M. : MIKROSKOPIE III MIKROSKOPIE III

Transkript

1 MIKROSKOPIE III Martina Viková LCAM DTM FT TU Liberec,

2 Příprava preparátů pro mikroskopii I 1. NATIVNÍ PREPARÁTY (bez zvláštní přípravy) podélné pohledy vláken, vzorky pigmentů, barviv živé objekty ve vodě nebo fyziologickém roztoku (prvoci, řasy, buňky, listy mechu, pokožka, atd.) V případě materiálů s malým rozdílem n je nutno použít buď fázového kontrastu, nebo obarvení vzorku, popř. změnit imerzní kapalinu. (typickou ukázkou jsou acetátová vlákna, která nejsou v glycerínu prakticky vidět a je nutno použít jako imerzní kapalinu vodu) Při dlouhodobém pozorování je nutno brát v úvahu zahřívání preparátu a odpařování imerzní kapaliny

3 Příprava preparátů pro mikroskopii II 2. NÁTĚRY A ROZTLAKY Vzorek (měkká tkáň, suspenze částic) se rozetře nebo natře na podložním nebo krycím skle. 3. MIKRORELIÉFY A ADHEZIVNÍ PREPARÁTY studují se povrchy nebo povrchové vrstvy Princip: Nanesení tenké vrstvy rychle tuhnoucí průhledné hmoty (4 8% roztok celoidinu v acetonu, bezbarvý lak na nehty, lepidlo, kanagom,.) Otisk se sejme (sloupne) a přenese (přilepí) na podložní sklíčko, doporučuje se eventuálně lepící pásku zhomogenizovat namočením v benzenu a vysušením

4 Otisky textilních vláken

5 Příprava preparátů pro mikroskopii III 4. ŘEZY Princip: ze vzorku se připraví pevný kontrastní tenký řez, který se prohlíží ve SM v procházejícím světle. Parafín zahřát na teplotu o 2oC vyšší, než je teplota tání ( 58 oc) Parafín: měkký (45 50 oc) střední (50 53 oc) tvrdý (53 58 oc) Celoidin nitrát celulózy; rozpustný v éteru a alkohol/éter (1 : 1) Želatina pro řídké tkáně, které se jinak silně smrští; nebo tukové tkáně (10 až 20 % roztok v destilované vodě)

6 Příprava preparátů pro mikroskopii IV

7 Příprava řezů u textilních preparátů

8 Rozptylující preparát (preparáty z vláken s přírodnp rodní pigmentací-živ.vl iv.vlákna) Rozptylové diagramy: Délka šipek zde znázorňuje intenzitu paprsků v daném směru po průchodu preparátem. Režim pozorování -v procházejícím světle 1. Dopadající paprsky se rozptylují na nehomogenitách indexu lomu rozměrově menších než vlnová délka světla. 2. Takovou nehomogenitou je i každé reálné rozhraní dvou indexů lomu nebo drsnost povrchů.

9 Fázový preparát (preparáty s optickou aktivitou) Dopadající vlnoplocha Preparát má oblasti s různým indexem lomu, tzn. s různou rychlostí šíření fáze n1 n d Δ Takto se průchodem zdeformovala původně rovinná vlnoplocha, jinak řečeno, vznikl fázový posuv mezi sousedními paprsky Režim pozorování -v procházejícím světle za použití kontrastních metod 1) Fázový preparát bez absorpce (v různých místech preparátu je různý index lomu). Biologické preparáty. 2) Rozdíl optických drah je Δ = d(n - n 1 ). Tuto strukturu lze zviditelnit různými modifikacemi interferenčního kontrastu.

10 (preparáty z textiln Dvojlomný preparát ty z textilních vláken s výjimkou anorganických vláken ) E Režim pozorování - v procházejícím i dopadajícím polarizovaném světle 1) Optická struktura je tvořena neabsorbujícím dvojlomným krystalem s různě orientovanou optickou osou v jednotlivých částech výbrusu. Mineralogické preparáty. Dvojlom vykazují rovněž biologické preparáty, jako např. nervová vlákna. 2) Lineárně polarizované dopadající světlo průchodem přes preparát obecně změní směr kmitů vektoru elektrické intenzity E prošlého světla. Vznikne světlo elipticky polarizované. 3) Optická struktura (kontrast) se vyjeví v polarizačním mikroskopu (projektoru).

11 Nerovný povrch preparátu (difuze způsoben sobená povrchem preparátu) Rozptylový diagram: silně závisí na povrchovém reliéfu, např. Režim pozorování v procházejícím světle za použití Hoffmanova kontrastu nebo v dopadajícím světle a temném poli) 1) Optická struktura vzniká též lomem prošlých paprsků na nerovném povrchu a rozptylem na hranách nerovností. 2) Nerovné bývají často oba dva povrchy objektu.

12 Měření spektráln lních vlastností malých vzorků Omezení klasické spektrofotometrie = min. aperturní otvor ~ Ø 2mm

13 Makrospektrofotometry 1

14 Makrospektrofotometry 2 X SPECTRA Universita v Upsalle LCAM MAKROSPEFO

15 Vlákna z míst m krimináln lních činů Vlákno nalezené za nehty oběti Vlákno z košile nalezené na ostří nože, kterým byla oběť zabita

16 Mikro-spektrofotometrie 1 - počátky Schéma mikrofotometru Zeiss 1 polychromatický zdroj světla, 2 interferenční filtr, 3 monochromatický zdroj světla, 4 kondenzor 5 preparát, 7 děliče světla, 8 preparátový okulár, 9 okulár s polohou měřeného místa, 10 - fotonásobič

17 Mikro-spektrofotometrie 2 - počátky Schéma mikroskopu upraveného na mikrospektrofotometr s monochromatickým osvitem - obvykle bylo prováděno měření při alespoň dvou vlnových délkách

18 Mikro-spektrofotometrie 3 komerční systémy

19 Mikro-spektrofotometrie 4 komerční systémy TFProbe Microspectrophotometer (USA) QDI 1000 MSP fa Craic Technologies (USA)

20 Mikro-spektrofotometrie 5 komerční systémy MicroSpec s inverzním m uspořádáním

21 Mikro-spektrofotometrie 6 LIM Klasický optický mikroskop Nikon + spektrometr Ocean Optics nebo Avantes + vláknová optika

22 LCAM Microspefo I

23 LCAM Microspefo II

24 Opakovatelnost měřm ěření vliv osvětlen tlení Xenonová výbojka Halogenová žárovka

25 Spektráln lní charakteristika - vliv osvětlen tlení %T Wavelenght /nm/ Tungsten Xenon Mercury

26 Proměnliv nlivé preparáty

27 Vliv vstupní apertury průměr r vláknov knové optiky 200μm 100μm 50μm

28 Porovnání spekter a vliv imerzního prostřed edí T % Vlnová délka MS voda MS glycerin S pletenina

29 LCAM Mikrospefo dopadající světlo % remise Vlnová délka (nm)

30 Bezpečnostn nostní znaky BM BaSO4 Papír+OZP RM BaSO 4 Papír + OZP Bílý marker Růžový marker Goniochromní metalýza

31 Viková, M. : MIKROSKOPIE III

32 Multispektráln lní obrazová analýza I Slit aperture in Spectral-DV CCD Microscope Light Source Transmission Grating Slit aperture in microscope Dichroic in microscope Specimen Spectral Image Stack

33 Multispektráln lní obrazová analýza II This dimension sees a line on the sample or a linescan CCD Both Both dimensions (X,Y) (X,Y) see see intensity ranges This dimension sees spectral information. Transmission grating Spectral data is gathered at each pixel intensity wavelength

34 Multispektráln lní obrazová analýza III Move specimen under slit 3 dimensional data set (spectral stack): X Y Wavelength 660 nm 600 nm 580 nm 515 nm 440 nm Show me 515nm emission only 515 nm