NANOKOMPOZITNÍ Ag-HA BIOKOMPATIBILNÍ VRSTVY

Transkript

1 NANOKOMPOZITNÍ -HA BIOKOMPATIBILNÍ VRSTVY Miroslav JELÍNEK 1,2, Marie WEISEROVÁ 3, Tomáš KOCOUREK 1,2, Karel JUREK 1, Jakub STRNAD 4, Pavel KUDRNA 4 1 Fyzikální ústav v.v.i. AV ČR, Na Slovance 2, Praha 8, ČVUT v Praze, Fakulta biomedicínského inženýrství, nám. Sítná 3105, Kladno, Mikrobiologický ústav v.v.i AV ČR, Vídeňská cesta 1083, Prague 4 4 Lasak, Ltd., Papírenská 25, Praha 6, Abstrakt Příspěvek pojednává o přípravě KrF laserem a studiu dopovaných biokompatibilních materiálů se zaměřením na hydroxyapatit (HA). Je uveden přehled materiálů užívaných pro dopaci. Jsou uvedeny experimentální výsledky HA vrstev dopovaných stříbrem. Vlastnosti vrstev byly určovány pomocí profilometru, SEM, WDX, XRD a optické transmise. Obsah stříbra ve vrstvách HA se pohyboval od 0,06 do 13,7 at.%. Antibakteriální vlastnosti HA, stříbra a dopovaných vrstev HA stříbrem byly studovány in vivo pomocí buněk Escherichia coli. 1. ÚVOD V posledních letech se ukazuje, že jen málo materiálů je opravdu biokompatibilních [1]. Proto je cílem vyvinout tenké biokompatibilní vrstvy pro pokrytí materiálu implantátu a touto cestou zlepšit biokompatibilní a mechanické vlastnosti. Výzkum je především soustředěn na vrstvy hydroxyapatitu (HA) a modifikace těchto materiálů dopací. HA - Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 - tvoří z 80% anorganickou část kostí, zubní skloviny a dentinu. HA je velmi křehký, biologicky aktivní materiál, který má osteokondukční i osteoindukční vlastnosti. Používá se v zubních implantátech, periodontální léčbě, rozšiřování dásní, maxilofaciální chirurgii a otolaryngologii [2-3]. Dopace HA vrstev: Vlastnosti HA (povrchová tvrdost, pevnost v tahu, biodegradace a bioresorbence) mohou být zlepšeny dopanty jako jsou stříbro, hořčík, zinek, bioaktivní sklo, zirkon, yttrium a indium [4-8]. Povrchová tvrdost HA vrstev dopovaných oxidy hořčíku, dioxidy manganu nebo oxidy zinku je mnohem lepší než nedopovaných HA vrstev [4,6]. Stříbrem dopované HA ( + HA) vrstvy vykazují nižší povrchovou tvrdost se vzrůstajícím počtem iontů stříbra [9]. + HA mohou zlepšit antibakteriální charakteristiky HA a podporují regeneraci povrchových buněk. Významné rozdíly v bakteriální přilnavosti mezi HA a + HA vrstvami byly publikovány v [10-15]. Předpokládá se, že + HA vrstvy vykazují nejenom lepší kompatibilitu s tkání, ale také vytváří překážku pro přilnutí bakterií na povrch implantátu [16]. Uvádí se, že bakteriální přilnutí se může snížit až o 99% v porovnání s čistým HA [14]. Ukázalo se, že pro antibakteriální vlastnosti je významné stříbro a sloučeniny iontů + [17-19]. Mechanismus záleží na mnoha faktorech. Rychlost s jakou jsou ionty uvolněny, závisí na ploše povrchu stříbrných částic, bývá vyšší při větší ploše. Malé částice a nanočástice vykazují lepší výsledky [20]. Další faktor může být krystalinita povrchu, která zpomaluje proces [21]. Stříbrem dopovaný HA může být použit všude, kde bývá využíván HA. + HA může mít ještě širší

2 aplikaci v lékařství, protože stříbro tlumí bakteriální, virové a mykotické infekce, a podporuje protizánětlivý proces. Naše pozornost je zaměřena na shrnutí a studium tenkých vrstev + HA vytvořených pulsní laserovou depozicí (PLD). Tato metoda dovoluje jednoduše měnit depoziční parametry a jednoduše kontrolovat obsah v HA vrstvách. 2. EXPERIMENT HA a + HA vrstvy byly připraveny metodou PLD s použitím excimerového KrF laseru (λ = 248 nm, τ= 20 ns, opakovací frekvence 10 Hz). Laserový svazek byl fokuzován na stříbrný, HA (nebo + HA) terč s hustotou energie 2 Jcm -2. Podložka (titan, tavený křemen nebo křemík (111)) byla ve vzdálenosti 5 cm od terče. Substrát měl buď pokojovou teplotu (RT) nebo byl ohřátý na 600 C, aby bylo možné vytvořit amorfní či krystalické vrstvy. Vrstvy rostly ve směsi vodních par a argonu o tlaku 40 Pa. Pro depozici + HA vrstev byl HA terč částečně přikryt destičkou, aby bylo dosaženo požadovaného procentuálního zastoupení v HA vrstvě. Tloušťka a hrubost vrstev byla měřena Alpha-step IQ mechanickým profilometrem (KLA Co.). Topologie (SEM - scanning electron microscopy) a složení (WDX - wavelength dependence X- ray analysis) byly analyzovány EDAX Jeol Supersprobe 733. Krystalické vlastnosti byly měřeny pomocí XRD (X- ray diffraction) s geometrií paralelního svazku, skenujícím detektorem se stacionárním vzorkem, při glazing angle of incidence (GAOI). GAOI, které v našem případě bylo pět stupňů, umožňovalo osvětlení celého vzorku. Kvůli GAOI metodě, nejsou ve spektru píky podložky a pro polykrystalický materiál jsou polohy píků stejné jako při symetrickém skenu. Difraktometr měl rotující anodový generátor vyzařující rentgenové záření (300 ma, 55 kv). Optické transmisní spektrum bylo získáno zařízením Shimadzu spectrometer UV 1601 (λ = nm). V této studii, byly na testy antibakteriálních vlastností + HA vrstev použity buňky Escherichia coli K12 C 600 [22]. Buňky vyrostly v Lysogeny Broth (LB) [23] prostředí a byly umístěny na LA destičky (LA; LB s 15% příměsí agaru). Přes noc vzniklé kultury byly rozředěny pomocí sterilního slaného fyziologického roztoku tak, že finální koncentrace buněk byla 1 3 x 10 6 CFU/ml (Colony Forming Units) a byly použity pro antimikrobiální testy. Každá analyzovaná destička byla umístěna do sterilní skleněné nádoby a pokryta každá 1 ml bakteriální suspenze. Vzorky byly kultivovány přes noc při teplotě 37 C. Suspenze byly poté přemístěny do zkumavek a rozředěny na 10-6 ve slaném fyziologickém roztoku. Z každé rozředěné kultury bylo 100 µl rozetřeno na agarovou destičku. Destičky zrály přes noc a poté byl zjišťován počet vyrostlých kolonií. 3. VÝSLEDKY A DISKUZE Depozice - vrstvy čistého stříbra, vrstvy čistého HA a vrstvy HA s různými obsahy stříbra byly vytvořeny pomocí PLD. Obsah stříbra v HA vrstvách byl nastavován změnou poměru počtu laserových výstřelů do HA a terče během jednoho otočení terče (např. HA: poměr byl nastaven 19:1, 1:1, 1:3, 1:5, 1:11). K dosažení požadovaného složení HA + vrstvy byly nejprve nutné určit rychlost růstu a HA a poté vypočítat vhodný počet pulsů HA:. Odrazivost terče je mnohem větší než HA terče a to je důvod, proč stříbrná část terče byla relativně větší. Depoziční parametry představovaných vrstev jsou shrnuty v tab. 1.

3 Tab. 1. Depoziční podmínky a výsledky analýz pro vybrané vrstvy HA,, HA+ (T S teplota podložky). vzorek terč pulsy T s počet tloušťka at.% HA HA: ( C) pulsů (nm) (WDX) struktura HA-04 HA polykryst. HAAG-1 HA amorfní HAAG HAAG-3 HA: 1: ,4 amorfní HAAG-19 (23) HA: 1: ,3 amorfní HAAG-4 HA: 1: amorfní HAAG-5 HA: 1: ,7 polykryst. HA-05 HA: 19: ,06 polykryst. Topologie Byly vytvořeny vrstvy o tloušťkách v rozmezí desítky nanometrů až několik mikrometrů. Vrstvy byly hladké, někdy pokryty malými kapičkami. Žádné mimořádné změny v topologii krystalických a amorfních vrstev nebyly pozorovány. Struktura (XRD) HA vrstvy a HA vrstvy dopované stříbrem vytvořené při pokojové teplotě byly amorfní. Vrstvy vytvořené při vyšších teplotách (> 520 C) byly polykrystalické. Pro malou koncentraci stříbra v HA (0.06 at.%, HA: = 19:1) žádné píky stříbra v XRD spektru nebyly pozorovány. Při koncentraci 1.3 at.% (HA: = 1:1) byly píky pozorovány a při koncentraci 13.6 at.% byl stříbrný pík mnohem větší v porovnání s píky HA. Z XRD Intensity [a.u.] spektra bylo vypočítáno s 40 použitím metody Williamson- HA Hall plot velikost krystalických 30 zrn: HA ~ 30 nm a ~ nm. Na obr. 1. jsou HA uvedeny XRD spektra +HA 20 vrstev θ Obr. 1. XRD spektrum vzorku HAAG-27 (HA: = 1:3, 4,4 at.% ). Složení (WDX) ve stříbrem dopovaných HA vrstvách byl použitím WDX spektrometrie analyzován obsah Si, P, Ca a. V závislosti na depozičních podmínkách se obsah měnil od 0.06 do 13.7 at.% - viz tab.1. Příklad WDX spektrální analýzy HA + je na obr. 2. Rozložení prvků, Ca a P bylo ve vrstvách velice homogenní viz obr. 3.

4 Obr. 2. Obr. 3. Obr. 2. WDX spektrální analýza vzorku HAAG-3 (4,4 at.%, měřena plocha 2 x 3 mm 2 ). Obr. 3. Rozložení ve vzorku HAAG-3 (zvětšení 1500x, 1 pixel je nm). Optická transmise - čistých a čistých HA vrstev, a HA vrstev obsahujících stříbro je na obr. 4. Transmise vrstvy (HAAG-2) ukazuje charakteristický pík blízko 300nm. Všechny stříbrem dopované vrstvy (HAAG-3, 4) vykazují podobný charakteristický pík ve spektru. Pík může být pozorován dokonce ve spektru vrstvy s nízkým obsahem (HA-05, HA: = 19:1, 0.06 at.% ). Hodnota propustnosti závisí na tloušťce vrstvy a transmisní křivka může být částečně ovlivněna i strukturou vrstvy (amorfní či polykrystalická vrstva). Obr. 4. Transmise v závislosti na vlnové délce (HAAG-2), stříbrem dopovaná HA vrstva (HAAG-4 (13.7 at.% ), HAAG-3 (4.4 at.% ), HA-05 ( 0.06 at.% )) a čistý HA (HAAG-1). In vivo test Antibakteriální efekt stříbrem dopovaných HA vrstev byl zkoumán využitím E. Coli C600. Testované, stříbrem dopované HA vrstvy (s obsahem 0,06 at.%, 8,3 at.% a 13,7 at.%) byly umístěny ve sterilních skleněných komůrkách a byly pokryty 1ml bakteriální kultury obsahující 106 CF/ml. Po kultivaci přes noc při teplotě 37 C, byla zkoumána bakteriální suspenze a byl zjišťován počet živých (přeživších) buněk. Antimikrobiální účinek HA vrstev obsahujících stříbro proti E. coli je ukázán na obr. 5. Testem bylo zjištěno, že žádná kolonie E. Coli nebyla zjištěna na vrstvách, pokud obsah stříbra byl roven nebo byl vyšší

5 jak 8.3%. Výsledky v tab.2. ukazují antibakteriální účinnosti různých doponovanch HA vrstev proti E. Coli, které byly vypočítané podle vzorce 1. Výsledek nad 99% lze považovat za vynikající [24]. Obr. 5. Antibakteriální efekt stříbrné vrstvy a stříbrem dopované vrstvy HA na buňky E. coli. Tab. 2. Antibakteriální efekt a v HA vrstvách na buňkách Escherichia coli (data vyjadřují průměr 2-3 experimentů). koncentrace protibakteriální účinnost % HAAG-13 HAAG-17 HA-05 HAAG-23 HAAG-14 0 % 100 % 0.06 at. % 8.3 at. % 13.7 at. % čistý HA, čisté, žádné žádný HA Vzorec 1. ABÚ = Antibakteriální účinnost, P REF P EXP ABÚ (%) = x 100% P REF P REF = Počet buněk v referenční skupině, P EXP = Počet buněk v experimentální skupině Výsledky můžeme porovnat s plazmou naprášenými HA vrstvami dopovanými [25]. Byly testovány tři bakterie a zjištěn antibakteriální efekt vyšší než 95% pro koncentrace stříbra nad 3 wt% (0.6 at.%). Naše výsledky jsou srovnatelné ukazující účinnost 3.9% pro 0.06 at.% koncentraci stříbra a 100% pro koncentraci stříbra 8.3 at.% a 13.7 at.%. 4. ZÁVĚR Použitím PLD jsme vytvořili tenké vrstvy stříbra, krystalické a amorfní HA vrstvy a HA vrstvy dopované stříbrem. Dopované vrstvy byly deponovány z terče složeného z částí stříbra a HA. Změnou poměru plochy HA a jsme měnili obsah stříbra od 0.06 at.% do 13.7 at.%. Změna teploty substrátu vedle ke vzniku amorfních či krystalických vrstev. Velikost krystalických zrn ve vrstvách byla ~ 30 nm pro HA a ~ nm pro stříbro. Podle WDX analýzy se stříbro v HA rozložilo velice homogenně. Měření transmise HA + vrstev ukázalo charakteristický stříbrný pík v optickém spektru, který byl pozorován dokonce i u vrstev s

6 velice nízkým obsahem. Více detailů týkajících se fyzikálních vlastností HA + vrstev bude uvedeno v [26]. Antibakteriální vlastnosti, HA a HA + vrstev byly testovány na Escherichi coli K12 C600. Antibakteriální účinnost 100% byla stanovena pro stříbrem dopovanou HA vrstvu v koncentraci 8.3 a 13.7 at.%. PODĚKOVÁNÍ Práce byla podpořena grantovou agenturou Ministerstva průmyslu a obchodu ČR: projekt číslo FI-IM5/218. LITERATURA [1] R. J. Narayan, Functionally Gradient Hard Carbon Composites for Improved Adhesion and Wear, Materials Science and Engineering-NCSU-doctoral (2002). [2] B. D. Ratner. Biomaterials Science : An Introduction to Materials in Medicine. Vol. 1. (Academic Press, 2004) [3] V. Nelea, M. Jelinek in Pulsed Laser Deposition of Thin Films: Applications-Led Growth of Functional Materials, R. Eason, edit., (Wiley-VCH, Berlin, 2007). [4] J. Kalita, H.A. Bhatt, Materials Science and Engineering: C 27 (4), 837 (2006). [5] S. Ramesh, C.Y. Tan, C.L. Peralta, W.D. Teng, Science and Technology of Advanced Materials 8 (4), 257 (2007). [6] C.K. Wang, C.P. Ju, J.H. Chern Lin, Materials Chemistry and Physics 53 (2), 138 (1998). [7] M. Inuzuka, S. Nakamura, S. Kishi, K. Yoshida, K. Hashimoto, Y. Toda, K. Yamashita, Solid State Ionics 172, 509 (2004). [8] E.A. Massa, E.B. Slamovich, T.J. Webster, Material research society Proceedings 57394, (2001). [9] W. Chen, Y. Liu, H.S Courtney, M. Bettenga, C.M. rawal, J.D. Bumgardner, J.L. Ong, Biomaterials 27, 5512 (2006). [10] R-J Chung, M-F Hsieh, K-Ch Huang, L-H Perng; Fong-In Chou, Tsung-Shune Chin, Journal of Sol-Gel Science and Technology 33 (2), 229 (2005). [11] W. Chen, S. Oh, A.P. Ong 1, N. Oh, Y. Liu, H.S. Courtney, M. Appleford, J.L. Ong, Journal of Biomedical Materials Research Part A (28 A) 4, 899 (2006). [12] L. Feng, F.Z. Cui, T.N. Kim, J.W. Kim, Journal of materials science letters 18 (7), 559 (1999). [13] K-S Hwang, S Hwangbo, J-T Kim, Journal of Nanoparticle Research 10 (8), 1337 (2007). [14] Y. Chen, X. Zheng, Y. Xie, C. Ding, H. Ruan, C. Fan, Journal of Materials Science: Materials in Medicine 19 (12), 3603 (2008). [15] A. Mo, J. Liao, W. Xu, S. Xian, Y. Li, S. Bai, Applied Surface Science 255 (2), 435 (2008). [16] W. Chen, S. Ohk, A. P. Ong, N. Oh, Y. Liu, H. S. Courtney, M. Appleford, J. L. Ong, Journal of Biomedical Materials Research 82, 899 (2007). [17] L. Cléries, J.M. Fernández-Pradas, J.L. Morenza. J. Biomed. Mater. Res. 49, 43 (2000).

7 [18] Q. L. Feng, J. Wu, G.Q. Chen, F.Z. Cui, T.N. Kim, J.Q. Kim, J Biomed Mater Res. 52, 662 (2000). [19] M. Rai, A. Yadav, A. Gade. Biotechnology advances 27, 76 (2009). [20] G. Martínez-Castanón, M. Nino- Martin0z, F. Martinez- Gutierrez, J.R. Martinez- Mendoza, F. Ruiz, Journal of Nanoparticle Research, 1343 (2008). [21] R. Kumar, H. Münstedt, Polymer International 54, 1180 (2005). [22] R.K. Appleyard, Genetics, [23] S.E. Luria, in : Cold Spring Harb Symp Quant Biol. (1953), p [24] L. Huang, D.Q. Li, Y.J. Lin, M. Evans, D.G. Evans, X. Duan, J. Inorg. Biochem., 99(5), 986 (2005). [25] Y. Chen, X. Zheng, Y. Xie, Ch. Ding, H. Ruan, C. Fan, J. Matre. Sci: Mater. Med. 19, 3603 (2008). [26] M. Jelinek, M. Weiserova, T. Kocourek, J. Remsa, K. Jurek, J. Strnad, COLA 2009, Singapore Will be published in Appl. Phys. A.