Syntéza 3. generace fotosenzitizérů založených na ftalocyaninovém jádře

Transkript

1 UIVERZIT KRLOV V PRZE FRMCEUTICKÁ FKULT V HRDCI KRÁLOVÉ KTEDR FRMCEUTICKÉ CHEMIE KOTROLY LÉČIV D I P L O M O V Á P R Á C E yntéza 3. generace fotosenzitizérů založených na ftalocyaninovém jádře Hradec Králové, 2009 Kateřina edláčková

2 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. 2

3 Děkuji celé Katedře farmaceutické chemie a kontroly léčiv, především pak mému školiteli PharmDr. Petru Zimčíkovi, Ph.D., za jeho ochotu a hlavně za jeho trpělivost. 3

4 Obsah 1 eznam zkratek Cíl práce Teoretická část Fotodynamická terapie Vývoj fotodynamické terapie Začátky PDT Vývoj fotosenzitizérů Kyslík Zdroj světla Mechanismus fotosenzitizace Fotosenzitizéry Obecné vlastnosti ideálního P Typy fotosenzitizérů Cíle pro PDT Fotopoškození nádorových buněk Cévní uzávěr a imunomodulační odpověď PDT a léčba rakoviny PDT a nemelanomatózní rakovina kůže Psoriasis vulgaris Metodická část yntéza nesymetrických ftalocyaninů yntéza 3 B ftalocyaninů Experimentální část Příprava 4,5-bis(terc-butylsulfanyl)ftalonitrilu (1) Příprava zinečnatého ftalocyaninu (4) metodou cyklizace s octanem zinečnatým v chinolinu Příprava zinečnatého Pc (5) za použití butanolátu lithného Příprava symetrického hořečnatého Pc (6) Příprava asymetrického hořečnatého Pc (7)

5 5.6 Příprava zinečnatého Pc (4) Výsledky a diskuze Závěr Citovaná literatura

6 1 eznam zkratek L BCCs HP HpD ML MFs MTs MCs PDT PpIX Pc P RO ubpc kyselina aminolevulanová karcinom basálních buněk hematoporfyrin derivát hematoporfyrinu methylester kyseliny aminolevulanové mikrofilamenty mikrotubuly nemelanomatózní karcinom kůže fotodynamická terapie protoporfyrin IX ftalocyanin fotosenzitizér reaktivní formy kyslíku subftalocyanin 6

7 2 Cíl práce Cílem mé diplomové práce byla syntéza 3. generace fotosenzitizérů založených na ftalocyaninovém jádře, připravených smíšenou tetramerizací dvou odlišných prekurzorů. Z předchozích diplomových prací na Katedře farmaceutické chemie a kontroly léčiv bylo zjištěno, že látka struktury uvedené na Obr. 1 má výhodné fotofyzikální vlastnosti předurčující jí k tomu, aby se po napojení na vhodné nosiče mohla stát fotosensitizérem 3. generace s cílenější distribucí. Mou prací bylo hledat nejvhodnější postupy pro syntézu cílové látky. Zn COOH Obr. 1 Vzorec asymetrického ftalocyaninu 7

8 3 Teoretická část 3.1 Fotodynamická terapie Fotodynamická terapie (PDT) je minimálně invazivní terapeutický prostředek používaný pro klinickou léčbu několika typů rakoviny a neonkologických potíží. U PDT je sloučenina s fotosenzitivními vlastnostmi (P) selektivně akumulovaná ve zhoubné tkáni. ásledná aktivace P viditelným světlem, přednostně v červené oblasti viditelného spektra (nad 600 nm), kde jsou tkáně více propustné pro světlo, generuje reaktivní formy kyslíku, zejména singletový kyslík, zodpovědný za cytotoxicitu. Jsou popsány tři hlavní mechanismy, pomocí kterých singletový kyslík přispívá k destrukci tumorů. Jedná se o přímé buněčné poškození, cévní uzávěr a aktivaci imunitní odezvy proti nádorovým buňkám. PDT má nad jinými konvenčními metodami léčby rakoviny značné výhody, jako např. nízkou systémovou toxicitu a schopnost selektivně ničit nádory přístupné světlu. PDT je tudíž užívána pro léčbu endoskopicky přístupných nádorů jako jsou nádory plic, močového měchýře, gastrointestinální a gynekologické novotvary a také v dermatologii pro léčbu nemelanomatózních rakovin kůže a prekancerózních onemocnění. (1) PDT nemůže vyléčit choroby v pokročilých stádiích, protože není možné ozáření celého těla v patřičné dávce. Přesto však při rozvinutých chorobách může prodloužit život a zlepšit jeho kvalitu. (2) Vývoj fotodynamické terapie větlo, které od pradávna přicházelo ze slunce, poskytovalo zemi energii, důležitou pro rozvoj života. Primitivní člověk uctíval slunce jako nebeské těleso nejvyšší mystiky. tarověké egyptské, indické a čínské kultury používaly terapeutický efekt slunce k léčbě velké škály nemocí jako je vitiligo, psoriáza, rakovina a dokonce psychóza. (3) Průkopníkem léčby světelnými paprsky (helioterapie) byl Herodotus. (4) Tato léčba se však rozšířila až koncem 19. a počátkem 20. století. (5) Zasloužil se o to dánský fyzik iels Finsen, který byl za svou práci na fototerapii v roce 1903 odměněn obelovou cenou. použitím červeného světla úspěšně léčil neštovice a pomocí ultrafialového světla kožní tuberkulózu. (4) 8

9 Většina průkopnických prací na PDT byla provedena v Evropě na přelomu minulého století. Z toho důvodu je většina literatury týkající se PDT psaná v němčině, francouzštině a dánštině, po druhé světové válce se rozšířila do anglicky mluvících zemí. (4) Začátky PDT V roce 1900 německý student medicíny Oskar Raab popsal koncept usmrcení buňky pomocí interakce světla a chemikálií. Zatímco pracoval pro profesora Hermana von Tappeinera v Mnichově, popsal smrtelný efekt, jež mělo světlo a červený akridin na prvoky rodu Paramecium. (6) tanovil, že toxicita in vitro se vyskytuje jako výsledek fluorescence způsobené přenosem energie ze světla na chemikálii. Zanedlouho potom předpověděl profesor von Tappeiner budoucnost fluorescenčních látek v medicíně. Ve stejnou dobu jako Raab, pozoroval francouzský neurolog Prime fotosenzitivní reakce na částech těla pacientů, jež byly vystaveny slunci. Těmto pacientům byl podáván eosin na epilepsii. (4) ásledkem toho von Tappeiner a kožní lékař Jesionek zveřejnili první lékařské podání bílého světla s lokálně aplikovaným eosinem k léčbě kožních nádorů. (7) V roce 1904 von Tappeiner a Jodlbauer zjistili, že kyslík je nedílnou součástí fotosenzitizačních reakcí a v roce 1907 zavedli termín fotodynamický děj. (4) Vývoj fotosenzitizérů V roce 1841 získal cherer zahřátím krve s kyselinou sírovou a následným odkovením sraženinu. V roce 1867 bylo zjištěno, že tato sraženina má fluorescenční schopnosti. Tato sraženina byla nazvána hematoporfyrin (HP). (4) V roce 1911 Hausman popsal fotosenzitivní reakce u myší, kterým byl podán HP. (8) Friedrich Meyer-Betz si v roce 1913 injekčně podal 200 mg hematoporfyrinu, aby zjistil, jestli podobné efekty mohou být vyvolány také u lidí. Pozoroval dlouhotrvající bolesti a otoky v oblastech exponovaných světlu. (9) V roce 1924 byla Francouzem Policardem, který pracoval v Lyonu, popsána lokalizace porfyrinů v maligní tkáni. (10) Objevil typické červené fluorescence HP v experimentech s krysími sarkomy (zhoubný nádor z pojivové tkáně) vystavenými UV 9

10 světlu generovanému Woodovou lampou. V roce 1942 ěmci uler a Banzer, popsali lokalizaci a fluorescenci exogenně podávaných porfyrinů v maligních nádorech (11). Jedním z hlavních milníků ve vývoji PDT byl rok Dougherty a spolupracovníci z Roswell Park Center Institut v Buffalu ohlásili první úspěšnou léčbu nádoru následující po podání derivátu hematoporfyrinu (HpD) a jeho aktivací červeným světlem u pokusného zvířete. V roce 1978 Dougherty popsal první velkou skupinu pacientů úspěšně léčenou s PDT. (12) Od roku 1976 je v rámci Evropy jedním z nejvýznamnějších center, kde probíhá výzkum P, Ústav biofyziky v Radium Hospital v orském Oslu. Ústav je pod vedením profesora Johana Moana. V roce 1984 se k Moanově skupině připojil biochemik profesor Claudie Rimington. Jeho cílem bylo vyčištění všech P, včetně HpD (13) (14) (15). Jeho práce položila základy pro rozvoj lepších P. Moanova skupina studovala intracelulární distribuci P s použitím fluorescenční mikroskopie. Ukázala, že ty P, které jsou lokalizované v cévní části organismu, mají nejsilnější účinek. (4) Kyslík Moanova skupina zjistila, že vysoce reaktivní singletový kyslík hrál významnou roli v buněčné toxicitě během procesu PDT. V roce 1979 Moan a Wold vyvinuli techniku k detekci produkce singletového kyslíku. Technika byla založena na reakci singletového kyslíku se stericky chráněnými aminy vedoucími ke vzniku stabilního nitroxidového radikálu, který mohl být měřen pomocí resonance elektronového spinu (ER). (16) tejná skupina zkoumala efekt závislosti fotodynamického efektu na kyslíku u HpD v rakovinových buňkách. (17) Bylo dokázáno, že úbytek koncentrace kyslíku je spojen s méně efektivním fotodynamickým efektem. Vědci prokázali, že hypoxické rakovinové buňky jsou odolné vůči PDT. avrhli podání kyslíku pacientům během PDT, aby se zvýšila úroveň okysličení nádorů a tím i efekt PDT. Další práce vědecké skupiny ukázala, že singletový kyslík se od místa svého vzniku nerozptýlil o více než 0,05 µm. (18) (19) Z tohoto důvodu singletový kyslík generovaný mimo buňky nezpůsobuje intracelulární změny. (20) Oxidativní poškození nádorové buňky 10

11 způsobené singletovým kyslíkem se vyskytuje v přímé blízkosti subcelulární lokalizace P. Toto poškození je velmi důležité pro následný účinek PDT. lfred Maier a jeho spolupracovníci v Rakousku studovali efekt PDT za hyperbarických podmínek. Pacienti s pokročilým karcinomem jícnu, kteří byli léčeni PDT za těchto podmínek, měli při srovnání s pacienty léčenými samotnou PDT značně lepší výsledky. (21) (22) (23) Zdroj světla Prvními světelnými zdroji byly konvenční lampy. Tyto lampy vyzařovaly nekoherentní světlo. (24) elaserové světelné zdroje jsou primárně používány v dermatologii. Poté byly používány různé typy laserů, např. barvivové lasery. ejpopulárnější z nich byl argonový laser, jehož vlnová délka může být modifikována tak, aby spojila optimální absorpční vlnovou délku požadovaného P (např. 630 nm pro HpD). Vzhledem k vysoké ceně a náročné údržbě se tyto systémy však příliš nepoužívají. Daleko výhodnější jsou polovodičové diodové lasery. Jsou relativně levné, menší, mobilnější, nevyžadují externí chladicí systém a jsou spolehlivé. (25) 3.2 Mechanismus fotosenzitizace Základní způsoby, při kterých mají kombinace P, světla a kyslíku za následek smrt ve fotosenzitizované buňce, jsou ukázané na Obr. 2. P, jež jsou v základním energetickém stavu 0, mohou absorbovat viditelné světlo (fotony). P se tak dostávají do prvního elektronicky excitovaného singletového stavu 1 a následně do excitovaného tripletového stavu T 1, který přetrvává relativně dlouho. Energie excitovaných P může být uvolněna několika způsoby. Buď vyzáření ve formě tepla, emisemi fotonů ze stavu 1 (fluorescence), anebo ze stavu T 1 (fosforescence). Excitovaný tripletový stav může také předávat proton nebo elektron do biomolekul (lipidy, proteiny, K) nebo generovat radikály, jež reagují s kyslíkem za tvorby reaktivních forem kyslíku (RO). Mezi RO se počítají superoxid, hydroxylový radikál a peroxid vodíku (Obr. 2, reakce typu I). Kromě toho T 1 stav může předávat energii přímo molekulárnímu kyslíku v základním stavu v jeho přirozené 11

12 tripletové formě, jež potom tvoří neradikální, ale vysoce reaktivní singletový kyslík (Obr. 2, reakce typu II). (26) čkoliv přesný mechanismus PDT ještě není plně rozpoznán, obecně se soudí, že singletový kyslík produkovaný reakcí typu II, je primárně zodpovědný za smrt buněk. Přispění obou dvou typů reakcí ke smrti buněk závisí na několika faktorech zahrnujících vlastnosti P, subcelulární lokalizaci, substrát a přítomnost kyslíku. Za hypoxických podmínek radikály vznikající fotoreakcí typu I jsou primárně zodpovědné za senzitizaci. U okysličeného média hraje singletový kyslík nejdůležitější roli, neméně důležitý je také vliv superoxidu, hydroxylového radikálu a peroxidu vodíku. Je třeba si všimnout, že RO jsou vysoce reaktivní a mají velmi krátkou životnost. Proto pouze substráty situované velmi blízko u RO budou primárně zasaženy PDT léčbou. (18) P* H 2 O 2 O 2 * OH* Excitovaný singletový stav ( 1 ) Typ I R* P* R Tripletový stav (T 1 ) P* Typ II 1 O 2 3 O 2 P ( 0 ) Oxidativní stres Buněčné poškození Červené světlo P ( 0 ) Oprava/Přežití ekróza mrt buněk poptóza Obr. 2 Mechanismus fotosenzitizace (1) 12

13 3.3 Fotosenzitizéry Obecné vlastnosti ideálního P Mezi obecné vlastnosti ideálního P patří zejména: 1. chemická čistota, známé složení a dobrá stabilita 2. akumulace přednostně v cílové nádorové tkáni 3. minimální toxicita bez přítomnosti světla - cytotoxicita pouze po fotoaktivaci 4. vysoký kvantový výtěžek singletového kyslíku 5. vysoká absorpce - zejména v červené a dalece červené oblasti spektra (600 nm 800 nm), tato vlastnost souvisí s penetrací světla do tkáně, jež je spojena s vlnovou délkou, např. hloubka světelné penetrace při více jak 500 nm a méně než 600 nm je 8 mm (26) 6. cena, dostupnost, modifikovatelnost. (27) Typy fotosenzitizérů V současné době lze P rozdělit do tří generací. (27) Do první generace P, které byly použité v experimentální PDT, se řadí hematoporfyrin (HP) a jeho deriváty (HpD). Jako HpD jsou označované směsi mono- di- a oligomerů porfyrinů, které vykazují lepší fotosenzitizační vlastnosti. (26) (28) Látky druhé generace byly připraveny s cílem odstranit některé nevýhodné vlastnosti HpD. Patří sem látky odvozené od porfyrinů, ale i látky jiných chemických struktur. Jako třetí generace se označují P druhé generace spojené s některými biomolekulami. (27) První generace P HpD (porfimer sodný, Photofrin, Photohem, Photosan) HpD je směs produktů vzniklých z HP izolovaného z hemu. Hem je nutné zbavit centrálního atomu železa působením HBr v kyselině octové. Při tomto procesu dochází 13

14 k adici HBr na periferní dvojné vazby. Během dalšího kroku dochází ve vodném prostředí k hydrolýze bromidu za vzniku vlastního HP (viz Obr. 3). HP však není zodpovědný za vlastní PDT efekt. Ten způsobují jeho oligomerní frakce. Tyto frakce byly získány z HP působením kyseliny sírové v prostředí kyseliny octové a následnou neutralizací hydroxidem sodným. Vzniklé frakce jsou složité směsi dimerů a oligomerů, jejichž jednotky jsou spojovány buď esterovými, nebo éterovými vazbami. Tato směs byla částečně vyčištěna pomocí gelové chromatografie a stala se základem Photofrinu. (27) HO OH Oc Oc Fe 3+ I H H ii H H HOOC Hem COOH HOOC COOH Hematoporfyrin HOOC COOH OH iii HOOC HOOC H HOOC H O O H HO H O H H OH COOH COOH Obr. 3 yntéza HpD. Reakční podmínky: i) k.bromovodíková, k.octová, voda ii) k.sírová, k.octová iii) hyroxid sodný (27) Photofrin byl poprvé schválen v Kanadě v roce 1993 pro profylaktickou léčbu rakoviny močového měchýře. (26) 14

15 Jedná se směs více než 60-ti sloučenin (oligomery HP), která vykazuje špatné optické vlastnosti v červené oblasti spektra, má omezenou selektivitu pro vychytávání v nádorech a její použití je provázeno dlouhotrvajícími vedlejšími efekty, (např. dlouhodobá kožní fototoxicita). Proto se další vývoj u PDT zaměřil na přípravu alternativních P s lepšími fyzikálními, chemickými a terapeutickými vlastnostmi. (26) Druhá generace P Látky druhé generace jsou již chemicky jednotné a je možné je snadno charakterizovat. Patří sem látky ze skupiny porfyrinů, ftalocyaninů, texafyrinů, porfycenů a dalších. Porfyrinům jsou velice příbuzné chloriny a bakteriochloriny, které mají o jednu (chloriny) případně o dvě (bakteriochloriny) konjugované vazby v makrocyklickém systému méně. (27) H H H H H H Porfyrin Chlorin Bakteriochlorin Obr. 4 Rozdíl mezi porfyriny, chloriny a bakteriochloriny (27) 15

16 Temoporfin (mthpc, Foscan) Temoporfin (tetra(m-hydroxyfenyl)chlorin (Obr. 5) je zástupcem skupiny chlorinů. Byl syntetizován v roce 1989 jako jeden z řady porfyrinů, ze které se později ukázal být nejúčinnější. (29) Jeho výhodou je, že požadovaného účinku lze dosáhnout již při menší koncentraci P za použití nižších dávek světla. Díky tomu je přibližně stokrát účinnější než Photofrin. Mezi jeho nevýhody patří dlouhodobá fototoxicita a poměrně malá selektivita vychytávání mezi nádorovou a zdravou tkání. (30) I přes zmíněné nevýhody byl temoporfin v říjnu roku 2001 v Evropě zaveden k léčbě rakoviny hlavy a krku rezistentní k jiným terapiím. Zároveň probíhají klinické zkoušky v léčbě rakoviny jícnu a dysplazie u Barrettova jícnu. (31) OH HO H H OH HO Obr. 5 Temoporfin Talaporfin (Pe6, MCE) Talaporfin jako další z derivátů chlorinů má silnou absorpci při vyšších vlnových délkách (664 nm). Rychle se vylučuje z tkání a k ozáření tak může dojít 4 hodiny po intravenózní aplikaci. (32) Regrese nádoru je při nízkých dávkách světla a P pouze krátkodobá. Při vyšších dávkách je sice léčebný efekt prodloužen, ale pouze za cenu ztráty selektivity. (33) 16

17 H H HOOC HOOC H O HOOC COOH Obr. 6 Talaporfin Verteporfin (BPD-M, Visudyne TM ) Základní skelet verteporfinu je blízký porfyrinům. bsorpční maximum verteporfinu je posunuto až k vlnové délce 690 nm, při které světlo proniká dvakrát hlouběji než při 630 nm. Verteporfin je rychle absorbován nádorovou tkání, ale je z tkání a těla také velmi rychle vyloučen. Kožní fotosenzitivita proto přetrvává pouze několik dní. (34) Verteporfin se dostal do druhé fáze klinických zkoušek nemelanotických kožních nádorů. Probíhají také preklinické koušky využití verteporfinu při terapii Barrettova jícnu, při autotransplantační léčbě u nádorových onemocnění kostní dřeně. ejvětší význam verteporfinu spočívá v léčbě senilní makulární degenerace. (31) H 3 COOC H 3 COOC H H COOH COOCH 3 Obr. 7 Verteporfin 17

18 5-aminolevulinová kyselina (L, Levulan, Metvix, Hexvix, Benzvix) L je endogenní látka, která se účastní biosyntézy hemu. L je prekurzor P protoporfyrinu IX (PpIX) a sama nemůže vyvolat fotodynamický účinek. Lidské tělo může použít L k syntéze PpIX. Biosyntéza hemu je kontrolována negativní zpětnou vazbou, pří níž vysoké koncentrace hemu brání přeměně glycinu a sukcinylkoenzymu na L. Při exogenním podání L je tento kontrolní mechanismus vynechán a dochází k syntéze PpIX. Z něj pomocí ferochelatázy (enzymu, který umožní zabudování molekuly železa) vzniká fotodynamicky neaktivní hem. (27) PDT založená na L byla poprvé aplikována v roce 1990 kanaďanem Kennedym a od té doby je široce používána. Mezi výhody použití PpIX patří rychlé vyloučení z tkáně a tedy krátkodobá kožní fotosenzitivita. V současné době je L používána zejména pro léčbu některých kožních nemocí. (35) L špatně proniká do tkání z důvodu nízké lipofility. K terapii se používají její estery, které lépe pronikají do tkání. Metvix je methyl ester kyseliny 5-aminolevulinové (ML). Byl zaveden k léčbě aktinoidní keratózy v roce 2001 a později také k léčbě karcinomu bazálních buněk. Další využití je v léčbě karcinomu skvamózních buněk kůže, léčbě akné a hojení ran. Hexvix je hexyl ester kyseliny 5-aminolevulinové. Jeho použití pro detekci a léčbu rakoviny močového měchýře je ve vývoji. (27) O H H 2 OH H O 5-aminolevulinová kyselina COOH COOH Protoporfyrin IX Obr. 8 yntéza PpIX z kyseliny 5-aminolevulinové (27) 18

19 Ftalocyaniny Ftalocyaniny (Obr. 9) jsou atraktivní P pro PDT díky vhodným fotofyzikálním a fotochemickým vlastnostem. Pc je barvivo strukturně podobné porfyrinu. Pc je tvořen kruhem ze čtyř isoindolových jednotek spojených atomy dusíku (porfyrin se skládá ze čtyř pyrolových jednotek spojených methinovým uhlíkem). Pc může absorbovat světlo při vlnové délce nm, takže může penetrovat tkání hlouběji než Photofrin. Komplex Pc s kationty kovů (jako Zn-Pc, l-pc) má stabilní fyzikální a chemické vlastnosti (36) Mezi nevýhody ftalocynaninů patří vysoce špatná rozpustnost nejen ve vodě, ale i v organických rozpouštědlech. Tuto vlastnost je možné odstranit substitucí na periferii nebo začleněním do lipozómů. (37) R R M R R Obr. 9 Ftalocyanin Připojením dalšího benzenového kruhu na periferii Pc se tvoří látky typu naftalocyaninů. aftalocyaniny absorbují při vlnových délkách kolem 770 nm, což zvyšuje jejich terapeutickou hloubku. Mohou tak být použity u vysoce pigmentovaných nádorů jako je melanom. (27) 19

20 R R M R R Obr. 10 aftalocyanin Třetí generace P Třetí generaci tvoří P druhé generace spojené s některými biomolekulami umožňujícími cílenější distribuci v těle. (27) Příkladem třetí generace P mohou být Pc konjugované s biomolekulami. Vazba Pc na nosiče může upravovat jejich vlastnosti. Může zvyšovat jejich lipofilitu, zvýšením rozpustnosti v biologickém médiu může zabraňovat jejich agregaci a také může podporovat rozpoznání cílových buněk, což vede ke zvýšené biologické účinnosti. Pc se mohou konjugovat se sacharidy, s aminokyselinami nebo peptidy, s proteiny, se steroidními hormony a také s dalšími molekulami. (38) P z čínské medicíny K zisku P je možné využít také rostlinných zdrojů. edávný výzkum ukázal, že hypericin může být použit u PDT. Jde o přírodně se vyskytující pigment polycyklického chinonu produkovaný některými druhy rostlin rodu Hypericum. PDT s hypericinem jako P, byla použita k potlačení růstu nádorů. Hypericin se může specificky koncentrovat v rakovinových lézích močového měchýře a zabíjet rakovinové buňky. Předpokládá se, že za protinádorový účinek je nejvíce zodpovědné poškození nádorového cévního systému. PDT s hypericinem vyvolává zmenšení nádorů a regresi pomocí buněčné nekrózy a někdy i buněčné apoptózy. (39) 20

21 OH O OH HO HO OH O OH Obr. 11 Hypericin Kurkumin je žlutá fenolická sloučenina získávána z čínské léčivé rostliny kurkuma. Kurkuma je používána v Číně po staletí, ale její účinky proti rakovině začaly být studovány teprve před několika lety. Kurkumin může zastavit množení rakovinových buněk vyvoláním buněčné apoptózy bez ovlivnění zdravých buněk, ale tento účinek je omezen pouze na některé druhy rakoviny. edávný výzkum ukázal, že kurkumin by mohl vyvolat zřetelnou apoptózu lidských epidermálních rakovinových buněk dokonce pod normálním světlem. (39) HO MeO OMe OH Obr. 12 Kurkumin 3.4 Cíle pro PDT Existují tři hlavní mechanismy, pomocí kterých singletový kyslík a další RO přispívají k destrukci tumoru u PDT. Je to přímé buněčné poškození, poškození cévního zásobení nádoru a aktivování imunitní reakce proti nádorovým buňkám. (26) (40) (41) Míra uplatnění jednotlivých mechanismů závisí na několika faktorech, které zahrnují charakter P, jeho lokalizaci uvnitř nádoru během ozařování, dávky světelné expozice, typ nádoru a jeho cévní uspořádání. ystematicky podané P se přednostně akumulují v nádorových tkáních. Mechanismy zapojené do této selektivní akumulace ještě nejsou dobře známy, ale souvisejí s charakterem nádoru, P (náboj, velikost a struktura) a jeho způsobem podání. kumulace P v nádorových buňkách se zvyšuje s jejich lipofilitou. 21

22 Toho lze využít např. pří použití lipozomů, které zlepšují doručení P do cílové tkáně. (42) P začleněné v lipozomech jsou k cílovým nádorovým buňkám přenášeny připojením k séru proteinů, zejména nízko denzním lipoproteinům (LDL). (41) Fotopoškození nádorových buněk Při použití PDT jsou na buněčné úrovni poškozeny rozdílné organely. Komponenty cílených buněk zahrnují plasmatickou membránu, lyzozomy, mitochondrie, Golgiho aparát, endoplasmatické retikulum, jádro a také cytoskelet. ingletový kyslík má velmi krátkou životnost, proto se primární cíle PDT musí nacházet v blízkosti P, jinak nedojde k fotopoškození. Je také popsána buněčná relokalizace P během ozařovacího procesu, díky které jsou ovlivněny i sekundární cíle. Primární místo lokalizace může být rozhodující pro smrt buněk, ale efektivní poškození by nastalo v sekundárních místech, do kterých je P během ozařování přemístěn. (43) (44) Mezi faktory ovlivňující lokalizaci P se řadí chemický charakter P, fyzikálněchemické vlastnosti, způsob podání, koncentrace, inkubační doba, dávky světla a druh nádorové buňky. V tomto smyslu byla popsána mitochondriální lokalizace pro hlinité (lpc) a křemičité (Pc4) ftalocyaniny, PpIX, L, mthpc. aopak lyzozomální lokalizace byla popsána pro hypericin, zatímco zinečnaté ftalocyaniny (ZnPc) se kumulují zejména v Golgiho aparátu. (44) (45) (46) Rozlišují se tři hlavní procesy programované smrti buňky (apoptóza, nekróza a autofagie), které se vyskytují po PDT. Tyto procesy zřejmě souvisí s lokalizací P. ěkteré publikace uvádí, že P lokalizované v mitochondriích nebo v endoplazmatickém retikulu, jsou lepší induktory apoptózy než P, které jsou lokalizované v Golgiho aparátu, lyzozomech, plazmatické membráně, nebo jež zůstávají difúzně distribuovány v cytosolu. P, které zasahují plazmatickou membránu nebo lyzozomy jsou více spojené s nekrózou. (44) (45) (47) Zaměření cytoskeletu je důležitým prvkem v protirakovinové terapii zahrnující PDT, protože cytoskelet hraje významnou roli ve většině buněčných procesů (např. nádorový růst, buněčná pohyblivost, dělení a transport vezikul). Mikrotubuly (MT) a 22

23 mikrofilamenty (MF) představují primární cíle v chemoterapii s protirakovinovými sloučeninami, jako jsou vinka alkaloidy, nokodazoly a taxoidy. (48) Bylo také popsáno, že po PDT s porfyriny (Photofrin, verteroporfin), ftalocyaniny (ZnPc, lpc) a porfyceny byly poškozeny MTs. (45) (46) (49) (50) Tyto výsledky ukázaly závislost dávky a času na mikrotubulárních změnách u rakovinových buněk. (50) (51) Cévní uzávěr a imunomodulační odpověď Cévní zásobení nádoru představuje běžnou cestu pro šíření rakovinových buněk do vzdálených orgánů, stejně jako způsob získávání živin a molekulárního kyslíku nezbytného pro jejich realizaci. Proto se v současnosti léčba rakoviny zaměřuje na cévní zásobení nádoru. K cévnímu poškození přispívá u PDT P jako je Photofrin. Vyvolává vaskulární konstrikci a trombotické formace a tím omezuje kyslíkové zásobení buněk nádoru. Tyto hypoxické vaskulární efekty jsou spojeny s inhibicí nebo zpomalením růstu tumoru. (40) (52) (53) (54) Fototerapie s verteporfinem zaměřující se na cévní uspořádání je v současné době používána u věkově závislé makulární degenerace. (55) Poškození endoteliálních buněk v léčeném nádoru aktivuje kaskádu událostí, které vedou k dilataci řečiště, agregaci krevních destiček, místnímu zánětu a má také modulační efekt na imunitní systém. Vyvolané akutní cévní poranění má za následek smrt neoplastických buněk. ekrotické a apoptické buňky jsou rychle odstraňovány pomocí granulocytů a makrofágů. Mrtvé buňky mohou stimulovat mikroprostředí nádorů, které přispívá k aktivaci dalších faktorů. Jsou to cévní endoteliální růstový faktor, COX 2, prostaglandiny, tumor-nekrotizující faktor a cytokiny. Zatímco rakovinové terapie jako chemoterapie jsou imunosupresivní a jsou známé pro svou toxicitu vůči kostní dřeni, PDT společně s jinými lokálními rakovinovými terapiemi (kryoterapie, hypertermie) může imunitní systém aktivovat. (52) (53) 23

24 3.5 PDT a léčba rakoviny Pomocí PDT bylo s dobrými výsledky léčeno mnoho onkologických pacientů. Mnoho publikovaných studií zdůrazňuje důležitost PDT pro léčbu endoskopicky přístupných nádorů. elektivita PDT vyplývá z přednostní lokalizace (netoxického) P v cílené tkáni a ze skutečnosti, že pouze ozářené oblasti budou zasaženy. Photofrin byl schválen pro léčbu časného a pokročilého stadia rakoviny plic, pro povrchovou rakovinu žaludku, adenokarcinom jícnu, rakovinu krku a rakovinu močového měchýře. Chlorinový derivát temoporfin byl také schválen v EU pro paliativní léčbu rakoviny hlavy a krku. (56) Topické aplikace P byly schváleny pro léčbu jak nádorových tak jiných proliferativních kožních onemocnění. (57) I přes stále probíhající výzkumy představuje již dnes PDT efektivní pomocnou léčbu, která vede k prodloužení přežití nebo zlepšení kvality života pacienta. Vzrůstající zájem o nové P a jejich užití pro terapii rakoviny rozšířilo PDT aplikace do ostatních oborů medicíny, zejména oftalmologie a dermatologie. (40) (55) PDT a nemelanomatózní rakovina kůže Další možné využití nachází PDT v klinické dermatologii pro léčbu nemelanomatózních rakovin kůže (MC). MC jsou nejčastější zhoubné nádory vyskytující se u bílé populace v Evropě, U, ustrálii a Kanadě. Její výskyt se od roku 1960 celosvětově stabilně zvyšuje v měřítku o 3-8 % za rok. (58) Pokud je MC včas léčena, má dobré prognózy. L a ML jsou dva topické P, které se používají u PDT při MC. PDT bylo již úspěšně použito u Bowenovi nemoci a u bazálního karcinomu buněk (BCC). (57) (59) (60) Chirurgie stále zůstává standardem a nejčastější volbou při léčbě BCC, ale i PDT je považována za efektivní a spolehlivou terapii pro rozsáhlé mnohonásobné nebo extenzivní léze a pro léze u imunosuprimovaných pacientů. (57) (61) ktinický zánět rtu, extramamární Pagetova nemoc, Kaposiho sarkom, paliativní kožní metastáze a také pacienti s Gorlinovým syndromem také začínají být léčeni pomocí PDT. (62) (63) 24

25 3.5.2 Psoriasis vulgaris V literatuře je také popsané využití PDT v léčbě lupénky. apř. Bissonet podal orálně L psoriatickým pacientům a hodnotil fluorescenci PpIX u poškozené i normální kůže. Boehncke zkoumal spojení PDT s červeným světlem. Bylo prokázáno, že systematická PDT vyvolává apoptózu u postižených T lymfocytů u psoriatického povlaku. (64) 25

26 4 Metodická část 4.1 yntéza nesymetrických ftalocyaninů Ftalocyaniny (Pc) jsou 18 π-elektronové aromatické makrocykly tvořené čtyřmi isoindolovými jednotkami spojenými pomocí dusíkového můstku v polohách 1 a 3. Částečná dvourozměrná π elektronová delokalizace u těchto makrocyklů je příčinou značného množství unikátních fyzikálních vlastností. Pc jsou chemicky a tepelně stabilní sloučeniny, jež mají výjimečné optické a elektrické chování. Pro tyto důvody nacházejí široké uplatnění v oblastech výzkumu materiálů. Pc jsou schopné kompletovat ve svém centru více než 70 odlišných kovových a nekovových kationtů. (65) Výhoda Pc nad ostatními běžnými třídami barviv je, že jejich fotofyzikální vlastnosti jsou snadno měnitelné pomocí výměny centrálního kationtu. apříklad Zn, i, Mg, a l kovové Pc jsou silně fluorescenční, zatímco Ru Pc jsou fosforescenční (66) a Cu Pc nemají významnou luminiscenci. (67) Je také možné obměnit širokou škálu substituentů na periferii makrocyklů. Pokud jsou tyto skupiny objemné nebo se jedná o dlouhé alifatické řetězce, můžou sloužit ke zvýšení rozpustnosti ftalocyaninů v běžných organických rozpouštědlech. (68) truktura azaanalogů ftalocyaninů (azaftalocyaniny, zapc) je odvozena od Pc izosterní náhradou methinové skupiny (-CH=) v benzenových podjednotkách dusíkovými atomy. (69) Příprava nesymetricky substituovaného Pc je uskutečněna smíšenou kondenzací dvou rozdílných ftalonitrilů. Je získána směs sloučenin a požadovaný Pc musí být izolován nejčastěji pomocí chromatografických technik. Tato neselektivní metoda obvykle vede k malým výtěžkům požadovaného nesymetrického Pc, a proto bylo provedeno již mnoho pokusů jak vyřešit tento problém. Centrálně nesymetrický Pc lze také získat použitím nesymetricky substituovaného prekurzoru, například monosubstituovaného ftalonitrilu. V takovýchto případech vede reakce ke směsi polohových izomerů, které ukazuje Obr. 13. (70) 26

27 Obr. 13 Polohové izomery vzniklé cyklizací nesymetrického prekurzoru (65) tatistická směs těchto čtyř izomerů by mohla obsahovat 12,5% D 2h izomeru, 12,5 % C 4h izomeru, 25% C 2v a 50% C s izomeru. (70) Tato skutečnost byla prvně rozpoznaná Linsteadem v roce 1936 v průběhu studií na syntéze 1,2-naftalocyaninu a vedla organické chemiky k oddělení a popsání každého izomeru a k navržení selektivních syntetických cest. První přímé pozorování existence ftalocyaninových konstitučních izomerů bylo dosaženo pomocí protonové MR spektroskopie v roce 1985 Wöhrlem a spolupracovníky. (71) 27

28 4.1.1 yntéza 3B ftalocyaninů Pc 3 B jsou složené ze tří jednotek a jedné B jednotky. Tyto Pc lze získat různými selektivními mechanismy, které se liší použitím různých prekurzorů a reakčních podmínek. (69) tatistická kondenzace ejsnadnější metoda přípravy Pc nesoucích různé substituenty je smíšená kondenzace dvou odlišně substituovaných prekurzorů. V principu se jedná o neselektivní metodu, ze které vychází směs šesti sloučenin, které ukazuje chéma 1. C C + C B C metal salt, base high boling point alcohol B B B M M M B B 4 B 4 2 B 2 B B B B M M M B B B 3 B B (B) 3 2 chéma 1 tatistická kondenzace (72) Protože se jedná o neselektivní metodu, vyžaduje použití chromatografických technik k izolaci požadovaného makrocyklu. eparace statistických směsí jsou obtížné, vzhledem k tendenci Pc molekul agregovat. (73) (74) (75) (76) (77) (78) 28

29 by se přednostně tvořil 3 B derivát, musí být použity přiměřené stechiometrické poměry reaktantů a B. tatistická kondenzace předpovídá, že reakce mezi dvěma odlišnými ftalonitrilovými deriváty stejné reaktivity v poměru 3:1 poskytne směs produktů v následujících procentech: 4 33%, 3 B 44%, a ostatní produkty kondenzace 23%. Obecně při použití molárního poměru 3:1 je možné získat požadované sloučeniny ve výtěžcích od 10 do 20%. (73) (74) (75) (76) (77) (78) Je vždy lepší použít ftalonitrily s odlišnou charakteristikou rozpustnosti, což může dovolit separaci nesymetrických Pc na základě rozdílných rozpustností sloučenin přítomných ve výsledné statistické směsi. Vložení tercbutylových skupin nebo uhlovodíkových řetězců na 3,6 pozice jedné z výchozích sloučenin (obvykle jeden použit v nadbytku) usnadňuje izolaci 3 B produktů, protože tyto substituenty poskytují Pc rozpustnost a nepodporují agregaci makrocyklů. McKeown také ukázal, že výborná chromatografická separace může být dosažena s komplexní směsí Pc majících odlišný stupeň alkyl a oligo(oxyethylen) substituce vzhledem k odlišným polaritám těchto dvou typů postranních řetězců. (79) (80) (81) Cook a spolupracovníci obvykle používali 3,6-disubstituované ftalonitrily () v poměru 9:1 s ohledem na druhý ftalonitril (B). Tento poměr vede ke zvýšení množství 4 a snižuje množství požadovaného 3 B, ale žádné další produkty statistické kondenzace se netvoří a požadována sloučenina ( 3 B) může být snadno separována z této jednoduché směsi. (82) (83) Tento stechiometrický poměr 9:1 je také užitečný, když B je reaktivnější než. (65) Proces, který redukuje množství možných Pc a potlačuje agregaci mezi nimi, vyžaduje použití ftalonitrilů () nesoucího objemné a rigidní skupiny, například fenyl ve 3,6 pozici, ve spojení s jiným ftalonitrilem postrádajícím objemné substituenty (B). (65) ubftalocyaninová metoda Originální metoda pro selektivní syntézu nesymetricky substituovaných Pc typu 3 B, vyvinutá v letech 1980 Kobayashim a kolektivem, se týká kruhové expanze subftalocyaninu (ubpc)(obr. 14) jeho reakcí se sukcinimidem nebo diiminoisoindolem. (69) 29

30 Obr. 14 ubftalocyanin (84) ubftalocyaninového jádro vykazuje geometrické pnutí. Díky němu je jádro lehce štěpitelné za přítomnosti diiminoisoindolové jednotky, která je začleněná do vlastního systému tak, aby vytvořila Pc derivát typu 3 B. Tato reakce se ukázala být velmi selektivní a účinná a také dovolila syntézu Pc, které před tím nebyly dostupné. (85) (86) Výsledek této syntetické metody závisí zejména na reakčních podmínkách. Typická kruhová expanze je dosažena přidáním 6 až 9 molárního přebytku diiminoisoindolinového derivátu do roztoku ubpc v DMO/1-chlornaftalenu nebo dichlorbenzenu (1:4 až 4:1), nebo,-(dimethylamino)ethanolu, a ponechání reakční směsi při C po dobu 5-12 hodin. Požadované nesymetricky substituované Pc jsou získány ve výtěžcích v rozmezích od 3-90%. (85) Wöhrle a kolektiv dokázal, že přidání kovu do reakční směsi zvyšuje výtěžky požadovaných 3 B nesymetricky substituovaných Pc a ostatních produktů. ubpc mohou reagovat s méně reaktivními ftalonitrilovými deriváty za přítomnosti silné báze jako je 1,8- diazabicyklo(5.4.0)undec-7-en (DBU), dávající vznik dobrým výtěžkům 3 B Pc. (87) 30

31 chéma 2 yntéza Pc subftalocyaninovou metodou (65) Metoda s využitím pevné fáze Další metoda pro selektivní přípravu 3 B Pc, vyvinutá převážně Leznoffem, je syntéza na pevné fázi. (88) (89) (90) Tato metoda vyžaduje přípravu přiměřeně substituovaného ftalonitrilu (B) vázaného na polymerní pevné fázi. K tomuto ftalonitrilu B, může být přidán jiný, odlišně substituovaný volný ftalonitril (), dávající vzniknout 3 B Pc. Ten může být snadno oddělen od 4 makrocyklu vymytím pomocí vhodného rozpouštědla. Požadované 3 B Pc jsou následně odštěpeny z vazby na polymer. Leznoff a kolektiv používal zejména polymery s připojenými alkoholovými skupinami. (88) (89) Výtěžek nesymetricky substituovaného Pc je okolo 20-25%. (90) 31

32 Linker + B C C B C C B C C + C C MX 2 lkohol B M + M 3 B 4 Vymytí symetrického 4 M B M 4 3 B M - kov pevná fáze chéma 3 yntéza Pc s využitím pevné fáze (72) 32

33 5 Experimentální část Teploty tání byly stanoveny na digitálním přístroji pro stanovování teplot tání ELECTROTHERML I9200 a nejsou korigovány. Průběh reakcí a čistota produktů a meziproduktů byly kontrolovány tenkovrstvou chromatografií na deskách Merck ilikagel 60 F254. Detekce byla prováděna světlem vlnové délky 254 nm a 366 nm. Vyvíjecí soustavy jsou uvedeny u jednotlivých reakcí. loupcová chromatografie byla prováděna na silikagelu Merck Kieselgel 60 (0,040-0,063 mm). Infračervená spektra (IČ) byla měřena IČ spektrofotometrem ICOLET IMPCT 400 na KOCH FaF UK v Hradci Králové. Vlnočty jsou uvedeny v cm -1. MR spektra byla měřena na přístroji VRI MERCURY VxBB 300 na KOCH FaF UK v Hradci Králové. Měření bylo prováděno při frekvenci 299,95 MHz ( 1 H MR) a 75,43 MHz ( 13 C MR). Posuny jsou vztaženy k vnitřnímu standardu i(ch 3 ) 4. pektrum ve viditelné oblasti bylo změřeno na přístroji HIMDZU UV 2401 PC: UV-VI recording spectrophotometer. MLDI-TOF hmotnostní spektra byla měřena na hmotnostním spektrometru Voyager-DE TR (pplied Biosystems, Framingham, M, U). ěkteré výchozí látky pro syntézu byly již dříve připraveny na KFCHKL podle publikovaných postupů: 2,3-dikyanochinoxalin-6-karboxylová kyselina (91) butylester 2,3-dikyanochinoxalin-6-karboxylové kyseliny (92) 33

34 Cl Cl C C + H ah - H 2 1 C C chéma 4 yntéza prekurzoru 1 C HOOC C C C chinolin Zn(CH 3 COO) 2 Zn 4 COOH chéma 5 Příprava nesymetrického Pc (4) metodou cyklizace s octanem zinečnatým v chinolinu C H 9 C 4 OOC + C 1 3 C C 1. Li, butanol 2. Zn(CH 3 COO) 2 Zn 5 COOC 4 H 9 chéma 6 Příprava nesymetrického zinečnatého Pc (5) pomocí butanolátu lithného HOOC 2 C C + Mg HOOC Mg 6 COOH HOOC COOH chéma 7 yntéza symetrického Pc (6) 34

35 C HOOC + C 1 2 C C + butanol Mg 1. k. p-toluensulfonová 2. Zn(CH 3 COO) 2 Mg 7 COOH Zn 4 COOH chéma 8 yntéza asymetrického hořečnatého Pc (7) a zinečnatého Pc (4) 5.1 Příprava 4,5-bis(terc-butylsulfanyl)ftalonitrilu (1) C C Hydrid sodný v minerálním oleji (2,28 g, 0,057 mol) jsem dala do zábrusové baňky se dvěma vývody a promyla benzínem pod argonem, aby se odstranil olej. echala jsem usadit a poté dekantovala. To samé jsem opakovala ještě jednou. Do baňky s ah jsem přidala 100 ml bezvodého DMF. Poté jsem velmi opatrně pod argonem injekční stříkačkou přidávala 2-methylpropan-2-thiol (5,64 ml, 0,0501 mol). Přídavek 2-methylpropan-2- thiolu jsem prováděla velmi opatrně, protože se z reakce uvolňoval H 2. Po ukončení vývoje H 2 jsem do reakce přidala 4,5-dichlorftalonitril (4,5 g, 0,0228 mol) a oxid měďný (6,51 g, 0,0458 mol), který slouží v reakci jako katalyzátor. Baňku jsem dala do lázně a zahřívala za stálého míchání při 90 C po dobu 30 minut v inertním prostředí argonu. Po 30 minutách jsem baňku sejmula z aparatury a nechala při pokojové teplotě míchat 35

36 dalších 30 min. Obsah jsem přelila do kádinky s 200 ml destilované vody s ledem. Vzniklou sraženinu jsem přefiltrovala přes skládaný filtr. Filtrát jsem 3 protřepala chloroformem (3 150 ml). Produkt na filtračním papíře jsem 3 extrahovala do chloroformu. Vytřepaný podíl a extrakt z filtračního papíru jsem spojila a podrobila sloupcové chromatografii s mobilní fází chloroform/toluen 2:1. Čisté frakce produktu jsem odpařila a překrystalizovala z benzínu. Vyrobila jsem 1,49 g 4,5-bis(terc-butylsulfanyl)ftalonitrilu (1) což činí výtěžek 20%. T. t. 157,5-158 C (methanol) (lit. (91) C). Elementární analýza: alezeno: C 62,81, H 6,50, 8,83 %. Vypočítáno pro C 16 H : C 63,12; H 6,62; 9,20 %. 1 H MR (CDCl 3 ) δ 1.44 (s, 18H, CH3), 7.86 ppm (s, 2H, aromh). 13 C MR (CDCl 3 ) δ 30,9; 49,6; 112,5; 115,2; 136,9; 146,9 ppm. 5.2 Příprava zinečnatého ftalocyaninu (4) metodou cyklizace s octanem zinečnatým v chinolinu Zn COOH avážila jsem 2,3-dikyanochinoxalin-6-karboxylovou kyselinu (2) (22 mg, 0,098 mmol), prekurzor 1 (0,09 g, 0,00298 mol) a octan zinečnatý (0,514 g, 0,0028 mol). Vše jsem smíchala v kádince. Obsah kádinky jsem nasypala do baňky s čerstvě předestilovaným chinolinem, přidala míchadlo a vše ponořila do parafinové lázně zahřáté na 130 C. Pod zpětným chladičem jsem zahřívala asi hodinu. Po zhruba hodině zahřívání nenastala žádná změna, tento způsob přípravy nefunguje. 36

37 5.3 Příprava zinečnatého Pc (5) za použití butanolátu lithného. Zn COOC 4 H 9 avážila jsem prekurzor 1 (0,0906 g, 0,0003 mol) a butylester 2,3- dikyanochinoxalin-6-karboxylové kyseliny (3) (0,028 g, 0,0001 mol) a vše dala do varné baňky. Varnou baňku jsem dala pod zpětný chladič a přidala čerstvě předestilovaný butanol. Po chvilce zahřívání v glycerinové lázni při 130 C jsem přidala vrchem chladiče kovové lithium (0,0196 g, 0,0028 mol). Po přidání lithia ihned došlo k reakci, směs se zbarvila zeleně. měs jsem zahřívala v lázni při stejné teplotě asi 2 hodiny a poté jsem přidala bezvodý octan zinečnatý (0,732 g, 0,004 mol). Po dvou hodinách zahřívání jsem baňku sejmula z lázně, nechala vychladnout a odpařila rozpouštědla na vakuové rotační odparce. Poté jsem do baňky přidala 50% kyselinu octovou a míchala při pokojové teplotě 30 minut. Vzniklý produkt jsem seškrabala ze stěn a přefiltrovala přes fritu. Produkt jsem rozpustila v chloroformu a zkusila TLC v soustavě chloroform/ethyl-acetát 20:1. Dle TLC mají ale všechny kongenery stejné R f a nedělí se od sebe. 37

38 5.4 Příprava symetrického hořečnatého Pc (6) HOOC COOH Mg HOOC COOH Hořčík (0,168 g, 0,024 mol) jsem dala do varné baňky spolu s míchadlem a čerstvě předestilovaným bezvodým butanolem a pod zpětným chladičem zahřívala cca tři hodiny při 130 C. Po třech hodinách jsem do směsi přidala prekurzor 2 (0,224 g, 0,001 mol) a celou směs zahřívala cca 24 hodin. Poté jsem na vakuové rotační odparce odpařila butanol a přidala 50% kyselinu octovou a míchala půl hodiny. Obsah baňky jsem odsála a promyla dostatečným množstvím vody a následně acetonem, pyridinem a etherem. Poté jsem filtrační koláč převedla do Erlenmayerovy baňky a přidala 50 ml 5% kyseliny chlorovodíkové a suspenzi jsem rozdrobnila za pomocí ultrazvuku. uspenzi jsem zfiltrovala a následně rozpustila v hydroxidu sodném. Roztok jsem přefiltrovala přes filtr. Filtrát jsem okyselila roztokem HCl a vypadlou sraženinu odfiltrovala a promyla vodou a vysušila. Výsledný produkt nebyl, bohužel, v ničem rozpustný a proto jsme nebyli schopni jej analyzovat. 5.5 Příprava asymetrického hořečnatého Pc (7) Mg COOH 38

39 Do varné baňky jsem navážila Mg (0,672 g, 0,028 mol) a přidala čerstvě předestilovaný bezvodý butanol spolu s malým krystalkem jodu. měs jsem zahřívala pod zpětným chladičem asi tři hodiny. Po třech hodinách jsem přidala prekurzor 1 (0,906 g, 0,003 mol) a prekurzor 2 (0,224 g, 0,001 mol) a opět zahřívala. Po čtyřech hodinách zahřívání jsem odpařila butanol a produkt míchala 30 minut v 50% kyselině octové. Vzniklou sraženinu jsem přefiltrovala a promyla vodou. Filtrační papír s produktem jsem kvantitativně převedla do baňky a rozpustila v chloroformu. Zkusila jsem tenkovrstvou chromatografii v soustavě chloroform/pyridin 2:1 (R f Pc 7 je 0,67). Poté jsem chloroformový roztok přefiltrovala a filtrát odpařila a získala 1,3144 g směsi Pc. Do suchého produktu jsem přidala 100 ml chloroformu a rozdělila na dvě části. Dvě třetiny jsem nechala na přípravu Pc 4 (viz dále). Jednu třetinu (0,4151 g) jsem podrobila přečištění na sloupcové chromatografii. Jako vyvíjecí soustavu jsem použila chloroform/pyridin 8:1. Po odpaření rozpouštědla z frakcí obsahujících čistý produkt jsem pevnou látku promyla benzínem a vysušila. Zisk 51 mg Pc 7, což činí výtěžek 14%. (Elementární analýza: alezeno: C 59,11; H 5,87; 11,35 %. Vypočítáno pro C 59 H 64 Mg 10 O H 2 O: C 59,16, H 5,72, 11,69 %.) IČ (KBr) ν max 2961, 1896, 2861, 1718w (C=O), 1596, 1483, 1472, 1390, 1365, 1240, 1163, 1099, 1067, 942, 785, 752, 697. UV-vis (pyridin) λ max (ε) 724 (116100), 705 (115100), 669 (34000), 549sh, 637 (27700), 374 (81600). 1H MR δ H ([D5]-pyridin) 1.54 (s, 9H, CH3), 1.56 (s, 9H, CH3), 1.66 (s, 18H, CH3), 1.67 (s, 18H, CH3), 8.96 (d, 1H, J=9 Hz, arh), 9.02 (d, 1H, J=9Hz, arh), 9.97 (s, 1H, arh), 10,12-10,25 ppm (m, 6H, arh). 13 C MR δ C ([D5]-pyridin) 31,4; 48,7; 48,8; 131,08; 131,15; 131,22; 131,44; 132,70; 133,76; 134,68; 138,81; 138,88; 138,97; 141,53; 141,67; 142,33; 142,38; 142,89; 142,95; 142,98; 145,18; 151,07; 151,34; 154,31; 154,48; 155,29; 155,42; 155,64; 155,70; 168,55 ppm (některé signály byly překryty signály rozpouštědla nebo vykazovaly stejný chemický posun). MLDI-TOF m/z 1161 [M+H] +, 1105 [M-C 4 H 8 +H] +, 1049 [M-2 C 4 H 8 +H] +, 993 [M-3 C 4 H 8 +H] +, 937 [M-4 C 4 H 8 +H] +. 39

40 5.6 Příprava zinečnatého Pc (4) Zn COOH Dvě třetiny chloroformového roztoku z předchozí reakce (0,8993 g) jsem odpařila na rotační vakuové odparce. Rozpustila jsem ve směsi chloroformu/thf 1:1 (80 ml) a přidala jsem kyselinu p-toluensulfonovou (1,4239 g, 7,494 mmol) rozpuštěnou v THF (20 ml). měs jsem míchala při pokojové teplotě jednu hodinu. Po hodině jsem odpařila rozpouštědla na vakuové rotační odparce. Produkt jsem promyla vodou, přefiltrovala přes skládaný filtr a filtrační papír jsem následně promyla metanolem. Bezkovový Pc jsem rozpustila v pyridinu, přidala jsem octan zinečnatý (1,3720 g, 7,497 mmol) a zahřívala pod zpětným chladičem při 130 C asi 4 hodiny. Po 4 hodinách jsem odpařila rozpouštědla na vakuové rotační odparce. Produkt jsem rozpustila v chloroformu a třikrát vytřepala 1% HCl a následně třikrát vodou. Do oddělené organické fáze jsem přidala sušidlo síran sodný a nechala chvíli stát. Po přefiltrování a odpaření rozpouštědla jsem produkt čistila pomocí sloupcové chromatografie se soustavou chloroform/pyridin 3:1. Během čištění jsem změnila soustavu na chloroform/pyridin 1:1. Postupně jsem odebírala jednotlivé frakce, které jsem odpařila na vakuové rotační odparce. Oddělily se dvě frakce: nejprve symetrický Pc typu 4 a poté požadovaný Pc 4. ymetrický 4 jsem promyla metanolem a přefiltrovala přes fritu a nechala vyschnout. Množství vyrobeného 4 je 0,20 g což činí výtěžek 25%. Množství požadovaného Pc 4 je 0,085 g což činí výtěžek 11 %. (Elementární analýza: alezeno: C 57,17, H 5,49, 11,18 %. Vypočítáno pro C 59 H O 2 6 Zn+2H 2 O: C 57,20, H 5,53, 11,30 %.) IČ (KBr) ν max 2960, 2895, 2861, 1708w (C=O), 1595, 1487, 1390, 1373, 1239, 1163, 1102, 1065, 942, 784, 746, 694. UV-vis(pyridin) λ max (ε) 726 (139400), 704 (128100), 669 (39000), 636 (31200), 540sh, 377 (86200). 1 H MR δ H ([D5]-pyridin) 40

41 1.53 (s, 9H, CH3), 1.56 (s, 9H, CH3), 1.69 (s, 18H, CH3), 1.70 (s, 18H, CH3), 8,97 (s, 2H, ar H), 9.92 (s, 1H, arh), ppm (m, 6H, arh). 13 C MR δ C ([D5]-pyridin) 31,43; 48,70; 48,73; 48,90; 130,52; 130,66; 131,13; 132,41; 133,79; 137,99; 138,11; 138,27; 141,54; 141,75; 142,57; 142,65; 143,08; 143,34; 143,46; 145,26; 150,86; 154,45; 154,62; 155,31; 155,43; 155,64; 155,70; 168,51 ppm (některé signály byly překryty signály rozpouštědla nebo vykazovaly stejný chemický posun).mldi-tof m/z 1201 [M+H] +. 41

42 6 Výsledky a diskuze Základní molekula ftalocyaninů má planární strukturu. Proto tyto látky mají tendenci k agregaci a tvorbě dimerů. gregace snižuje jejich rozpustnost, ztěžuje jejich separaci a čištění na chromatografické koloně. Z toho důvodu se na periferii musí zavést objemné substituenty, které brání agregaci tím, že se uspořádají nad a pod rovinu molekuly. Jako objemný substituent jsem použila terc-butylsulfanylovou skupinu. Jako další skupinu na periferii jsem zavedla karboxylovou skupinu, která se zdá být nejlepším substituentem pro další použití. Umožňuje vazbu na další molekuly. Důležitou roli hraje také přítomnost centrálního kovu. Zinečnaté Pc mají delší životnost tripletového stavu a vyšší kvantové výtěžky singletového kyslíku. Při syntéze prekurzoru jsem vycházela z 2-methylpropan-2-thiolu a 4,5- dichlorftalonitrilu. ukleofilní substitucí jsem připravila 4,5-bis(terc-butylsulfanyl) ftalonitril (1) s výtěžkem 20%. Metoda popsaná v literatuře Choiim a kolektivem uvádí výtěžek 93% u podobných n-butylsulfanyl derivátů (92). Její aplikace u těchto látek ovšem vedla dříve v naší laboratoři k úplně jiným látkám (94). Připravený prekurzor 1 jsem podrobila cyklizaci metodou statistické kondenzace s prekurzorem 2. Vycházela jsem z předpokladu, že výchozí substituenty jsou stejně reaktivní a proto jsem je použila v poměru 3:1. yntézu požadovaného zinečnatého Pc 4 jsem prováděla nejprve metodou cyklizace s octanem zinečnatým v prostředí chinolinu. Bohužel tato reakce nevedla k přípravě Pc 4, nedetekovala jsem přítomnost žádného Pc. Jinou metodou cyklizace je použití butanolátů. V případě podobných, ale azaftalocyaninových derivátů, byla v naší laboratoři zjištěna silná vazba vzniklých produktů na silikagel, což vedlo k velice špatné separaci. Pravděpodobnou příčinou mohla být karboxylová skupina. Proto jsem do prvního pokusu o cyklizaci tímto způsobem použila ester 3 s myšlenkou hydrolýzy esterové vazby po izolaci požadovaného Pc 5. Jak se ale ukázalo, tak nedocházelo k separaci produktů statistické kondenzace a R f hodnoty Pc 5 byly shodné se symetrickým Pc typu 4. V souběžně prováděných pokusech 42

43 s analogickými azaftalocyaninovými analogy se nepodařilo esterovou vazbu hydrolyzovat, a proto jsem se o ni ani nepokoušela a tato metoda cyklizace byla zavržena. Při další syntéze jsme využili cyklizaci pomocí butanolátu hořečnatého, která se v naší laboratoři již dříve osvědčila jako efektivní. yntéza hořečnatého Pc 7 probíhala bez větších obtíží, ty nastaly až u čištění sloupcovou chromatografií. Jako mobilní fázi jsem použila chloroform/pyridin 8:1. První zelená frakce ( 4 ) se oddělila, ale požadovaný produkt 7 se zachytil na startu. Zkoušela jsem změnit soustavu nejdřív na chloroform/pyridin 6:1 potom na 2:1 nakonec na samotný pyridin a ještě pyridin/metanol 5:1. Produkt jsem nakonec získala ve výtěžku 14 %. Tato sloučenina je velmi dobře rozpustná v běžných organických rozpouštědlech jako je aceton, chloroform, pyridin, toluen, DMF a THF. Při syntéze Pc 4 jsem dále vycházela z Pc 7. U Pc 7 lze snadno centrální hořečnatý kationt odstranit pomocí silnější kyseliny. V mém případě jsem použila kyselinu p- toluensulfonovou. Zinečnatý Pc 4 jsem připravila pomocí octanu zinečnatého ze vzniklého bezkovového Pc. Doba reakce byla asi 2 hodiny. Výtěžek Pc 4 touto metodou je 11%. U této sloučeniny byly později na KFCHKL měřeny další vlastnosti a látka vykázala velmi slibné fotofyzikální vlastnosti (Q-pás absorpce při 726 nm, ε = M -1 cm -1 ), které umožňují silnou absorpci světla při vyšších vlnových délkách, kde je pronikání světla přes lidské tkáně hlubší. Tato sloučenina vykazuje také velmi vysoký kvantový výtěžek singletového kyslíku (Φ Δ = 0,80), který zajišťuje efektivní fotosenzitizaci. Vzhledem k objemným periferním substituentům, vykazuje Pc 4 dobrou rozpustnost v organických rozpouštědlech a nízký stupeň agregace. Jedna karboxylová skupina v konečné struktuře Pc 4 umožňuje navázání na možné nosiče. Tato sloučenina je vhodná pro vazbu k cílovým strukturám a tvoří vysoce aktivní část P třetí generace. Vzhledem k tomu, že jsme chtěli zkoumat také vlastnosti tetrachinoxalinoporfyrazinového jádra, plánovala jsem připravit také sloučeninu 6. U syntézy této sloučeniny 6, jsem vycházela z prekurzoru 2, který byl cyklen také pomocí butanolátu hořečnatého. yntéza probíhala bez větších problémů. Jako největší problém se ukázala rozpustnost Pc 6. Vzniklá sloučenina se ukázala jako nerozpustná, s největší 43