorku Rozlišení R = Ve w 1 + w 2 2 V e w1 w2 ideální objem nanášeného vzorku ~ 1-2 % objem nanášeného vzorku [% V t ]

12 Vztah mezi rozlišením, průtokem a délkou kolony výška kolony [cm] průtok [ml/min] koncentrace zvyšování průtoku snižování délky čas

13 Tvar kolony krátká a silná kolona dlouhá a tenká kolona silná kolona nemá dostačující rozlišení ale má lepší průtok a kapacitu

14 Stacionární fáze Pharmacia Sephadex Sepharose Sephacryl Sephacel glukosa (dextrosa) agarosa glukosa + akryamid cellulosa Bio-Rad FPLC Superose Superdex BioGel P BioGel A akrylamid agarosa

15 Sephadex pór glukosová jednotka

16 Vlastnosti Sephadexu

17 malé proteiny

18 Sephacryl HR cross- link N, N -methylen bis-aktŕylamid

19 Ve [ml]

20 Sepharose

21 Sepharose CL Sepharose + 2, 3 dibromopropanol NaOH SepharoseCL lepší teplotní a chemická stabilita extrémě malé množství ionizovatelných skupin rozsah ~ Sephadex velké proteiny Sephacryl

22 prokřížená poresní agarosa Superose

23 Bio-Gel P Bio-Gel P gely poresní polyakrylamidové částice vzniklé kopolymerací akrylamidu a N,N'-methylene-bis-akrylamidu. extremě hydrofilní nenabité

24 Bio-Gel A gely agarosa minimalní nespecifické interakce výborné průtokové vlastnosti Bio-Gel A

25 Použití gelové permeační chromatografie vysoké rozlišení separace molekul na základě velikosti (tvaru) vhodná jako závěrečný krok purifikace odsolení skupinová separace výměna pufru separace polymerů od monomerů separace denaturovaných forem proteinů od nativních odstranění vysokomolekulárních a nízkomolekulárních látek

26 vysoké rozlišení Experiment skupinová separace stacionární fáze kolona výběr podle frakcionačního rozsahu lepší strmá selektivita pro úzké píky malé částice dlouhá a tenká kolona cm Sephadex G-25 mobilní fáze kompatibilní, střední iontová síla kompatibilní nezáleží na délce kolony průtok nižší průtok i střední průtok objem vzorku 0,5-5% objemu kolony až ¼ objemu kolony

27 Před purifikací: zkontrolujte viskozitu vzorku zfiltrujte nebo odstřeďte vzorek Pro zvýšení rozlišení: 1. optimální frakcionační rozsah 2. co nejmenší objem vzorku 3. co nejmenší částice gelu (x průtok) 4. dvě kolony do série 5. snížit průtok Nespecifická adsorbce vzácně na agarosu a dextran pokud K av > 1 iontové nebo hydrofobní interakce pufr > 0.05M NaCl Hydrofobní interakce - 25% acetonitrile, EtOH nebo isopropopanol, 10% etyleneglycol

28 Ionexová chromatografie

29 Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje V případě proteinů hraje zásadní roli ph!

30 Princip ionexové chromatografie

31

32 Ionexy Katexy záporný náboj vazba kationtů Anexy kladný náboj vazba aniontů

33 silný anex Q Sepharosa 0,1 M NaOH

34 Nosiče polystyren Amberlit, Dowex celulosa X-Sephacel dextran X-Sephadex prokřížená agarosa X-Sepharosa syntetické polymery MonoBeads, MiniBeads (Q, S)

35 X-Sepharosa Sepharose High Performance (34 µm), Sepharose Fast Flow (90 µm), Sepharose Big Beads ( µm), Sepharose CL-6B (90 µm, lepší chemická a fyzikální stabilita) Vzorek: 0,8 mg cytochrom C (pi 10,3) 0,8 mg lysozym (pi>11) 3 mg ribonukleasa A (pi 9,3) Startovací pufr: 20mM fosfátový pufr ph 6,8 Eluční pufr: 20mM fosfátový pufr ph 6,8+0,5 M NaCl Průtok: 1 ml/min Kolona: 1ml Průběh separace: ekvilibrace 20 ml startovacího pufru aplikace vzorku 2 ml promytí - 5 ml startovacího pufru eluce 40 ml, lineární gradient, % elučního pufru

36 Vzorek: 0,8 mg α-laktoglobulin (pi 5,8) 0,4 mg conalbumin (pi 6,3) 1,2 mg trypsin inhibitor (pi 4,5) Startovací pufr: 20mM Tris/HCl ph 7,4 Eluční pufr: 20mM Tris/HCl ph 7,4 + 0,5 M NaCl Průtok: 1 ml/min (150cm/h) Kolona: 1ml Průběh separace: ekvilibrace 20 ml startovacího pufru aplikace vzorku 2 ml promytí - 5 ml startovacího pufru eluce 40 ml, lineární gradient, 0-80 % elučního pufru

37 Údaje od výrobce

38 MonoBeads, MiniBeads (Q, S) vysoké rozlišení MiniBeads mikropurifikace, analysa vyšší pracovní tlak FPLC/HPLC MonoBeads -FPLC

39 Vzorek: pankreatin Eluce: gradient iontové síly Rozlišení

40 Výběr vhodného ph pro ionexovou chromatografii

41 ph gradient Eluční gradient

42 gradient iontové síly lineární x skokový

43 Vliv strmosti gradientu

44 Vliv elučního objemu

45 Koncentrační efekt

46

47 Alfa-amylasová aktivita byla měřena s využitím rozpustného škrobu jako substrátu a produkty reakce byly detekovány reakcí s dinitrosalicylovou kyselinou. Reakční směs obsahovala 0,2 ml enzymu, 0,3 ml 1% škrobu a 0,5 ml 50 mm Tris pufru ph 8,2. Reakce probíhala 1 minutu při 37 C a byla ukon čena přídavkem 4ml dinitrosalicylové kyseliny. Směs byla povařena 5 minut. Absorbance výsledných produktů při 530 nm byla 1,235 v 1cm kyvetě. Vypočítejte aktivitu amylasy. A 530nm 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 Kalibrace y = 0,1107x R² = 0,9672 postup: Byla připravena koncentrační řada glukosy (2, 4, 6, 8, 10mM glukosa) a 1 ml byl smíchán se 4 ml dinitrosalicylové kyseliny. Směs byla povařena 5 minut. Absorbance výsledných produktů byla měřena při 530 nm. 0, koncentrace glukosy / mmol/l

48 Vypočítejte aktivitu malátdehydrogenasy. Reakční směs obsahovala 0,5 ml NAD+ (100mM), 0,5 ml malátu (200 mm), 1 ml enzymového preparátu (konc. bílkovin 1,5 mg/ml) a 2 ml pufru (100 mm Tris, ph 7,5). Reakce probíhala při teplotě 37 C a byl sledován přírůstek absorbance při 340 nm. Po 5 minutách vzrostla absorbance z 0,2 na 1,45. Vypočítejte celkovou a specifickou aktivitu malátdehydrogenasy v enzymovém preparátu. (ε=6220 l/mol/ cm). Měření absorbance probíhalo v jednocentimetrové kyvetě a všechny substráty byly v reakční směsi v nadbytku.

49 Chromatofokusace separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost

50 Polypufry - amfolyty Stacionární fáze Polybuffer 96 - ph 9-6 Polybuffer 74 - ph 7-4 PBE94 Pharmalyte - ph 8-10,5 PBE118

51

52 Princip fokusace

53 MonoP Beads směs kvartérních a terciálních aminů

54 Dvoudimensionální chromatografie Beckman Coulter PF 2D

55 Dvoudimensionální chromatografie ph hydrofobicita frakce

56