Biofyzikální chemie nekovalentní interakce, prostorové uspořádání proteinů, voda. Zita Purkrtová říjen - prosinec 2015

Transkript

1 Biofyzikální chemie nekovalentní interakce, prostorové uspořádání proteinů, voda Zita Purkrtová říjen - prosinec 2015

2 Interakce v biochemii D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

3 Interakce v biochemii Interakce vzájemné působení dvou nebo více činitelů Jakých činitelů? biopolymer a jeho části biopolymer a nadmolekulární útvary (membrány) rozpouštědlo a molekuly přítomné v rozpouštědle molekula biopolymeru je komplexní systém, o to více systém biopolymer rozpouštědlo široká škála možných interakcí intra- a inter- interakce biochemické děje jsou charakteristické svou dynamikou... vratností...specifitou

4 Chemická vazba kovalentní vazba sdílení jednoho nebo více elektronových párů stabilita vazby dána termodynamicky (vysoké vazebné energie) i kineticky (vysoké aktivační energie rozpadu) dělení dle rozdílu elektronegativit prvků na: iontové polární vazby rozdíl elektronegativit > 1,7 polární kovalentní vazbu - 1,67 > rozdíl elektronegativit > 0,4 nepolární kovalentní vazbu rozdíl elektronegativit < 0,4

5 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Nekovalentní interakce nekovalentní interakce (vazba, síla) nedochází ke sdílení elektronových párů vznik a rozštěpení vazby je vratný děj probíhající bez katalyzátoru (nízká aktivační a vazebná energie) kombinovatelnost nekovalentních interakcí aditivita energie vazeb zvyšující stabilitu

6 Nekovalentní interakce Elektrostatické (Coulombické) interakce Vodíkové vazby van der Waalsovy interakce Hydrofobní interakce

7 Elektrostatické interakce F q q r Ca 2+

8 van der Waalsovy interakce všechny typy interakcí, které nespadají do kategorie elektrostatických, vodíkových a hydrofobních interakcí dělení: Interakce permanentní dipól-permanentní dipól (van der Waalsovy-Debyeovy) E d d ktr Interakce permanentní dipól-indukovaný dipól (van der Waalsovy-Keesomovy) E d id r permitivita vakuaa [C 2.N -1. m -2 ]... dipólový moment [D=C.m] k... Boltzmanova konstanta... polarizovatelnost molekuly Londonovy disperzní síly (interakce přechodný dipól-přechodný dipól) E disp 2 3I I I r 0 1 I polarizovatelnost molekuly I... ionisační energie molekuly

9 van der Waalsovy interakce dělení: patrové interakce (- interakce) vzájemná interakce -elektronových systémů lokalizovaných pod i nad aromatickými kruhy stabilizace dihelixů DNA a některých úseků RNA

10 Vodíkové vazby (můstky) slabě kyselý donor D-H interaguje prostřednictvím atomu vodíku s volným elektronovým párem akceptoru A

11 Hydrofobní interakce interakčním partnerem je vždy voda pojem hydrofobní je používán ve smyslu neschopné se mísit s vodou (tedy vytvářet vodíkové můstky s vodou) dávající přednost nepolárnímu prostředí před vodným přenos nepolární sloučeniny do vodného roztoku doprovázený charakteristickou teplotní závislostí termodynamických veličin způsobující vyšší uspořádanost molekul vody v okolí molekul rozpuštěné látky kvantitativní vyjádření hydrofobity rozdělovací koeficient = termodynamická rovnovážná konstanta v systému vodanepolární rozpouštědlo

12 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Hydrofobní interakce entropicky řízený děj G = H - TS m -S p ΔG 0, ΔH 0, ΔS 0 ΔG 0, ΔH 0, ΔS 0

13 energie [kj/mol] energie [kj/mol] Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia, Hydrofobní interakce charakteristickým rysem je velká hodnota c p přenosu nepolární sloučeniny do vody mísení dvou jednoduchých málo mísení oleje s vodou mísitelných kapalin (panel A) (panel B) H G TS A teplota [K] G H TS B teplota [K]

14 Hydrofobní a nepolární?? nepolární = hydrofobní?? Hydrofobní interakce Hydrofobní látka Nepolární (kovalentní) vazba Nepolární rozpouštědlo Nepolární látka

15 Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia, Nekovalentní interakce - souhrn Typ interakce Příklad Vazebná energie (kj/mol) vodíkové vazby: voda (led) O H...O= 17 peptidové vazby =N H...O=C 15 mezi neutrální a nabitou skupinou COO -...HO CH 2 15 elektrostatické interakce ion - ion COO H 3 N interakce dvou permanentních dipólů C + =O -... C + =O Londonovy dispersní interakce mezi dvěma alifatickými atomy C 0,11 patrové interakce mezi dvěma aromatickými kruhy Phe 6 mezi dvěma methylovými hydrofobní interakce skupinami 1,2 mezi dvěma postranními řetězci valinu 6

16 Nekovalentní interakce - rozdělení Termodynamické hledisko dělení: interakce enthalpické povahy interakce entropické povahy G H T. S Hledisko síly interakce (r -x ) interakce dalekého dosahu (x 3) interakce krátkého dosahu (x>3) Hledisko struktury biopolymeru lokální interakce nelokální interakce

17 Nekovalentní interakce a struktura proteinů

18 Nekovalentní interakce a struktura proteinů Hydrofobní interakce AMK s hydrofobním/nepolárním postranním řetězcem hydrofobní profil proteinu rozhodující síly stabilizující nativní konformaci kvantitativní vyjádření hydrofobity Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia, rozdělovací koeficient = termodynamická rovnovážná konstanta v systému vodanepolární rozpouštědlo modelující hydrofobní vnitřek molekuly proteinu (např. benzen či n-oktanol) Elektrostatické interakce klasické (nespecifické) elektrostatické interakce destabilizující vliv v oblastech ph vzdálených od pi specifické elektrostatické interakce (iontové páry, solné můstky) malý stabilizující vliv iontových párů na povrchu (cca 4-5 iontových párů na 150 AMK)

19 Hydrofobní profil proteinu zobrazení rozložení polárních a nepolárních AMK zbytků v rámci molekuly proteinu určení hydrofóbních/hydrofilních oblastí proteinu pravděpodobná lokalizace AMK zbytku v rámci molekuly proteinu (povrch x vnitřek proteinu) interakce proteinu s okolním prostředím: hydrofilní oblasti na povrchu proteinu (a tedy potažmo antigenní) hydrofóbní oblasti uvnitř proteinu případně reagující s membránou in silico předpověď x experimentální určení in silico předpověď různá měřítka (např. Kyte-Doolittle) predikční programy např. ProtScale ( experimentální určení hydrofobity AMK/proteinu: zádrž na hydrofobní koloně rozdělovací koeficient mezi vodnou a organickou fázi

20 Hydrofobní profil proteinu AMK Kyte- Doolittle Hopp- Woods Ala 1,8-0,5 Arg - 4,5 3,0 Asn - 3,5 0,2 Asp - 3,5 3,0 Cys 2,5-1,0 Gln - 3,5 0,2 Glu - 3,5 3,0 Gly - 0,4 0,0 His - 3,2-0,5 Ile 4,5-1,8 Leu 3,8-1,8 Lys - 3,9 3,0 Met 1,9-1,3 Phe 2,8-2,5 Pro - 1,6 0,0 Ser - 0,8 0,3 Thr - 0,7-0,4 Trp - 0,9-3,4 Tyr - 1,3-2,3 Val 4,2-1,5

21 Hydrofobní profil proteinu pro membránové oblasti v centru hodnota min. 1,6 měřítko Kyte-Doolittle

22 Nekovalentní interakce a struktura proteinů van der Waalsovy interakce interakce permanentní dipól-permanentní dipól četné především uvnitř molekuly (např. dvě karbonylové skupiny) interakce permanentní-indukovaný dipól např. karbonylová skupina indukující dipól v methylové skupině interakce přechodný dipól-přechodný dipól velmi časté vpodstatě tak mohou reagovat každé dvě molekuly, které se přiblíží dostatečně blízko nezanedbatelný vliv na stabilitu struktury; důležité při interakcích mezi proteinem a komplementárními ligandy vodíkové vazby stabilizace struktury proteinu molekula bílkoviny může tvořit: intramolekulární vazby v rámci molekuly skupiny peptidové vazby mezi neutrální a nabitou skupinou intermolekulové vazby s molekulami rozpouštědla

23 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Nekovalentní interakce a vazba efektoru k molekule enzymu H 2 O H 2 O různé typy nekovalentních interakcí

24 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Vazba vody uvnitř a na povrchu molekuly proteinu H 2 O cytochrom f krystalová struktura hemoglobinu

25 Hydratace bílkovin 0,3 g H 2 O na 1 g bílkoviny, teoreticky tedy tloušťka jedné molekuly H 2 O výměna molekul vody v hydratačním obalu pomalejší než v čisté vodě mezi molekulami hydratačního obalu a molekulou proteinu nekovalentní interakce různé povahy (povaha funkčních skupin na povrchu) hydratační obal zásadní pro biologickou funkci proteinu (konformační flexibilita, difuze)

26 Voda bruslařka rodu Gerris

27 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Molekula vody dynamická struktura

28 Fyzikální vlastnosti vody Sloučenina Teplota tání Teplota varu Výparné teplo (K) (K) (kj.mol -1 ) CH ,21 NH ,22 HF ,20 Ne ,74 H 2 O ,65 H 2 S ,67 H 2 Se ,70 H 2 Te ,20 isoelektronické sloučeniny hydridy vysoké výparné teplo zaručuje účinné ochlazení organismu odpařením již malého množství vody (vypaření 2 g vede k ochlazení zbývajících 998 g o 1 C) vysoká tepelná kapacita vody (4,18 kj/kg/k) a vysoká tepelná vodivost umožňují účinnou termoregulaci a zabraňují lokálním fluktuacím teploty vysoká relativní permitivita (78,5 při 298 K) je rozhodující pro schopnost rozpouštět i polární struktury nejen iontové sloučeniny

29 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Vodíkové vazby ve struktuře vody Základní forma ledu (Ih) - šesterečná struktura; 4 vodíkové vazby (úhel H-O-H) - ledové pravidlo orientace molekul; defekty krystalové mřížky ledu Kapalná voda - přesný model není znám - určité pravidelné struktury - klastry - strukturovaný soubor dipólů - dynamika obměny vodíkových vazeb - v řádu nanometrů nehomogenní

30 Voda jako rozpouštědlo polární látka D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

31 Voda jako rozpouštědlo amfifilní látka D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

32 Voda jako rozpouštědlo nepolární látka Klathrát = organizovaná struktura molekul vody, která se vytvoří jako důsledek hydrofobních interakcí kolem nepolární látky ve vodném prostředí molekuly vody nepolární látka/skupina

33 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Nativní struktura biopolymeru konfigurace x konformace biopolymeru hierarchie uspořádání struktura s nízkou hodnotou Gibbsovy energie uplatňují se inter- i intra- interakce zcela zásadní vliv rozpouštědla kooperativita

34 Nativní struktura biopolymeru kooperativita lineární allosterický efekt průměrná kooperativita molekuly = pravděpodobnost s jakou změní (n+1)-tý zbytek svou konformaci jako důsledek změny konformace zbytku n-tého vznik mikroprostředí v rámci molekuly biopolymeru povrch molekuly x její střed např. rozdílná permitivita konformačně-dynamické struktura

35 Vznik nativní struktury biopolymeru nejedná se o náhodný proces Levinthalův paradox řetězec 100 AMK se sbalí za cca 5s pokud by byly náhodně zkoušeny všechny možné konformace rychlostí trvalo by nalezení správné konformace s, stáří vesmíru přitom je jen s nicméně přesný model sbalování není znám... energetická bilance procesu D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

36 Vznik nativní struktury biopolymeru model roztavené globule (molten globule) počáteční spontánní kolaps (hnaný hydrofobními interakcemi) dá vzniknout nestabilnímu mezistupni (molten globule), který již má určitý stupeň nativních struktur, ale postranní řetězce ještě nejsou zcela fixovány hierarchický model sbalování pomocí gardedám nutná přítomnost chaperonových proteinů či intramolekulárních chaperonových sekvencí možná účast dvou enzymů v konečné fázi: protein disulfid isomerasa peptid prolyl cis-trans isomerasa

37 Vznik nativní struktury biopolymeru energetická bilance procesu Je vždy dosaženo absolutního minima Gibbsovy energie? vliv energetického příspěvku vazby specifických nízkomolekulárních partnerů (např. prosthetická skupina) vznik nadmolekulárních komplexů otázka renaturace D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005

38 He, B. et al. (2009): Predicting intrinsic disorder in proteins: an overview. Cell Research 19, Vnitřně neuspořádané oblasti v proteinové struktuře pojem, který se objevuje posledních zhruba deset let oblasti, které jsou funkční, ale přesto (v určité fázi či okamžiku) neuspořádané calcineurin

39 Vnitřně neuspořádané oblasti v proteinové struktuře a jejich funkce Chouard, T. (2011): Breaking the protein rules. Nature 471, tumour-supressor protein p53 Uversky, V. N. (2011): Intrinsically disordered proteins from A to Z. Int J Biochem Cell Biol 43,

40 Chouard, T. (2011): Breaking the protein rules. Nature 471, Vnitřně neuspořádané oblasti v proteinové struktuře a jejich funkce vztah uspořádanosti struktury enzymu a vazby substrátu model zámku a klíče fold as you bind shape shifting

41 Denaturace nativní struktury Každá podstatná změna prostorového uspořádání biopolymeru, která vede ke ztrátě jeho biologické aktivity. neuspořádané (statistické) klubko (random coil) x neúplně denaturované stavy (stabilní meziprodukty denaturace) v procesu denaturace dochází k zániku původních a vzniku nových nekovalentních interakcí role rozpouštědla vratná x nevratná denaturace fyzikální a chemické vlivy x chemická činidla pro experimentální stanovení možno využít jakoukoliv metodu, která sleduje změnu v konformaci biopolymeru N D K D D N

42 [] [deg.cm 2.dmol -1 ] Denaturace nativní struktury dvoustavový model (pro vratnou denaturaci) c o = D + N N D F = f N N + f D D K D = FN-F F-FD FD f D = F D / c o F N teplota [ C] f N = F N / c o Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia, 2000.

43 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Denaturace nativní struktury Tm (teplota tání) = hodnota intensity denaturačního faktoru, která je zapotřebí k dosažení poloviny denaturace

44 D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005 Denaturace nativní struktury Jsou tyto stavy stejné? Tm (teplota tání) = hodnota intensity denaturačního faktoru, která je zapotřebí k dosažení poloviny denaturace

45 Diferenciální mikrokalorimetrie bílkovin c p H T p 10 8 cp [J/K/g] 6 4 c p N c p,d 2 0 T d t [ C] Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia, 2000.

46 Děkuji za pozornost.

47 Kódované aminokyseliny D. L. Nelson, M.M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 4 th edition, W.H. Freeman and Company, 2005