Pavlína Tinavská Laboratoř imunologie, Nemocnice České Budějovice

Transkript

1 Pavlína Tinavská Laboratoř imunologie, Nemocnice České Budějovice

2 nízce agresivní lymfoproliferativní onemocnění základem je proliferace a akumulace klonálních maligně transformovaných vyzrálých B lymfocytů charakteristický imunofenotyp: CD19+CD5+CD23+CD20 low CD22+CD200+ bez exprese lehkých povrchových řetězců kappa i lambda postupný vzrůst počtu lymfocytů je způsoben nekontrolovanou klonální proliferací, poruchou jejich zániku, dlouhověkostí

3 nejčastější leukémie v Evropě a Severní Americe % všech leukémií incidence v Evropě 3/ obvyklá je u starší populace, zřídka u lidí mladších 50-ti let, 2x častější u mužů, nepostihuje děti choroba má dlouhé, roky až desetiletí trvající bezpříznakové období jediným znakem nemoci je lymfocytóza v periferní krvi i kostní dřeni

4 klinické příznaky až při pokročilejším stadiu onemocnění (při vyšší mase maligních buněk) teploty neinfekčního původu zvýšené noční pocení úbytek na váze anémie a trombocytopenie s krvácivými příznaky zvětšení uzlin a sleziny infiltrace nelymfatických orgánů deficit T buněčné imunity zvýšená náchylnost k častějším virovým infekcím

5 3 typy B-CLL typická (malé uniformní vyzrálé lymfocyty, < 10 % atypických lymfocytů) smíšená B-CLL/B-PLL (11 51 % prolymfocytů) atypická (> 10 % atypických lymfocytů, < 10 % prolymfocytů) heterogenní onemocnění s vysoce variabilní prognózou klinická kritéria pro klasifikaci stupně pokročilosti onemocnění tumorózní masa rychlost progrese onemocnění senzitivita k chemoterapii 2 systémy dle Raie a Bineta

6 Rai 0 Lymfocytóza přes A I Lymfocytóza, lymfadenopatie B Binet Postižení méně než 3 lymfoidních oblastí* Postižení více než 3 lymfoidních oblastí II III IV Lymfocytóza, hepatosplenomegalie C Anémie nebo trombocytopénie Lymfocytóza, anémie Lymfocytóza, trombocytopénie *lymfoidní oblast: uzliny krční, axilární, linguinální, slezina, játra na základě systémů klinického stagingu nelze přesně předpovědět prognózu jednotlivých pacientů zejména v časných stadiích tohoto onemocnění

7 přesnější a časnější stratifikace tohoto onemocnění pomocí biologických prognostických ukazatelů Cytogenetické aberace pozitivní x negativní prognostické markery Del 13q ovlivnění exprese anti-apoptického proteinu Bcl-2 Trisomie chromozómu 12 atypická morfologie lymfocytů Del 17p rychlá progrese nemoci, špatná odpověď na léčbu Del 11q změny v signálních drahách zprostředkovanými některými supresorovými geny (p53)

8 Sérové prognostické markery b 2 mikroglobulin sérová CD23 (> 2700 U/ml) thymidin kináza (stk) Molekulární prognostické markery exprese CD38 mikro RNA na 13 chromozómu Bcl-2 gen inhibice apoptózy mutační status genů pro variabilní části těžkých řetězců imunoglobulinů (IgVh) ZAP70 (70 kda zeta asociovaný protein)

9 vysoká prognostická hodnota postačující k určení prognózy pacienta mutované IgVh geny se liší od sekvence odpovídající zárodečné linie o více než 2 % (s homologií se zárodečnou linií < 98 %) = pozitivní MS nemutované IgVh (s homologií se zárodečnou linií >98 %) = negativní MS běžné používání v diagnostice a určování prognózy u nemocných s B- CLL naráží na časovou a technickou náročnost provedení tohoto vyšetření zástupné markery technicky i finančně dostupnější jedním z genů, které umožňují odlišit mutovanou a nemutovanou formu B-CLL je gen pro ZAP-70

10 zeta asociovaný protein o molekulové hmotnosti 70 kda gen pro ZAP-70 na dlouhém rameni 2. chromozómu tyrozinkináza složená ze 3 funkčních jednotek normálně exprimována v cytoplazmě T lymfocytů a NK buněk je součástí TCR a hraje zásadní roli v T- buněčné signalizaci vedoucí k aktivaci T lymfocytů

11 u normálních B lymfocytů není ZAP-70 exprimován exprese v maligních lymfocytech B-CLL vysoce koreluje s nemutovanou formou tohoto onemocnění je prokázána souvislost mezi vyšší hladinou exprese ZAP-70 a rychlejší progresí nemoci a kratší dobou přežívání pacientů významný prognostický marker doplňující vyšetření mutačního stavu genu pro variabilní části těžkých řetězců imunoglobulinů u pacientů s B-CLL

12 Imunohistochemie Western blotting Stanovení ZAP-70 mrna (PCR) Průtoková cytometrie nejčastěji používaná metoda velmi dobrá dostupnost relativní snadnost a časová nenáročnost bez potřeby separace čisté populace B lymfocytů absence jednotně užívané standardizované metodiky

13 intracelulární značení pomocí MAbs stanovení exprese ZAP-70 na CD5+ T lymfocytech a CD56+ NK buňkách jako vnitřní kontrola hranice pro pozitivitu je volena dle statisticky zjištěné hodnoty nejlépe korelující s mutačním stavem IgVh nebo s výsledky citlivějších metod poměrné vyjádření exprese ZAP-70 pomocí střední intenzity fluorescence (MeanFluorescenceIndex) maligních buněk B-CLL a kontrolních T lymfocytů Hraniční mez pozitivity ZAP 70: % ZAP-70+ buněk B-CLL > 20 % MFI (B-CLL/T-ly) > 0,2 MFI (T-ly/B-CLL) < 3

14 muž K.N., 1936 lymfocytóza 81 % celkově cca 74 % CD19+CD5+ B lymfocytů pozitivní mutační status - 93 % homologie mutovaný stav genu Vh3 pro variabilní část těžkého imunoglobulinového řetězce

15 x-mean T - Ly = 1,71 MFI = 0,164 x-mean B - CLL = 0,28 0,67 % ZAP-70+ buněk B CLL ZAP 70 negativní lepší prognóza

16 muž Z.Č., 1950 lymfocytóza 93 % celkově cca 71 % CD19+CD5+ B lymfocytů negativní mutační status % homologie nemutovaný stav genu Vh3 pro variabilní část těžkého imunoglobulinového řetězce

17 x-mean T - Ly = 3,79 MFI = 0,340 x-mean B - CLL = 1,29 79,2 % ZAP-70+ buněk B CLL ZAP 70 pozitivní horší prognóza

18 žena A.K., 1943 lymfocytóza 67 % celkově cca 52 % CD19+CD5+ B lymfocytů pozitivní mutační status 90% homologie mutovaný stav genu Vh3 pro variabilní část těžkého imunoglobulinového řetězce

19 x-mean T - Ly = 2,52 x-mean B CLL = 0,41 MFI = 0,163 1,72 % ZAP-70+ buněk B CLL ZAP 70 negativní lepší prognóza

20 muž P.P., 1959 lymfocytóza 60 % celkově cca 53 % CD19+CD5+ B lymfocytů negativní mutační status - 99,7 % homologie nemutovaný stav genu Vh5 pro variabilní část těžkého imunoglobulinového řetězce

21 x-mean T - Ly = 3,01 x-mean B - CLL = 1,12 MFI = 0,372 59,8 % ZAP-70+ buněk B CLL ZAP 70 pozitivní horší prognóza

22 MFI = 0,163 < 0,2 1,72 % ZAP-70+ buněk B CLL < 20 % ZAP 70 negativní mutovaný gen IgVh lepší prognóza MFI = 0,372 > 0,2 59,8 % ZAP-70+ buněk B CLL > 20 % nemutovaný gen IgVh ZAP 70 pozitivní horší prognóza

23 Adams et al., 2014: Prognostic Value of ZAP-70 Expression in Chronic Lymphocyic Leukemia as Assessed by Quantitative Polymerase Chain Reaction and Flow Cytometry. Clinical Cytometry B: Rossi et al., 2010: Prognostic impact of ZAP-70 expression in chronic lymphocytic leukemia: mean fluorescence intensity T/B ratio versus percentage of positive cells. Journal of Translational Medicine :23. Princip et al., 2006: Clinical significance of ZAP-70 protein expression in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2006, 108/3:

24 MFI = 0,163 < 0,2 1,72 % ZAP-70+ buněk B CLL < 20 % ZAP 70 negativní pozitivní mutační status lepší prognóza Hraniční mez pozitivity ZAP 70: % ZAP-70+ buněk B-CLL > 20 % MFI (B-CLL/T-ly) > 0,2 MFI (T-ly/B-CLL) < 3

25 MFI = 0,372 > 0,2 59,8 % ZAP-70+ buněk B CLL > 20 % ZAP 70 pozitivní negativní mutační status horší prognóza Hraniční mez pozitivity ZAP 70: % ZAP-70+ buněk B-CLL > 20 % MFI (B-CLL/T-ly) > 0,2 MFI (T-ly/B-CLL) < 3